Method Article

Przygotowanie i ocena strukturalna monowarstw komórek nabłonka w fizjologicznie dobranym urządzeniu do hodowli mikroprzepływowej

DOI:

10.3791/64148

⸱

July 1st, 2022

 ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, School of Science and Engineering, Tulane University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prezentowany protokół opisuje rozwój i wykorzystanie techniki barwienia aktyną na bazie falloidyny z konfokalną laserową mikroskopią skaningową (CLSM) do wizualizacji przylegającej struktury warstwy komórkowej w mikroprzepływowych kanałach hodowli dynamicznej i tradycyjnych komorach do hodowli statycznej ze stałą studnią. Takie podejście pomaga w ocenie zbiegu warstw komórkowych, tworzenia monowarstw i jednorodności grubości warstwy.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eksperymenty mikroprzepływowe in vitro mają ogromny potencjał, aby ujawnić wiele wglądów w zjawiska mikrofizjologiczne występujące w stanach takich jak zespół ostrej niewydolności oddechowej (ARDS) i uszkodzenie płuc wywołane respiratorem (VILI). Jednak badania nad kanałami mikroprzepływowymi o wymiarach fizjologicznie istotnych dla końcowych oskrzelików ludzkiego płuca stoją obecnie przed kilkoma wyzwaniami, zwłaszcza ze względu na trudności w ustaleniu odpowiednich warunków hodowli komórkowej, w tym szybkości przepływu pożywki, w danym środowisku hodowli. Prezentowany protokół opisuje obrazowe podejście do oceny struktury ludzkich komórek nabłonka płuc NCI-H441 hodowanych w nieprzepuszczalnym dla tlenu kanale mikroprzepływowym o wymiarach fizjologicznie istotnych dla końcowych oskrzelików ludzkiego płuca. Za pomocą barwienia aktyną nitkową na bazie falloidyny, struktury cytoszkieletu komórek są ujawniane za pomocą konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej, co pozwala na wizualizację zarówno pojedynczych, jak i warstwowych komórek. Dalsza kwantyfikacja określa, czy stosowane warunki hodowli komórkowej wytwarzają jednolite monowarstwy nadające się do dalszych eksperymentów. Protokół opisuje metody hodowli komórkowej i oceny warstw w kanałach mikroprzepływowych i tradycyjnych środowiskach ze stałą studzienką. Obejmuje to budowę kanałów, hodowlę komórkową i wymagane warunki, utrwalanie, przepuszczalność i barwienie, konfokalne obrazowanie mikroskopowe, przetwarzanie obrazu i analizę danych.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zespół ostrej niewydolności oddechowej (ARDS) to ostry stan wynikający z uszkodzenia i rozprzestrzeniania się uszkodzenia miąższu płuc, skutkujący obrzękiem płuc pęcherzyków płucnych, niedostateczną wymianą gazową i późniejszą hipoksemią1. To inicjuje cykl uwalniania cytokin prozapalnych, rekrutacji neutrofili, uwalniania toksycznych mediatorów i uszkodzenia tkanek, co z kolei wywołuje dalszą reakcję zapalną2. Dodatkowo, płucny środek powierzchniowo czynny, który stabilizuje drogi oddechowe i zapobiega uszkodzeniom spowodowanym powtarzającą się rekrutacją/derekrutacją (R/D), może zostać dezaktywowany lub w inny sposób dy....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Linia komórek ludzkiego nabłonka płuc NCI-H441 została wykorzystana w niniejszym badaniu (patrz Tabela materiałów).

1. Hodowla komórkowa w kanale mikroprzepływowym

  1. Wykonaj kanał mikroprzepływowy i wykonaj obróbkę wstępną, wykonując poniższe czynności.
    1. Zaopatrz się w jednokanałowy układ przepływu (patrz Tabela materiałów) i oddziel górną część od płyty podstawy z poliwęglanu.
    2. Uzyskać prostokątne szkło nakrywkowe #1,5 (grubość 0,17 mm) o wymiarach 60 mm x 22 mm. Oczyść powierzchnie szkła nakrywkowego w kąpieli ultradźwiękowej i potraktuj jedną stronę roztwor....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiona metoda pozwala na wizualizację warstw komórek nabłonkowych hodowanych w kanałach hodowli mikroprzepływowej i wykorzystuje demonstrację w tradycyjnych środowiskach hodowli komórkowych o stałej studni jako walidację. Uzyskane obrazy będą istniały w spektrum jakości, intensywności sygnału i specyficzności celu komórkowego. Udane obrazy będą charakteryzować się wysokim kontrastem, co pozwoli na analizę obrazu i kwantyfikację danych w celu późniejszej oceny statystycznej. Nieudane obrazy będą przyciemnione, rozm.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiony protokół opisuje hodowlę, utrwalanie sieciowania, barwienie, przenikanie i konfokalną wizualizację mikroskopową ludzkich komórek nabłonka płuc NCI-H441 w dynamicznym środowisku jednokanałowego mikroprzepływowego układu przepływowego, a także w środowisku statycznym tradycyjnego ośmiokomorowego szkła nakrywkowego. W przypadku każdego protokołu mikroprzepływowej hodowli komórkowej warunki przepływu pożywki do hodowli komórkowych mają ogromne znaczenie, ponieważ przepływ o dużej szybkości może zmyć komórki lub.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują Alanowi Shepardsonowi za zaprojektowanie wzoru cięcia dla kleju 3M i arkusza mylarowego używanego do budowy kanałów mikroprzepływowych oraz za testowanie szybkości przepływu pożywki do hodowli komórkowej i programowania pompy strzykawkowej. Finansowanie zostało zapewnione przez NIH R01 HL0142702, NSF CBET 1706801 oraz Newcomb-Tulane College Dean's Grant.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
System mikroskopu konfokalnego A1R HD25NikonA1R HD25https://www.microscope.healthcare.nikon.
com/produkty/mikroskopy-konfokalne/A1HD25-A1RHD25/specyfikacje
Odczynnik ActinGreen 488 ReadyProbes (AlexaFluor 488 phalloidyna)InvitrogenR37110https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/R37110
Taśma transferowa samoprzylepna podwójnie wyściółkowana3M468MPhttps://gizmodorks.com/3m-468mp-adhesive-transfer-tape-sheet-5-pack/
Air-Tite  Jednorazowe strzykawki HSW Soft-JectAir-Tite RL514-817-53https://www.fishersci.com/shop/products/air-tite-hsw-soft-ject-disposable-syringes-6/1481753#?keyword=syringe%20leur%20locking%205ml
BAISDY 4 mil (0,1 mm) gruby arkusz mylarowyBAISDYAS022https://www.amazon.ca/Stencil-Perfect-Silhouette-Machines-BAISDY/dp/B07RJJ9BNC
Branson Ultrasonics  Ultradźwiękowa kąpiel czyszcząca seriiM Branson Ultrasonics15-336-100https://www.fishersci.com/shop/products/m-series-ultrasonic-cleaning-bath/15336100
Corning  Fibronektyna, HumanFisher ScientificCB-40008https://www.fishersci.com/shop/products/corning-fibronectin-human-3/CB40008?keyword=true
DPBS, wapń, magnezGibco14040133https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14040133?SID=srch-srp-14040133
ECIS Cultureware Jednorazowe matryce elektrod 8 x 10 ECIS Flow ArrayBioFizyka stosowana1F8x10E PChttps://www.biophysics.com/cultureware.php#1F8x10E
Enterprise Technology Solutions Szafka na sterylizator UV, białaEnterprise Technology Solutions50-211-1163
https://www.fishersci.com/shop/products/uv-sterilizer-cabinet-white/502111163 Płodowa surowica bydlęca (FBS)Gibco26140079https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/26140079
Finnpipette F2 o zmiennej objętości PipetyThermo Scientific4642090https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/4642090
Fisherbrand 50mL Easy Reader Plastikowe probówki wirówkoweFisher Scientific06-443-21https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-higher-speed-easy-reader-plastic-centrifuge-tubes-8/p-193269
Fisherbrand  Okulary nakrywkowe: prostokąty (#1.5)Fisher Scientific12-544-GPhttps://www.fishersci.com/shop/products/cover-glasses-rectangles-promo-22/12544GP#coverglass
Fisherbrand  Sterylne strzykawki jednorazowego użytkuFisher Scientific14-955-458https://www.fishersci.com/shop/products/sterile-syringes-single-use-12/14955458
Gibco RPMI 1640 MediumGibco11875093https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/11875093
Image-iT Utrwalacz Roztwór (4% formaldehydu, bez metanolu)InvitrogenFB002https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/FB002
ImageJ FidżiImageJ ImageJFidżihttps://imagej.net/downloads
Olejek immersyjny F 30 ccNikonMXA22168https://www.microscope.healthcare.nikon.
com/produkty/akcesoria/olejek-immersyjny/specyfikacje
Duży zasięg CO2  Inkubator, 821 l, polerowana stal nierdzewnaThermo Scientific3950https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/3950
Laxco LMC-3000 Series Brightfield Compound Microscope SystemLaxcoLMC3BF1https://www.fishersci.com/shop/products/lmc-3000-series-brightfield-compound-microscope-system-8/LMC3BF1
Złączka Masterflex, nylonowa, prosta, męska Luer Lock do adaptera kolczastego węża, 1/16" ID; 25/PKMasterflexZY-45505-31https://www.masterflex.com/i/masterflex-fitting-nylon-straight-male-luer-lock-to-hose-barb-adapters-1-16-id-25-pk/4550531?PubID=ZY&persist=true&ip=no&
gclid=Cj0KCQiA3rKQBhCNARIsAC
UEW_Zb5yXy1em6bGs0a9KFOk5k
pdlkHCvAEslHumdqcnlwSN0MdR0
udmwaAuDHEALw_wcB
Microsoft ExcelMicrosoft0016https://www.microsoft.com/en-us/download/details.aspx?id=56547
Jednorazowe strzykawki zThermo Scientific03-377-24https://www.fishersci.com/shop/products/national-target-all-plastic-disposable-syringes/0337724#tab8
NCI-H441 Ludzkie nabłonkowe komórki płucKolekcja kultur typu amerykańskiego (ATCC)HTB-174https://www.atcc.org/products/htb-174
NE-1600 Sześciokanałowa programowalna pompa strzykawkowaNew Era Systemy pompNE-1600https://www.syringepump.com/NE-16001800.php
NIS Elements ARNikonNIS Elements ARhttps://www.microscope.healthcare.nikon.
com/products/software/nis-elements/nis-elements-advanced-research
Odczynnik NucBlue Live ReadyProbes (Hoechst 33342)InvitrogenR37605https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/R37605?SID=srch-srp-R37605
Nunc Lab-tek Komorowa szklana osłonaThermo Scientific155411https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/155361
Parafilm M Folia do owijaniaFisher ScientificS37441https://www.fishersci.com/shop/products/parafilm-m-wrapping-film-3/S37441
Zawór blokujący PendoTech 3-kierunkowy, polisulfon, męski/ Żeński wlot Luer x żeński Luer BranchPendoTechZY-19406-49https://www.masterflex.com/i/pendotech-3-way-stopcock-polysulfone-male-female-luer-inlet-x-female-luer-branch/1940649
Roztwór buforowany fosforanem (PBS), pH 7,4Gibco10010023https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10010023
Poli-D-LizynaGibcoA3890401https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A3890401#/A3890401
Reynolds Folia aluminiowaReynolds458742928317https://www.amazon.com/Reynolds-Wrap-Aluminum-Foil-Square/dp/B00UNT0Y2M
SaponinMillipore Sigma (Sigma Aldrich)47036https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/47036
Szkło SlowFade Soft-set Anti-fade MountantInvitrogenS36917-5X2MLhttps://www.thermofisher.com/order/catalog/product/S36917-5X2ML
Thermo Scientific 1300 Series klasa II, pakiet szafy bezpieczeństwa biologicznego typu A2Thermo Scientific13-100-752PMhttps://www.fishersci.com/shop/products/1300-series-class-ii-type-a2-biological-safety-cabinet-package-promo/p-9049003#?keyword=biosafety%20hood
Rurka transferowa Tygon, silikon utwardzany platyną BioPharm, 1/16" ID x 1/8" OD; 50 stópCole-ParmerEW-95702-01https://www.coleparmer.com/i/tygon-transfer-tubing-biopharm-platinum-cured-silicone-1-16-id-x-1-8-od-50-ft/9570201?searchterm=95702-01
tworzywa sztucznego National Target

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Matthay, M. A., et al. Acute respiratory distress syndrome. Nature Reviews Disease Primers. 5, 18(2019).
  2. Rawal, G., Yadav, S., Kumar, R. Acute respiratory distress syndrome: An update and Review. Journal of Translational Internal Medicine. 6

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Epithelial Cell MonolayerMicrofluidic Culture DeviceHuman Lung EpithelialConfocal MicroscopyPhalloidin StainingCell Layer EvaluationMicrofluidic Channel ConstructionCell Culture ConditionsActin Cytoskeleton ImagingTransepithelial Electrical Resistance

Related Articles