Podstawy histologii i wykrywanie śmierci komórki w tkance pszczoły miodnej

Podsumowanie

Metody immunohistochemiczne są przydatne w badaniach nad pszczołami miodnymi do wykrywania i oceny poziomu apoptozy i nekrozy w jelicie środkowym i gruczołach podgardłowych dorosłych pszczół.

Streszczenie

Pszczoły miodne (Apis mellifera L.) wewnątrz ula (pielęgniarki i inne pszczoły ulowe) i na zewnątrz ula (zbieracze) są narażone na zmiany klimatu i pogody, różne pestycydy, patogeny i niedożywienie, głównie przedostające się przez usta i wpływające głównie na przewód pokarmowy dorosłych pszczół. Aby zrozumieć i zapobiec wpływowi takich zewnętrznych i wewnętrznych stresorów na pszczoły miodne, jedną z przydatnych metod badawczych jest metoda immunohistochemiczna. Opisano podstawowy protokół przygotowania jelita środkowego (ventriculus) i gruczołów podgardłowych (HPG) dorosłych pszczół do analizy histologicznej. Opisano szczegółową metodologię oceny stopnia uszkodzenia komórek i odróżnienia martwicy od programowanej śmierci komórki (apoptozy) jako naturalnego procesu regeneracji tkanek. Przedstawiono wyniki leczenia dorosłych pszczół miodnych kwasem szczawiowym i pestycydami (insektycydem i akarycydem) oraz oznaczaniem śmierci komórek w komorze i HPG. Omówiono również zalety i wady metodologii.

Wprowadzenie

Pszczoły miodne (Apis mellifera L.) są, wśród innych dzikich zapylaczy, najważniejszymi zapylaczami roślin rolniczych. Przez tysiące lat zmieniające się środowisko wpłynęło na pszczoły, aby przystosowały swoją morfologię, fizjologię, zachowanie i tolerancję na kilka patogenów i pasożytów. W związku z tym pszczoły miodne rozwinęły bardzo różnorodną gamę gatunków i podgatunków na całym świecie¹. Wyniki te są zgodne z wcześniejszymi ustaleniami, że istnieje zmienność genetyczna w strukturze przewodu pokarmowego pszczoły miodnej, ale sugerują również, że zmiany w jelicie środkowym są spowodowane czynnikami środowiskowymi^2....

Protokół

1. Podstawy histologii w badaniach nad pszczołą miodną

1. Disekcja tkanek pszczoły miodnej
   UWAGA: Do dyssekcji pszczół robotnic należy użyć mikroskopu stereoskopowego z oświetleniem LED. Najbardziej użyteczne powiększenie to ~20x.
   1. Manipulacja i dyssekcja
      1. Ostrożnie chwycić pszczołę robotnicę pęsetą i umieścić ją na lodzie (lub w zamrażarce w temperaturze -20 °C) na 2 min w celu unieruchomienia²². Przypiąć pszczołę do szalki Petriego szpilkami ukośnie przez najwyższą tylną część toraksu dwukrotnie, od lewej do prawej i od prawej do lewej.
      2. Wlać sól fizjologiczną dla owadów, aby p....

Wyniki

Wykrywanie śmierci komórek w jelicie środkowym
Nowo wyklute pszcz zostały (Apis mellifera carnica) z pasieki eksperymentalnej Instytutu Rolnictwa Słowenii w Lublanie poddano indywidualnie działaniu 3% kwasu szczawiowego (OA)²³. OA jest często stosowany w pszczelarstwie do zwalczania Varroa destructor. Po zabiegu pszczół robotnic (trzech z każdej grupy) unieruchomiono na lodzie. Wypreparowano jelito środkowe i utrwalono je w 10% formalinie. Następnie tkankę od.......

Dyskusja

W organizmach żywych śmierć komórki jest definiowana jako apoptoza lub nekroza²⁵ i może jej towarzyszyć autofagia²⁶. Różnica między komórkami apoptozycznymi i martwiczymi polega na tym, że apoptoza jest formą zaprogramowanej śmierci komórki i pojawia się w normalnych komórkach, podczas gdy nekroza występuje z powodu warunków śmiertelnych (np. wypadku, choroby)^27,28. Apoptozę można wykryć za pomocą zestawów testowych.......

Materiały

₂₄

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Zestaw peroksydazy 2-propanol
ApopTag (ApopTag Peroksydaza in situ Wykrywanie apoptozy)	Test Sigma-Aldrich	S7100	B, https://www.sigmaaldrich.com/SI/en/product/mm/s7100?gclid=CjwKCA jw7vuUBhBUEiwAEdu2pPanI9SE j81ZTl-nLHEoxXAv7ViKwPA_QRx H7fciMRNcYwR7lbPQbhoCqcQQA vD_BwE; Kontrole pozytywne zawarte w S7101
Obejmuje
system kolorymetryczny TUNEL DeadEnd	Promega	G7360	Test A, https://worldwide.promega.com/products/cell-health-assays/apoptosis-assays/deadend-colorimetric-tunel-system/?catNum=G7360
Mikroskop preparacyjny  (do sekcji pszczół)	Zeiss
			destylowana
Kaseta
EnVision System zestaw fosfatazy alkalicznej	Dako
Eosin Y Solution	Sigma-Aldrich		alkoholowy
Etanol			95% (lub mniej czysty), 90%, 80%
Faramount podłoże montażowe	, wodneŚredni	montażowy
Stół spłaszczający	Leica	HI1220
Kleszcze  (do sekcji pszczół)	Narzędzia do nauki precyzyjnej	11294-00	Standard #4
Formalina 10%			Formaldehyd
Hematoxylin	Sigma-Aldrich
HistoChoice Środek	czyszczący	Sigma-Aldrich
Peroksydaza wodorowa 3%
Inkubator	BioRad
Szpilki do owadów  (do sekcji pszczół)	Entosphinx	44594	Szpilki do owadów ze stali nierdzewnej – białe, rozmiar 2
ISCDDK, AP (zestaw do wykrywania śmierci komórek in situ, fosfataza alkaliczna)	Roche	11684809910	Test C, https://www.sigmaaldrich.com/deepweb/assets/sigmaaldrich/product/documents/362/737/11684809910b ul.pdf
KH2PO4
Zegar laboratoryjny
Mikroskop świetlny	Szkiełka
	Pudełko ze szkiełkami musi być zabezpieczone w plastikowej folii, aby zapobiec kurzowi
NaCl
Paraformaldehyd 4%
Paraplast	Pipety
Pasteur	1,5 mL; 3 ml
(do sekcji pszczół)			Wypełniony kondensacją krzemu  (Xantoprene L niebieski i Płyn uniwersalny plus aktywator)
Proteinaza K	Merck	21627
Roztwór Ringera  (do sekcji pszczół)			7,5 g NaCL, 2,38 g Na2HPO4, 2,72 g KH2PO4, 1 l wody destylowanej
Nożyczki  (do sekcji pszczół)	Narzędzia do nauki precyzyjnej	1406-09, 14061-09	Proste i zakrzywione, 9 cm
Płyn uniwersalny plus aktywator  (do sekcji pszczół)	Kulzer
Zegarmistrz s kleszcze (do preparacji pszczół)	Narzędzia do nauki o naprawach	91100-12
Kąpiel wodna	Pędzel
	2x
(do sekcji pszczół)	Kulzer

Woda do zatapianiaDako Środek czyszczący mikroskopowe Leica Mikrotom Leica Modułowa stacja do zatapiania tkanek Leica NaHPO Leica PBS szalka Petriego  do akwareli Leica Xantoprene L niebieski  powiedział: