Technika iniekcji zarodka do edycji genów u kleszcza czarnonogiego, Ixodes scapularis

Podsumowanie

Obecny protokół opisuje metodę wstrzykiwania zarodków kleszczy. Wstrzyknięcie zarodka jest preferowaną techniką manipulacji genetycznej w celu wytworzenia linii transgenicznych.

Streszczenie

Kleszcze mogą przenosić różne patogeny wirusowe, bakteryjne i pierwotniakowe i dlatego są uważane za wektory o znaczeniu medycznym i weterynaryjnym. Pomimo rosnącego obciążenia chorobami przenoszonymi przez kleszcze, badania nad kleszczami pozostają w tyle za wektorami chorób owadów ze względu na wyzwania związane z zastosowaniem narzędzi transformacji genetycznej do badań funkcjonalnych nad unikalną biologią kleszczy. Interwencje genetyczne zyskują na popularności w celu ograniczenia chorób przenoszonych przez komary. Jednak rozwój takich interwencji wymaga stabilnej transformacji linii zarodkowej poprzez wstrzykiwanie zarodków. Takiej techniki iniekcji zarodka brakuje w przypadku cheliceratów, w tym kleszczy. Kilka czynników, takich jak zewnętrzna gruba warstwa wosku na zarodkach kleszczy, twarda kosmówka i wysokie ciśnienie wewnątrz owalu, to niektóre z przeszkód, które wcześniej uniemożliwiały opracowanie protokołu wstrzykiwania zarodka u kleszczy. Obecne prace pokonały te przeszkody, a technika wstrzykiwania zarodka dla kleszcza czarnonogiego, Ixodes scapularis, została opisana tutaj. Technika ta może być wykorzystana do dostarczania składników, takich jak CRISPR/Cas9, w celu stabilnych transformacji linii zarodkowej.

Wprowadzenie

Kleszcze są wektorami o znaczeniu medycznym i weterynaryjnym, zdolnymi do przenoszenia różnych patogenów wirusowych, bakteryjnych, pierwotniaków i nicieni^1,2. We wschodnich Stanach Zjednoczonych kleszcz czarnonogi, Ixodes scapularis, jest ważnym wektorem patogenu boreliozy (LD), krętka Borrelia burgdorferi. Każdego roku w Stanach Zjednoczonych odnotowuje się ponad 400 000 przypadków LD, co czyni ją najczęstszą chorobą zakaźną przenoszoną przez wektory w USA¹. Oprócz B. burgdorferi, sześć innych mikroorganizmów jest przenoszonych przez I. scapularis, w tym cztery bakterie (Anaplasma phagocytophilum, B. mayonii, B. miyamotoi i Ehrlichia muris eauclarensis), jeden pasożyt pierwotniak (Babesia microti) i jeden wirus (wirus Powassan), co czyni ten gatunek kleszcza poważnym problemem zdrowia publicznego³. Podczas gdy choroby przenoszone przez kleszcze stały się bardziej powszechne w ostatnich latach, badania nad kleszczami pozostały w tyle za innymi wektorami stawonogów, takimi jak komary, ze względu na unikalną biologię kleszczy i wyzwania związane ze stosowaniem genetycznych i funkcjonalnych narzędzi genomicznych^4,5.

Techniki edycji genów, szczególnie CRISPR/Cas9, umożliwiły prowadzenie badań genomiki funkcjonalnej w organizmach niemodelowych. W celu tworzenia dziedzicznych mutacji w organizmie, iniekcja zarodka pozostaje preferowaną metodą dostarczania konstruktów do zmiany linii zarodkowej^6,7,8,9. Jednak do niedawna⁴, jaja kleszczy były uważane za zbyt trudne lub wręcz niemożliwe do wstrzyknięcia bez zabicia zarodka^10,11. Gruba warstwa wosku na jajach, twarda kosmówka i wysoki nacisk wewnątrz owalu były jednymi z głównych przeszkód, które uniemożliwiały wstrzyknięcie zarodka kleszczom. Dorosły, karmiony krwią I. scapularis składa pojedynczy lęg do 2 000 jaj¹² w ciągu 3-4 tygodni (około 100 jaj / dzień). Jaja są składane pojedynczo, a każde jajo jest pokryte woskiem, który jest wydzielany przez wypukłości lub "rogi" narządu gruczołowego Gené^13,14,15 matki. Wosk ten chroni jaja przed wysuszeniem i zawiera związki przeciwdrobnoustrojowe¹⁵. Aby skutecznie wstrzyknąć jaja kleszczy, ważne jest, aby usunąć warstwę wosku, zmiękczyć kosmówkę i wysuszyć jaja, aby zmniejszyć ciśnienie wewnątrzowalne, aby wstrzyknięcie nie uszkodziło nieodwracalnie jaja. Rozumiejąc krytyczne znaczenie iniekcji zarodków dla udanej transformacji linii zarodkowej, opracowano protokół dla I. scapularis, który można wykorzystać do dostarczenia konstruktu CRISPR/Cas9 i wygenerowania stabilnych mutacji linii zarodkowej⁴. Oprócz wkładu w badania nad I. scapularis, protokół ten może być również zoptymalizowany pod kątem innych gatunków kleszczy.

Protokół

Dorosłe osobniki Ixodes scapularis zostały zakupione na Uniwersytecie Stanowym Oklahomy (OSU) lub wyhodowane na Uniwersytecie Nevady w Reno (UNR) (protokół IACUC #21-001-1118).

1. Przygotowanie samic kleszczy do pobrania zarodków

UWAGA: Aby zebrać jaja w odpowiednim wieku, ważne jest zsynchronizowanie składania jaj. Chociaż sygnały dotyczące składania jaj u kleszczy pozostają niejasne, w standardowych warunkach insektowych (temperatura 27 °C i wilgotność względna >90%) samice I. scapularis zaczynają składać jaja około 8 dni po oderwaniu żywiciela. Ten okres można wydłużyć, przechowując pełne samice w temperaturze 4 °C. Samice karmione krwią przechowywaliśmy w temperaturze 4 °C do 8 tygodni bez żadnego negatywnego wpływu na składanie jaj. Warunki te mogą wymagać modyfikacji dla każdego owada.

1. Przechowuj wszystkie nasycone samice w temperaturze 4 °C z wilgotnością względną >90% w plastikowym pudełku o pojemności 6 litrów wyłożonym wilgotną bibułą filtracyjną do czasu użycia do mikrowstrzyknięć.
2. Na tydzień przed wstrzyknięciem przenieść samice z 4 °C do inkubatora o temperaturze 27 °C w celu rozpoczęcia składania jaj.
3. Kiedy samice zaczną składać jaja (3-4 dni po przeniesieniu ich do temperatury 27 °C), usuń jaja za pomocą pędzla z cienką końcówką i przygotuj samice do ablacji narządów (gruczołów woskowych) Gené.
   UWAGA: Narząd Gené rozciąga się od obszaru między scutum a capitulum (grzbietowa podstawa aparatu gębowego), aparat gębowy wygina się nad brzuszną powierzchnią ciała (równolegle do powierzchni), a rozszerzony organ genu pokrywa jaja, gdy tylko jaja zostaną złożone (Ryc. 1). Jaja złożone przed usunięciem narządu Gené lub opróżnieniem go z woskowiny będą pokryte woskowiną i nie nadają się do wstrzykiwań i muszą zostać wyrzucone.
4. Aby usunąć lub opróżnić narząd Gené, użyj gliny, aby umieścić nabrzmiałą samicę na szklanym szkiełku pod mikroskopem zorientowanym tak, aby aparat gębowy był widoczny zarówno po stronie brzusznej, jak i grzbietowej (Ryc. 1B,C).
   1. Ostrożnie nakłuj obszar dokładnie między tarczką a aparatem gębowym za pomocą cienkich kleszczy i igieł wolframowych wykonanych w laboratorium przy użyciu drutu wolframowego zgodnie z wcześniej opublikowanym protokołem¹⁶ (igły można również kupić komercyjnie i podłączyć do mikrosondy preparucyjnej, patrz Tabela Materiałów).
   2. Przechodząc do środka za pomocą wolframowej igły, wyciągnij gruczoł woskowy ( Rysunek 1D, E). Usunięcie gruczołu może potrwać kilka minut. Zetrzyj płynną wydzielinę wosku za pomocą chusteczek laboratoryjnych.
      UWAGA: Gruczoł można również usunąć od strony brzusznej tuż pod aparatem gębowym; sięgając z tyłu w kierunku scutum z igłą i kleszczami. Nałożenie kleju silikonowego wokół aparatów gębowych również blokuje wywijanie narządów Gene'a i może być stosowane zamiast usuwania lub opróżniania woskowiny (osobista komunikacja z dr Ladislavem Simo, INRAE, Francja). Nabrzmiałe kleszcze nie pozostaną na taśmie dwustronnej. Używanie gliny do "owijania" kleszcza pomaga utrzymać go na miejscu podczas manipulacji. Użyj kleszczy, aby przytrzymać kleszcza i igłę wolframową do wypreparowania. Część brzuszna jest łatwiejsza do przekłucia igłą i preferowana przez autorów.
5. Aby opróżnić gruczoł, ułóż kleszcza grawicy, jak wspomniano w kroku 1.4. Ostrożnie nakłuj obszar za aparatem gębowym po stronie grzbietowej i uciskaj stronę brzuszną za pomocą kleszczy.
   UWAGA: Alternatywnie nie jest konieczne usuwanie gruczołu woskowego; Opróżnienie gruczołu z wosku potrwa kilka dni. Samice składające jaja mają biały obszar wokół części gębowej, który wskazuje lokalizację gruczołu woskowego i może być używany jako odniesienie.
   1. Umieść krawędź niestrzępiącej się chusteczki laboratoryjnej i usuń płynny wosk wychodzący z miejsca nakłucia. Upewnij się, że unikasz wydzielania hemolimfy, która jest przezroczystym płynem w porównaniu z lekko żółtawym lepkim woskiem. Może minąć 5-10 minut, zanim większość wosku zostanie usunięta.
6. Po manipulacji umieścić samice w inkubatorze w temperaturze 27 °C (>90% wilgotności względnej) i pozwolić im dojść do siebie przez 1-2 dni.
   UWAGA: Leczone samice zwykle potrzebują 1-2 dni, aby dojść do siebie i ponownie rozpocząć składanie jaj.
7. Kiedy samice ponownie zaczną składać jaja, za pomocą cienkiego pędzla zbierz świeżo złożone jaja (0-18 godzin po złożeniu jaj) i umieść je w probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml.
   UWAGA: W przypadku używania jaj od tej samej samicy przez dłuższy czas, procedurę tę należy powtórzyć po 4-5 dniach składania jaj, jeśli gruczoły nie zostały usunięte.

2. Leczenie zarodków za pomocą mikroiniekcji

1. Dodać ~200 μl (lub objętość wystarczającą do przykrycia jaj, w zależności od liczby jaj) 5% (wagowo/objętościowo) chlorku benzalkoniowego/wody (patrz Tabela materiałów) do probówki zawierającej jaja w wieku 0-18 godzin. Delikatnie obracaj jajkami pędzlem przez 5 minut, aby uniknąć osadzania się jaj na dnie tubki (szczegółowe informacje można znaleźć w Sharma et al.⁴). Usunąć supernatant za pomocą mikropipety, pozostawiając jaja w probówce.
   UWAGA: Chlorek benzalkoniowy działa żrąco na skórę i oczy, należy nosić rękawice i okulary ochronne
.
2. Do probówki z jajami dodać ~200 μl wody destylowanej (DI), zamieszać pędzlem i usunąć wodę z probówki do mikrowirówki za pomocą mikropipety. Powtórz mycie wodą DI jeszcze raz.
3. Po umyciu wodą DI dodać ~200 μL 5% (w/v) chlorku sodu (NaCl) i delikatnie mieszać pędzlem przez 5 min. Po 5 minutach wyjąć roztwór z probówki i dwukrotnie umyć jajka wodą DI.
4. Dodać ~100 μl 1% (w/v) roztworu NaCl do probówki mikrowirówki zawierającej jaja. Jaja należy przechowywać w 1% (w/v) roztworze NaCl do czasu użycia ich do wstrzykiwań.
5. Mikroiniekcje należy rozpocząć po około godzinie. Ta oś czasu pomaga w prawidłowym wysuszaniu jaj i zapobiega ich pękaniu.
   UWAGA: Jaja można przechowywać w 1% (w/v) roztworze NaCl przez 7-8 godzin bez znaczącego wpływu na przeżywalność. Jeśli jaja są trudne do wstrzyknięcia lub pęknięcia, oznacza to, że jaja nie są wystarczająco wysuszone i mogą być dalej traktowane 5% (w/v) NaCl przez dodatkowe 5 minut.

3. Przygotowanie igieł iniekcyjnych

1. Włóż glinokrzemianowe szkło kapilarne (z żarnikiem, patrz Tabela materiałów) do ściągacza igieł zgodnie z instrukcjami producenta.
2. Dostosuj ściągacz igieł do następujących ustawień: Ciepło: 575, Ciągnięcie: 20, Prędkość: 50, Czas: 200 i Ciśnienie: 700.
3. Aktywuj funkcję ciągnięcia ściągacza igieł i powtórz proces dla dodatkowych igieł.
4. Wyciągnięte igły przechowuj, wbijając je w linie gliny modelarskiej na czystej szalce Petriego.
5. Naładować igłę mieszanką iniekcyjną za pomocą końcówki do mikropodajnika (patrz Tabela materiałów).
   UWAGA: Porównanie igieł używanych do wstrzykiwania zarodków kleszczy i komarów jest pokazane na Rysunek 2.

4. Ustawienie szkiełek do mikroiniekcji

1. Za pomocą taśmy dwustronnej przyklej do siebie dwa szklane szkiełka mikroskopowe, pozostawiając odstęp około 0,5 cm, aby wspomóc wyrównanie jaj i zapobiec ich przewróceniu się podczas wstrzyknięć (Ryc. 3A).
2. Nałóż kawałek przezroczystego opatrunku foliowego (patrz Tabela materiałów) na taśmę dwustronną w szczelinie między szkiełkami. Upewnij się, że opatrunek foliowy jest idealnie wyrównany ze szczeliną.

5. Mikroiniekcje zarodków

1. Wyrównaj 8-10 jajek na raz na szkiełku (powyżej) za pomocą jednowłosego pędzla.
   UWAGA: Jaja ustawione w linii prostopadłej do dłuższej osi (Rysunek 3B) do krawędzi szkiełka są łatwiejsze do wstrzyknięcia niż jaja, których oś podłużna jest wyrównana równolegle do krawędzi (Rysunek 3C). Jaja w orientacji prostopadłej (Rysunek 3B) mogą lepiej wytrzymać wstrzyknięcie, co skutkuje wyższą przeżywalnością.
2. Umieść szkiełko z wyrównanymi jajami na stoliku mikroskopu złożonego. Użyj kawałka niestrzępiącej się chusteczki, aby usunąć 1% roztwór NaCl, w którym są przechowywane.
3. Podłączyć napełnioną igłę do wstrzykiwania do mikrowstrzykiwacza podłączonego do mikromanipulatora (patrz Tabela Materiałów).
4. Otwórz igłę, delikatnie pocierając ją o powierzchnię jaja, ustawiając wysokie ciśnienie na mikrowstrzykiwaczu (>5 000 hPa).
5. Po otwarciu igły należy zmniejszyć ciśnienie (1 000-2 500 hPa) mikroiniektora w zależności od otwarcia igły.
   UWAGA: Mały otwór będzie wymagał stosunkowo wyższego ciśnienia, podczas gdy większy otwór będzie wymagał niższego ciśnienia. Ma to na celu kontrolowanie objętości wstrzykiwanego konstruktu. W zależności od wielkości otworu igły, objętość wstrzyknięcia będzie się wahać od 1 do 5 l.
6. Wstrzyknąć wszystkie jaja na szkiełku pod kątem 10°-15° tak szybko, jak to możliwe i natychmiast przesunąć szkiełko do warunków wysokiej wilgotności na szalce Petriego wyłożonej wilgotnym papierem. Zaraz po wstrzyknięciu jaja zaczynają wysychać.
   UWAGA: Wstrzyknięcie niewielkiej liczby jaj na raz zwiększa powodzenie wstrzyknięcia i prawdopodobieństwo przeżycia. Igły zapychają się przez refluks zarodkowy. Jeśli końcówka jest nadal ostra, aby usunąć zatkane igły, przesuń igłę do małej kropelki 1% NaCl dodanej do krawędzi szkiełka. Działanie kapilarne usunie mały zator. Jeśli igła jest już, zmień ją.

6. Opieka nad zarodkami po iniekcji

1. Umieścić szkiełko z wstrzykniętymi zarodkami na dużej szalce Petriego wyłożonej wilgotną bibułą filtracyjną.
   UWAGA: Bardzo ważne jest, aby nie przeszkadzać jajom przez co najmniej 5-6 godzin. Pozwala to na prawidłowe uszczelnienie rany po wstrzyknięciu. Rana po wstrzyknięciu może się otworzyć po wzburzeniu, a cytoplazma może zacząć wyciekać, powodując śmiertelność jaj.
2. Po 5-6 godzinach dodaj niewielką kroplę wody DI do przezroczystego opatrunku filmowego z dołączonymi wstrzykniętymi zarodkami. Za pomocą pędzla delikatnie przesuń jajka. Przenieś jaja na małą szalkę Petriego (10 cm) i zanurz je w wodzie DI.
   UWAGA: Opatrunek foliowy umożliwia łatwe usunięcie komórek jajowych po wstrzyknięciu. W momencie, gdy kropla wody zostanie dodana do opatrunku foliowego, jajka zaczną poruszać się wraz z wodą.
3. Jaja należy przechowywać zanurzone w wodzie i umieścić szalkę Petriego w plastikowym pudełku o pojemności 6 litrów w inkubatorze w temperaturze 27 °C i wilgotności względnej >90%.
4. Jaja należy sprawdzać regularnie, codziennie przez pierwsze kilka dni, a następnie co 3-4 dni, aż larwy zaczną się wykluwać.
   UWAGA: Jeśli duża liczba jaj zostanie uszkodzona podczas mikroiniekcji, delikatne spuszczenie wody z defibrylowanego jaja po tygodniu zapobiegnie rozwojowi grzybów na martwych jajach.
5. Kiedy larwy zaczynają wylęgać się z wstrzykniętych zarodków (21-25 dni po wstrzyknięciu w obecnej konfiguracji laboratoryjnej), należy je codziennie sprawdzać i przenosić wyklute larwy do szklanych fiolek z sitkiem na górze. Larwy mogą wykluwać się pod wodą i przetrwać przez ~ 1-2 tygodnie.
6. Przesiewaj larwy⁴, jeśli jajom wstrzyknięto konstrukt, który może skutkować widocznym fenotypem.

Wyniki

Skuteczny protokół iniekcji zarodka dla I. scapularis jest opisany w tym artykule. Samice składające jaja trzymano w wysokiej wilgotności, aby uniknąć wysuszenia częściowo woskowanych jaj. Warstwa woskowiny została usunięta w celu wstrzyknięcia zarodków kleszczy poprzez ablację narządu genu (gruczołu woskowego) ciężarnej samicy (Ryc. 1A-E). Użyliśmy igieł ze szkła glinokrzemianowego z krótszą szyjką (Rysunek 2). Ten kształt był idealny do ...

Dyskusja

Jest to pierwszy protokół opracowany w celu skutecznego wstrzykiwania wczesnych zarodków kleszczy. Osiągnięto wskaźnik przeżycia na poziomie ~4%-8%, który jest porównywalny z wstrzyknięciem zarodka w innych dobrze ugruntowanych modelach owadów⁵.

Ponieważ jest to protokół początkowy, przewiduje się, że protokół ten będzie dalej udoskonalany i wyspecjalizowany w odniesieniu do poszczególnych gatunków kleszczy. W szczególności czas wstrzyknięcia będzie się różnił w zależno...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Kapilary z krzemianu glinu, z włóknem	Instrumenty Sutter	AF100-64-10	Iniekcja zarodka
Chlorek benzalkoniowy 50% w wodzie, 25 g	TCI-America	B0414	Leczenie zarodków, 25 g to około 25 ml
Bibuła filtracyjna	Whatman	1001-090	Pielęgnacja po wstrzyknięciu
Kleszcze	Thomas Scientific	300-101	Narząd genu manipulacja
Chusteczki laboratoryjne	Genesee Scientific	88-115
Końcówki do mikroładowarek	Eppendorf	930001007	Ładowanie ciągniętych igieł
Mikromanipulator	Instrumenty Sutter	ROE-200	Iniekcja zarodka
Szkiełka mikroskopowe - gładkie, szlifowane krawędzie	Genesee Scientific	29-100	Wyrównanie zarodka, preferowane są krawędzie szlifowane, można mieć fazowane krawędzie zasłaniać jaja przed wzrokiem
NaCl	Research Products International	S23020-500.0	Leczenie zarodków
Ściągacz igieł	Sutter Instruments	P-1000
Trwała taśma dwustronna	Scotch	34-8716-3417-5	Wyrównanie zarodków
Płytki Petriego	Genesee Scientific	32-107G	Pielęgnacja po wstrzyknięciu
Tegaderm/ Przezroczysty Opatrunek filmowy	3M Opieka zdrowotna	1628	Wyrównanie zarodków Igły
wolframowe	Narzędzia Fine Science Tools	10130-10	Manipulacja narządami genu
Drut wolframowy	Amazon	B08DNT7ZK3	Manipulacja narządami genu
Cyfrowy mikrowtryskiwacz XenoWorks	Instrumenty Sutter	MPC-200	Wstrzyknięcie zarodka