Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Przygotowanie i ocena strukturalna monowarstw komórek nabłonka w fizjologicznie dobranym urządzeniu do hodowli mikroprzepływowej

1.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64148

⸱

1 lipca 2022

 ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, School of Science and Engineering, Tulane University

W tym artykule

Podsumowanie

Prezentowany protokół opisuje rozwój i wykorzystanie techniki barwienia aktyną na bazie falloidyny z konfokalną laserową mikroskopią skaningową (CLSM) do wizualizacji przylegającej struktury warstwy komórkowej w mikroprzepływowych kanałach hodowli dynamicznej i tradycyjnych komorach do hodowli statycznej ze stałą studnią. Takie podejście pomaga w ocenie zbiegu warstw komórkowych, tworzenia monowarstw i jednorodności grubości warstwy.

Streszczenie

Eksperymenty mikroprzepływowe in vitro mają ogromny potencjał, aby ujawnić wiele wglądów w zjawiska mikrofizjologiczne występujące w stanach takich jak zespół ostrej niewydolności oddechowej (ARDS) i uszkodzenie płuc wywołane respiratorem (VILI). Jednak badania nad kanałami mikroprzepływowymi o wymiarach fizjologicznie istotnych dla końcowych oskrzelików ludzkiego płuca stoją obecnie przed kilkoma wyzwaniami, zwłaszcza ze względu na trudności w ustaleniu odpowiednich warunków hodowli komórkowej, w tym szybkości przepływu pożywki, w danym środowisku hodowli. Prezentowany protokół opisuje obrazowe podejście do oceny struktury ludzkich komórek nabłonka płuc NCI-H441 hodowanych w nieprzepuszczalnym dla tlenu kanale mikroprzepływowym o wymiarach fizjologicznie istotnych dla końcowych oskrzelików ludzkiego płuca. Za pomocą barwienia aktyną nitkową na bazie falloidyny, struktury cytoszkieletu komórek są ujawniane za pomocą konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej, co pozwala na wizualizację zarówno pojedynczych, jak i warstwowych komórek. Dalsza kwantyfikacja określa, czy stosowane warunki hodowli komórkowej wytwarzają jednolite monowarstwy nadające się do dalszych eksperymentów. Protokół opisuje metody hodowli komórkowej i oceny warstw w kanałach mikroprzepływowych i tradycyjnych środowiskach ze stałą studzienką. Obejmuje to budowę kanałów, hodowlę komórkową i wymagane warunki, utrwalanie, przepuszczalność i barwienie, konfokalne obrazowanie mikroskopowe, przetwarzanie obrazu i analizę danych.

Wprowadzenie

Zespół ostrej niewydolności oddechowej (ARDS) to ostry stan wynikający z uszkodzenia i rozprzestrzeniania się uszkodzenia miąższu płuc, skutkujący obrzękiem płuc pęcherzyków płucnych, niedostateczną wymianą gazową i późniejszą hipoksemią1. To inicjuje cykl uwalniania cytokin prozapalnych, rekrutacji neutrofili, uwalniania toksycznych mediatorów i uszkodzenia tkanek, co z kolei wywołuje dalszą reakcję zapalną2. Dodatkowo, płucny środek powierzchniowo czynny, który stabilizuje drogi oddechowe i zapobiega uszkodzeniom spowodowanym powtarzającą się rekrutacją/derekrutacją (R/D), może zostać dezaktywowany lub w inny sposób dysfunkcyjny przez procesy chemiczne zachodzące podczas ARDS, powodując dalszy stres i uszkodzenie otaczającego miąższu3. Jeśli dojdzie do wystarczającego uszkodzenia, może być konieczna wentylacja mechaniczna, aby zapewnić odpowiednie natlenienie ogólnoustrojowe4. Jednak wentylacja mechaniczna wiąże się z własnymi wyzwaniami i urazami, w tym możliwością uszkodzenia płuc wywołanego respiratorem (VILI), charakteryzującego się uszkodzeniem miąższu płuc spowodowanym naprężeniami mechanicznymi wywieranymi podczas nadmiernego napompowania (volutrauma) i/lub R/D granicy faz powietrze-ciecz w drożach oddechowych zamkniętych płynem (atelectrauma)5. Gradient ciśnienia doświadczany przez komórki nabłonkowe wystawione na działanie granicy faz powietrze-ciecz (jak w oskrzeliku zamkniętym płynem) w modelu atelektraumy może powodować reakcję obturacyjną wynikającą z przepuszczalności (POOR), prowadząc do pozytywnego cyklu urazów POOR-get-POORer6,7,8.

Eksperymenty in vitro mogą dostarczyć wglądu w te zjawiska w mikroskali, ale obecne badania w środowiskach kanałów mikroprzepływowych o fizjologicznie istotnych wymiarach napotykają na kilka wyzwań9. Po pierwsze, optymalizacja warunków hodowli komórkowej stanowi istotną barierę wejścia do badań nad hodowlami komórkowymi w środowiskach mikroprzepływowych, ponieważ istnieje wąskie przecięcie, w którym parametry przepływu pożywki, czas trwania hodowli i inne warunki hodowli umożliwiają optymalne tworzenie warstwy komórkowej. Obejmuje to ograniczenia dyfuzji wynikające z nieprzepuszczalności tlenu w obudowie kanału hodowli mikroprzepływowej. Wymaga to starannego rozważenia parametrów przepływu mediów, ponieważ niskie natężenia przepływu mogą pozbawić komórki tlenu, zwłaszcza te najbardziej oddalone od wlotu; Z drugiej strony, wysokie prędkości przepływu mogą wypchnąć komórki z kanału hodowlanego lub spowodować nieprawidłowy lub nierównomierny rozwój warstw. Ograniczenia dyfuzji można rozwiązać, stosując materiały przepuszczalne dla tlenu, takie jak polidimetylosiloksan (PDMS) w aparacie do hodowli na granicy faz powietrze-ciecz (ALI); jednak wiele konwencjonalnych kanałów hodowli mikroprzepływowej, takich jak te z systemu wykrywania impedancji ogniwa elektrycznego i podłoża (ECIS), jest z natury nieprzepuszczalnych dla tlenu, biorąc pod uwagę charakter produkowanej obudowy10. Protokół ten ma na celu zapewnienie techniki analizy warstw komórkowych hodowanych w obudowie nieprzepuszczalnej dla tlenu.

Podczas porównywania żywotności warunków hodowli, obserwacje konkretnych cech warstwy, takich jak obecność monowarstwy, topologia powierzchni, konfluencja i jednorodność grubości warstwy, są niezbędne do określenia, czy warstwa komórkowa wytworzona przez określony zestaw warunków hodowli spełnia pożądane specyfikacje i jest rzeczywiście istotna dla projektu eksperymentalnego. Ograniczoną ocenę można przeprowadzić za pomocą metod takich jak ECIS, która wykorzystuje pomiary potencjału elektrycznego (napięcia) wytwarzanego przez rezystancję prądu przemiennego o wysokiej częstotliwości (AC) (impedancji) wywieranej przez elektrycznie izolujące membrany komórek hodowanych na złotych elektrodach w układzie przepływowym. Modulując częstotliwość prądu przemiennego przyłożonego do komórek, można celować i badać specyficzne, zależne od częstotliwości właściwości komórkowe komórek i warstw komórkowych, takie jak siła przylegania do powierzchni, tworzenie ścisłych połączeń oraz proliferacja lub konfluencja komórek11. Jednak te pośrednie formy pomiarów są nieco trudne do zinterpretowania na początku eksperymentu i mogą nie określać ilościowo wszystkich istotnych aspektów warstwy komórkowej. Zwykła obserwacja warstwy komórkowej pod mikroskopem z kontrastem fazowym może ujawnić naturę pewnych cech, takich jak zbieganie się; jednak wiele istotnych cech, takich jak obecność monowarstwy i jednorodność grubości warstwy, wymaga trójwymiarowej (3D) oceny, która nie jest możliwa w przypadku obrazowania w jasnym polu, kontraście fazowym lub mikroskopii fluorescencyjnej12.

Celem tego badania było opracowanie techniki barwienia aktyną nitkową, aby umożliwić weryfikację monowarstwy na podstawie obrazowania i ocenę jednorodności warstwy komórkowej za pomocą konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej (CLSM). Aktyna nitkowa (F-aktyna) została uznana za odpowiedni cel dla koniugatu fluoroforu, częściowo ze względu na sposób, w jaki F-aktyna ściśle podąża za błoną komórkową, co pozwala na wizualne przybliżenie całej objętości komórki13. Inną ważną korzyścią płynącą z celowania w F-aktynę jest sposób, w jaki barwienie F-aktyny wizualnie wyjaśnia zakłócenia cytoszkieletu lub zmiany narzucone przez stresy i napięcia doświadczane przez komórki. Sieciowanie za pomocą formaldehydu wolnego od metanolu zastosowano w celu zachowania morfologii komórek i warstwy komórkowej, ponieważ utrwalacze odwadniające, takie jak metanol, mają tendencję do spłaszczania komórek, rażąco zniekształcając warstwę komórkową i zmieniając jej właściwości14,15.

Aby określić zdolność techniki oceny warstw do złagodzenia tych wyzwań, komórki hodowano w tradycyjnych ośmiodołkowych komorach hodowlanych, jak również w kanałach mikroprzepływowych, aby ocenić różnice, jeśli takie istnieją, w warstwach komórek, które zostały wyprodukowane. W przypadku stałych studni hodowlanych zastosowano ośmiodołkowe komorowe jednostki ze szkła nakrywkowego. W przypadku hodowli mikroprzepływowej matryce przepływowe (długość kanału 50 mm, szerokość 5 mm, głębokość 0,6 mm) zostały zoptymalizowane pod kątem hodowli unieśmiertelnionych komórek ludzkiego nabłonka płuc (NCI-H441) w środowisku o wymiarach fizjologicznie istotnych dla końcowych oskrzelików obecnych w strefie oddechowej ludzkiego płuca16. Chociaż protokół ten został opracowany z myślą o środowisku hodowli w układach przepływowych ECIS, może on mieć zastosowanie do każdego nieprzepuszczalnego dla tlenu środowiska hodowli dynamicznej, dla którego konieczna jest ocena charakterystyki warstwy komórkowej hodowli lub warunków hodowli.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

W niniejszym badaniu wykorzystano ludzką linię komórkową nabłonka płuc NCI-H441 (patrz Tabela materiałów).

1. Hodowla komórek w kanale mikrofluidycznym

  1. Wykonaj kanał mikrofluidyczny i przeprowadź wstępną obróbkę zgodnie z poniższymi krokami.
    1. Należy pozyskać jednokanałową macierz przepływową (patrz Tabela materiałów) i oddzielić górną część od poliwęglanowej płytki podstawowej.
    2. Należy przygotować prostokątne szkiełko nakrywkowe nr 1,5 (grubość 0,17 mm) o wymiarach 60 mm x 22 mm. Powierzchnie szkiełka nakrywkowego należy oczyścić w myjce ultradźwiękowej, a następnie jedną stronę potraktować roztworem poli-D-lizyny o stężeniu 0,1 mg/ml w temperaturze pokojowej przez 5 min, po czym wysuszyć w 60 °C przez 30 min.
    3. Przykleić dwustronną taśmę klejącą o grubości 0,13 mm (patrz Tabela materiałów), wycięty laserowo tak, aby odpowiadał wymiarom górnej części macierzy przepływowej oraz kanału przepływowego (długość 50 mm, szerokość 5 mm), do górnej części macierzy przepływowej, dbając o precyzyjne wyrównanie wycięć kanałów17.
    4. Przytwierdź przekładkę z mylaru o grubości 0,1 mm (patrz Tabela materiałów), wycięty laserowo tak, aby odpowiadał wymiarom górnej części matrycy przepływowej oraz kanału przepływowego, do paska klejącego, dbając o precyzyjne dopasowanie wycięć kanałów.
    5. Powtórz kroki 1.1.3 i 1.1.4, aż do uzyskania pożądanej wysokości kanału (na przykład dla wysokości kanału 0,6 mm należy zastosować dwa dystansory i trzy paski klejące).
    6. Przytwierdź prostokątne szkiełko nakrywkowe do najniższego paska klejącego stroną potraktowaną poli-D-lizyną do kleju. Po zakończeniu montażu, zgodnie z opisem w Rycina 1następnie należy wywrzeć silny i równomierny nacisk na górną i dolną część konstrukcji i przytrzymać przez 1 min.
      UWAGA: Konstrukcja obudowy kanału, obejmująca szkiełko nakrywkowe, kleje, dystanse oraz górną część matrycy przepływowej, została ukończona.
    7. Przepłucz kanał wodą dejonizowaną za pomocą strzykawki, jednocześnie sprawdzając szczelność układu.
    8. Sterylizować obudowę kanału w sterylizatorze ultrafioletowym (UV) przez 30 min18.
    9. Stosując technikę sterylną, należy potraktować kanał za pomocą 2.0 µg/mL ludzka fibronektyna (patrz Tabela materiałów) w soli fizjologicznej buforowanej fosforanowo (PBS), a następnie inkubować przez co najmniej 30 min w temperaturze 37 °C19.
  2. Przeprowadź hodowlę komórkową w kanale mikroprzepływowym zgodnie z poniższymi krokami.
    1. W sterylnej komorze z laminarnym przepływem powietrza, przy użyciu mikropipety, przenieś jednorodną zawiesinę komórek NCI-H441 w medium RPMI 1640 z 10% płatkową surowicą bydlęcą (FBS) (patrz Tabela materiałów) w celu zasiedlenia dwóch kanałów mikroprzepływowych, z komórkami o gęstości powierzchniowej 150 000 komórek/cm² w każdym z nich2.
      1. W przypadku kanałów o wymiarach 50 mm x 5 mm x 0,6 mm należy użyć 0,25 ml roztworu o stężeniu 2,5 x 106 zawiesiny o stężeniu [liczba] komórek/ml w celu wypełnienia każdego kanału oraz części portów. Za pomocą mikroskopu w jasnym polu należy zweryfikować, czy komórki zostały równomiernie rozdzielone w obrębie kanałów.
    2. Hodować obie linie przez odpowiednio 24 h i 48 h w 37 °C z 5% CO2 przy użyciu programowalnej pompy strzykawkowej (patrz Tabela materiałów), co powoduje wyssanie zużytej pożywki z kanału i zassanie świeżej pożywki do kanału z jałowego zbiornika z pożywką przyłączonego do wlotu kanału, wykonanego z rozciętej strzykawki o pojemności 20 mL zaklejonej folią parafinową.
      1. Po 10-minutowym okresie oczekiwania po wysianiu komórek, wprowadzić i pompować świeżą pożywkę z rezerwuaru przez kanał ze zmienną prędkością przepływu, zaczynając od 0.2 µL/min i stopniowe zwiększanie do 10 µL/min przez 4 h, utrzymując tę prędkość w dalszym czasie20.
        UWAGA: Zmienna szybkość przepływu zapewnia warunki hodowli, które umożliwiają komórkom (1) opadanie pod wpływem grawitacji na powierzchnię hodowlaną, (2) przyleganie do powierzchni hodowlanej oraz (3) tworzenie konfluentnej monowarstwy.
  3. Przeprowadzić fiksację komórek wewnątrz kanałów mikroprzepływowych przy użyciu roztworu formaldehydu.
    OSTRZEŻENIE: Formaldehyd jest toksyczny i musi być przetwarzany w odpowiednim dygestorium chemicznym21.
    1. W dygestorium przygotować roztwory formaldehydu, używając 4% formaldehydu w PBS (bezwodny metanol) (patrz Tabela materiałów) w celu przygotowania dwóch porcji o objętości 4 ml każda, rozcieńczając pierwszą do stężenia 1% formaldehydu, a drugą do 2% formaldehydu, przy użyciu soli fizjologicznej w buforze fosforanowym Dulbecco (DPBS; z Ca2+ oraz Mg2+) jako rozcieńczalnik. Przenieść roztwory formaldehydu do oddzielnych strzykawek o pojemności 5 ml i odpowiednio je opisać. Nabrać 20 ml DPBS do oddzielnej strzykawki o pojemności 20 ml.
    2. Wyjąć kanały mikroprzepływowe z aparatury hodowlanej i umieścić je w dygestorium chemicznym.
    3. Zmontuj aparat do fiksacji i barwienia.
      1. Przymocuj 10-centymetrowy odcinek przewodu transferowego do bocznego otworu trójdrożnego kurka odcinającego. poprzez adapter z męskim złączem Luer lock do króćca węża (patrz Tabela materiałów), a następnie podłączyć kurek do portu wlotowego układu przepływowego.
      2. Następnie do portu wylotowego układu przepływowego należy przyłączyć kolejny 10-centymetrowy odcinek przewodu transferowego, używając tego samego typu adaptera z kolbą.
      3. Na koniec wolne końce obu rurek transferowych należy umieścić w odpowiednim pojemniku na odpady chemiczne i biologiczne, takim jak oznakowana, pusta probówka stożkowa do wirowania o pojemności 50 ml.
    4. Przekręć kranik, aby zablokować wlot do układu przepływowego, a następnie przepłucz linię odpływową za pomocą DPBS. Następnie przekręć kranik, aby zablokować linię odpływową i powoli przemyj komórki 2 ml DPBS. Powtarzaj etap przepłukiwania, za każdym razem używając nowej porcji roztworu. Do kanału wprowadza się nowy roztwór (lub nową stężenie roztworu).
    5. Powoli przepuść 2 ml 1% roztworu utrwalacza przez kanał, a następnie pozostaw na 5 min.22.
    6. Powoli przepuść 2 ml 2% roztworu fiksacyjnego przez kanał, a następnie pozostaw na 15 min.
    7. Przemyj komórki, powoli wprowadzając do kanału 2 ml świeżego DPBS w trzech oddzielnych cyklach (po 5 min każdy).
    8. Wykonać kroki 1.3.3–1.3.7 równolegle dla obu kanałów mikroprzepływowych.
  4. Przebarwić, permeabilizować i dodać medium montażowe do komórek w kanale mikroprzepływowym.
    1. Przygotuj 0,1% roztwór saponiny, dodając 1 mg saponiny (patrz Tabela materiałów) na ml DPBS, aby otrzymać 4 ml roztworu, a następnie delikatnie wymieszać za pomocą wortexa23Nabrać 8 ml DPBS do strzykawki o pojemności 20 ml.
    2. Dodaj odczynnik faloidyny do barwienia F-aktyny oraz odczynnik Hoechst do barwienia jąder komórkowych (patrz Tabela materiałów) do 0,1% roztworu saponiny, dodając po dwie krople (0,1 ml) każdego z odczynników na 1 ml roztworu saponiny. Przygotowany roztwór barwiący/permeabilizujący należy chronić przed światłem, owijając go folią aluminiową.24.
    3. Przepłucz linię niewielką ilością roztworu do barwienia i permeabilizacji (zgodnie z opisem w kroku 1.3.4), następnie wprowadź 2 ml roztworu do kanału mikrofluidycznego i przykryj kanał folią aluminiową, pozostawiając go w temperaturze pokojowej na 30 min.
    4. Wypłucz roztwór barwiący/permeabilizujący dwukrotnie, używając 2 ml DPBS przez 5 min podczas każdego płukania.
    5. Aby uzyskać lepszą jakość obrazu, należy dodać odpowiednie medium montażowe (o współczynniku załamania światła zbliżonym do oleju w obiektywie mikroskopu i szkiełka nakrywkowe, patrz Tabela materiałów) do kanału.
      1. Za pomocą mikropipety nanieś minimalną ilość miękkiego medium montażowego zapobiegającego blaknięciu (antifade) do każdego otworu kanału mikrofluidycznego, upewniając się, że dolna powierzchnia jest całkowicie pokryta, a w obszarze przeznaczonym do obrazowania nie pozostały pęcherzyki powietrza.25Uszczelnij końce kanału i zweryfikuj integralność warstwy komórkowej, obserwując ją pod mikroskopem w jasnym polu.
    6. Wykonaj kroki 1.4.3-1.4.5 dla obu kanałów mikroprzepływowych równolegle.
      UWAGA: Aby uzyskać najwyższą jakość obrazu, należy obrazować komórki jak najszybciej po zabarwieniu. W przypadku wystąpienia fotoblaknięcia lub w razie potrzeby długotrwałego przechowywania można zastosować inne media montażowe o właściwościach antyblaknięcia lub konservujących próbkę. Należy pamiętać, że media montażowe utwardzane na twardo zniekształcą strukturę 3D komórek, a co za tym idzie, warstwę komórkową; z tego powodu preferowane są media montażowe utwardzane na miękko.26.
  5. Wykonaj obrazowanie komórek w kanale mikroprzepływowym zgodnie z poniższymi krokami.
    1. Skalibruj mikroskop konfokalny (patrz Tabela materiałówustawienia, w tym moc lasera, wzmocnienie, przesunięcie (offset) oraz parametry skanowania, takie jak prędkość skanowania, obszar skanowania, format skanowania, rozdzielczość i średnica otworu (pinhole)27.
    2. Przetestuj miejsce obrazowania, wykonując skany referencyjne oraz stosy Z (Z-stacks), aż do uzyskania pożądanych parametrów i warunków obrazowania. Dobierz parametry, korzystając z obiektywów o kolejno większych powiększeniach, aż do osiągnięcia i optymalizacji ustawień dla obiektywu immersyjnego 40x.28.
    3. Przyjmując płytkę podstawową matrycy przepływowej jako punkt odniesienia, należy wykonać stosy Z (Z-stacks) w pięciu lokalizacjach: w miejscu przewidywanego położenia pierwszej elektrody od strony wlotu, w połowie drogi między centrum a poprzednią lokalizacją, w centrum, w połowie drogi między centrum a położeniem ostatniej elektrody (od strony wylotu) oraz przy ostatniej elektrodzie, zgodnie z oznaczeniami w Rycina 2.
  6. Przeprowadź przetwarzanie obrazów i analizę danych.
    1. Eksportuj przekroje poprzeczne XZ i YZ za pomocą pakietu oprogramowania mikroskopu konfokalnego (patrz Tabela materiałów).
    2. Przy użyciu oprogramowania do przetwarzania obrazów (patrz Tabela materiałów) z funkcją detekcji krawędzi (wartość progowania 15,0), zmierz całkowitą powierzchnię obrazu w pikselach, używając narzędzie Magic Wand poza obszarem obrazu, a następnie obszar z wyłączeniem całkowitej powierzchni przekroju warstwy komórkowej w pikselach, wykorzystując narzędzie Magic Wand w części obrazu znajdującej się na zewnątrz warstwy komórkowej29.
    3. Korzystając z oprogramowania do przetwarzania danych (patrz Tabela materiałów), od wartości pikseli całkowitej powierzchni odejmij wartość pikseli powierzchni zewnętrznej, aby wyznaczyć wartość pikseli powierzchni przekroju poprzecznego.
    4. Przelicz wartości pikseli pola przekroju poprzecznego na µm2 wartości poprzez pomnożenie wartości pikseli przez kwadrat µm/pixewartość l, wskazana w oprogramowaniu mikroskopu dla konkretnego obrazu (0.31 µm/pixel dla serii obrazów Z-stack wykonanych w rozdzielczości 1024p bez powiększenia przy użyciu obiektywu olejowego 40x).
    5. Obliczyć średnie i odchylenia standardowe danych oraz przedstawić wyniki na wykresie.

Schemat kanału mikroprzepływowego z paskami adhezyjnymi i dystansami; wymiary kanału 50×5×0,6 mm.
Rycina 1: Schemat konstrukcji kanału mikroprzepływowego w widoku rozdzielonym. Górny element stanowi górną część układu przepływowego, cienkie szare elementy to paski adhezyjne, cienkie niebieskie elementy to dystans z mylaru, a dolny element to prostokątne szkiełko podstawowe. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Schemat kanału mikrofluidycznego; lokalizacje wlotu, centrum i wylotu; badanie dynamiki płynów.
Rycina 2: Pięć miejsc obrazowania wzdłuż obszaru mikrofluidycznego kanału hodowlanego, w którym powstaje jednorodna warstwa. Miejsca obrazowania są następujące: od strony wlotu, w pobliżu miejsca, w którym znajdowałaby się pierwsza elektroda w nienaruszonym układzie przepływowym; w połowie drogi między lokalizacją od strony wlotu a centrum kanału; w centrum kanału; w połowie drogi między centrum a lokalizacją od strony wylotu oraz od strony wylotu, w pobliżu miejsca, w którym znajdowałaby się ostatnia elektroda w nienaruszonym układzie przepływowym. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

2. Hodowla komórkowa w ośmiokomorowym szkiełku nakrywkowym

  1. Przeprowadź wstępną obróbkę lamelek w ośmiokomorowej kasetce.
    1. Należy przygotować sterylną ośmiokomorową kasetkę z lamellą wykonaną ze szkła okrywek nr 1,5, z zastosowaną powłoką zwiększającą adhezję komórek (Rysunek 3patrz Tabela materiałów).
    2. Stosując technikę sterylną, należy opracować powierzchnię studni hodowlanych za pomocą 2.0 µg/mL ludzką fibronektynę w PBS i inkubować przez co najmniej 30 min w temperaturze 37 °C19.
  2. Przeprowadź hodowlę komórkową w komorze z lamellą, postępując zgodnie z poniższymi krokami.
    1. W sterylnej komorze z laminarnym przepływem powietrza przenieś porcje 0,5 ml zawiesin komórek NCI-H441 w medium RPMI 1640 z 10% FBS o gęstościach objętościowych 81 000, 162 000 i 324 000 komórek/ml, aby zasiać do dołków hodowlanych z gęstością powierzchniową odpowiednio 45 000, 90 000 i 180 000 komórek/cm²2odpowiednio. Należy sprawdzić za pomocą mikroskopu w polu jasnym, czy komórki zostały równomiernie rozmieszczone w studzienkach.
    2. Hodować komórki przez 24 h, 48 h i 96 h w 37 °C z 5% CO2, codziennie wymieniając medium.
  3. Przeprowadź fiksację formaldehydem w ośmiokomorowym szkiełku nakrywkowym.
    UWAGA: Formaldehyd jest toksyczny i musi być obsługiwany w odpowiednim dygestorium chemicznym21.
    1. W dygestorium przygotuj roztwory formaldehydu, sporządzając dwie porcje 4% formaldehydu w PBS (bezwodnikowym z metanolu), a następnie rozcieńczając pierwszą z nich do stężenia 1% formaldehydu, a drugą do 2% formaldehydu, używając soli fizjologicznej z buforem fosforanowym Dulbecco (DPBS; z $\text{Ca}^{2+}$2+ i Mg2+) w charakterze rozcieńczalnika.
    2. Wyjmij ośmio-dołkową komorę hodowlaną z szkiełka coverglass z inkubatora i umieść ją w dygestorium.
    3. Ostrożnie przemyj komórki 0,5 ml DPBS za pomocą mikropipety, powoli wprowadzając ciecz w górną część narożnika każdej studzienki.
    4. Usuń znajdujący się w każdym dołku płyn, powoli odsysając go z narożnika dołków za pomocą mikropipety. Stosując metodę wprowadzania cieczy (krok 2.3.3), wprowadź 0,5 ml 1% roztworu fiksatywy do każdego dołka i pozostaw na 5 min.22.
    5. Usunąć obecny płyn z każdej dołki, stosując metodę ekstrakcji cieczy opisaną w kroku 2.3.4. Wykorzystując metodę wprowadzania cieczy opisaną w kroku 2.3.3, wprowadzić 0,5 ml 2% roztworu fiksatywy do każdej dołki i pozostawić na 15 min.
    6. Stosując metody wprowadzania i odsysania cieczy (kroki 2.3.3 i 2.3.4), przemyj komórki, wprowadzając i usuwając 0,5 ml świeżego DPBS do każdej studni w trzech oddzielnych cyklach, po 5 min każdy.
  4. Przeprowadzić barwienie, permeabilizację oraz dodanie medium montażowego w ośmiokomorowej szkiełku nakrywkowym.
    1. Przygotować 0,1% roztwór saponiny, dodając 1 mg saponiny na 1 mL DPBS, a następnie delikatnie wymieszać za pomocą wortexa.23.
    2. Do 0,1% roztworu saponiny dodać po dwie krople (0,1 ml) odczynnika faloidyny do barwienia F-aktyny oraz odczynnika Hoechst do barwienia jąder komórkowych na każdy 1 ml roztworu saponiny. Przygotowany roztwór należy chronić przed światłem, owijając go folią aluminiową.24.
    3. Do każdej studzienki należy wprowadzić 0,2 ml roztworu barwiącego/permeabilizującego, a następnie przykryć szkiełko przedmiotowe z komorami folią aluminiową i pozostawić w temperaturze pokojowej na 30 min.
    4. Przepłucz dwa razy roztwór barwiący/permeabilizujący przy użyciu 0,5 ml DPBS.
    5. Aby uzyskać lepszą jakość obrazu, do dołków należy dodać odpowiednie medium montażowe (o współczynniku załamania światła zbliżonym do współczynnika oleju immersyjnego obiektywu mikroskopu oraz szkła nakrywkowego).
      1. Za pomocą mikropipety nanieś minimalną ilość miękkiego medium montażowego zapobiegającego blaknięciu (antifade) do każdej studzienki, upewniając się, że powierzchnia dna jest całkowicie pokryta i w obszarze przeznaczonym do obrazowania nie pozostały żadne pęcherzyki powietrza.25Zweryfikuj integralność warstwy komórkowej, obserwując ją pod mikroskopem w polu jasnym.
        UWAGA: Aby uzyskać najwyższą jakość obrazu, należy wykonać obrazowanie komórek jak najszybciej po barwieniu. W przypadku wystąpienia fotoblaknięcia lub potrzeby długoterminowego przechowywania można zastosować inne media montażowe o właściwościach przeciwblaknięciowych lub konserwujących próbkę. Należy pamiętać, że media montażowe utwardzane na twardo zniekształcą strukturę 3D komórek, a co za tym idzie, warstwę komórkową, dlatego zaleca się stosowanie mediów montażowych o miękkiej konsystencji.26.
  5. Wykonaj obrazowanie w ośmiokomorowym szkiełku nakrywkowym.
    1. Dostosuj ustawienia mikroskopu konfokalnego, w tym moc lasera, wzmocnienie (gain), offset oraz parametry skanowania, takie jak prędkość skanowania, obszar skanowania, format skanowania, rozdzielczość i średnica otworu (pinhole).27.
    2. Przetestuj miejsce obrazowania, wykonując skany referencyjne oraz stosy Z (Z-stacks), aż do uzyskania pożądanych parametrów i warunków obrazowania. Dobieraj parametry, korzystając z obiektywów o kolejno większych powiększeniach, aż do uzyskania i optymalizacji obrazu przy użyciu obiektywu imersyjnego 40x.28.
    3. Należy wykonać stosy Z (Z-stacks) dla trzech losowych obszarów w każdym połączeniu gęstości wysiewu i czasu trwania hodowli.
  6. Przeprowadź przetwarzanie obrazów i analizę danych.
    1. Wyeksportuj przekroje poprzeczne w płaszczyznach XZ i YZ, korzystając z oprogramowania mikroskopu konfokalnego.
    2. Używając oprogramowania do przetwarzania obrazów z funkcją detekcji krawędzi (wartość progu 15,0), zmierz całkowitą powierzchnię obrazu w pikselach, wykorzystując narzędzie Magiczna różdżka poza obrazem, a następnie obszar z wyłączeniem całkowitej powierzchni przekroju warstwy komórkowej w pikselach, przy użyciu narzędzie Magicznym Różdżką w części obrazu znajdującej się na zewnątrz warstwy komórkowej29.
    3. Za pomocą oprogramowania do przetwarzania danych odejmij wartość pikseli obszaru zewnętrznego od całkowitej wartości pikseli obszaru, aby wyznaczyć wartość pikseli pola przekroju poprzecznego.
    4. Przelicz wartości pikseli pola przekroju poprzecznego na µm2 wartości poprzez pomnożenie wartości pikseli przez kwadrat µm/pixewartość l wskazana w oprogramowaniu mikroskopu dla konkretnego obrazu (0.31 µm/pixel dla serii obrazów Z-stack wykonanych w rozdzielczości 1024p bez powiększenia przy użyciu obiektywu imersyjnego 40x).
    5. Oblicz średnie i odchylenia standardowe, a następnie przedstaw wyniki na wykresie.

schemat szkiełka nakrywki z 8 komorami do eksperymentów mikroskopowych, ilustracja konfiguracji hodowli komórkowej.
Rycina 3: Schemat ośmiokomorowego szkiełka nakrywki użytego w eksperymencie z hodowlą w stałych studzienkach, barwieniem i obrazowaniem, mającym na celu porównanie wpływu początkowej gęstości zasiewu komórek oraz czasu trwania hodowli na tworzenie się warstw komórkowych. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Przedstawiona metoda umożliwia wizualizację warstw komórek nabłonkowych hodowlanych w mikrofluidycznych kanałach hodowlanych i wykorzystuje demonstrację w tradycyjnych środowiskach hodowli komórkowych w studzienkach jako walidację. Uzyskane obrazy będą charakteryzować się różną jakością, intensywnością sygnału i specyficznością względem celu komórkowego. Prawidłowe obrazy będą wykazywać wysoki kontrast, umożliwiając analizę obrazu i kwantyfikację danych do późniejszej ewaluacji statystycznej. Obrazy nieudane będą ciemne,...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Przedstawiony protokół opisuje hodowlę, utrwalanie sieciowania, barwienie, przenikanie i konfokalną wizualizację mikroskopową ludzkich komórek nabłonka płuc NCI-H441 w dynamicznym środowisku jednokanałowego mikroprzepływowego układu przepływowego, a także w środowisku statycznym tradycyjnego ośmiokomorowego szkła nakrywkowego. W przypadku każdego protokołu mikroprzepływowej hodowli komórkowej warunki przepływu pożywki do hodowli komórkowych mają ogromne znaczenie, ponieważ przepływ o dużej szybkości może zmyć komórki lub...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

Autorzy dziękują Alanowi Shepardsonowi za zaprojektowanie wzoru cięcia dla kleju 3M i arkusza mylarowego używanego do budowy kanałów mikroprzepływowych oraz za testowanie szybkości przepływu pożywki do hodowli komórkowej i programowania pompy strzykawkowej. Finansowanie zostało zapewnione przez NIH R01 HL0142702, NSF CBET 1706801 oraz Newcomb-Tulane College Dean's Grant.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
System mikroskopu konfokalnego A1R HD25NikonA1R HD25https://www.microscope.healthcare.nikon.
com/produkty/mikroskopy-konfokalne/A1HD25-A1RHD25/specyfikacje
Odczynnik ActinGreen 488 ReadyProbes (AlexaFluor 488 phalloidyna)InvitrogenR37110https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/R37110
Taśma transferowa samoprzylepna podwójnie wyściółkowana3M468MPhttps://gizmodorks.com/3m-468mp-adhesive-transfer-tape-sheet-5-pack/
Air-Tite  Jednorazowe strzykawki HSW Soft-JectAir-Tite RL514-817-53https://www.fishersci.com/shop/products/air-tite-hsw-soft-ject-disposable-syringes-6/1481753#?keyword=syringe%20leur%20locking%205ml
BAISDY 4 mil (0,1 mm) gruby arkusz mylarowyBAISDYAS022https://www.amazon.ca/Stencil-Perfect-Silhouette-Machines-BAISDY/dp/B07RJJ9BNC
Branson Ultrasonics  Ultradźwiękowa kąpiel czyszcząca seriiM Branson Ultrasonics15-336-100https://www.fishersci.com/shop/products/m-series-ultrasonic-cleaning-bath/15336100
Corning  Fibronektyna, HumanFisher ScientificCB-40008https://www.fishersci.com/shop/products/corning-fibronectin-human-3/CB40008?keyword=true
DPBS, wapń, magnezGibco14040133https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14040133?SID=srch-srp-14040133
ECIS Cultureware Jednorazowe matryce elektrod 8 x 10 ECIS Flow ArrayBioFizyka stosowana1F8x10E PChttps://www.biophysics.com/cultureware.php#1F8x10E
Enterprise Technology Solutions Szafka na sterylizator UV, białaEnterprise Technology Solutions50-211-1163
https://www.fishersci.com/shop/products/uv-sterilizer-cabinet-white/502111163 Płodowa surowica bydlęca (FBS)Gibco26140079https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/26140079
Finnpipette F2 o zmiennej objętości PipetyThermo Scientific4642090https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/4642090
Fisherbrand 50mL Easy Reader Plastikowe probówki wirówkoweFisher Scientific06-443-21https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-higher-speed-easy-reader-plastic-centrifuge-tubes-8/p-193269
Fisherbrand  Okulary nakrywkowe: prostokąty (#1.5)Fisher Scientific12-544-GPhttps://www.fishersci.com/shop/products/cover-glasses-rectangles-promo-22/12544GP#coverglass
Fisherbrand  Sterylne strzykawki jednorazowego użytkuFisher Scientific14-955-458https://www.fishersci.com/shop/products/sterile-syringes-single-use-12/14955458
Gibco RPMI 1640 MediumGibco11875093https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/11875093
Image-iT Utrwalacz Roztwór (4% formaldehydu, bez metanolu)InvitrogenFB002https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/FB002
ImageJ FidżiImageJ ImageJFidżihttps://imagej.net/downloads
Olejek immersyjny F 30 ccNikonMXA22168https://www.microscope.healthcare.nikon.
com/produkty/akcesoria/olejek-immersyjny/specyfikacje
Duży zasięg CO2  Inkubator, 821 l, polerowana stal nierdzewnaThermo Scientific3950https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/3950
Laxco LMC-3000 Series Brightfield Compound Microscope SystemLaxcoLMC3BF1https://www.fishersci.com/shop/products/lmc-3000-series-brightfield-compound-microscope-system-8/LMC3BF1
Złączka Masterflex, nylonowa, prosta, męska Luer Lock do adaptera kolczastego węża, 1/16" ID; 25/PKMasterflexZY-45505-31https://www.masterflex.com/i/masterflex-fitting-nylon-straight-male-luer-lock-to-hose-barb-adapters-1-16-id-25-pk/4550531?PubID=ZY&persist=true&ip=no&
gclid=Cj0KCQiA3rKQBhCNARIsAC
UEW_Zb5yXy1em6bGs0a9KFOk5k
pdlkHCvAEslHumdqcnlwSN0MdR0
udmwaAuDHEALw_wcB
Microsoft ExcelMicrosoft0016https://www.microsoft.com/en-us/download/details.aspx?id=56547
Jednorazowe strzykawki zThermo Scientific03-377-24https://www.fishersci.com/shop/products/national-target-all-plastic-disposable-syringes/0337724#tab8
NCI-H441 Ludzkie nabłonkowe komórki płucKolekcja kultur typu amerykańskiego (ATCC)HTB-174https://www.atcc.org/products/htb-174
NE-1600 Sześciokanałowa programowalna pompa strzykawkowaNew Era Systemy pompNE-1600https://www.syringepump.com/NE-16001800.php
NIS Elements ARNikonNIS Elements ARhttps://www.microscope.healthcare.nikon.
com/products/software/nis-elements/nis-elements-advanced-research
Odczynnik NucBlue Live ReadyProbes (Hoechst 33342)InvitrogenR37605https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/R37605?SID=srch-srp-R37605
Nunc Lab-tek Komorowa szklana osłonaThermo Scientific155411https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/155361
Parafilm M Folia do owijaniaFisher ScientificS37441https://www.fishersci.com/shop/products/parafilm-m-wrapping-film-3/S37441
Zawór blokujący PendoTech 3-kierunkowy, polisulfon, męski/ Żeński wlot Luer x żeński Luer BranchPendoTechZY-19406-49https://www.masterflex.com/i/pendotech-3-way-stopcock-polysulfone-male-female-luer-inlet-x-female-luer-branch/1940649
Roztwór buforowany fosforanem (PBS), pH 7,4Gibco10010023https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10010023
Poli-D-LizynaGibcoA3890401https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A3890401#/A3890401
Reynolds Folia aluminiowaReynolds458742928317https://www.amazon.com/Reynolds-Wrap-Aluminum-Foil-Square/dp/B00UNT0Y2M
SaponinMillipore Sigma (Sigma Aldrich)47036https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/47036
Szkło SlowFade Soft-set Anti-fade MountantInvitrogenS36917-5X2MLhttps://www.thermofisher.com/order/catalog/product/S36917-5X2ML
Thermo Scientific 1300 Series klasa II, pakiet szafy bezpieczeństwa biologicznego typu A2Thermo Scientific13-100-752PMhttps://www.fishersci.com/shop/products/1300-series-class-ii-type-a2-biological-safety-cabinet-package-promo/p-9049003#?keyword=biosafety%20hood
Rurka transferowa Tygon, silikon utwardzany platyną BioPharm, 1/16" ID x 1/8" OD; 50 stópCole-ParmerEW-95702-01https://www.coleparmer.com/i/tygon-transfer-tubing-biopharm-platinum-cured-silicone-1-16-id-x-1-8-od-50-ft/9570201?searchterm=95702-01
tworzywa sztucznego National Target

Bibliografia

  1. Matthay, M. A., et al. Acute respiratory distress syndrome. Nature Reviews Disease Primers. 5, 18(2019).
  2. Rawal, G., Yadav, S., Kumar, R. Acute respiratory distress syndrome: An update and Review. Journal of Translational Internal Medicine. 6 (2), 74-77 (2018).
  3. Bilek, A. M., Dee, K. C., Gaver, D. P. Mechanisms of surface-tension-induced epithelial cell damage in a model of pulmonary airway reopening. Journal of Applied Physiology. 94 (2), 770-783 (2003).
  4. Modrykamien, A. M., Gupta, P. The acute respiratory distress syndrome. Baylor University Medical Center Proceedings. 28 (2), 163-171 (2017).
  5. Jacob, A. -M., Gaver, D. P. Atelectrauma disrupts pulmonary epithelial barrier integrity and alters the distribution of tight junction proteins ZO-1 and Claudin 4. Journal of Applied Physiology. 113 (9), 1377-1387 (2012).
  6. Kay, S. S., Bilek, A. M., Dee, K. C., Gaver, D. P. Pressure gradient, not exposure duration, determines the extent of epithelial cell damage in a model of pulmonary airway reopening. Journal of Applied Physiology. 97 (1), 269-276 (2004).
  7. Jacob, A. M., Gaver, D. P. An investigation of the influence of cell topography on epithelial mechanical stresses during pulmonary airway reopening. Physics of Fluids. 17 (3), 031502(1994).
  8. Gaver, D. P., et al. The POOR get POORer: A hypothesis for the pathogenesis of ventilator-induced lung injury. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 202 (8), 1081-1087 (2020).
  9. Jain, P., et al. Reconstruction of ultra-thin alveolar-capillary basement membrane mimics. Advanced Biology. 5 (8), 2000427(2021).
  10. Byrne, M. B., Leslie, M. T., Gaskins, H. R., Kenis, P. J. A. Methods to study the tumor microenvironment under controlled oxygen conditions. Trends in Biotechnology. 32 (11), 556-563 (2014).
  11. Szulcek, R., Bogaard, H. J., van Nieuw Amerongen, G. P. Electric cell-substrate impedance sensing for the quantification of endothelial proliferation, barrier function, and motility. Journal of Visualized Experiments. (85), e51300(2014).
  12. Jaccard, N., et al. Automated method for the rapid and precise estimation of adherent cell culture characteristics from phase contrast microscopy images. Biotechnology and Bioengineering. 111 (3), 504-517 (2013).
  13. Hagiyama, M., et al. Modest static pressure suppresses columnar epithelial cell growth in association with cell shape and cytoskeletal modifications. Frontiers in Physiology. 8, 00997(2017).
  14. Srinivasan, M., Sedmak, D., Jewell, S. Effect of fixatives and tissue processing on the content and integrity of Nucleic Acids. The American Journal of Pathology. 161 (6), 1961-1971 (2002).
  15. Zhu, L., Rajendram, M., Huang, K. C. Effects of fixation on bacterial cellular dimensions and integrity. Iscience. 24 (4), 102348(2021).
  16. Lust, R. M. The Pulmonary System. XPharm: The Comprehensive Pharmacology Reference. , Elsevier. 1-6 (2007).
  17. EpilogueLaser. FusionSeries: Pro & Edge Laser System Manual and Original Instructions. EpilogueLaser. , Golden, CO: Author. (2022).
  18. Chitnis, D. S., Katara, G., Hemvani, N., Chitnis, S., Chitnis, V. Surface disinfection by exposure to germicidal UV light. Indian Journal of Medical Microbiology. 26 (3), 241(2008).
  19. Sandell, L., Sakai, D. Mammalian cell culture. Current Protocols Essential Laboratory Techniques. 5 (1), 4(2011).
  20. New Era Pump Systems. Multi-Phaser Programmable Syringe Pump: NE-1000 Series User Manual. New Era Pump Systems. , Farmingdale, NY. (2014).
  21. Thermo Fisher Scientific. Safety Data Sheet: Image-iT Fixative Solution (4% formaldehyde, methanol-free). Thermo Fisher Scientific. , Waltham, MA. (2018).
  22. Thavarajah, R., Mudimbaimannar, V. K., Rao, U. K., Ranganathan, K., Elizabeth, J. Chemical and physical basics of routine formaldehyde fixation. Journal of Oral and Maxillofacial Pathology. 16 (3), 400-405 (2012).
  23. Jamur, M. C., Oliver, C. Permeabilization of cell membranes. Immunocytochemical Methods and Protocols. 588, 63-66 (2009).
  24. Thermo Fisher Scientific. ActinGreen 488 ReadyProbes Reagent Protocol. Thermo Fisher Scientific. , Walther, MA. (2022).
  25. Slowfade Glass soft-set Antifade Mountant. Thermo Fisher Scientific. , Available from: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/S36917-5X2ML?SID=srch-hj-S36917-5X2ML (2022).
  26. Ravikumar, S., Surekha, R., Thavarajah, R. Mounting media: An overview. Journal of Dr. NTR University of Health Sciences. 3 (5), 1-8 (2014).
  27. Shihan, M. H., Novo, S. G., Le Marchand, S. J., Wang, Y., Duncan, M. K. A simple method for quantitating confocal fluorescent images. Biochemistry and Biophysics Reports. 25, 100916(2021).
  28. North, A. J. Seeing is believing? A beginners' guide to practical pitfalls in image acquisition. Journal of Cell Biology. 172 (1), 9-18 (2006).
  29. Ferriera, F., Rasband, W. ImageJ User Guide. National Institutes of Health. , Bethesda, MD. (2012).
  30. Halldorsson, S., Lucumi, E., Gómez-Sjöberg, R., Fleming, R. M. T. Advantages and challenges of microfluidic cell culture in polydimethylsiloxane devices. Biosensors and Bioelectronics. 63, 218-231 (2015).
  31. Smith, H. S., Riggs, J. L., Mosesson, M. W. Production of fibronectin by human epithelial cells in culture. American Association for Cancer Research. 39 (10), 4138-4144 (1979).
  32. Sieck, G. C., Mantilla, C. B., Prakash, Y. S. Volume measurements in confocal microscopy. Methods in Enzymology. 307, Academic Press. 296-315 (1999).
  33. Heijink, I. H., et al. Characterisation of cell adhesion in airway epithelial cell types using electric cell-substrate impedance sensing. European Respiratory Journal. 35 (4), 894-903 (2009).
  34. Zhang, X., Wang, W., Li, F., Voiculescu, I. Stretchable impedance sensor for mammalian cell proliferation measurements. Lab on a Chip. 17 (12), 2054-2066 (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Monowarstwa komórek nabłonkowychnabłonek płuc człowiekamikroskopia konfokalnabarwienie falloidynąocena warstwy komórkowejkonstrukcja kanału mikroprzepływowegowarunki hodowli komórekobrazowanie cytoszkieletu aktynowegotransepitelna oporność elektryczna
Przygotowanie i ocena strukturalna monowarstw komórek nabłonka w fizjologicznie dobranym urządzeniu do hodowli mikroprzepływowej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.