Method Article

Przygotowanie i ocena strukturalna monowarstw komórek nabłonka w fizjologicznie dobranym urządzeniu do hodowli mikroprzepływowej

DOI:

10.3791/64148

⸱

July 1st, 2022

 ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, School of Science and Engineering, Tulane University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prezentowany protokół opisuje rozwój i wykorzystanie techniki barwienia aktyną na bazie falloidyny z konfokalną laserową mikroskopią skaningową (CLSM) do wizualizacji przylegającej struktury warstwy komórkowej w mikroprzepływowych kanałach hodowli dynamicznej i tradycyjnych komorach do hodowli statycznej ze stałą studnią. Takie podejście pomaga w ocenie zbiegu warstw komórkowych, tworzenia monowarstw i jednorodności grubości warstwy.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eksperymenty mikroprzepływowe in vitro mają ogromny potencjał, aby ujawnić wiele wglądów w zjawiska mikrofizjologiczne występujące w stanach takich jak zespół ostrej niewydolności oddechowej (ARDS) i uszkodzenie płuc wywołane respiratorem (VILI). Jednak badania nad kanałami mikroprzepływowymi o wymiarach fizjologicznie istotnych dla końcowych oskrzelików ludzkiego płuca stoją obecnie przed kilkoma wyzwaniami, zwłaszcza ze względu na trudności w ustaleniu odpowiednich warunków hodowli komórkowej, w tym szybkości przepływu pożywki, w danym środowisku hodowli. Prezentowany protokół opisuje obrazowe podejście do oceny struktury ludzkich komórek nabłonka płuc NCI-H441 hodowanych w nieprzepuszczalnym dla tlenu kanale mikroprzepływowym o wymiarach fizjologicznie istotnych dla końcowych oskrzelików ludzkiego płuca. Za pomocą barwienia aktyną nitkową na bazie falloidyny, struktury cytoszkieletu komórek są ujawniane za pomocą konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej, co pozwala na wizualizację zarówno pojedynczych, jak i warstwowych komórek. Dalsza kwantyfikacja określa, czy stosowane warunki hodowli komórkowej wytwarzają jednolite monowarstwy nadające się do dalszych eksperymentów. Protokół opisuje metody hodowli komórkowej i oceny warstw w kanałach mikroprzepływowych i tradycyjnych środowiskach ze stałą studzienką. Obejmuje to budowę kanałów, hodowlę komórkową i wymagane warunki, utrwalanie, przepuszczalność i barwienie, konfokalne obrazowanie mikroskopowe, przetwarzanie obrazu i analizę danych.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zespół ostrej niewydolności oddechowej (ARDS) to ostry stan wynikający z uszkodzenia i rozprzestrzeniania się uszkodzenia miąższu płuc, skutkujący obrzękiem płuc pęcherzyków płucnych, niedostateczną wymianą gazową i późniejszą hipoksemią1. To inicjuje cykl uwalniania cytokin prozapalnych, rekrutacji neutrofili, uwalniania toksycznych mediatorów i uszkodzenia tkanek, co z kolei wywołuje dalszą reakcję zapalną2. Dodatkowo, płucny środek powierzchniowo czynny, który stabilizuje drogi oddechowe i zapobiega uszkodzeniom spowodowanym powtarzającą się rekrutacją/derekrutacją (R/D), może zostać dezaktywowany lub w inny sposób dysfunkcyjny przez procesy chemiczne zachodzące podczas ARDS, powodując dalszy stres i uszkodzenie otaczającego miąższu3. Jeśli dojdzie do wystarczającego uszkodzenia, może być konieczna wentylacja mechaniczna, aby zapewnić odpowiednie natlenienie ogólnoustrojowe4. Jednak wentylacja mechaniczna wiąże się z własnymi wyzwaniami i urazami, w tym możliwością uszkodzenia płuc wywołanego respiratorem (VILI), charakteryzującego się uszkodzeniem miąższu płuc spowodowanym naprężeniami mechanicznymi wywieranymi podczas nadmiernego napompowania (volutrauma) i/lub R/D granicy faz powietrze-ciecz w drożach oddechowych zamkniętych płynem (atelectrauma)5. Gradient ciśnienia doświadczany przez komórki nabłonkowe wystawione na działanie granicy faz powietrze-ciecz (jak w oskrzeliku zamkniętym płynem) w modelu atelektraumy może powodować reakcję obturacyjną wynikającą z przepuszczalności (POOR), prowadząc do pozytywnego cyklu urazów POOR-get-POORer6,7,8.

Eksperymenty in vitro mogą dostarczyć wglądu w te zjawiska w mikroskali, ale obecne badania w środowiskach kanałów mikroprzepływowych o fizjologicznie istotnych wymiarach napotykają na kilka wyzwań9. Po pierwsze, optymalizacja warunków hodowli komórkowej stanowi istotną barierę wejścia do badań nad hodowlami komórkowymi w środowiskach mikroprzepływowych, ponieważ istnieje wąskie przecięcie, w którym parametry przepływu pożywki, czas trwania hodowli i inne warunki hodowli umożliwiają optymalne tworzenie warstwy komórkowej. Obejmuje to ograniczenia dyfuzji wynikające z nieprzepuszczalności tlenu w obudowie kanału hodowli mikroprzepływowej. Wymaga to starannego rozważenia parametrów przepływu mediów, ponieważ niskie natężenia przepływu mogą pozbawić komórki tlenu, zwłaszcza te najbardziej oddalone od wlotu; Z drugiej strony, wysokie prędkości przepływu mogą wypchnąć komórki z kanału hodowlanego lub spowodować nieprawidłowy lub nierównomierny rozwój warstw. Ograniczenia dyfuzji można rozwiązać, stosując materiały przepuszczalne dla tlenu, takie jak polidimetylosiloksan (PDMS) w aparacie do hodowli na granicy faz powietrze-ciecz (ALI); jednak wiele konwencjonalnych kanałów hodowli mikroprzepływowej, takich jak te z systemu wykrywania impedancji ogniwa elektrycznego i podłoża (ECIS), jest z natury nieprzepuszczalnych dla tlenu, biorąc pod uwagę charakter produkowanej obudowy10. Protokół ten ma na celu zapewnienie techniki analizy warstw komórkowych hodowanych w obudowie nieprzepuszczalnej dla tlenu.

Podczas porównywania żywotności warunków hodowli, obserwacje konkretnych cech warstwy, takich jak obecność monowarstwy, topologia powierzchni, konfluencja i jednorodność grubości warstwy, są niezbędne do określenia, czy warstwa komórkowa wytworzona przez określony zestaw warunków hodowli spełnia pożądane specyfikacje i jest rzeczywiście istotna dla projektu eksperymentalnego. Ograniczoną ocenę można przeprowadzić za pomocą metod takich jak ECIS, która wykorzystuje pomiary potencjału elektrycznego (napięcia) wytwarzanego przez rezystancję prądu przemiennego o wysokiej częstotliwości (AC) (impedancji) wywieranej przez elektrycznie izolujące membrany komórek hodowanych na złotych elektrodach w układzie przepływowym. Modulując częstotliwość prądu przemiennego przyłożonego do komórek, można celować i badać specyficzne, zależne od częstotliwości właściwości komórkowe komórek i warstw komórkowych, takie jak siła przylegania do powierzchni, tworzenie ścisłych połączeń oraz proliferacja lub konfluencja komórek11. Jednak te pośrednie formy pomiarów są nieco trudne do zinterpretowania na początku eksperymentu i mogą nie określać ilościowo wszystkich istotnych aspektów warstwy komórkowej. Zwykła obserwacja warstwy komórkowej pod mikroskopem z kontrastem fazowym może ujawnić naturę pewnych cech, takich jak zbieganie się; jednak wiele istotnych cech, takich jak obecność monowarstwy i jednorodność grubości warstwy, wymaga trójwymiarowej (3D) oceny, która nie jest możliwa w przypadku obrazowania w jasnym polu, kontraście fazowym lub mikroskopii fluorescencyjnej12.

Celem tego badania było opracowanie techniki barwienia aktyną nitkową, aby umożliwić weryfikację monowarstwy na podstawie obrazowania i ocenę jednorodności warstwy komórkowej za pomocą konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej (CLSM). Aktyna nitkowa (F-aktyna) została uznana za odpowiedni cel dla koniugatu fluoroforu, częściowo ze względu na sposób, w jaki F-aktyna ściśle podąża za błoną komórkową, co pozwala na wizualne przybliżenie całej objętości komórki13. Inną ważną korzyścią płynącą z celowania w F-aktynę jest sposób, w jaki barwienie F-aktyny wizualnie wyjaśnia zakłócenia cytoszkieletu lub zmiany narzucone przez stresy i napięcia doświadczane przez komórki. Sieciowanie za pomocą formaldehydu wolnego od metanolu zastosowano w celu zachowania morfologii komórek i warstwy komórkowej, ponieważ utrwalacze odwadniające, takie jak metanol, mają tendencję do spłaszczania komórek, rażąco zniekształcając warstwę komórkową i zmieniając jej właściwości14,15.

Aby określić zdolność techniki oceny warstw do złagodzenia tych wyzwań, komórki hodowano w tradycyjnych ośmiodołkowych komorach hodowlanych, jak również w kanałach mikroprzepływowych, aby ocenić różnice, jeśli takie istnieją, w warstwach komórek, które zostały wyprodukowane. W przypadku stałych studni hodowlanych zastosowano ośmiodołkowe komorowe jednostki ze szkła nakrywkowego. W przypadku hodowli mikroprzepływowej matryce przepływowe (długość kanału 50 mm, szerokość 5 mm, głębokość 0,6 mm) zostały zoptymalizowane pod kątem hodowli unieśmiertelnionych komórek ludzkiego nabłonka płuc (NCI-H441) w środowisku o wymiarach fizjologicznie istotnych dla końcowych oskrzelików obecnych w strefie oddechowej ludzkiego płuca16. Chociaż protokół ten został opracowany z myślą o środowisku hodowli w układach przepływowych ECIS, może on mieć zastosowanie do każdego nieprzepuszczalnego dla tlenu środowiska hodowli dynamicznej, dla którego konieczna jest ocena charakterystyki warstwy komórkowej hodowli lub warunków hodowli.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Linia komórek ludzkiego nabłonka płuc NCI-H441 została wykorzystana w niniejszym badaniu (patrz Tabela materiałów).

1. Hodowla komórkowa w kanale mikroprzepływowym

  1. Wykonaj kanał mikroprzepływowy i wykonaj obróbkę wstępną, wykonując poniższe czynności.
    1. Zaopatrz się w jednokanałowy układ przepływu (patrz Tabela materiałów) i oddziel górną część od płyty podstawy z poliwęglanu.
    2. Uzyskać prostokątne szkło nakrywkowe #1,5 (grubość 0,17 mm) o wymiarach 60 mm x 22 mm. Oczyść powierzchnie szkła nakrywkowego w kąpieli ultradźwiękowej i potraktuj jedną stronę roztworem 0,1 mg/ml poli-D-lizyny w temperaturze pokojowej przez 5 minut, a następnie wysusz w temperaturze 60 °C przez 30 minut.
    3. Przymocuj dwustronny klej o grubości 0,13 mm (patrz Tabela materiałów), wycięty laserowo tak, aby dopasować wymiary górnej części tablicy przepływowej i kanału przepływowego (50 mm długości, 5 mm szerokości), do górnej części tablicy przepływowej, zwracając uwagę na dokładne wyrównanie wycięć w kanale17.
    4. Przymocuj podkładkę dystansową z mylaru o grubości 0,1 mm (patrz Tabela materiałów), wyciętą laserowo w celu dopasowania do wymiarów górnej części matrycy przepływowej i kanału przepływowego, do paska samoprzylepnego, zwracając uwagę na dokładne wyrównanie wycięć w kanale.
    5. Powtarzaj kroki 1.1.3 i 1.1.4, aż do uzyskania żądanej wysokości kanału (na przykład dla wysokości kanału 0.6 mm użyj dwóch przekładek i trzech pasków samoprzylepnych).
    6. Przymocuj prostokątne szkło nakrywkowe do najniższego paska kleju, stroną pokrytą poli-D-lizyną skierowaną w stronę kleju. Po zakończeniu montażu, jak pokazano w Rysunek 1, przyłóż mocny i równy nacisk na górę i dół konstrukcji i przytrzymaj przez 1 min.
      UWAGA: Konstrukcja obudowy kanału, w tym szkła nakrywkowego, klejów, przekładek i górnej części układu przepływowego, została zakończona.
    7. Przepłucz kanał wodą dejonizowaną za pomocą strzykawki, jednocześnie sprawdzając, czy nie ma wycieków.
    8. Sterylizuj obudowę kanału w sterylizatorze ultrafioletowym (UV) przez 30 min18.
    9. Stosując sterylną technikę, potraktować kanał 2,0 μg/ml ludzkiej fibronektyny (patrz Tabela materiałów) w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i inkubować przez co najmniej 30 minut w temperaturze 37 °C19.
  2. Wykonaj hodowlę komórkową w kanale mikroprzepływowym, wykonując poniższe czynności.
    1. W sterylnym kapturze z przepływem laminarnym użyj mikropipety, aby przenieść równomierną zawiesinę komórek NCI-H441 w pożywce RPMI 1640 z 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) (patrz tabela materiałów) w celu wysiewu dwóch kanałów mikroprzepływowych, z których każdy zawiera komórki o gęstości powierzchniowej 150 000 komórek/cm2.
      1. W przypadku kanałów 50 mm x 5 mm x 0,6 mm użyj 0,25 ml zawiesiny 2,5 x 106 komórek/ml do wypełnienia każdego kanału, a także części portów. Sprawdź, czy komórki zostały równomiernie rozmieszczone w kanałach za pomocą mikroskopu jasnego pola.
    2. Hodowlę dwóch kanałów odpowiednio przez 24 godziny i 48 godzin w temperaturze 37 °C przy 5% CO2 za pomocą programowalnej pompy strzykawkowej (patrz tabela materiałów), pobierając zużyte pożywki z kanału i świeże pożywki do kanału ze sterylnego zbiornika pożywki podłączonego do wlotu kanału, składającego się z przeciętej strzykawki o pojemności 20 ml pokrytej folią parafinową.
      1. Po 10-minutowym okresie oczekiwania po wysianiu komórek, wprowadź i pompuj świeże podłoże ze zbiornika przez kanał ze zmiennym natężeniem przepływu, zaczynając od 0,2 μL/min i zwiększając do 10 μL/min przez 4 godziny, utrzymując następnie tę szybkość20.
        UWAGA: To zmienne natężenie przepływu zapewnia warunki hodowli, które pozwalają komórkom (1) grawitacyjnie osiadać na powierzchni hodowli, (2) przylegać do powierzchni hodowli i (3) tworzyć zlewającą się monowarstwę.
  3. Wykonać utrwalenie komórek w kanałach mikroprzepływowych za pomocą roztworu formaldehydu.
    UWAGA: Formaldehyd jest toksyczny i musi być przetwarzany w odpowiednim chemicznym dygestoriach class21.
    1. W dygestorium chemicznym przygotować roztwory formaldehydu, używając 4% formaldehydu w PBS (bez metanolu) (patrz tabela materiałów), aby utworzyć dwie porcje po 4 ml, rozcieńczając pierwszą do stężenia 1% formaldehydu, a drugą do 2% formaldehydu przy użyciu buforowanej fosforanem soli fizjologicznej Dulbecco (DPBS; z Ca2+ i Mg2+) jako rozcieńczalnik. Przenieść roztwory formaldehydu do oddzielnych strzykawek o pojemności 5 ml i odpowiednio oznaczyć. Pobrać 20 ml DPBS do oddzielnej strzykawki o pojemności 20 ml.
    2. Usunąć kanały mikroprzepływowe z aparatu hodowlanego i umieścić je w okapie oparów chemicznych.
    3. Zmontuj aparat do utrwalania i barwienia.
      1. Przymocuj 10-centymetrowy odcinek rurki przesyłowej do bocznego portu trójdrogowego zaworu odcinającego za pomocą męskiego zamka Luer do adaptera zadzioru węża (patrz Tabela materiałów), a następnie podłącz kran do portu wlotowego układu przepływowego.
      2. Następnie podłącz kolejny 10-centymetrowy odcinek rurki przesyłowej do portu wylotowego układu przepływowego za pomocą tego samego typu adaptera króćca węża.
      3. Na koniec zabezpiecz wolne końce obu probówek przesyłowych w pojemniku na odpady chemiczne i biologicznie odpowiednim do zagrożeń biologicznych, takim jak oznaczona pusta stożkowa probówka wirówkowa o pojemności 50 ml.
    4. Przekręć kurek, aby zablokować port wlotowy układu przepływowego i przepłukać przewód odpływowy za pomocą DPBS. Następnie przekręć kurek, aby zablokować linię odpływową i powoli umyj komórki 2 ml DPBS. Powtarzaj etap płukania przy użyciu nowego roztworu za każdym razem. Do kanału wprowadza się nowy roztwór (lub stężenie roztworu).
    5. Powoli przepchnij 2 ml 1% roztworu utrwalającego przez kanał, a następnie pozostaw na 5 minut22.
    6. Powoli przepchnąć 2 ml 2% roztworu utrwalającego przez kanał, a następnie odstawić na 15 minut.
    7. Umyj komórki, powoli wprowadzając 2 ml świeżego DPBS do kanału w trzech oddzielnych przypadkach (5 minut każda).
    8. Wykonaj kroki 1.3.3-1.3.7 dla obu kanałów mikroprzepływowych równolegle.
  4. Zabarwić, przeniknąć i dodać pożywkę montażową do komórek w kanale mikroprzepływowym.
    1. Przygotuj 0,1% roztwór saponin, dodając 1 mg saponiny (patrz Tabela Materiałów) na ml DPBS, aby uzyskać 4 ml roztworu i delikatnie zwirować, aby wymieszać23. Pobrać 8 ml DPBS do strzykawki o pojemności 20 ml.
    2. Dodać odczynnik falloidyny barwiący F-aktynę i odczynnik Hoechsta barwiący jądro (patrz Tabela materiałów) do 0,1% roztworu saponin, w dwóch kroplach (0,1 ml) każdego odczynnika na ml roztworu saponiny. Przygotowany roztwór barwiący/przepuszczalny należy trzymać z dala od światła, przykrywając folią aluminiową24.
    3. Przepłukać linię niewielką ilością roztworu barwiącego/przepuszczalnego (zgodnie z opisem w kroku 1.3.4), a następnie wprowadzić 2 ml roztworu do kanału mikroprzepływowego i przykryć kanał folią aluminiową przed pozostawieniem go w temperaturze pokojowej na 30 minut.
    4. Wypłucz roztwór barwiący/przepuszczalny dwukrotnie 2 ml DPBS przez 5 minut na spłukiwanie.
    5. Aby uzyskać lepszą jakość obrazu, dodaj do kanału odpowiedni nośnik mocujący (o współczynniku załamania światła ściśle pasującym do oleju do obiektywów mikroskopu i szkła osłonowego, patrz Tabela materiałów).
      1. Za pomocą mikropipety wprowadź minimalną ilość miękko osadzonego środka zapobiegającego blaknięciu do każdego portu kanału mikroprzepływowego, upewniając się, że dolna powierzchnia jest całkowicie pokryta i żadne pęcherzyki nie są uwięzione w pożądanym obszarze obrazowania25. Uszczelnij końce kanału i sprawdź integralność warstwy komórkowej, obserwując pod mikroskopem jasnego pola.
    6. Wykonaj kroki 1.4.3-1.4.5 dla obu kanałów mikroprzepływowych równolegle.
      UWAGA: Komórki obrazu należy przesyłać jak najszybciej po barwieniu, aby uzyskać maksymalną jakość obrazu. Jeśli dochodzi do fotowybielania lub pożądane jest długotrwałe przechowywanie, można użyć innych nośników montażowych o właściwościach zapobiegających blaknięciu lub konserwujących próbki. Należy pamiętać, że trudno utwardzalne media montażowe zniekształcą strukturę 3D komórek, a co za tym idzie, warstwę komórkową; Z tego powodu preferowane są miękkie nośniki montażowe26.
  5. Zobrazuj komórki w kanale mikroprzepływowym, wykonując poniższe czynności.
    1. Dostosuj ustawienia mikroskopu konfokalnego (patrz Tabela materiałów), w tym moc lasera, wzmocnienie, przesunięcie i parametry skanowania, takie jak prędkość skanowania, obszar skanowania, format skanowania, rozdzielczość i średnica otworka27.
    2. Przetestuj lokalizację obrazowania, wykonując skany referencyjne, a także stosy Z, aż zostaną spełnione żądane parametry i warunki obrazu. Wybieraj parametry dla obiektywów o sekwencyjnym większym powiększeniu, aż do osiągnięcia 40-krotnego zanurzenia w oleju i zoptymalizowania28.
    3. Używając płyty bazowej tablicy przepływowej jako odniesienia, skonstruuj stosy Z w pięciu miejscach, w niedoszłym położeniu pierwszej elektrody po stronie wlotowej, w połowie odległości między środkiem a poprzednim miejscem, w środku, w połowie drogi między środkiem a położeniem ostatniej elektrody (po stronie wylotowej) i w ostatniej elektrodzie, jak wskazano w Rysunek 2.
  6. Przetwarzanie obrazu i analiza danych.
    1. Eksport przekrojów XZ i YZ za pomocą pakietu oprogramowania mikroskopu konfokalnego (patrz tabela materiałów).
    2. Korzystając z oprogramowania do przetwarzania obrazu (patrz tabela materiałów) z funkcją wykrywania krawędzi (wartość progowa 15,0), zmierz całkowity obszar obrazu w pikselach za pomocą narzędzia Różdżka na zewnątrz obrazu, a następnie obszar z wyłączeniem całkowitego pola przekroju warstwy komórki w pikselach za pomocą narzędzia Magiczna różdżka w części obrazu na zewnątrz warstwy komórki29.
    3. Korzystając z oprogramowania do przetwarzania danych (patrz Tabela materiałów), odejmij wartość piksela obszaru zewnętrznego od wartości piksela całkowitej powierzchni, aby znaleźć wartość piksela pola przekroju poprzecznego.
    4. Przekształć wartości pikseli pola przekroju poprzecznego na wartości μm2, mnożąc wartości pikseli przez kwadrat wartości μm/piksel, jak wskazano w oprogramowaniu mikroskopu dla konkretnego obrazu (0,31 μm/piksel dla stosów Z wykonanych w rozdzielczości 1024p bez zoomu na 40-krotnym obiektywie olejowym).
    5. Obliczanie średnich i odchyleń standardowych danych oraz wyników wykresów.

figure-protocol-1
Rysunek 1: Schemat rozstrzelony konstrukcji kanału mikroprzepływowego. Górny element to górna część tablicy przepływowej, cienkie szare elementy to paski samoprzylepne, cienkie niebieskie elementy to przekładki mylarowe, a dolny element to prostokątne szkło nakrywkowe. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-protocol-2
Rysunek 2: Pięć miejsc obrazowania wzdłuż konsekwentnie wytwarzającego warstwę obszaru kanału hodowli mikroprzepływowej. Lokalizacje obrazowania są następujące: po stronie wlotu, w pobliżu miejsca, w którym pierwsza elektroda znajdowałaby się na nienaruszonym układzie przepływowym; w połowie drogi między lokalizacją po stronie wlotu a środkiem kanału; środek kanału; W połowie drogi między środkiem a lokalizacją po stronie wylotu i po stronie wylotu, w pobliżu miejsca, w którym ostatnia elektroda znajdowałaby się na nienaruszonym układzie przepływowym. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

2. Hodowla komórkowa w ośmiokomorowym szkle nakrywkowym

  1. Przeprowadzić wstępną obróbkę szkła nakrywkowego z ośmioma komorami.
    1. Uzyskaj sterylne szkło nakrywkowe z ośmioma komorami wykonane ze szkła nakrywkowego #1.5 i powierzchnią zwiększającą przyleganie komórek (Rysunek 3, patrz Tabela Materiałów).
    2. Stosując technikę sterylną, potraktuj powierzchnię studzienek hodowlanych 2,0 μg/ml ludzkiej fibronektyny w PBS i inkubuj przez co najmniej 30 minut w temperaturze 37 °C19.
  2. Wykonaj hodowlę komórkową w komorze nakrywkowej, wykonując poniższe czynności.
    1. W sterylnym okapie z przepływem laminarnym przenieś 0,5 ml porcji roztworów komórek NCI-H441 równomiernie zawieszonych w pożywce RPMI 1640 z 10% FBS przy gęstości objętościowej 81 000, 162 000 i 324 000 komórek/ml w celu wysiewu dołków hodowlanych o gęstości powierzchni odpowiednio 45 000, 90 000 i 180 000 komórek/cm2. Sprawdź, czy komórki zostały równomiernie rozmieszczone w studzienkach za pomocą mikroskopu jasnego pola.
    2. Komórki hodowlane przez 24 godziny, 48 godzin i 96 godzin w temperaturze 37 °C z 5% CO2 , codziennie wymieniając pożywki.
  3. Wykonać utrwalanie formaldehydu w ośmiokomorowym szkle nakrywkowym.
    UWAGA: Formaldehyd jest toksyczny i musi być przetwarzany w odpowiednim chemicznym dygestoriach class21.
    1. W dygestorium chemicznym przygotować roztwory formaldehydu, sporządzając dwie porcje 4% formaldehydu w PBS (bez metanolu), rozcieńczając pierwszą do stężenia 1% formaldehydu, a drugą do 2% formaldehydu, używając buforowanej fosforanem soli fizjologicznej Dulbecco (DPBS; z Ca2+ i Mg2+) jako rozcieńczalnika.
    2. Wyjąć z inkubatora szkło nakrywkowe z ośmiodołkową komorą hodowlaną i umieścić je w okapie oparów chemicznych.
    3. Delikatnie umyj komórki 0,5 ml DPBS za pomocą mikropipety, powoli wprowadzając płyn wzdłuż górnej części rogu każdej studzienki.
    4. Usuń istniejącą ciecz z każdej studzienki, powoli ekstrahując ją z rogu studzienek za pomocą mikropipety. Stosując metodę wprowadzania płynu (krok 2.3.3), wprowadzić 0,5 ml 1% roztworu utrwalającego do każdej studzienki i pozostawić na 5 minut22.
    5. Usunąć istniejącą ciecz z każdej studzienki przy użyciu metody ekstrakcji cieczą opisanej w kroku 2.3.4. Stosując metodę wprowadzania płynu, opisaną w kroku 2.3.3, wprowadzić 0,5 ml 2% roztworu utrwalającego do każdej studzienki i pozostawić na 15 minut.
    6. Stosując metody wprowadzania i ekstrakcji cieczy (kroki 2.3.3 i 2.3.4), umyj komórki, wprowadzając i usuwając 0,5 ml świeżego DPBS do każdej studzienki w trzech oddzielnych instancjach przez 5 minut każda.
  4. Wykonaj barwienie, przepuszczalność i dodawanie mediów montażowych w ośmiokomorowym szkle nakrywkowym.
    1. Przygotuj 0,1% roztwór saponin, dodając 1 mg saponiny na ml DPBS i delikatnie zwiruj, aby wymieszać23.
    2. Do 0,1% roztworu saponin dodać po dwie krople (0,1 ml) odczynnika falloidyny barwiącego F-aktynę i odczynnika Hoechsta barwiącego jądro na ml roztworu saponiny. Przygotowany roztwór należy trzymać z dala od światła, przykrywając folią aluminiową24.
    3. Wprowadzić 0,2 ml roztworu barwiącego/przepuszczalnego do każdej studzienki i przykryć szklaną pokrywę z komorą folią aluminiową, zanim pozostawisz ją w temperaturze pokojowej na 30 minut.
    4. Roztwór barwiący/przepuszczalny wypłukać dwukrotnie 0,5 ml DPBS.
    5. Aby uzyskać lepszą jakość obrazu, dodaj odpowiedni nośnik montażowy (o współczynniku załamania światła ściśle dopasowanym do oleju do obiektywu mikroskopu i szkła osłonowego) do studzienek.
      1. Za pomocą mikropipety wprowadź minimalną ilość miękko osadzonego środka zapobiegającego blaknięciu do każdej studzienki, upewniając się, że dolna powierzchnia jest całkowicie pokryta i żadne pęcherzyki nie są uwięzione w pożądanym obszarze obrazowania25. Sprawdź integralność warstwy komórkowej, obserwując pod mikroskopem w jasnym polu.
        UWAGA: Komórki obrazu należy przesyłać jak najszybciej po barwieniu, aby uzyskać maksymalną jakość obrazu. Jeśli dochodzi do fotowybielania lub pożądane jest długotrwałe przechowywanie, można użyć innych nośników montażowych o właściwościach zapobiegających blaknięciu lub konserwujących próbki. Należy pamiętać, że twardo utwardzalne nośniki montażowe zniekształcają strukturę 3D komórek, a co za tym idzie, warstwę komórek, dlatego preferowane są miękkie nośniki montażowe26.
  5. Wykonaj obrazowanie w ośmiodołkowym szkle nakrywkowym.
    1. Dostosuj ustawienia mikroskopu konfokalnego, w tym moc lasera, wzmocnienie, przesunięcie i parametry skanowania, takie jak prędkość skanowania, obszar skanowania, format skanowania, rozdzielczość i średnica otworu otworkowego27.
    2. Przetestuj lokalizację obrazowania, wykonując skany referencyjne, a także stosy Z, aż zostaną spełnione żądane parametry i warunki obrazu. Wybieraj parametry dla obiektywów o sekwencyjnym większym powiększeniu, aż do osiągnięcia 40-krotnego zanurzenia w oleju i zoptymalizowania28.
    3. Zbuduj stosy Z w trzech losowych lokalizacjach w każdym pojedynku gęstości zasiewu i czasu trwania kultury.
  6. Przetwarzanie obrazu i analiza danych.
    1. Eksport przekrojów XZ i YZ za pomocą pakietu oprogramowania mikroskopu konfokalnego.
    2. Korzystając z oprogramowania do przetwarzania obrazu z funkcją wykrywania krawędzi (wartość progowa 15,0), zmierz całkowity obszar obrazu w pikselach za pomocą narzędzia Różdżka na zewnątrz obrazu, a następnie obszar z wyłączeniem całkowitego pola przekroju poprzecznego warstwy komórki w pikselach za pomocą narzędzia Różdżka w części obrazu na zewnątrz warstwy komórki29.
    3. Korzystając z oprogramowania do przetwarzania danych, odejmij wartość piksela obszaru zewnętrznego od wartości piksela w obszarze całkowitym, aby znaleźć wartość piksela pola przekroju poprzecznego.
    4. Przekształć wartości pikseli pola przekroju poprzecznego na wartości μm2, mnożąc wartości pikseli przez kwadrat wartości μm/piksel, jak wskazano w oprogramowaniu mikroskopu dla konkretnego obrazu (0,31 μm/piksel dla stosów Z wykonanych w rozdzielczości 1024p bez zoomu na 40-krotnym obiektywie olejowym).
    5. Obliczanie średnich i odchyleń standardowych oraz wyników wykresów.

figure-protocol-3
Rysunek 3: Diagram ośmiodołkowego szkła nakrywkowego użytego do eksperymentu z hodowlą, barwieniem i obrazowaniem w stałej studni, porównujący wpływ początkowej gęstości wysiewu komórek i czasu trwania hodowli na tworzenie warstw komórkowych. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiona metoda pozwala na wizualizację warstw komórek nabłonkowych hodowanych w kanałach hodowli mikroprzepływowej i wykorzystuje demonstrację w tradycyjnych środowiskach hodowli komórkowych o stałej studni jako walidację. Uzyskane obrazy będą istniały w spektrum jakości, intensywności sygnału i specyficzności celu komórkowego. Udane obrazy będą charakteryzować się wysokim kontrastem, co pozwoli na analizę obrazu i kwantyfikację danych w celu późniejszej oceny statystycznej. Nieudane obrazy będą przyciemnione, rozm...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiony protokół opisuje hodowlę, utrwalanie sieciowania, barwienie, przenikanie i konfokalną wizualizację mikroskopową ludzkich komórek nabłonka płuc NCI-H441 w dynamicznym środowisku jednokanałowego mikroprzepływowego układu przepływowego, a także w środowisku statycznym tradycyjnego ośmiokomorowego szkła nakrywkowego. W przypadku każdego protokołu mikroprzepływowej hodowli komórkowej warunki przepływu pożywki do hodowli komórkowych mają ogromne znaczenie, ponieważ przepływ o dużej szybkości może zmyć komórki lub...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują Alanowi Shepardsonowi za zaprojektowanie wzoru cięcia dla kleju 3M i arkusza mylarowego używanego do budowy kanałów mikroprzepływowych oraz za testowanie szybkości przepływu pożywki do hodowli komórkowej i programowania pompy strzykawkowej. Finansowanie zostało zapewnione przez NIH R01 HL0142702, NSF CBET 1706801 oraz Newcomb-Tulane College Dean's Grant.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
System mikroskopu konfokalnego A1R HD25NikonA1R HD25https://www.microscope.healthcare.nikon.
com/produkty/mikroskopy-konfokalne/A1HD25-A1RHD25/specyfikacje
Odczynnik ActinGreen 488 ReadyProbes (AlexaFluor 488 phalloidyna)InvitrogenR37110https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/R37110
Taśma transferowa samoprzylepna podwójnie wyściółkowana3M468MPhttps://gizmodorks.com/3m-468mp-adhesive-transfer-tape-sheet-5-pack/
Air-Tite  Jednorazowe strzykawki HSW Soft-JectAir-Tite RL514-817-53https://www.fishersci.com/shop/products/air-tite-hsw-soft-ject-disposable-syringes-6/1481753#?keyword=syringe%20leur%20locking%205ml
BAISDY 4 mil (0,1 mm) gruby arkusz mylarowyBAISDYAS022https://www.amazon.ca/Stencil-Perfect-Silhouette-Machines-BAISDY/dp/B07RJJ9BNC
Branson Ultrasonics  Ultradźwiękowa kąpiel czyszcząca seriiM Branson Ultrasonics15-336-100https://www.fishersci.com/shop/products/m-series-ultrasonic-cleaning-bath/15336100
Corning  Fibronektyna, HumanFisher ScientificCB-40008https://www.fishersci.com/shop/products/corning-fibronectin-human-3/CB40008?keyword=true
DPBS, wapń, magnezGibco14040133https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14040133?SID=srch-srp-14040133
ECIS Cultureware Jednorazowe matryce elektrod 8 x 10 ECIS Flow ArrayBioFizyka stosowana1F8x10E PChttps://www.biophysics.com/cultureware.php#1F8x10E
Enterprise Technology Solutions Szafka na sterylizator UV, białaEnterprise Technology Solutions50-211-1163
https://www.fishersci.com/shop/products/uv-sterilizer-cabinet-white/502111163 Płodowa surowica bydlęca (FBS)Gibco26140079https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/26140079
Finnpipette F2 o zmiennej objętości PipetyThermo Scientific4642090https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/4642090
Fisherbrand 50mL Easy Reader Plastikowe probówki wirówkoweFisher Scientific06-443-21https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-higher-speed-easy-reader-plastic-centrifuge-tubes-8/p-193269
Fisherbrand  Okulary nakrywkowe: prostokąty (#1.5)Fisher Scientific12-544-GPhttps://www.fishersci.com/shop/products/cover-glasses-rectangles-promo-22/12544GP#coverglass
Fisherbrand  Sterylne strzykawki jednorazowego użytkuFisher Scientific14-955-458https://www.fishersci.com/shop/products/sterile-syringes-single-use-12/14955458
Gibco RPMI 1640 MediumGibco11875093https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/11875093
Image-iT Utrwalacz Roztwór (4% formaldehydu, bez metanolu)InvitrogenFB002https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/FB002
ImageJ FidżiImageJ ImageJFidżihttps://imagej.net/downloads
Olejek immersyjny F 30 ccNikonMXA22168https://www.microscope.healthcare.nikon.
com/produkty/akcesoria/olejek-immersyjny/specyfikacje
Duży zasięg CO2  Inkubator, 821 l, polerowana stal nierdzewnaThermo Scientific3950https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/3950
Laxco LMC-3000 Series Brightfield Compound Microscope SystemLaxcoLMC3BF1https://www.fishersci.com/shop/products/lmc-3000-series-brightfield-compound-microscope-system-8/LMC3BF1
Złączka Masterflex, nylonowa, prosta, męska Luer Lock do adaptera kolczastego węża, 1/16" ID; 25/PKMasterflexZY-45505-31https://www.masterflex.com/i/masterflex-fitting-nylon-straight-male-luer-lock-to-hose-barb-adapters-1-16-id-25-pk/4550531?PubID=ZY&persist=true&ip=no&
gclid=Cj0KCQiA3rKQBhCNARIsAC
UEW_Zb5yXy1em6bGs0a9KFOk5k
pdlkHCvAEslHumdqcnlwSN0MdR0
udmwaAuDHEALw_wcB
Microsoft ExcelMicrosoft0016https://www.microsoft.com/en-us/download/details.aspx?id=56547
Jednorazowe strzykawki zThermo Scientific03-377-24https://www.fishersci.com/shop/products/national-target-all-plastic-disposable-syringes/0337724#tab8
NCI-H441 Ludzkie nabłonkowe komórki płucKolekcja kultur typu amerykańskiego (ATCC)HTB-174https://www.atcc.org/products/htb-174
NE-1600 Sześciokanałowa programowalna pompa strzykawkowaNew Era Systemy pompNE-1600https://www.syringepump.com/NE-16001800.php
NIS Elements ARNikonNIS Elements ARhttps://www.microscope.healthcare.nikon.
com/products/software/nis-elements/nis-elements-advanced-research
Odczynnik NucBlue Live ReadyProbes (Hoechst 33342)InvitrogenR37605https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/R37605?SID=srch-srp-R37605
Nunc Lab-tek Komorowa szklana osłonaThermo Scientific155411https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/155361
Parafilm M Folia do owijaniaFisher ScientificS37441https://www.fishersci.com/shop/products/parafilm-m-wrapping-film-3/S37441
Zawór blokujący PendoTech 3-kierunkowy, polisulfon, męski/ Żeński wlot Luer x żeński Luer BranchPendoTechZY-19406-49https://www.masterflex.com/i/pendotech-3-way-stopcock-polysulfone-male-female-luer-inlet-x-female-luer-branch/1940649
Roztwór buforowany fosforanem (PBS), pH 7,4Gibco10010023https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10010023
Poli-D-LizynaGibcoA3890401https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A3890401#/A3890401
Reynolds Folia aluminiowaReynolds458742928317https://www.amazon.com/Reynolds-Wrap-Aluminum-Foil-Square/dp/B00UNT0Y2M
SaponinMillipore Sigma (Sigma Aldrich)47036https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/47036
Szkło SlowFade Soft-set Anti-fade MountantInvitrogenS36917-5X2MLhttps://www.thermofisher.com/order/catalog/product/S36917-5X2ML
Thermo Scientific 1300 Series klasa II, pakiet szafy bezpieczeństwa biologicznego typu A2Thermo Scientific13-100-752PMhttps://www.fishersci.com/shop/products/1300-series-class-ii-type-a2-biological-safety-cabinet-package-promo/p-9049003#?keyword=biosafety%20hood
Rurka transferowa Tygon, silikon utwardzany platyną BioPharm, 1/16" ID x 1/8" OD; 50 stópCole-ParmerEW-95702-01https://www.coleparmer.com/i/tygon-transfer-tubing-biopharm-platinum-cured-silicone-1-16-id-x-1-8-od-50-ft/9570201?searchterm=95702-01
tworzywa sztucznego National Target

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Matthay, M. A., et al. Acute respiratory distress syndrome. Nature Reviews Disease Primers. 5, 18(2019).
  2. Rawal, G., Yadav, S., Kumar, R. Acute respiratory distress syndrome: An update and Review. Journal of Translational Internal Medicine. 6 (2), 74-77 (2018).
  3. Bilek, A. M., Dee, K. C., Gaver, D. P. Mechanisms of surface-tension-induced epithelial cell damage in a model of pulmonary airway reopening. Journal of Applied Physiology. 94 (2), 770-783 (2003).
  4. Modrykamien, A. M., Gupta, P. The acute respiratory distress syndrome. Baylor University Medical Center Proceedings. 28 (2), 163-171 (2017).
  5. Jacob, A. -M., Gaver, D. P. Atelectrauma disrupts pulmonary epithelial barrier integrity and alters the distribution of tight junction proteins ZO-1 and Claudin 4. Journal of Applied Physiology. 113 (9), 1377-1387 (2012).
  6. Kay, S. S., Bilek, A. M., Dee, K. C., Gaver, D. P. Pressure gradient, not exposure duration, determines the extent of epithelial cell damage in a model of pulmonary airway reopening. Journal of Applied Physiology. 97 (1), 269-276 (2004).
  7. Jacob, A. M., Gaver, D. P. An investigation of the influence of cell topography on epithelial mechanical stresses during pulmonary airway reopening. Physics of Fluids. 17 (3), 031502(1994).
  8. Gaver, D. P., et al. The POOR get POORer: A hypothesis for the pathogenesis of ventilator-induced lung injury. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 202 (8), 1081-1087 (2020).
  9. Jain, P., et al. Reconstruction of ultra-thin alveolar-capillary basement membrane mimics. Advanced Biology. 5 (8), 2000427(2021).
  10. Byrne, M. B., Leslie, M. T., Gaskins, H. R., Kenis, P. J. A. Methods to study the tumor microenvironment under controlled oxygen conditions. Trends in Biotechnology. 32 (11), 556-563 (2014).
  11. Szulcek, R., Bogaard, H. J., van Nieuw Amerongen, G. P. Electric cell-substrate impedance sensing for the quantification of endothelial proliferation, barrier function, and motility. Journal of Visualized Experiments. (85), e51300(2014).
  12. Jaccard, N., et al. Automated method for the rapid and precise estimation of adherent cell culture characteristics from phase contrast microscopy images. Biotechnology and Bioengineering. 111 (3), 504-517 (2013).
  13. Hagiyama, M., et al. Modest static pressure suppresses columnar epithelial cell growth in association with cell shape and cytoskeletal modifications. Frontiers in Physiology. 8, 00997(2017).
  14. Srinivasan, M., Sedmak, D., Jewell, S. Effect of fixatives and tissue processing on the content and integrity of Nucleic Acids. The American Journal of Pathology. 161 (6), 1961-1971 (2002).
  15. Zhu, L., Rajendram, M., Huang, K. C. Effects of fixation on bacterial cellular dimensions and integrity. Iscience. 24 (4), 102348(2021).
  16. Lust, R. M. The Pulmonary System. XPharm: The Comprehensive Pharmacology Reference. , Elsevier. 1-6 (2007).
  17. EpilogueLaser. FusionSeries: Pro & Edge Laser System Manual and Original Instructions. EpilogueLaser. , Golden, CO: Author. (2022).
  18. Chitnis, D. S., Katara, G., Hemvani, N., Chitnis, S., Chitnis, V. Surface disinfection by exposure to germicidal UV light. Indian Journal of Medical Microbiology. 26 (3), 241(2008).
  19. Sandell, L., Sakai, D. Mammalian cell culture. Current Protocols Essential Laboratory Techniques. 5 (1), 4(2011).
  20. New Era Pump Systems. Multi-Phaser Programmable Syringe Pump: NE-1000 Series User Manual. New Era Pump Systems. , Farmingdale, NY. (2014).
  21. Thermo Fisher Scientific. Safety Data Sheet: Image-iT Fixative Solution (4% formaldehyde, methanol-free). Thermo Fisher Scientific. , Waltham, MA. (2018).
  22. Thavarajah, R., Mudimbaimannar, V. K., Rao, U. K., Ranganathan, K., Elizabeth, J. Chemical and physical basics of routine formaldehyde fixation. Journal of Oral and Maxillofacial Pathology. 16 (3), 400-405 (2012).
  23. Jamur, M. C., Oliver, C. Permeabilization of cell membranes. Immunocytochemical Methods and Protocols. 588, 63-66 (2009).
  24. Thermo Fisher Scientific. ActinGreen 488 ReadyProbes Reagent Protocol. Thermo Fisher Scientific. , Walther, MA. (2022).
  25. Slowfade Glass soft-set Antifade Mountant. Thermo Fisher Scientific. , Available from: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/S36917-5X2ML?SID=srch-hj-S36917-5X2ML (2022).
  26. Ravikumar, S., Surekha, R., Thavarajah, R. Mounting media: An overview. Journal of Dr. NTR University of Health Sciences. 3 (5), 1-8 (2014).
  27. Shihan, M. H., Novo, S. G., Le Marchand, S. J., Wang, Y., Duncan, M. K. A simple method for quantitating confocal fluorescent images. Biochemistry and Biophysics Reports. 25, 100916(2021).
  28. North, A. J. Seeing is believing? A beginners' guide to practical pitfalls in image acquisition. Journal of Cell Biology. 172 (1), 9-18 (2006).
  29. Ferriera, F., Rasband, W. ImageJ User Guide. National Institutes of Health. , Bethesda, MD. (2012).
  30. Halldorsson, S., Lucumi, E., Gómez-Sjöberg, R., Fleming, R. M. T. Advantages and challenges of microfluidic cell culture in polydimethylsiloxane devices. Biosensors and Bioelectronics. 63, 218-231 (2015).
  31. Smith, H. S., Riggs, J. L., Mosesson, M. W. Production of fibronectin by human epithelial cells in culture. American Association for Cancer Research. 39 (10), 4138-4144 (1979).
  32. Sieck, G. C., Mantilla, C. B., Prakash, Y. S. Volume measurements in confocal microscopy. Methods in Enzymology. 307, Academic Press. 296-315 (1999).
  33. Heijink, I. H., et al. Characterisation of cell adhesion in airway epithelial cell types using electric cell-substrate impedance sensing. European Respiratory Journal. 35 (4), 894-903 (2009).
  34. Zhang, X., Wang, W., Li, F., Voiculescu, I. Stretchable impedance sensor for mammalian cell proliferation measurements. Lab on a Chip. 17 (12), 2054-2066 (2017).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Epithelial Cell MonolayerMicrofluidic Culture DeviceHuman Lung EpithelialConfocal MicroscopyPhalloidin StainingCell Layer EvaluationMicrofluidic Channel ConstructionCell Culture ConditionsActin Cytoskeleton ImagingTransepithelial Electrical Resistance

Related Articles