Pobieranie i długotrwałe utrzymywanie mrówek tnących liście (atta) w warunkach laboratoryjnych

Podsumowanie

Tutaj opisany jest protokół skutecznego zbierania i utrzymywania zdrowych kolonii mrówek Atta (Hymenoptera: Formicidae) w warunkach laboratoryjnych. Dodatkowo szczegółowo opisano różne typy i konfiguracje gniazd wraz z możliwymi procedurami eksperymentalnymi.

Streszczenie

Mrówki są jedną z najbardziej zróżnicowanych biologicznie grup zwierząt na planecie i zamieszkują różne środowiska. Utrzymanie kolonii mrówek w kontrolowanym środowisku umożliwia wzbogacenie ich biologii, co może przyczynić się do badań stosowanych. Praktyka ta jest zwykle stosowana w badaniach kontroli populacji gatunków, które powodują straty ekonomiczne, takich jak mrówki Atta. Aby wyhodować swojego mutualistycznego grzyba, te mrówki tnące liście zbierają liście i w tym celu są uważane za szkodniki rolnicze szeroko rozpowszechnione na całym kontynencie amerykańskim. Są wysoce zorganizowane społecznie i zamieszkują rozbudowane podziemne gniazda składające się z różnych komór. Ich utrzymanie w kontrolowanym środowisku zależy od codziennej rutyny kilku procedur i częstej pielęgnacji, które są opisane tutaj. Rozpoczyna się od zebrania królowych w okresie rozrodczym (tj. lotu godowego), które są następnie indywidualnie przenoszone do plastikowych pojemników. Ze względu na wysoką śmiertelność królowych, drugi zbiór można przeprowadzić około 6 miesięcy po locie godowym, kiedy to początkowe gniazda z rozwiniętym zwojem grzybów są wykopywane, ręcznie zbierane i umieszczane w plastikowych pojemnikach. W laboratorium liście są codziennie dostarczane do założonych kolonii, a odpady wyprodukowane przez mrówki są usuwane co tydzień wraz z pozostałym suchym materiałem roślinnym. W miarę wzrostu ogrodu grzybowego kolonie są przenoszone do różnych typów pojemników zgodnie z celem eksperymentalnym. Kolonie mrówek tnących liście są umieszczane w połączonych ze sobą pojemnikach, reprezentujących system organizacyjny z funkcjonalnymi komorami zbudowanymi przez te owady w naturze. Ta konfiguracja jest idealna do monitorowania takich czynników, jak ilość odpadów, stan ogrodu grzybów oraz zachowanie robotnic i królowej. Za największą zaletę utrzymywania kolonii mrówek w kontrolowanych warunkach uważa się ułatwione gromadzenie danych i bardziej szczegółowe obserwacje.

Wprowadzenie

Mrówki stanowią zróżnicowaną grupę osobników, które wywierają wpływ na większość środowisk naziemnych¹. Działają jako wydajne rozpraszacze^2,3,4, predators⁵ and ecosystem engineers6^,7,8,9,10, podkreślając ich znaczenie i sukces ekologiczny w ekosystemach naturalnych. Wszystkie gatunki mrówek są klasyfikowane jako owady eusocjalne; Jednak ich organizacja społeczna różni się znacznie między różnymi grupami gatunkowymi, tj. systemy podziału pracy, grupy funkcjonalne, komunikacja między osobnikami, organizacja paszy, fundacja kolonii i proces rozmnażania¹¹. Jako wysoce zróżnicowana grupa uciekają się do kilku zasobów pokarmowych i wyspecjalizowanych zachowań żywieniowych. W rzeczywistości rolnictwo było nie tylko ogromnym krokiem naprzód dla cywilizacji ludzkiej, ale także dla gatunków mrówek. Około 55 do 65 lat temu¹², mrówki attine zaczęły hodować grzyby i włączać je do niemal wyłącznej diety. Stały się tak wyspecjalizowane, że rozwinęły ścisłe, zależne i obowiązkowe interakcje klasyfikowane jako symbioza, w której jeden osobnik nie przeżywa bez drugiego.

Niższe mrówki hodujące grzyby zbierają i przetwarzają martwą materię organiczną, taką jak fragmenty gnijących liści, aby wyhodować swój mutualistyczny grzyb; podczas gdy mrówki o wyższym wzroście grzybów zbierają świeży materiał roślinny, tworząc jeden z najbardziej udanych symbiotycznych systemów naturalnych¹³. Ta wysoce wyspecjalizowana technika rolnicza pozwoliła im zająć nową niszę. Mrówki o wyższej attynie obejmują mrówki ścinające liście, monofiletyczną grupę, która wzbudza między 19 Ma (15-24 Ma) a 18 Ma (14-22 Ma)^14,15,16 składająca się z czterech prawidłowych rodzajów: Atta Fabricius, Acromyrmex Mayr, Amoimyrmex Cristiano i Pseudoatta Gallardo. System rolnictwa polegający na obcinaniu liści, wykonywany przez mrówki ścinające liście, wyewoluował z pochodnych systemów rolniczych¹⁷. Większość z tych gatunków wykorzystuje wyłącznie mutualistyczny gatunek grzyba Leucoagaricus gongylophorus Singer¹⁸ (zwany również Leucocoprinus gongylophorus Heim¹⁹), co oznacza znaczące przejście ewolucyjne¹¹. Odmiany grzybów są przenoszone pionowo, z pierwotnych gniazd na potomstwo, co sugeruje, że są rozmnażane klonalnie²⁰.

Co ciekawe, społeczeństwa Atta rozwinęły złożoną strukturę organizacyjną o ogromnym znaczeniu w swoim środowisku i dużym zainteresowaniu myrmekologów. Ich populacja może składać się z milionów osobników, z których większość to bezpłodne robotnice, które wykazują uwydatniony polimorfizm, tj. wyraźny rozmiar i morfologię anatomiczną. Populacja jest podzielona na kasty w zależności od wieku, stanu fizjologicznego, typu morfologicznego, zachowań i wyspecjalizowanych działań w kolonii²¹. Pracownicy mogą być rozróżniani na ogrodników i pielęgniarki, generalistów w gnieździe, zbieraczy i kopaczy oraz obrońców lub żołnierzy²¹. Organizacja ta pozwala na wykonywanie zadań we współpracy i samoorganizującym się systemie, który może wytwarzać wysoce ustrukturyzowane zachowania zbiorowe, pozwalając im skutecznie reagować na zakłócenia środowiskowe²².

Rolę odnowy populacji odgrywa pojedyncza królowa (tj. monogyniczna), tak długo jak żyje, stanowiąc stałą kastę reprodukcyjną²². Wiadomo, że królowe Atta żyją ponad 20 lat, składając jaja przez całe życie²³. Ponieważ królowa jest niezastąpiona, jej wytrzymałość ma kluczowe znaczenie dla przetrwania kolonii^13,20,23,24. Jednak tysiące skrzydlatych reprodukcyjnych samic i samców można znaleźć w gnieździe w sezonach lęgowych, ale żadna nie pozostaje w pierwotnym gnieździe, tworząc tymczasową kastę²². W koloniach Atta sexdens produkuje się prawie 3 000 reprodukcyjnych samic i 14 000 reprodukcyjnych samców²⁵. Występuje, gdy kolonia osiąga dojrzałość płciową, około 38 miesięcy od jej wdrożenia, i od tego czasu jest powtarzana corocznie, aż do jej wygaśnięcia^23,25. Nowe kolonie Atta powstają poprzez haplometrozę, w której jedna królowa rozpoczyna nowe gniazdo.

Gdy warunki środowiskowe są sprzyjające, reproduktorzy opuszczają podziemne gniazdo, aby rozpocząć lot godowy. Okres jego występowania różni się w zależności od regionu, rozciągając się przez cały rok na całym terytorium Brazylii w zależności od gatunku. Wydaje się jednak, że wydarzenie to poprzedzają opady deszczu i wilgotność na wysokości²⁶, co może być związane z ułatwieniem wykopów ze względu na wilgotność gleby²². Często na 1-5 tygodni przed lotem godowym wejścia do gniazd i kanały są poszerzane, aby ułatwić osobnikom rozrodczym odlot. Przed opuszczeniem swoich macierzystych kolonii skrzydlate samice zbierają i przechowują w jamie podpoliczkowej część mutualistycznego grzyba^20,27. Wiele kopulacji jest wykonywanych w trakcie lotu i oblicza się, że jedna królowa może być zapłodniona przez trzy do ośmiu samców (tj. poliandria) u niektórych gatunków²⁸, zapewniając zmienność genetyczną²⁹. Następnie królowe udają się do gleby, preferując miejsca, w których nie ma lub jest mało roślinności²⁵, gdzie usuwają skrzydła i kopią swoją pierwszą komorę lęgową. Jest to jedyny okres, w którym królowe można zobaczyć poza gniazdem. Chociaż osobniki z tymczasowej kasty były widziane w sztucznych gniazdach, nie wiadomo, czy jakakolwiek udana kopulacja (tj. lot godowy) została przeprowadzona w warunkach laboratoryjnych²⁴.

Początkowa budowa gniazda odpowiada najważniejszemu okresowi kolonii, który może trwać od 6 h do 8 h^23,25. W tym momencie królowa zamyka się w początkowej komnacie, a w ciągu kilku dni rozpoczyna się składanie jaj. Pierwsze jaja są karmione do grzybni, którą królowa zwraca przez królową, co oznacza początek ogrodu grzybowego kolonii. Pierwsze larwy pojawiają się po około 25 dniach²², a prawie pod koniec pierwszego miesiąca kolonia składa się z maty rozmnażającego się grzyba, w której zagnieżdżone są niedojrzałe (jaja, larwy i poczwarki) oraz królowej, która wychowuje swoje pierwsze potomstwo w izolacji²³. Jaja są również źródłem pożywienia pierwszych larw i są często spożywane przez królową¹³. Dodatkowo królowa utrzymuje się dzięki rezerwom ciała tłuszczowego i katabolizującym mięśniom skrzydeł, które nie są już używane¹³. Początkowa kultura grzyba nie jest spożywana, ponieważ przetrwanie kolonii zależy od jej rozwoju, a w tym okresie królowa zapładnia ją płynem kałowym¹³. Kilka dni po wynurzeniu się pierwsze robotnice otwierają wejście do gniazda i rozpoczynają żerowanie w bezpośrednim sąsiedztwie gniazda¹³. Zawierają one materiał zebrany jako podłoże ogrodu grzybów, który obecnie służy jako pokarm dla robotników^13,22. Przed dodaniem do kultury grzybów, materiał roślinny przynoszony przez robotnice jest krojony na drobne kawałki i zwilżany płynem kałowym¹³. Mrówki manipulują inokulum grzyba, aby zwiększyć i kontrolować jego wzrost, co posłuży do podziału dużych komór wykopanych w glebie, specjalizujących się w kondycjonowaniu ogrodu^13,22,25.

Około 6 miesięcy po locie godowym, gniazda A. sexdens zawierają komorę grzybów i kilka kanałów. Wielka specjalizacja w budowie gniazd mrówek wycinających liście działa jako mechanizm obronny przed naturalnymi wrogami i niekorzystnymi czynnikami środowiskowymi²². Wiadomo, że mrówki ścinające liście rozdrabniają ogród grzybów i przenoszą go do komór o dużej wilgotności, gdy komory zaczynają wysychać¹³. Tak więc, pomimo tego, że wykopanie gniazda wiąże się ze znacznymi kosztami energii, zainwestowana energia jest odwracana na korzyść samej kolonii²². Z kilkoma wyjątkami, gatunki Atta tworzą również wyspecjalizowane komory na odpady kolonii, wykonane głównie z zubożonego substratu grzyba i ciał martwych mrówek, izolując je od reszty gniazda i ustanawiając ważną strategię odporności społecznej³⁰. Ponadto wyraźna grupa pracowników bezpośrednio manipuluje odpadami, aby uniknąć zanieczyszczenia innych osób. Robotnice nieustannie żerują, aby pielęgnować grzyba, który jest głównym zasobem odżywczym kolonii. Mogą jednak żywić się sokiem roślinnym również podczas cięcia fragmentów. Materiał roślinny jest starannie wybierany do pielęgnacji ogrodu grzybowego i zależy od wielu czynników, takich jak cechy liści i właściwości ekosystemu^13.

Strategia żerowania mrówek tnących liście w celu uzyskania świeżego materiału jest bardzo złożona, a w połączeniu z wysokim zapotrzebowaniem na zbiory w założonych koloniach, powoduje znaczne straty ekonomiczne dla producentów rolnych i zagraża obszarom odtworzenia lasów^22,31. Dlatego mrówki te można sklasyfikować jako szkodniki w większości obszarów, w których można je spotkać, od południowych Stanów Zjednoczonych po północno-wschodnią Argentynę^11,13,22,32. Wymieranie problematycznych kolonii jest trudne ze względu na szereg adaptacji nieodłącznie związanych z biologią tych owadów (tj. organizacja społeczna, żerowanie, uprawa grzybów, higiena i złożone struktury gniazdowe)³³. W związku z tym strategie kontroli populacji różnią się od tych powszechnie stosowanych wobec innych szkodników owadzich i głównie uciekają się do atrakcyjnych ofert zanieczyszczonych przynęt^33,34. Ponieważ jednak mrówki te mogą odrzucać substancje szkodliwe zarówno dla grzybów, jak i osobników z kolonii, a także zagrażać polom uprawnym³³, nowe naturalne związki i alternatywy kontroli są stale testowane^33,35,36. Ponieważ wyniki eksperymentów trudno monitorować na koloniach testowanych w terenie, wstępne eseje są przeprowadzane w kontrolowanym środowisku.

Zatem protokoły eksperymentalne muszą być dostosowane do grup interesów, biorąc pod uwagę niejednorodny styl życia mrówek, wspierając badania na poziomie gatunku i uwzględniając kolonie jako jednostki operacyjne, gdzie jedna mrówka jest elementem złożonego superorganizmu¹¹. Zebrane do tej pory doniesienia dotyczące rodzaju Atta umożliwiły skuteczne zbieranie i utrzymywanie kolonii w warunkach laboratoryjnych oraz uznanie ich podstawowych potrzeb i ogólnego funkcjonowania. W oparciu o ich naturalne procesy, takie jak rozmnażanie, zakładanie kolonii i zachowania żywieniowe, opracowano rutynę praktyk, która pozwala na długoterminowe zakładanie kolonii w różnych typach gniazd. W tym miejscu opisano protokół proceduralny mający na celu utrzymanie mrówek ścinających liście w laboratorium i podkreślono możliwe ogólne badania z odrębnymi celami eksperymentalnymi i zasięgiem naukowym.

Protokół

1. Kolekcja królowych

1. Szukaj w literaturze okresu sezonu rozrodczego Atta w interesującym Cię regionie. Występowanie w sezonie rozrodczym, częstotliwość i pora dnia lotów godowych różni się w zależności od regionalnych warunków klimatycznych (tabela 1). Chociaż zazwyczaj odbywa się to wiosną, informacje te muszą zostać zebrane dla miejsca, w którym zbiórka ma się odbyć^{37,38,39,40,41,42,43,44,45,46}.
2. Zidentyfikuj i oznacz miejsca, w których gniazda Atta są uważane za możliwe obszary do zbierania królowych i młodych kolonii. Podczas lotów godowych królowe są rozproszone po miejscach gniazdowania; Dlatego obszary z większą liczbą kolonii mają większe szanse na miejsca lądowania królowych, w których inicjują one nowe wykopaliska gniazdowe.
3. Sprawdź wybrane wcześniej obszary pod kątem oznak lotu godowego w okresie rozrodczym mrówek Atta. Śledź warunki środowiskowe w dniach lotu godowego, takie jak upały i opady deszczu.
4. Zidentyfikuj gniazda mrówek ścinających liście w wybranych wcześniej obszarach i poszukaj cech zewnętrznych, które wskazują na zbliżający się odlot skrzydlatych mrówek rozrodczych. Cechy gniazd obejmują poszerzone wejścia do tuneli (ryc. 1), zwiększony przepływ robotnic wykazujących bardziej agresywne zachowanie wobec potencjalnych drapieżników oraz skrzydlate mrówki reprodukcyjne pojawiające się przy wejściach do tuneli (ryc. 1). Uważaj na dni o wysokiej wilgotności następujące po opadach deszczu, ponieważ zazwyczaj poprzedzają one loty zaślubin.
5. Przygotuj pojemniki z plastikową pokrywką z dolną warstwą tynku, aby zachować królowe pojedynczo. Upewnij się, że pojemność pojemnika wynosi około 200 ml, a warstwa tynku na dnie ma około 1 cm wysokości i jest wysoce chłonna w celu kontroli wilgotności.
   UWAGA: Aby przygotować podłoże tynku, postępuj zgodnie z instrukcjami producenta.
6. Przygotuj środowisko o stałej temperaturze 23 ± 1 °C i wilgotności względnej około 70% ± 10%. Wybierz miejsce, w którym nie ma intensywnej aktywności i dużego przepływu osób, aby uniknąć wibracji i zakłóceń. Używaj środków czyszczących o neutralnym zapachu, aby zapobiec jakiejkolwiek ingerencji w zachowanie mrówek.
   UWAGA: Wahania w określonych warunkach środowiskowych mogą powodować kondensację wody lub utratę wilgoci i zagrażać ogrodowi grzybowemu.
7. Po locie godowym zbierz bezskrzydłe królowe, które rozpoczęły wykopywanie gniazda, i ostrożnie umieść je pojedynczo w plastikowych pojemnikach przygotowanych z warstwą tynku. Unikaj dotykania królowych gołymi rękami i używaj rękawiczek lateksowych lub pęsety entomologicznej.
   UWAGA: Usuwanie skrzydeł i zachowanie podczas kopania gleby wskazują na reprodukcyjne samice, które już kopulowały, a zatem są w stanie założyć nową kolonię. Kolekcja Queens jest również traktowana jako pierwsza kolekcja w tej pracy.
8. Przenieś pojemniki z królowymi do lokalizacji, w której wcześniej wybrano kontrolowane środowisko. Transport królowych należy wykonywać z najwyższą ostrożnością, unikając zbyt wielu zakłóceń i utrzymując minimalną stałą temperaturę.
9. Nie manipuluj ani nie przesuwaj królowych przez około 3 dni po zebraniu, aby uniknąć stresu.

Rysunek 1. Wejście do gniazda poszerzone o skrzydlate mrówki rozmnażające się i robotnice. Poszerzone wejścia do tuneli są jedną z cech gniazda, która wskazuje na występowanie lotów godowych Atta. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

2. Utrzymanie królowych

1. Początkowo należy dodawać 2,5 ml wody do warstwy gipsu biorcy co 2 dni za pomocą strzykawki igłowej.
   1. Zamiast otwierać pojemnik, ostrożnie przebij pokrywki pojemnika igłą, aby uniknąć zakłóceń spowodowanych manipulacją. Ten sam otwór może być używany w tym okresie. Upewnij się, że dodana woda nie nasiąknie warstwą tynku. Unikaj bezpośredniego podlewania królowej, początkowej gąbki grzybowej i wszelkich niedojrzałych. Dopóki ogród grzybowy wykazuje suchy wygląd przy braku wody, należy nawadniać warstwę tynku.
2. Dwa tygodnie po zbiorze sprawdź, czy grzyb został zwrócony przez królowe. Jeśli nie ma grzyba, przenieś około 2 g grzyba uzyskanego z założonej kolonii. Wykonaj ten krok również, jeśli grzyb się nie rozwija.
   UWAGA: W celu przeniesienia grzyba konieczne jest zebranie zdrowego grzyba z założonej kolonii i usunięcie wszystkich mrówek, które mogą się na niej znajdować. Użyj łyżki stołowej, pęsety entomologicznej i lateksowych rękawiczek, aby manipulować grzybem.
3. Po pojawieniu się pierwszych robotnic zacznij regularnie oferować fragmenty młodych i cienkich liści, zgodnie z aktywnością cięcia kolonii. Upewnij się, że oferowane liście są zdrowe, a rośliny nie zostały potraktowane insektycydami lub innymi substancjami chemicznymi. We wczesnych stadiach upewnij się, że fragmenty liści nie przekraczają 4 cm.
   UWAGA: Gdy pierwsze robotnice rozpoczynają żerowanie na liściach, po ich pojawieniu się należy podać materiał roślinny. Częstotliwość składania zależy od zwinności, z jaką robotnice wprowadzają materiał roślinny do grzyba, ale może wynosić do 2-3 dni w tygodniu. Można również oferować płatki owsiane i płatki kukurydziane, ale należy je przeplatać z liśćmi, aby uniknąć wysuszenia grzybów.
4. Oferując nowe liście, usuń odpady kolonii i suche fragmenty liści. Unikaj używania perfum, kremów nawilżających, kremów lub innych substancji o silnym zapachu podczas manipulowania królowymi. Dodatkowo podczas wszystkich procesów używaj rękawiczek lateksowych.
5. Śledź rozwój kolonii, a gdy ogród grzybowy osiągnie co najmniej połowę objętości pojemnika, przenieś kolonię do sztucznego, trwałego gniazda.
   UWAGA: Ponieważ tempo rozwoju jest nieodłączne dla każdej kolonii, nie ma szacowanego czasu na przeniesienie kolonii. Zwykle rodziny z pierwszej kolekcji są przenoszone do gniazd z komorą ogrodową na grzyby o maksymalnej objętości 1 litra, ze względu na mały ogród grzybowy.

3. Kolekcja młodych kolonii

1. Zaopatrz się w plastikowe pojemniki o pojemności około 500 ml.
2. Około 6 miesięcy po locie godowym zidentyfikuj orientacyjne kopce w kształcie wieży z granulowanymi cząstkami gleby (Rysunek 1) z początkowych gniazd Atta (Rysunek 2) w miejscach, w których wcześniej zaznaczono występowanie mrówek ścinających liście.
   UWAGA: Szacuje się, że sześć miesięcy po locie godowym gniazda młodych kolonii znajdują się w glebie na głębokości do 1 m. W tym okresie wskazana jest nowa kolekcja, aby osiągnąć większe szanse na udane i trwałe kolonie w dużych ilościach.
3. Za pomocą motyki ogrodowej wykop wejście do gniazda, aż dotrzesz do komory, w której znajduje się młoda kolonia. Zbierz królową, ogród grzybów, niedojrzałe i młode robotnice i umieść je w plastikowym pojemniku. Przeprowadź proces zbierania tak delikatnie, jak to możliwe.
   UWAGA: Oczywiście zostanie również zebrana duża ilość gleby, która powinna być stopniowo usuwana w przyszłych procedurach pielęgnacyjnych w laboratorium.
4. Przenieś plastikowe pojemniki z pokrywką zawierającą kolonie do wyznaczonego kontrolowanego środowiska. Transport młodych kolonii należy wykonywać z najwyższą ostrożnością, unikając zbyt wielu zakłóceń i utrzymując minimalną stałą temperaturę. Powstrzymaj się od manipulowania lub przenoszenia kolonii przez około 3 dni, aby uniknąć stresu. Jeśli w pomieszczeniu panuje aktywna rutyna, na kolonie można nałożyć ciemną szmatkę.

Rysunek 2. Kopiec ziemny w kształcie wieży. Charakterystyczny kopiec w kształcie wieży wskazuje na obecność zalążków kolonii Atta sexdens i Atta laevigata. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

4. Utrzymanie młodych kolonii

1. Dostarczaj cienkie młode liście 3 razy w tygodniu.
   1. Upewnij się, że oferowane liście są zdrowe, a rośliny nie zostały potraktowane środkami owadobójczymi lub innymi substancjami chemicznymi. Na tym etapie upewnij się, że fragmenty liści mają co najmniej 7 cm długości.
      UWAGA: Płatki owsiane i płatki kukurydziane mogą być również oferowane, ale należy je przeplatać z liśćmi, aby uniknąć wysuszenia grzybów.
   2. Częstotliwość składania zależy od zwinności, z jaką pracownicy wprowadzają materiał roślinny do grzyba. Przy intensywnej aktywności cięcia zwiększaj ofiarę dwa razy dziennie, trzy razy w tygodniu lub 5 dni w tygodniu.
2. Oferując nowe liście, usuń odpady kolonii, w tym resztki gleby, za pomocą łyżki. Podczas wszystkich procesów używaj rękawiczek lateksowych. Podczas manipulowania młodymi koloniami unikaj używania perfum, środków nawilżających, kremów lub innych substancji o silnym zapachu.
   UWAGA: Pracownicy sami oddzielą glebę i odpady od grzyba.
3. Śledź rozwój kolonii, a gdy ogród grzybowy osiągnie co najmniej połowę objętości pojemnika, przenieś kolonię do sztucznego, trwałego gniazda.
   UWAGA: Ponieważ tempo rozwoju jest nieodłączne dla każdej kolonii, nie ma szacowanego czasu na przeniesienie kolonii.

Rysunek 3: Rodzaje sztucznych gniazd do przechowywania kolonii Atta sexdens i Atta laevigata. Ilustracja trwałych sztucznych gniazd mrówek tnących liście: klauzurowe pionowe ustawienie gniazda, klauzurowe poziome ustawienie gniazda i ustawienie gniazda na otwartej arenie. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

5. Trwałe sztuczne gniazda

1. Przygotuj klauzurowe pionowe gniazdo zgodnie z poniższym opisem (Rysunek 3 i Rysunek 4).
   UWAGA: Konfiguracje gniazd klauzurowych powinny zawsze mieć różnych odbiorców, aby oddzielnie udawać (1) komorę ogrodową na grzyby, (2) komorę na odpady i (3) komorę żerowania. Początkowo powinien zaczynać się od trzech pojemników, ale można dodać więcej odbiorców, aby zwiększyć ogród grzybów. Gniazda mogą różnić się wielkością i materiałem w zależności od ich przeznaczenia eksperymentalnego, chociaż tutaj opisano i zaleca się stosowanie materiałów przezroczystych. Pojemniki muszą być bez otworów, w przeciwnym razie mrówki uciekną. Opisany poniżej rodzaj gniazda może być używany do ogólnych badań, ale nie jest dobrze zalecany do asertywnego zbierania mrówek ze względu na zakłócenia spowodowane zdejmowaniem pokrywy, co powoduje duże poruszenie wśród osobników. Niemniej jednak, ze względu na przezroczystość materiału, możliwe jest zlokalizowanie królowej i różnych kast mrówek nawet wtedy, gdy ogród grzybów wypełnił cały pojemnik. Ponieważ jest to tendencja, zawsze zakłada się, że niedojrzałe osobniki znajdują się w środku ogrodu grzybowego, gdy zajmuje on większość przestrzeni dostępnej w pionowych pojemnikach.
   1. Wybierz przezroczysty pojemnik z pokrywką o pojemności około 1 l i dodaj 1 cm warstwę wysoce chłonnej bazy gipsowej. To będzie komora ogrodowa z grzybami. Wybierz dwa przezroczyste pojemniki z pokrywą o pojemności około 500 ml każdy, które będą komorami do usuwania odpadów i żerowania. Mrówki wybiorą, która komora będzie każda, a następnie upewnią się, że nie są zamienione.
      UWAGA: Aby przygotować podłoże tynku, postępuj zgodnie z instrukcjami producenta.
   2. Przedziurawij i połącz trzy pojemniki przezroczystą rurką lub wężem. W razie potrzeby nałóż taśmę maskującą na brzeg rurek, aby zagwarantować połączenie uda z pojemnikami i uniknąć ucieczki mrówek. Umieść pojemnik na podstawę gipsu pośrodku, a pozostałe pojemniki po przeciwnych stronach.
   3. Ostrożnie przenieś gąbkę na grzyby wybranych kolonii (patrz krok 2.5 i krok 4.3) wraz z królową, robotnicami i niedojrzałymi osobnikami do pojemnika na podstawę gipsu. Przed przeniesieniem upewnij się, że podłoże tynku jest podlane. Używaj rękawiczek lateksowych.
2. Przygotuj poziome gniazdo klauzurowe, jak opisano poniżej (Rysunek 3 i Rysunek 4).
   UWAGA: Gniazda o układzie poziomym pozwalają na dokładną obserwację ogrodu grzybowego i działań robotnic w stosunku do niego. Ponieważ młodsze części ogrodu grzybowego znajdują się na górze, można zaobserwować, jak ostatnio oferowane podłoża są włączane przez pracowników. Nowe części grzyba można dostrzec po jego kolorze, który będzie podobny do koloru ostatniego oferowanego zasobu, podczas gdy starsze części zwykle mają kolor beżowy. Potomstwo i królową można również łatwo zlokalizować, ponieważ w poziomych pojemnikach zwykle znajdują się na szczycie ogrodu grzybowego, nawet jeśli zajmuje on większość przestrzeni. Ta konfiguracja może być używana do badań skoncentrowanych na zachowaniu, ogniskowego pobierania próbek i celów popularyzatorskich, ponieważ daje percepcję organizacji wewnątrz gniazda.
   1. Zaopatrz się w przezroczysty pojemnik z pokrywką o wymiarach około 31 cm x 21 cm x 4,5 cm i dodaj 1 cm warstwę wysoce chłonnej bazy gipsowej. To będzie komora ogrodowa z grzybami. Wybierz dwa przezroczyste pojemniki z pokrywą o pojemności około 500 ml każdy, które będą komorami do usuwania odpadów i żerowania. Mrówki wybiorą, która komora będzie każda, a następnie upewnią się, że nie są zamienione.
      UWAGA: Aby przygotować podłoże tynku, postępuj zgodnie z instrukcjami producenta. W razie potrzeby zamknij niewielką przestrzeń między pokrywką a pojemnikiem taśmą maskującą, aby zapobiec ucieczce mrówek.
   2. Perforować i łączyć pojemniki za pomocą przezroczystej rurki lub węża. W razie potrzeby nałóż taśmę maskującą na brzeg rurek, aby zagwarantować połączenie uda z pojemnikami i uniknąć ucieczki mrówek. Umieść pojemnik na podstawę gipsu pośrodku, a pozostałe pojemniki po przeciwnych stronach.
   3. Ostrożnie przenieś gąbkę na grzyby wybranych kolonii (patrz krok 2.5 i krok 4.3) wraz z królową, robotnicami i niedojrzałymi osobnikami do pojemnika na podstawę gipsu. Przed przeniesieniem upewnij się, że podłoże tynku jest podlane. Używaj rękawiczek lateksowych.
3. Przygotuj otwarte gniazdo na arenie, jak opisano poniżej (Rysunek 3 i Rysunek 5).
   UWAGA: Otwarte gniazda na arenie pozwalają na zbieranie mrówek bez większych zakłóceń i analizy zachowań związanych z żerowaniem. Mogą również zapewnić wiarygodną reprezentację kolonii znalezionej w naturze do celów popularyzacji nauki.
   1. Wybierz przezroczysty pojemnik z pokrywką o pojemności około 1 l i dodaj 1 cm warstwę wysoce chłonnej warstwy tynku. To będzie komora ogrodowa z grzybami.
      UWAGA: Zaleca się rozpoczęcie od pojemników o pojemności 1 litra i stopniowe przechodzenie do pojemników o większej objętości, aby uzyskać większy ogród grzybowy. Pojemniki nie powinny jednak przekraczać objętości 5 litrów. Dodaj tyle pojemników, ile potrzeba.
   2. Wybierz otwartą arenę. Wielkość areny może się różnić w zależności od celów studiów. Jeśli wybrana jest duża arena, umieść pojemniki z ogrodem grzybów w jego wnętrzu (Rysunek 5). W przypadku małej areny, podłącz ją do pojemnika na grzyby ogrodowe za pomocą przezroczystego węża lub rurki (Rysunek 3). Arena będzie służyć jako komora do żerowania i usuwania odpadów, więc upewnij się, że nie jest zbyt mała.
   3. Nałóż jedną warstwę płynu politetrafluoroetylenowego jednym ruchem na granicę areny, aby zatrzymać mrówki. Użyj bawełny nasączonej płynem i rękawicy nitrylowej.
      UWAGA: Unikaj wdychania i dotykania skóry podczas używania płynu z politetrafluoroetylenu.
   4. Ostrożnie przenieś gąbkę na grzyby wybranych kolonii (patrz krok 2.5 i krok 4.3) wraz z królową, robotnicami i niedojrzałymi osobnikami do pojemnika na podstawę gipsu. Przed przeniesieniem upewnij się, że podłoże tynku jest podlane. Używaj rękawiczek lateksowych.

Rysunek 4: Sztuczne klauzurowe gniazda mrówek ścinających liście Atta sexdens i Atta laevigata. Krużgankowe pionowe ustawienie gniazda z góry (A) i z boku (B); krużgankowe poziome ustawienie gniazda z góry (C) i z boku (D). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Sztuczne otwarte gniazdo mrówek tnących liście Atta sexdens i Atta laevigata. Otwarta konfiguracja gniazda areny z górą Atta sexdens (A) i widokiem z boku (B). 1) Komory ogrodowe z grzybami; 2) odpady; 3) Plastry pomarańczy; 4) Szkło z warstwą politetrafluoroetylenu (PTFE). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

6. Utrzymanie rozwiniętych kolonii

1. Codziennie podawaj co najmniej jeden duży liść do komory żerowej na kolonię z 1 litrem ogrodu grzybów. Jeśli aktywność cięcia mrówek jest intensywna, zwiększ liczbę liści. Jeśli grzyb jest suchy, wstępnie zwilż liście, aby zapewnić dodatkową wilgotność. W gniazdach klauzurowych należy szybko złożyć ofiarę, aby uniknąć ucieczki mrówek z komory żerowania.
   UWAGA: Tutaj zbiera się liście z gatunków roślin, takich jak morwa (Morus nigra), mango (Mangifera indica), eukaliptus (Eucalyptus sp.), jambolan (Syzygium cumini), hibiskus (Hibiscus sp.), acalypha (Acalypha wilkesiana) i ligustrum (Ligustrum lucidum).
   1. Oferuj owoce, takie jak pomarańcza i jabłko, oraz płatki owsiane i kukurydziane, aby urozmaicić i uzupełnić dietę. Dużym rodzinom o intensywnej aktywności żerowej podawaj codziennie płatki owsiane i kukurydziane, a raz w tygodniu owoce. Jeśli tak nie jest, podawaj płatki na przemian z liśćmi, ale nie częściej niż trzy razy w tygodniu, a owoce raz lub dwa razy w miesiącu. Dostosuj ilość i częstotliwość każdego pokarmu do aktywności żerowania mrówek.
   2. Jeśli opisane powyżej opcje nie są dostępne, zidentyfikuj preferencje żywieniowe mrówek wśród liści, kwiatów i owoców regionalnych drzew i krzewów, a nawet skomercjalizowanych warzyw, zbóż i innych płatków. Unikaj oferowania zasobów z obronnymi związkami chemicznymi i pestycydami.
2. Usuwaj całą zawartość komory na odpady co 2 tygodnie ze wszystkich kolonii. Usuń również pracowników w celu kontroli populacji. Jeśli robotnice przenoszą zdrowy grzyb do komory na odpady, upewnij się, że królowa nie znajduje się na niej i usuń ją. Jeśli ilość wyrzucanych odpadów jest duża lub jest zbyt wilgotna, należy je usuwać raz w tygodniu.
3. Usuń materiał, który nie został pobrany przez mrówki, z komory żerowania za każdym razem, gdy oferują nowe i upewnij się, że jest zawsze czysty.
   1. Jeśli robotnice przenoszą zdrowy grzyb do komory żerowania, należy go zakłócić, pozostawić otwartą pokrywę pojemnika i nałożyć neutralny talk na powierzchnię brzegu komory. Wykonuj tę procedurę tylko wtedy, gdy w komorze grzybów jest jeszcze trochę miejsca, w ten sposób robotnice przeniosą grzyb z powrotem do pojemnika bez utraty go lub niedojrzałych osobników.
4. Jeśli chcesz mieć więcej ogrodu grzybowego, dodaj kolejny otynkowany pojemnik i przenieś do niego część gąbki na grzyby. Dopóki grzyb nie dotrze do połowy pojemnika, dodaj liście do komory na grzyby. Wzrost ogrodu grzybowego powinien odbywać się stopniowo, aby nie zagrozić równowadze kolonii. Jeśli potrzebny jest większy pojemnik, upewnij się, że grzyb zajmuje całą przestrzeń najmniejszych pojemników przed jego przeniesieniem. Nie należy dopuścić do gromadzenia się odpadów kolonii i suchych liści w komorze ogrodowej z grzybami.
5. Sprawdź podstawę tynku z pojemników, ponieważ z czasem może ona nabrać ciemnobrązowego koloru i stać się nieskuteczna z powodu wydalania mrówek, transportu odpadów i wysokiego stężenia wilgoci. Ponadto niektóre kolonie mogą przeciąć warstwę i usunąć ją. W takich przypadkach przenieś ogród grzybowy do nowego otynkowanego pojemnika.

Wyniki

Schemat blokowy przedstawiający proces zbierania mrówek jest pokazany w Rysunek 6. W tym miejscu przedstawiono niektóre wyniki uzyskane przy użyciu opisanego powyżej protokołu zbierania, konserwacji i konfiguracji gniazd.

Rysunek 6: Schemat blokowy do zbierania kolonii mrówek tnących liście.

Dyskusja

Opisany tutaj protokół mający na celu utrzymanie kolonii mrówek ścinających liście jest opracowywany i stosowany od ponad trzech dekad w sposób asertywny i powtarzalny. Pozwoliło to na rozwój badań, które byłyby ograniczone warunkami terenowymi. W ten sposób zdrowe mrówki i kolonie stały się dostępne do badań w kilku obszarach, takich jak morfologia porównawcza, toksykologia^51,52, histologia⁵³ i mikrobiologia 54,55,56 na poziomie osobnika ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Kleszcze entomologiczne	N/A	N/A	/A
Zbiornik szklany	N/A	N/A	Szkło hartowane, wykonane na zamówienie
Wąż	N/A	N/A	Przezroczysty, PVC 1/2 cala x 2,0 mm
Rękawice lateksowe	Descarpack	550301	Nie dotyczy
Rękawice nitrylowe	Descarpack	433301	N/A
Open arena	N/A	N/A	Skrzynka polipropylenowa
Woreczek na gips	N/A	N/A	Worek gipsowy stosowany w budownictwie, musi być chłonny
Plastikowe pojemniki do	zbiórki Prafesta	Natural Cód.: 8231/Natural Cód.: 8262	Pokrywa, przezroczysta, polipropylenowa
Plastikowe pojemniki na gniazda	Prafesta	Wycofane	Polistyren, hermetyczny
Teflon	Dupont	N/A	Ciecz politetrafluoroetylenowa (dyspersja PTFE 30)