Method Article

Izolacja warunkowo unieśmiertelnionych komórek śródbłonka kłębuszków nerkowych myszy z fluorescencyjnymi mitochondriami

DOI:

10.3791/64147

⸱

September 13th, 2022

 ,  ,  , 
1Department of Medicine, Division of Nephrology, The Icahn School of Medicine at Mount Sinai

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Artykuł opisuje metodę izolowania warunkowo unieśmiertelnionych komórek śródbłonka kłębuszków nerkowych z nerek transgenicznych myszy wykazujących ekspresję termolabilnego wirusa małp 40 i fotoaktywowalnych mitochondriów,PhAM wyciętych. Opisujemy procedurę izolacji kłębuszków nerkowych z całych nerek za pomocą kulek, etapów trawienia, wysiewu i hodowli GECs-CD31 dodatnich.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dysfunkcja komórek śródbłonka kłębuszków nerkowych (GEC) może zainicjować i przyczynić się do uszkodzenia bariery filtracji kłębuszkowej. Sugeruje się, że zwiększony mitochondrialny stres oksydacyjny jest mechanizmem powodującym dysfunkcję GEC w patogenezie niektórych chorób kłębuszków nerkowych. Historycznie rzecz biorąc, izolacja GEC od modeli in vivo była notorycznie trudna ze względu na trudności w izolowaniu czystych kultur z kłębuszków nerkowych. GEC mają złożone wymagania dotyczące wzrostu in vitro i bardzo ograniczoną żywotność. W tym miejscu opisujemy procedurę izolowania i hodowli warunkowo unieśmiertelnionych GEC z fluorescencyjnymi mitochondriami, umożliwiając śledzenie zdarzeń rozszczepienia i fuzji mitochondriów. GEC wyizolowano z nerek podwójnie transgenicznej myszy wykazującej ekspresję termolabilnego SV40 TAg (z Immortomouse), warunkowo promującego proliferację i hamującego różnicowanie komórek, oraz fotokonwertowalnego białka fluorescencyjnego (Dendra2) we wszystkich mitochondriach (z fotoaktywowanych mitochondriów [PhAMwyciętych] myszy). Wytworzona stabilna linia komórkowa pozwala na różnicowanie komórek po inaktywacji unieśmiertelniającego genu SV40 TAg i fotoaktywacji podzbioru mitochondriów, powodując zmianę fluorescencji z zielonej na czerwoną. Zastosowanie mitoDendra2-GEC pozwala na obrazowanie na żywo rozkładu, fuzji i rozszczepienia mitochondriów fluorescencyjnych bez barwienia komórek.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kłębuszek nerkowy ma kluczowe znaczenie dla filtracji krwi, ograniczając przepływ dużych cząsteczek przez barierę filtracyjną kłębuszków nerkowych1,2. Kłębuszek nerkowy zawiera cztery typy komórek: komórki nabłonka ciemieniowego, podocyty (komórki nabłonka trzewnego), komórki śródbłonka kłębuszków nerkowych (GEC) i komórki mezangialne3. Śródbłonek kłębuszków nerkowych charakteryzuje się unikalną strukturą naczyniową, zgodnie z obecnością okien wymaganych dla dużych objętości filtracji4. Wierzchołkowa powierzchnia śródbłonka kłębuszków nerkowych pokryta jest ujemnie naładowaną warstwą glikokaliksu i powłoką zwaną warstwą powierzchniową śródbłonka, która tworzy przestrzeń między śródbłonkiem a krwią. Struktura ta zapewnia wysoką selektywność ładunków, ograniczając przechodzenie ujemnie naładowanych cząsteczek, takich jak albumina, i zapobiegając adhezji leukocytów i płytek krwi5.

GEC są bardzo wrażliwe na zmiany metaboliczne, takie jak hiperglikemia związana ze środowiskiem cukrzycowym. Rzeczywiście, cukrzyca prowadzi do zwiększonego krążenia szkodliwych substancji, wysycenia szlaków metabolizmu glukozy i zaburzenia komórkowej równowagi redoks3,6. Co więcej, wzrost reaktywnych form tlenu indukuje dysfunkcję mitochondriów, która wpływa na funkcję śródbłonka7.

Ogólnym celem obecnego protokołu jest wyizolowanie unieśmiertelnionych komórek śródbłonka kłębuszków nerkowych z fluorescencyjnymi cechami mitochondrialnymi. Rzeczywiście, hodowla komórkowa pierwotnych GEC ma ograniczony cykl proliferacyjny i wczesne starzenie się8. Ponadto obecność fluorescencyjnych mitochondriów pomaga badać zdarzenia rozszczepienia i fuzji w odpowiedzi na hiperglikemię lub inne leczenie. Jako alternatywną metodę, inne laboratoria użyły h-TERT do unieśmiertelnienia komórek in vitro9.

Opisana tutaj metoda pozwala na izolację warunkowo unieśmiertelnionych komórek śródbłonka kłębuszków mitoDendra2 od zwierząt w wieku 4-6 tygodni (Rysunek 1). Ten szczegółowy protokół opisuje wykorzystanie myszy transgenicznych (H-2K b-tsA58) zawierających gen 40 dużego antygenu nowotworowego wirusa małpiego (SV40 TAg) gen10,11 do generowania termolabilnych, warunkowo unieśmiertelnionych komórek. Produkt genu tsA58 TAg działa w temperaturze dopuszczalnej 33 °C pod kontrolą indukowalnego 5' promotora flankującego mysiego genu H-2Kb, który zwiększa się powyżej poziomów podstawowych po ekspozycji na interferon gamma (IFNγ), utrzymując w ten sposób fenotyp warunkowej proliferacji12. H-2Kb ulega szybkiej degradacji w niedopuszczalnej temperaturze 37 °C przy braku IFNγ, usuwając funkcję unieśmiertelniania tsA58Tag w komórkach i umożliwiając komórkom rozwinięcie bardziej zróżnicowanego fenotypu13,14,15. Opcjonalne krzyżowanie myszy transgenicznych H-2Kb-tsA58 z myszami PhAM, które wyrażają specyficzną dla mitochondriów (podjednostka VIII oksydazy cytochromu c) Dendra2-green, umożliwia wykrywanie na żywo mitochondriów fluorescencyjnych16. Zielona fluorescencja Dendra2 przełącza się na czerwoną fluorescencję po ekspozycji na laser 405 nm16. Kiedy mitochondria łączą się po przełączeniu zdjęć, tworzą wydłużone kształty, które wydają się żółte w wyniku wymiany zielonego i żółtego materiału lub wydają się czerwone, gdy przechodzą rozszczepienie7,17. MitoDendra2-GEC są doskonałym narzędziem do badania odpowiedzi komórkowych mitochondriów GEC na różne bodźce.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie opisane tutaj procedury na zwierzętach zostały zatwierdzone przez IACUC w Icahn School of Medicine na Górze Synaj. Użyliśmy trzech samców myszy (transgeniczne myszy H-2Kb-tsA58 z mitochondriami aktywowanymi światłem [PhAM]) zakupionych w laboratorium Jacksona i utrzymywanych na normalnej diecie.

1. Warunki pracy i przygotowania

  1. Wyczyść przestrzeń roboczą wewnątrz okapu z przepływem laminarnym za pomocą 70% etanolu i światła UV-C.
  2. Przygotuj do mycia koralików. Sporządzić bufor-1 za pomocą 0,1 M fosforanu sodu o pH 7,4-8,0, bufor-2 za pomocą 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) bez wapnia i magnezu uzupełnionej 0,1% antygenem surowicy bydlęcej (BSA), 3 mM EDTA, pH 7,4 i buforem-3 przy użyciu 0,2 M Tris z 0,1% BSA, pH 8,5.

2. Magnetyczny koncentrator cząstek

  1. Przygotowanie koralików magnetycznych
    1. W probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml delikatnie wymieszaj 200 μl kulek magnetycznych (4 x 108 kulek) z 200 μl buforu-1,
      UWAGA: Przygotuj 200 μl kulek magnetycznych na mysz 1 dzień przed pobraniem tkanki. Koraliki zostaną użyte do zbioru kłębuszków nerkowych.
    2. Umieścić probówkę w magnetycznym koncentratorze cząstek na 1 minutę, a następnie ostrożnie zassać supernatant. Wyjmij rurkę z magnesu i ponownie zawieś umyte kulki w 200 μl buforu-1.
    3. Umieścić probówkę zawierającą kulki magnetyczne w koncentratorze cząstek magnetycznych na 1 minutę i delikatnie zassać supernatant.
    4. Dezaktywuj wolne grupy tosylowe, przemywając kulki magnetyczne 2x po 5 minut, używając 200 μl buforu-2, umieszczając probówkę w magnetycznym koncentratorze cząstek i odrzucając bufor
      5. .
    5. Inkubować kulki magnetyczne w 200 μl buforu-3 przez 24 godziny w temperaturze 4 °C lub przez 4 godziny w temperaturze 37 °C, w celu dezaktywacji pozostałych wolnych grup tosylowych. Umieścić probówkę w koncentratorze magnetycznym na 1 minutę, delikatnie zassać supernatant i wyrzucić go.
    6. Przemyć kulki magnetyczne 1x 200 μl buforu-2 przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Umieścić probówkę z powrotem w koncentratorze magnetycznym na 1 minutę i delikatnie zassać supernatant. Wyjąć probówkę z koncentratora magnetycznego i ponownie zawiesić kulki magnetyczne w 200 μl buforu-2, aby uzyskać 4 x 108 kulek/ml.
      UWAGA: Na tym etapie możliwe jest pozostawienie kulek w temperaturze 4 °C do 15 dni.

3. Izolacja komórek kłębuszków nerkowych myszy

  1. Przygotuj materiał perfuzyjny: strzykawkę 30 ml, igłę motylkową 25 g. Przygotuj materiał izolacyjny: sterylne naczynie 10 cm, skalpel, magnetyczny koncentrator cząstek, sitko do komórek 40 μm, sitko do komórek 100 μm.
  2. Przygotuj 100 ml 1x Hank's Balanced roztwór soli (HBSS) uzupełniony 1% antybiotykami i dostosuj pH do 7,35. Przefiltruj roztwór za pomocą filtra 0,2 μm i trzymaj go pod maską, aby uniknąć zanieczyszczenia.
  3. Wymieszaj 200 μl kulek magnetycznych z kroku 2.1.6 z 20 ml 1x HBSS.
    UWAGA: Na każdą mysz potrzebne będzie 200 μl kulek rozcieńczonych w 20 ml HBSS 1x.
  4. Przygotować 1 ml podwielokrotności kolagenazy typu II (125 CDU/mg) w stężeniu 1 mg/ml w 1x roztworze HBSS, pH 7,35. Wstępnie podgrzać RPMI 10% pożywką FCS w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C. Wstępnie podgrzać pożywkę do hodowli komórek śródbłonka w temperaturze 37 °C (szczegóły w Tabeli Materiałów).
    UWAGA: RPMI zostanie użyty do neutralizacji kolagenazy.
  5. Wstępnie pokryj dwie studzienki 6-dołkowej płytki 2 ml 10 μg/ml kolagenu IV (1 ml / dołek) przez 45 minut w temperaturze pokojowej. Umyj płytkę 3x 1x PBS, aby usunąć kwas octowy używany do rozcieńczania kolagenu. Powlekane płytki należy zużyć natychmiast lub przechowywać w temperaturze 2-8 °C do 4 tygodni.
    UWAGA: Zaleca się uszczelnienie płytki(ów) przezroczystą folią, aby zapobiec wysychaniu. Powłoka kolagenowa ułatwia przyczepianie się komórek do płytki.
  6. Oczyść i wysterylizuj wszystkie narzędzia chirurgiczne w Rysunek 2, używając 70% etanolu, a następnie sterylizując je w autoklawie przez 30 minut. Wyczyść miejsce pracy chirurgicznej 70% etanolem.
  7. Znieczulenie myszy za pomocą dootrzewnowego wstrzyknięcia ketaminy/ksylazyny (10 mg/ml ketaminy i 1 mg/ml ksylazyny). Aby potwierdzić, że zwierzę jest w pełni znieczulone, sprawdź, czy nie ma odruchu szczypania palców u stóp.
  8. Przymocuj łapy myszy za pomocą igieł 19 G, aby utrzymać ją na miejscu na platformie preparyjnej. Oczyść klatkę piersiową i brzuch 70% etanolem i otwórz brzuch wzdłuż klatki piersiowej nożyczkami a (Rysunek 2).
  9. Włóż igłę motylkową do lewej komory (Rysunek 3A) i wstrzyknij około 100 μl roztworu kulek (z kroku 1.2), aby rozszerzyć krążenie krwi.
  10. Ostrożnie przeciąć żyłę główną dolną poniżej nerek za pomocą igły 19 G (Rysunek 3A). Kontynuuj perfuzję rozpoczętą w kroku 3.9.
    UWAGA: Alternatywnie można użyć mini pompki z prędkością: 18,0+, czasem: 5 min. Dobra perfuzja jest ważna dla zebrania dużej liczby kłębuszków nerkowych z kulkami magnetycznymi. Jest to procedura nieprzeżytowa/terminalna.
  11. Delikatnie usuń tkankę tłuszczową pęsetą i wytnij obie nerki cienkimi nożyczkami chirurgicznymi c (Rysunek 2) i umieść je na talerzu z 1 ml 1x HBSS na lodzie. Zmiel nerkę nożyczkami b (Rysunek 2), a następnie sterylnym skalpelem na małe kawałki o średnicy 1 mm, jak pokazano w Rysunek 3B.
  12. Następnie inkubować zmieloną nerkę z 1 ml kolagenazy typu II z kroku 3.4 przez 35 minut w temperaturze 37 °C, delikatnie przechylając za pomocą wytrząsarki poziomej. Po tym etapie tkanka powinna zostać całkowicie strawiona, jak pokazano na Rysunek 3C.
  13. Dodaj 4 ml RPMI z 10% FBS (z kroku 3.4), aby zneutralizować kolagenazę. Przefiltruj strawioną tkankę przez sterylne sitko do komórek 100 μm do probówki o pojemności 50 ml. Użyj dna sterylnej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml, aby wymieszać strawioną tkankę z sitkiem, aby umożliwić przejście kłębuszków nerkowych.
  14. Przepłukać sitko komórkowe 15 ml 1x HBSS, a następnie odwirować przepływ przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. W tym momencie granulka składa się z trzech warstw; koraliki z kłębuszkami nerkowymi są widoczne w środkowej warstwie rurki, górna warstwa składa się z mniejszych struktur, takich jak kanaliki, a dolna warstwa to gruz (Rysunek 3D).
  15. Ostrożnie zassać supernatant i górną białą warstwę. Pozostała osada zawiera kulki zawierające kłębuszki nerkowe i szczątki (Rysunek 3D). Zawiesić osad z 1,5 ml 1x HBSS i przenieść do probówki o pojemności 2 ml.
  16. Umieść probówkę w koncentratorze magnetycznym (Rysunek 3E), odessać supernatant, a następnie przemyć kulki 2x 1 ml 1x HBSS; na tym etapie umieść 20 μL zawiesiny komórek na szkiełku podstawowym w celu sprawdzenia obecności kłębuszków nerkowych pod mikroskopem (Rysunek 3F; kłębuszek nerkowy [strzałka] i kilka koralików [żółte strzałki] w zawiesinie).
  17. Ostrożnie odessać supernatant, ponownie zawiesić osad w pożywce do wzrostu komórek śródbłonka (tabela materiałów) i przenieść go do czystej probówki o pojemności 2 ml. Dodać 2 μl IFNγ (100 U/ml) do probówki i umieścić komórki w jednym dołku na płytce 6-dołkowej. Inkubować komórki w temperaturze 33 °C.
  18. Po 3 dniach hodowli ostrożnie zmienić pożywkę, odpipetowując 1 ml pożywki i zastępując ją 1 ml świeżej pożywki. Na tym etapie komórki są niejednorodne z mieszaniną komórek kłębuszków nerkowych (Rysunek 4G).
    UWAGA: W kulturze wyrastającej z powierzchni będzie mieszanina komórek kłębuszków nerkowych i niektórych kulek magnetycznych (Rysunek 4G). Zauważ, że wszystkie komórki powinny mieć zielone, fluorescencyjne mitochondria.
  19. Po 7 dniach hodowli całkowicie odessać pożywkę i zastąpić ją świeżą 2 ml pożywki do wzrostu komórek śródbłonka uzupełnioną IFNγ (100 U/ml). Na tym etapie komórki zaczynają się namnażać, ale nadal są niejednorodne (Rysunek 4A).
  20. Po 10 dniach hodowli, gdy komórki osiągną ~80% zbieżności, należy przejść komórki za pomocą trypsyny, jak opisano w kroku 5.1, a następnie przenieść je do kolby T25 pokrytej kolagenem IV.
  21. Po 1 tygodniu (łącznie ~21 dni hodowli) należy przejść komórki do kolby T75 pokrytej kolagenem IV.

4. Przygotowanie koralików do izolacji komórek śródbłonka

  1. Zacznij od pokrycia koralików przeciw szczurom szczurzym przeciwciałem anty-mysim CD313,18,19. Użyć 10 μl kulek na każdą kolbę T75.
  2. Przemyj 10 μL kulek 3x 200 μL 1x PBS uzupełnionego 0,1% BSA, 2 mM EDTA, 1% penicyliny/streptomycyny. Umieść rurkę w magnesie koncentratora, aby za każdym razem pipetować bufor myjący.
  3. Zawiesić kulki w 200 μl PBS, 1% BSA, 2 mM EDTA, 1% penicyliny/streptomycyny. Dodać 4,8 μl szczurzego przeciwciała anty-mysiego CD317,18,19, umieścić probówkę na poziomym wytrząsarce i delikatnie mieszać przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, a następnie przechowywać probówkę w temperaturze 4 °C przez noc.

5. Izolowanie komórek śródbłonka kłębuszków nerkowych za pomocą koralików pokrytych CD31

  1. Dodać 3 ml 0,25% trypsyny do kolby T75 i inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 5 minut. Zneutralizować trypsynę za pomocą 3 ml pożywki do wzrostu śródbłonka, przenieść komórki do probówki o pojemności 15 ml, a następnie odwirować przy 200 x g przez 5 minut.
  2. Odessać supernatant i przemyć komórki w 1 ml PBS zawierającym 1% BSA, 2 mM EDTA, 1% penicyliny/streptomycyny. Wirować przy 200 x g przez 5 min.
  3. Zawiesić osad w 200 μl powlekanych kulek przygotowanych w kroku 4 i dodać 800 μl PBS zawierającego 1% BSA, 2 mM EDTA, 1% penicyliny/streptomycyny. Inkubować komórki przez 45 minut, ciągle wytrząsając w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
  4. Umieścić probówkę w koncentratorze magnetycznym i przemyć komórki 4x 1x PBS zawierającym 1% BSA, 2 mM EDTA, 1% penicyliny/streptomycyny. Ponownie zawiesić komórki w 3 ml śródbłonkowej pożywki wzrostowej uzupełnionej 100 U/ml IFNγ.
  5. Płytka 1,5 ml komórek/dołka w dołkach pokrytych kolagenem dożylnie na płytce 6-dołkowej. Hodować komórki w dopuszczalnych warunkach w temperaturze 33 °C.
    UWAGA: Wyizolowane komórki wykazują ekspresję dużego antygenu T tsA58 wirusa małpiego 40 (SV40), umożliwiając aktywację ciągłej proliferacji w temperaturze 33 °C (warunek permisywny).
  6. Po 4 dniach w hodowli usunąć 750 μl pożywki i zastąpić ją taką samą objętością świeżej pożywki uzupełnionej 100 U/ml IFNγ.
  7. Po 10 dniach do 14 dni hodowli sprawdź, czy nie rosną kolonie GECs CD31 dodatnie (Rysunek 4C), które wyrażają fluorescencyjne mitochondria za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego z filtrem 488 nm.
  8. Po 21 dniach hodowli komórki mogą osiągnąć zbieżność 80%-90%; przenieś je do kolby T25. Po osiągnięciu konfluencji komórki można utrzymywać za pomocą pożywki wzrostowej RPMI i 10% FCS.
    UWAGA: Przed osiągnięciem konfluencji komórki mogą wyglądać na niejednorodne (Rysunek 4B). Jednak gdy już się zlewają, uzyskują morfologię brukowaną.
  9. Na tym etapie komórki można poddać krioprezerwacji. Po osiągnięciu 80% zlewania dodaj 3 ml 0,25% trypsyny do komórek i inkubuj je w temperaturze 37 °C przez 5 minut. Zneutralizuj trypsynę równą objętością pożywki wzrostowej uzupełnionej 10% FBS.
  10. Wirować przy 200 x g przez 5 minut. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 3 ml pożywki zamrażającej (RPMI, 20% FBS, 10% DMSO). Podziel komórki w krioprobówkach i przechowuj je w temperaturze pary ciekłego azotu.

6. Uprawa mitoDendra2-GEC

  1. Rozmrozić komórki z krioalikwotu, począwszy od kroku 5.10, w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C i przenieść je do probówki o pojemności 15 ml z 10 ml wstępnie podgrzanej pożywki do wzrostu śródbłonka.
  2. Odwirować zawiesinę o sile 200 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Usunąć pożywkę i przenieść osad do kolby do hodowli komórkowych T25 cm2 pokrytej kolagenem dożylnie ze wstępnie podgrzaną pożywką do wzrostu komórek śródbłonka uzupełnioną 100 U/ml IFNγ i inkubować w temperaturze 33 °C.
  3. Zmień podłoże następnego dnia. Gdy komórki osiągną zbieżność 70%-80%, zwykle po 5 dniach, przenieś je do kolby do hodowli komórkowej T75 cm2.
  4. Aby zróżnicować komórki do fenotypu śródbłonka, należy przenieść komórki do warunków nieprzepuszczalnych w temperaturze 37 °C w pożywkach wzrostowych bez IFNγ.

7. Przekazywanie mitoDendra2-GECs

  1. Usunąć pożywkę, przemyć komórki PBS i dodać 3 ml ciepłego 0,25% roztworu trypsyny-EDTA (kolba T75 cm2), inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 minut.
  2. Po odłączeniu komórek dodaj 5 ml pożywki wzrostowej i pipetuj w górę iw dół. Odwirować zawiesinę o sile 200 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i przenieść komórki do nowej kolby lub płytki pokrytej kolagenem dożylnie.
    UWAGA: Pasażowanie powinno odbywać się raz w tygodniu w stosunku 1:4.

8. Charakterystyka mitoDendra2-GEC

  1. Wykonaj barwienie immunofluorescencyjne dla CD31 na zróżnicowanych komórkach7,18,19,20 (Rysunek 4D). Użyj również innych znaczników, takich jak vWF i Isolectin-B420.
  2. Aby potwierdzić mitochondrialną specyficzność Dendra2, oznacz komórki markerami specyficznymi dla mitochondriów, inkubując komórki w pożywce wzrostowej zawierającej 100 nM mitochondrialnego trackera przez 30 minut w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
  3. Usuń pożywkę i delikatnie umyj komórki wstępnie podgrzanym podłożem bez czerwieni fenolowej, aby wykonać obrazowanie na żywo.
    UWAGA: Alternatywnie, komórki można utrwalić za pomocą utrwalaczy formaldehydu (4%) przez 30 minut, a następnie kilkakrotnie przemyć w PBS. Stałe ogniwa można przechowywać w temperaturze 4 °C w 1x PBS do czasu użycia. Możliwe jest również potwierdzenie za pomocą cytometrii przepływowej: znakowanie komórek anty-CD31, anty-PECAM, anty-CD45. GEC powinny być ujemne dla markerów podocytów (synaptopodyna, Nphs1, Podxl), markerów komórek mezangialnych (PDGFRβ, angiotensynogen) i markerów komórek kanalików (akwaporyna, aminopeptydaza-N). Markery te służą jako kontrola negatywna. Ze względu na specyficzną dla mitochondriów ekspresję Dendra2 w tych komórkach, unikaj korzystania z kanału FITC.

9. Obrazowanie na żywych komórkach zmian strukturalnych mitochondriów w odpowiedzi na stres oksydacyjny lub wysoki poziom glukozy

  1. Płytka 1 x 105 GEC na naczyniu ze szklanym dnem o średnicy 35 mm pokrytej kolagenem IV przy użyciu pożywki do wzrostu komórek śródbłonka (tabela materiałów). Po 24 godzinach zmień na podłoże bez czerwieni fenolowej. Komórki mają zielone, fluorescencyjne mitochondria.
  2. Ustaw komorę środowiskową na 37 °C, 5% wilgotności i 5% CO2 1 h przed rozpoczęciem eksperymentu.
  3. Pod mikroskopem konfokalnym użyj obiektywu 40x/1,2 W, aby wyregulować ostrość i wybrać obszar zainteresowania. Inkubować komórki z 2 ml 5 mM lub 25 mM glukozy przez 60 minut.
  4. Wystaw komórki na działanie lasera o długości fali 405 nm (4% mocy lasera) w celu fotokonwersji subpopulacji mitochondriów z zielonej na czerwoną (Rysunek 5A-B, DE).
  5. Użyj lasera 561 nm, aby wzbudzić Dendra2 w stanie nieprzekształconym, aby uwidocznić czerwoną fluorescencję. Zobacz szczegółowy protokół przełączania zdjęć, jak opisano wcześniej16. Zdarzenia fuzji pojawiają się jako żółta fluorescencja po kilku minutach z powodu fuzji zielonej matrycy i czerwonej matrycy (Rysunek 4C, F).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym artykule opisano szczegółowy protokół izolacji warunkowo unieśmiertelnionych komórek śródbłonka kłębuszków nerkowych ze stabilnymi fluorescencyjnymi mitochondriami (mitoDendra2-GECs) (Rysunek 1). Wykorzystanie młodych myszy w wieku 6-10 tygodni jest niezbędne do uzyskania znacznej liczby zdrowych komórek. Po 3 dniach hodowli komórki zaczynają powoli rosnąć z izolowanych kłębuszków nerkowych, jak pokazano na Rysunek 3G. Po 7 dniach komórki są niejednorodne, wykazując inne typy...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mitochondria mają kluczowe znaczenie dla metabolizmu komórkowego, homeostazy i reakcji na stres, a ich dysfunkcja jest związana z wieloma chorobami, w tym chorobami nerek. Mitochondria odgrywają rolę w patologicznym wytwarzaniu nadmiernej ilości reaktywnych form tlenu (ROS), regulacji wewnątrzkomórkowego poziomu wapnia, szlakach śmierci komórki i dynamice cytoszkieletu 21,22,23.

Izolacja mysich GEC je...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają konkurencyjnych interesów finansowych, które mogliby zadeklarować.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują profesorowi Cijiang He i dr Fu Jia za ich spostrzeżenia na temat izolacji komórek śródbłonka myszy oraz dziękują profesorowi Mone Zaidi za dostarczeniewyciętych myszy PhAM i cenne dyskusje. Autorzy chcieliby również podziękować Microscopy CORE w Icahn School of Medicine w Mount Sinai i personelowi za otrzymane wskazówki. Prace te były wspierane przez granty z National Institutes of Health grant R01DK097253 oraz grant CDMRP Departamentu Obrony E01 W81XWH2010836 dla I.S.D.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
100 &mikro; m Sitko komórkoweFisher22-363-549
1ml Strzykawki insulinoweBD329424
25G motylBD367298
mm nożyczki krawędzioweF.S.T15000-00
30ml strzykawkaBD Biooscience309650
40 µ m sitko komórkoweFisher22-363-547
40 µ m nylonowa siatka
Bonn NożyczkiFST14184-09
Albumina surowicy bydlęcejFisherBP1600-100
CD31abcamab7388
Kolagenaza typu ICorning354236
Kolagenaza typ IISIGMAC6885125CDU/mg
Kolagen typ IVSIGMAC5533-5M
Dnase-IQiagen79254
Dynabeads 450Thermofisher Scientific14013
podłoże do wzrostu komórek śródbłonkaLonzacc-3156
Bardzo cienkie kleszczyki GraefeFST11150-10
FBSGemini100-106inaktywowana termicznie
Thermofisher33016015
Cienkie kleszczeF.S.T DumontE6511
HBSSGIBCO14065-056
IFNgCell ScienceCRI001B
ImmortomouseJackson laboratory32619Tg(H2-K1-tsA58)6Kio/LicrmJ
L-Glutamina 100xThermofisher Scientific25030081
Magnetyczny koncentrator cząstekThermofisher Scientific12320D
mitotrackerThermofisher ScientificM7512
PBS, 1XCorning46-013-CM
penecylina, streptomycyna, 100x, Thermofisher Scientific10378016
myszy PhaM,Jackson laboratory18397B6; 129S-Gt(ROSA)26Sortm1.1(CAG-COX8A/Dendra2)Dcc/J
Proteaza (10 mg/ml)SIGMAP6911
RPMIGIBCO3945
Pirogronian sodu 100mMThermofisher Scientific11360070
Standardowe kleszcze wzorcowe  FST11000-12
Nożyczki chirurgiczne - Sharp-BluntFST14008-14
synaptopodinSanta Cruzsc-515842
Trypsyna 0,05%ThermofisherScientific 25300054
3 Fibronektyna : , , , , ,

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Daehn, I. S., Duffield, J. S. The glomerular filtration barrier: A structural target for novel kidney therapies. Nature Reviews. Drug Discovery. 20 (10), 770-788 (2021).
  2. Fu, J., Lee, K., Chuang, P. Y., Liu, Z., He, J. C. Glomerular endothelial cell injury and cross talk in diabetic kidney disease. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 308 (4), 287-297 (2015).
  3. Lassen, E., Daehn, I. S. Molecular mechanisms in early diabetic kidney disease: Glomerular endothelial cell dysfunction. International Journal of Molecular Sciences. 21 (24), 9456(2020).
  4. Haraldsson, B., Jeansson, M. Glomerular filtration barrier. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 18 (4), 331-335 (2009).
  5. Yilmaz, O., Afsar, B., Ortiz, A., Kanbay, M. The role of endothelial glycocalyx in health and disease. Clinical Kidney Journal. 12 (5), 611-619 (2019).
  6. Giacco, F., Brownlee, M. Oxidative stress and diabetic complications. Circulation Research. 107 (9), 1058-1070 (2010).
  7. Daehn, I. S. Glomerular endothelial cell stress and cross-talk With podocytes in early [corrected] diabetic kidney disease. Frontiers in Medicine. 5, 76(2018).
  8. Satchell, S. C., et al. Conditionally immortalized human glomerular endothelial cells expressing fenestrations in response to VEGF. Kidney International. 69 (9), 1633-1640 (2006).
  9. Wieser, M., et al. hTERT alone immortalizes epithelial cells of renal proximal tubules without changing their functional characteristics. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 295 (5), 1365-1375 (2008).
  10. Jat, P. S., et al. Direct derivation of conditionally immortal cell lines from an H-2Kb- tsA58 transgenic mouse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (12), 5096-5100 (1991).
  11. Jat, P. S., Sharp, P. A. Cell lines established by a temperature-sensitive simian virus 40 large- T-antigen gene are growth restricted at the nonpermissive temperature. Molecular and Cellular Biology. 9 (4), 1672-1681 (1989).
  12. Israel, A., Kimura, A., Fournier, A., Fellous, M., Kourilsky, P. Interferon response sequence potentiates activity of an enhancer in the promoter region of a mouse H-2 gene. Nature. 322 (6081), 743-746 (1986).
  13. Mundel, P., et al. Rearrangements of the cytoskeleton and cell contacts induce process formation during differentiation of conditionally immortalized mouse podocyte cell lines. Experimental Cell Research. 236 (1), 248-258 (1997).
  14. Ohse, T., et al. Establishment of conditionally immortalized mouse glomerular parietal epithelial cells in culture. Journal of the American Society of Nephrology. 19 (10), 1879-1890 (2008).
  15. Rops, A. L., et al. Isolation and characterization of conditionally immortalized mouse glomerular endothelial cell lines. Kidney International. 66 (6), 2193-2201 (2004).
  16. Pham, A. H., McCaffery, J. M., Chan, D. C. Mouse lines with photo-activatable mitochondria to study mitochondrial dynamics. Genesis. 50 (11), 833-843 (2012).
  17. Archer, S. L. Mitochondrial dynamics--Mitochondrial fission and fusion in human diseases. The New England Journal of Medicine. 369 (23), 2236-2251 (2013).
  18. Casalena, G. A., et al. The diabetic microenvironment causes mitochondrial oxidative stress in glomerular endothelial cells and pathological crosstalk with podocytes. Cell Communication and Signaling. 18 (1), 105(2020).
  19. Qi, H., et al. Glomerular endothelial mitochondrial dysfunction is essential and characteristic of diabetic kidney disease susceptibility. Diabetes. 66 (3), 763-778 (2017).
  20. Akis, N., Madaio, M. P. Isolation, culture, and characterization of endothelial cells from mouse glomeruli. Kidney International. 65 (6), 2223-2227 (2004).
  21. Schuler, M. H., et al. Miro1-mediated mitochondrial positioning shapes intracellular energy gradients required for cell migration. Molecular Biology of the Cell. 28 (16), 2159-2169 (2017).
  22. Tang, C., et al. Mitochondrial quality control in kidney injury and repair. Nature Reviews. Nephrology. 17 (5), 299-318 (2020).
  23. Daniel, R., Mengeta, A., Bilodeau, P., Lee, J. M. Mitochondria tether to Focal Adhesions during cell migration and regulate their size. bioRxiv. , 827998(2019).
  24. Dylewski, J. F., et al. Isolation, purification, and conditional immortalization of murine glomerular endothelial cells of microvascular phenotype. MethodsX. 7, 101048(2020).
  25. Drexler, H. G., Uphoff, C. C. Mycoplasma contamination of cell cultures: Incidence, sources, effects, detection, elimination, prevention. Cytotechnology. 39 (2), 75-90 (2002).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Glomerular Endothelial CellsFluorescent MitochondriaMitochondrial FissionMitochondrial FusionCell IsolationMagnetic Bead SeparationCollagen IV CoatingEndothelial Cell CultureCD31 Antibody SelectionLive Cell Imaging

Related Articles