Artykuł metodologiczny

Destabilizacja przyśrodkowego łąkotki i chrząstki rys mysiego modelu przyspieszonej choroby zwyrodnieniowej stawów

DOI:

10.3791/64159

⸱

6 lipca 2022

 ,  ,  ,  , 
1Institute of Biomedical and Environmental Health Research, University of the West of Scotland, 2Institute of Infection, Immunity and Inflammation, University of Glasgow

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obecny protokół opisuje kontrolowane zadrapania mikroostrza na powierzchni chrząstki stawowej po destabilizacji kolana myszy poprzez przecięcie przyśrodkowego więzadła minipiszczelowego. Ten model zwierzęcy przedstawia przyspieszoną postać choroby zwyrodnieniowej stawów (OA) odpowiednią do badania tworzenia osteofitów, osteosklerozy i bólu we wczesnym stadium.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Choroba zwyrodnieniowa stawów jest najbardziej rozpowszechnioną chorobą układu mięśniowo-szkieletowego u osób powyżej 45 roku życia, co prowadzi do rosnących kosztów ekonomicznych i społecznych. Modele zwierzęce są wykorzystywane do naśladowania wielu aspektów choroby. Niniejszy protokół opisuje model destabilizacji i zadrapania chrząstki (DCS) pourazowej choroby zwyrodnieniowej stawów. Opierając się na szeroko stosowanej destabilizacji modelu łąkotki przyśrodkowej (DMM), DCS wprowadza trzy rysy na powierzchni chrząstki. W niniejszym artykule przedstawiono kroki mające na celu destabilizację kolana poprzez przecięcie przyśrodkowego więzadła łąkotkowego, a następnie trzy celowe powierzchowne zadrapania na chrząstce stawowej. Przedstawiono również możliwe metody analizy za pomocą dynamicznego obciążania, tomografii mikrokomputerowej i histologii. Chociaż model DCS nie jest zalecany w badaniach, które koncentrują się na wpływie choroby zwyrodnieniowej stawów na chrząstkę, umożliwia badanie rozwoju choroby zwyrodnieniowej stawów w krótszym oknie czasowym, ze szczególnym uwzględnieniem (1) tworzenia osteofitów, (2) choroby zwyrodnieniowej stawów i bólu urazu oraz (3) wpływu uszkodzenia chrząstki w całym stawie.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Choroba zwyrodnieniowa stawów (OA) jest najbardziej rozpowszechnioną chorobą układu mięśniowo-szkieletowego u osób powyżej 45 roku życia, z ponad 8,75 milionami szukających leczenia w Wielkiej Brytanii1. Rosnące rozpowszechnienie choroby doprowadziło do wzrostu kosztów ekonomicznych i społecznych, jest głównym czynnikiem przyczyniającym się do niepełnosprawności i obniża jakość życia pacjentów1. Ze względu na brak dostępnych metod leczenia istnieje pilna potrzeba przyspieszenia badań, aby zrozumieć rozwój i postęp choroby. Choroba jest złożona, a także ma charakter wieloczynnikowy. Głównymi pomiarami klinicznymi choroby są ból i ruchomość stawów2, a choroba zwyrodnieniowa stawów dotyczy wszystkich tkanek w stawie, nie tylko chrząstki3. Jednym z głównych wyzwań związanych ze zrozumieniem choroby zwyrodnieniowej stawów jest to, że od początkowej prezentacji/urazu do objawowej progresji choroby z bólem i unieruchomieniem mogą minąć lata, a czasem dekady.

Modelowanie choroby zwyrodnieniowej stawów u gryzoni poszerzyło naszą wiedzę na temat patofizjologii choroby zwyrodnieniowej stawów, pozwalając nam zrozumieć inicjację i progresję w znacznie krótszym czasie i dzięki szczegółowemu badaniu zaangażowanych tkanek. Istnieje wiele mysich modeli choroby zwyrodnieniowej stawów, od genetycznie modyfikowanych zwierząt po modele interwencji chirurgicznej. Najpowszechniej stosowanym mysim modelem pourazowej choroby zwyrodnieniowej stawów jest destabilizacja łąkotki przyśrodkowej (DMM)4,5. Zastrzeżeniem modelu jest zmienność między różnymi operatorami. Doświadczeni chirurdzy mogą wykonać zabieg przy minimalnym uszkodzeniu stawu, podczas gdy niedoświadczeni operatorzy odsłaniają torebkę stawową przez dłuższy czas i powodują uszkodzenia chrząstki. Ta zmienność procesu wpływa na nasilenie modelu, przy czym więcej początkowych uszkodzeń prowadzi do zwiększenia oceny uszkodzenia chrząstki i tworzenia osteofitów. Mając na celu zmniejszenie zmienności między operatorami i naśladowanie uszkodzeń chrząstki spowodowanych interwencją kliniczną, opracowano zmodyfikowaną wersję tego modelu, w której zadawane są kontrolowane dodatkowe uszkodzenia powierzchni chrząstki w postaci trzech powierzchownych zadrapań6. Pozwala to również na modelowanie progresji choroby zwyrodnieniowej stawów wynikającej z uszkodzenia chrząstki spowodowanego niektórymi interwencjami klinicznymi. W porównaniu ze standardowym modelem DMM, bezpośrednio wywołane uszkodzenie chrząstki powoduje konsekwentnie przyspieszone tworzenie wystających osteofitów, zwiększone uszkodzenie chrząstki i stan zapalny oraz mierzalny ból zastępczy u samców myszy.

Ten model jest szczególnie odpowiedni do badania wczesnego stadium pourazowej choroby zwyrodnieniowej stawów, skupiając się na tworzeniu osteofitów, prezentacji bólu (u samców myszy), zapaleniu błony maziowej i wczesnych zmianach parametrów kostnych. Spójność tworzenia osteofitów w tym modelu sprawia, że istotne jest badanie naprawy kości i kostnienia śródchrzęstnego, ponieważ tworzenie osteofitów jest procesem naprawy poprzez kostnienie śródchrzęstne7. Model naśladuje również uszkodzenia wprowadzane bezpośrednio do chrząstki podczas interwencji klinicznych, takich jak artroskopowe zabiegi chirurgiczne, a zatem nadaje się również do badania wpływu uszkodzenia chrząstki na cały staw.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury eksperymentalne zostały zatwierdzone przez Panel Oceny Etyki Uniwersytetu w Glasgow i Uniwersytetu Zachodniej Szkocji, a następnie przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Ustawy o Zwierzętach (Procedury Naukowe) z 1986 roku (UK). Do niniejszego badania wykorzystano 10-tygodniowe samce myszy C57Bl6/J, ważące około 25 g. Myszy pozyskano ze źródeł komercyjnych (patrz tabela materiałów).

1. Przygotowanie zwierząt

UWAGA: Rozważ płeć myszy w odniesieniu do celu badania, ponieważ modele pourazowej choroby OA wykazują istotne różnice w zależności od płci8,9,10.

  1. Upewnij się, że odczynnik znieczulający (2% izofluranu) jest gotowy.
    UWAGA: Można również zastosować znieczulenie iniekcyjne11. Ze względu na krótki czas trwania zabiegu zaleca się stosowanie znieczulenia wziewnego.
  2. Do kontroli chirurgicznej należy użyć oddzielnej grupy operowanej pozorowanej, dopasowanej do wieku.
    UWAGA: Kolano przeciwległe nie może być używane jako kontrola chirurgiczna (pozorowana operacja na przeciwległej nodze). Może to powodować problemy z dobrostanem zwierząt i prawdopodobnie wpłynie na chód i pomiary chodu. Kolano przeciwległe normalizuje wewnętrzne parametry kości12 i działa jako sparowane porównanie w testach bólu wywołanego13.
  3. Użyj dojrzałych szkieletowo myszy.
    UWAGA: Większość literatury inwokuje chorobę zwyrodnieniową stawów w wieku 8-12 tygodni. W obecnym badaniu myszy mają 10 tygodni
    4. .

2. Opieka przedoperacyjna (prowadzona przez asystenta chirurgicznego)

  1. W przypadku transportu z innej placówki należy odczekać co najmniej 1 tydzień przed interwencją chirurgiczną, aby myszy przystosowały się do nowego środowiska.
  2. Przeprowadzaj operację w odpowiednio wyznaczonym sterylnym pomieszczeniu, upewniając się, że wszystkie powierzchnie są sterylne (np. użyj sterylnych serwetek do zakrycia obszarów operacji).
    UWAGA: Zabieg jest aseptyczny.
  3. Ułóż i umieść sterylne narzędzia na sterylnych serwetach.
  4. Zważ mysz.
  5. Wywołać znieczulenie, wprowadzając mysz do klatki znieczulającej, a następnie wprowadzając 2% izofluoranu przez okres do 15 minut przy użyciu standardowego sprzętu do znieczulania (patrz Tabela materiałów).
    UWAGA: Klatka nie może mieć "resztkowego" znieczulenia przed wprowadzeniem myszy.
  6. Po znieczuleniu wyjmij mysz z komory anestezjologicznej i przypnij futro nad kolanem, przednią i boczną stroną od połowy goleni do połowy uda za pomocą małych maszynek do strzyżenia włosów.
    UWAGA: Wybór kolana kończyny tylnej zależy od preferencji operatora, po której stronie łatwiej jest przeprowadzić operację. Protokół ten operował lewą nogę.
  7. Upewnij się, że mysz jest w pełni znieczulona (nie reaguje na szczypanie stopy).
  8. Zdezynfekuj skórę, nakładając antybakteryjny środek do mycia skóry (np. zawierający chlorheksydynę lub jodofor, patrz Tabela materiałów) na ogoloną, odsłoniętą skórę.
  9. W przypadku analgezji należy podawać podskórnie 0,05 mg/kg buprenorfiny.
  10. Umieść mysz po stronie grzbietowej, pozostawiając kolano do operacji do góry, a nos myszy umieść w dyszy podłączonej do zestawu do znieczulenia.
  11. Przykryj mysz sterylną serwetą z małym otworem w kształcie dziurki od klucza.
  12. Ustaw nogę przeznaczoną do operacji z kolanem zgiętym pod kątem mniejszym niż 90°, z więzadłem rzepki skierowanym do góry i stopą unieruchomioną taśmą chirurgiczną.

3. Destabilizacja zabiegu łąkotki przyśrodkowej, a następnie zadrapanie chrząstki

  1. Dostosuj mikroskop, aby ustawić ostrość na więzadle rzepki.
  2. Ściśnij skórę kolana po bocznej stronie ząbkowanymi kleszczami (patrz Tabela materiałów), wykonaj małe nacięcie równolegle do dystalnego ścięgna rzepki za pomocą nożyczek chirurgicznych, wprowadź nożyczki i rozszerz nacięcie do około 1 cm. Przesuń skórę na stronę przyśrodkową, odsłaniając więzadło rzepki i bliższy płaskowyż piszczelowy (Ryc. 1).
  3. Za pomocą ostrza z numerem 11 wykonaj nacięcie wzdłuż przyśrodkowej strony więzadła rzepki, od góry do dołu więzadła (Rysunek 1A). Po dotarciu do dolnej części więzadła rzepki obróć ostrze o 90° i przedłuż nacięcie od więzadła rzepki w kierunku przyśrodkowym, aby uzyskać dostęp do torebki stawowej.
    UWAGA: W tym lub kolejnych krokach może wystąpić krwawienie. Jeśli wystąpi krwawienie, użyj sterylnego wacika i uciskaj przez kilka sekund (5 do 30 s).
  4. Ściśnij więzadło rzepki kleszczami i obróć nadgarstek, aby przesunąć więzadło rzepki na boczną stronę, na tyle, aby odsłonić podrzepkową poduszkę tłuszczową (IFP).
    UWAGA: Aby zminimalizować uszkodzenie więzadła rzepki, nie trzymaj pęsety zbyt mocno, tylko na tyle, aby więzadło było z boku.
  5. Trzymając lekko więzadło rzepki, ściśnij IFP mikropęsetą (patrz Tabela materiałów), aby ją podnieść i lekko przesunąć do góry. Pozwala to na uwidocznienie więzadła łąkotki przyśrodkowej.
  6. Zidentyfikuj więzadło oponowo-piszczelowe przyśrodkowe (MMTL) łąkotki przyśrodkowej, które zakotwicza róg czaszkowy łąkotki przyśrodkowej do przedniego plateau piszczelowego (ryc. 1B).
  7. Unikaj uszkodzeń i długotrwałego odsłonięcia chrząstki na płaskowyżu piszczelowym lub kłykciu kości udowej.
  8. Ostrożnie odetnij MMTL małymi nożyczkami sprężynowymi Vannas o średnicy 2 mm, pozostawiając nienaruszoną łąkotkę przyśrodkową i inne więzadła. W tym momencie zabieg chirurgiczny dla modelu DMM jest zakończony (ryc. 1C).
  9. Za pomocą noża mikrochirurgicznego o średnicy 3 mm zaznacz trzy równomiernie rozmieszczone wgłębienia na chrząstce stawowej piszczelowej w kierunku od tylnej do przedniej części.
    UWAGA: Nacięcia mają około 1 mm długości i uszkadzają tylko powierzchnię chrząstki (Rysunek 2D).
    1. Nie używaj nadmiernej siły z ostrzem na chrząstce (tj. upewnij się, że zadrapania są powierzchowne). Ten dodatkowy krok powoduje uszkodzenie chrząstki, indukując model DCS.
  10. Zamknij skórę dwoma lub trzema małymi metalowymi klipsami do zamykania ran o średnicy 7 mm lub wchłanialnymi podskórnymi szwami chirurgicznymi 6-0 (patrz tabela materiałów).
    UWAGA: Podskórne szwy chirurgiczne są lepsze, ponieważ pozwalają uniknąć dalszej interwencji, ale wydłużają czas trwania operacji. Szwy zewnętrzne zwiększają ryzyko otwarcia rany przez gryzienie myszy.
  11. Zidentyfikuj więzadło łąkotki przyśrodkowej łąkotki przyśrodkowej do operacji pozorowanej, ale nie przecinaj.
  12. W przypadku myszy otrzymujących tylko zadrapania chrząstki, wykonaj trzy powierzchowne zadrapania bez przecinania więzadła.
    UWAGA: Pomiędzy każdą myszą zmieniaj rękawiczki i sterylizuj narzędzia w autoklawie. Pamiętaj, aby sprawdzić, czy instrumenty ostygły przed ponownym użyciem.

4. Opieka pooperacyjna

  1. Jeśli wystąpiło krwawienie (>50 μl), wstrzyknąć podskórnie (na grzbiet myszy) 500 μl ciepłej, sterylnej soli fizjologicznej).
    UWAGA: Z naszego doświadczenia wynika, że chociaż myszy mają niewielkie krwawienia, nigdy nie jest to więcej niż mała kropla, a zatem płyny nie muszą być uzupełniane.
  2. Po operacji umieść mysz w klatce regeneracyjnej na czystej papierowej chusteczce i pozwól na powrót do zdrowia po znieczuleniu (5-10 min).
  3. Po operacji przenieś w pełni przytomne myszy do czystej klatki ze świeżą ściółką.
  4. W ciągu 72 godzin po interwencji chirurgicznej należy obserwować, czy nie ma żadnych oznak bólu lub niepokoju. Zwróć uwagę na:
    1. Zmiany masy ciała. Chociaż masa ciała może się zmniejszyć w pierwszym i drugim dniu, zwykle nie jest to więcej niż 5% masy ciała sprzed operacji.
    2. Ogólny brak pielęgnacji lub nadmierna pielęgnacja wokół nacięcia.
    3. Oznaki ogólnego pogorszenia stanu zdrowia, takie jak zgarbiona postawa, grymas twarzy i/lub nieprawidłowy oddech.
    4. Zakażenie rany sygnalizowane obrzękiem, upławą lub otwarciem rany.
      UWAGA: Zakażenie może wystąpić, jeśli rana pooperacyjna się otworzy. Ponieważ chirurgiczne gojenie ran (np. wymiana brakujących metalowych klipsów lub ponowne szycie) jest procedurą regulowaną, przed wykonaniem naprawy należy uzyskać odpowiednią zgodę.
  5. Usuń metalowe klipsy między 5-7 dniem po zabiegu.
  6. Utrzymuj myszy zazwyczaj 2-52 tygodnie po operacji, w zależności od projektu badania.
  7. Oceń ból/chód w dowolnym momencie badania.
    UWAGA: W niniejszym badaniu zastosowano dynamiczne przenoszenie ciężaru, jak opisano w kroku 5.1.
  8. Poddać zwierzę eutanazji zatwierdzoną metodą, zgodnie z krajowymi umowami licencyjnymi, lokalnymi wytycznymi i zatwierdzeniem eksperymentalnym.
    UWAGA: W niniejszym badaniu zwierzęta zostały poddane eutanazji poprzez wykrwawienie (nakłucie serca) w znieczuleniu końcowym, a następnie zwichnięcie szyjki macicy14.

5. Ocena choroby zwyrodnieniowej stawów

  1. Zmierz dynamiczne przenoszenie ciężaru jako zastępczy pomiar bólu, wykonując poniższe czynności.
    UWAGA: Ponieważ myszy są zwierzętami drapieżnymi, mają tendencję do ukrywania zachowań bólowych. To sprawia, że pomiar bólu jest trudny. Istnieje wiele sposobów mierzenia bólu wywołanego, takich jak Von Frey15 i analiza chodu16. W niniejszym badaniu mierzono obciążenie różnicowe między operowaną nogą z chorobą zwyrodnieniową stawów a nieoperowaną nogą kontrolną na macie uciskowej, podczas gdy mysz znajdowała się w klatce (patrz Tabela materiałów, Rysunek 2A).
    1. Zważ mysz. Wytaruj i skalibruj matę dociskową zgodnie z instrukcjami producenta (patrz Dynamiczne urządzenia nośne w Tabeli materiałów). Wprowadź mysz do klatki.
    2. Rejestruj ruch i nacisk łapy myszy w klatce przez 5 minut. Analizuj uzyskane dane, aby sprawdzić poprawność przez 1 minutę, postępując zgodnie z instrukcjami producenta.
      UWAGA: Automatyczna analiza producenta w oprogramowaniu DWB (patrz dynamiczne urządzenia do przenoszenia ciężaru w Tabeli materiałów) zapewnia pomiary każdej łapy proporcjonalnie do całkowitej masy ciała, zatwierdzony czas, w którym każda łapa pozostawała na macie, oraz oszacowanie powierzchni maty zajmowanej przez każdą łapę. Pozwala to na obliczenie obciążenia różnicowego między dwiema tylnymi łapami, obciążenia różnicowego między przednimi i tylnymi łapami, zwiększenia obciążenia przedniej łapy (jeśli ta sama mysz była mierzona przez pewien okres czasu), czasu spędzonego na podnoszeniu nogi OA w porównaniu z nogą przeciwległą i powierzchnią łapy.
  2. Ilościowe określenie zwapniałej tkanki za pomocą tomografii mikrokomputerowej (μCT).
    UWAGA: Chociaż podchrzęstną osteosklerozę kości i tworzenie osteofitów można mierzyć w sekcjach histologicznych, μCT oferuje możliwość trójwymiarowego określenia ilościowego. Rozdzielczość przechwytywania obrazu w μCT przy 5 μm jest wystarczająca, ponieważ pozwala to na wizualizację mniejszych struktur, takich jak osteofity, chociaż im wyższa rozdzielczość, tym lepiej.
    1. Utrwalić stawy kolanowe w 4% roztworze paraformaldehydu przez 24 godziny, a następnie przenieść do 70% EtOH.
    2. Skanowanie stawów kolanowych w skanerze μCT.
      UWAGA: W niniejszym badaniu próbki skanowano na skanerze μCT (patrz tabela materiałów) z filtrem aluminiowym 0,5 ustawionym na napięcie 50 kV i 200 μA. Próbki badano przy wielkości woksela 4,5 μm; Kąt obrotu 2 μm, 0,2° do obrazowania i kąt obrotu 0,5° do oznaczania ilościowego.
    3. Rekonstruuj skany, aby umożliwić wizualizację 3D. Prezentowane tu skany zostały zrekonstruowane przy użyciu kompatybilnego oprogramowania (patrz Spis materiałów).
    4. Przeanalizuj stwardnienie podchrzęstne kości (Rysunek 2B) wykonując poniższe czynności.
      1. Wybierz objętość zainteresowania (VOI) 0,5 mm × 0,9 mm × 0,9 mm w środku obciążenia przyśrodkowej płaskowyżu piszczelowego17.
      2. Normalizuj w stosunku do wewnętrznego fenotypu kości myszy, analizując nieoperowaną nogę.
      3. Określ gęstość kości podchrzęstnej i mikroarchitekturę, wybierając obszar zainteresowania (ROI) wyznaczający strukturę beleczkową w nasadzie piszczelowej, płytce podchrzęstnej lub całej kości podchrzęstnej w dwuwymiarowym widoku koronalnym stosu za pomocą oprogramowania CTan (patrz tabela materiałów).
        UWAGA: W miarę postępu choroby oddzielenie płytki podchrzęstnej od obszaru beleczkowego podchrzęstnego staje się trudniejsze do odróżnienia. Zaleca się wówczas analizę obszaru kości podchrzęstnej wybranego od przestrzeni stawowej do płytki wzrostowej.
    5. Określ ilościowo osteofity (Rysunek 2C), wykonując poniższe czynności.
      1. Identyfikacja osteofitów w zrekonstruowanych stosach obrazów trójwymiarowych za pomocą oprogramowania CTvol (patrz tabela materiałów).
        UWAGA: Zmineralizowane osteofity to wypukłości podobne do tkanej kości widoczne po przyśrodkowej stronie kości podchrzęstnej18. Ich przykład jest oznaczony żółtymi strzałkami w Rysunek 2C.
      2. Ręcznie policz liczbę zidentyfikowanych osteofitów w przyśrodkowej stronie stawu kolanowego.
      3. Zmierz objętość osteofitów w sekwencyjnej analizie obrazu 2D (przy użyciu analizatora CT), ręcznie wyznaczając krawędź osteofitów, wystającą z płytki podchrzęstnej jako obszar zainteresowania (ROI) do analizy.
      4. Oblicz gęstość kości osteofitu jako stosunek objętości kości do objętości osteofitu za pomocą oprogramowania analizatora CT (patrz tabela materiałów).
  3. Oceń uszkodzenie chrząstki i zapalenie błony maziowej (Rysunek 2D) zgodnie z wynikiem uszkodzenia chrząstki OARSI < sup class="xref">19 i wynikiem zapalenia błony maziowej20 na odcinkach 6 μm zatopionych w parafinie.
    1. Po skanowaniu odwapnić stawy kolanowe w 10% EDTA w temperaturze 4 °C przez minimum 2 tygodnie, zmieniając roztwór dwa razy w tygodniu.
    2. Zanurz próbki w parafinie. Informacje na temat poddanych zabiegom i okresów inkubacji znajdują się w pliku uzupełniającym 1.
    3. Wyciąć 5 μm przekroje koronalne próbek zatopionych w parafinie na obrotowym mikrotomie (patrz tabela materiałów).
    4. Wybierz sekcje w obszarze, w którym spotykają się kłykcie piszczelowe i udowe (Rysunek 2D). Wybierz dwie sekcje w trzech jednakowo oddalonych obszarach połączenia.
      UWAGA: Przekroje ocenione w niniejszym badaniu zostały wybrane w obszarach oddalonych od siebie o 80-100 μm.
    5. Skrawki bejcowania za pomocą Safranin-O i Fast green (patrz Tabela materiałów), postępując zgodnie z poniższymi krokami.
      1. Odparafinować odcinki zanurzając je (we wspomnianej kolejności) w ksylenie na 5 min (2x), 100% etanolu na 2 min, 95% etanolu na 2 min, 80% etanolu na 2 min i 70% etanolu na 2 min.
      2. Barwienie przefiltrowaną hematoksyliną (patrz tabela materiałów) przez 30 s. Następnie płucz w wodzie z kranu przez 5 minut (trzy razy).
      3. Myć buforem Scotta (2 g wodorowęglanu sodu i 10 g siarczanu magnezu w 1 l wody destylowanej) przez 2 minuty. Płukać w "wodzie z kranu" przez 5 minut (trzy razy).
      4. Plamić przez 4 minuty 0,2% Fast Green. Zanurz się w 1% lodowatym kwasie octowym pięć razy (świeżo przygotowany podczas każdej sesji). Szybko spłucz w wodzie z kranu.
      5. Barwieć przez 5 minut 0,5% Safraniną-O. Spłucz w 95% etanolu. Odwadniaj skrawki w 100% etanolu przez 3 minuty, a następnie 3 minuty w ksylenie.
    6. Sekcje punktacji zgodnie z Glassonem i wsp. dla chrząstki19 i Jackson et al. dla synovitis20.
      UWAGA: Istnieją inne metody kwantyfikacji, takie jak kwantyfikacja komputerowa autorstwa Pinamont et al.21.
    7. Zweryfikuj system punktacji z dwoma różnymi punktatorami, ślepymi na eksperyment.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Procentowe obciążenie na całkowitą masę ciała nogi obsługiwanej/OA zostało porównane z nogą przeciwległą/kontrolną. Chociaż inne parametry mogą również powodować znaczące różnice, takie jak wzrost obciążenia przedniej łapy po interwencji chirurgicznej, konsekwentna zmiana obciążenia tylnej łapy wskazuje na preferencję używania jednej nogi nad drugą i jest bardziej bezpośrednim wskaźnikiem znacznego dyskomfortu myszy z powodu rozwoju choroby zwyrodnieniowej stawów. Nie zaobserwowano znaczących zmian w obciążeniu tylnej nogi w modelu DMM w ciągu 8 tygodni po indukcji, podczas gdy myszy DCS znacznie faworyzują nogę przeciwległą/kontrolną 2 tygodnie po interwencji (Rysunek 3A).

Kość podchrzęstna została przeanalizowana, skupiając się na objętości pod przyśrodkowym obszarem obciążonym kłykciem piszczelowym. Tutaj oceniliśmy gęstość kości tego obszaru, określając procent zmineralizowanej kości w obszarze zainteresowania i obliczyliśmy stosunek między nogą przeciwległą a ipsilateralną. Współczynnik ten wskazuje, że oba modele mają zwiększoną gęstość kości w chorej kończynie (stosunek powyżej 1) 4 tygodnie po indukcji (Ryc. 3B). Pojawienie się osteofitów jest bardziej widoczne w modelu DCS, gdzie następuje znaczny wzrost liczby i objętości w porównaniu z modelem DMM 2 tygodnie po interwencji (Rysunek 3C, D). DCS objawia się podwyższonym uszkodzeniem chrząstki w przyśrodkowym przedziale piszczelowym i udowym oraz zapaleniem błony maziowej (Rysunek 3E, F) 4 tygodnie po indukcji.

figure-results-1
Rysunek 1: Interwencja chirurgiczna mająca na celu wywołanie pourazowej choroby zwyrodnieniowej stawów u myszy. Obrazy sekwencyjne reprezentują różne etapy procedury. (A) Odsłonięcie torebki stawowej przecinającej błonę powierzchowną wokół kolana poprzez wprowadzenie ostrza skalpela numer 11 po przyśrodkowej stronie więzadła rzepki i z dala od więzadła. Spowoduje to odsłonięcie poduszeczki tłuszczowej podrzepkowej. (B) Identyfikacja i przecięcie więzadła łąkotkowo-piszczelowego przyśrodkowego. Aby zidentyfikować więzadło, przesuń więzadło rzepki w kierunku bocznej, a następnie popchnij poduszeczkę tłuszczową w górę. Pozwala to na wizualizację więzadła jako małej poziomej białej linii tuż nad kłykciem piszczelowym (oznaczonej tutaj czarną strzałką). Aby przeciąć więzadło, dolne ostrze nożyczek sprężynowych umieszcza się pod więzadłem, uważając, aby nie uszkodzić chrząstki. Przesuń łąkotkę w kierunku strony przyśrodkowej, aby uwidocznić kłykieć piszczelowy. (C) Zarysowanie powierzchni odsłoniętej chrząstki i zamknięcie rany. Aby zadrapać chrząstkę, mikroostrze wkłada się w kierunku tylnej strony, gdzie styka się z chrząstką, a następnie przesuwa się do przodu w kierunku przedniej części stawu. Po wykonaniu zadrapań naciągnij skórę na kolano i zamknij ranę za pomocą szwu podskórnego lub klipsów do ran. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Ocena choroby zwyrodnieniowej stawów u myszy. (A) Dynamiczne obciążanie polega na dopasowaniu obciążenia maty ciśnieniowej do odpowiedniej łapy. Ładunek jest następnie wyrażany jako procent masy całkowitej. (B) Kość podchrzęstną mierzy się, wybierając objętość zainteresowania w obszarze obciążenia kłykcia piszczelowego przyśrodkowego i wybierając płytkę podchrzęstną lub kość beleczkową. Obrazy te mają rozdzielczość 4,5 μm. (C) Osteofity są identyfikowane i określane ilościowo w trójwymiarowym widoku uzyskanych obrazów μCT. Objętość osteofitów mierzy się, wybierając ROI wyznaczający krawędź osteofitu. Gęstość kości oblicza się jako objętość kości na objętość osteofitu. Prezentowane tutaj obrazy zostały wykonane w rozdzielczości 2 μm, ale kwantyfikacja odbywa się zwykle z rozdzielczością 4,5 μm. (D) Wyniki chrząstki i zapalenia błony maziowej są pobierane z odcinków 6 μm wybarwionych Safranin-O i Fast green. Przekrój czołowy kolana myszy, w którym wszystkie ćwiartki, oznaczone czarną ramką, są widoczne do oceny punktowej i pokazane jest powiększenie strony przyśrodkowej. Widoczne jest również zapalenie błony maziowej otaczające przyśrodkową stronę stawu kolanowego, zwłaszcza powyżej i poniżej przemieszczonej łąkotki. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Reprezentatywna ocena OA w modelach DMM i DCS. (A) DWB mierzony do 8 tygodni po indukcji na eksperymentach przeprowadzonych przez tego samego operatora-eksperta. Obciążenie jest wyrażone jako stosunek obciążenia roboczego/OA do obciążenia przeciwstawnego/kontrolnego. Sparowane testy t obu nóg są również pokazane w modelach Sham (szary), DMM (niebieski) i DCS (różowy). Analiza μCT 4 tygodnie po zabiegu chirurgicznym. (B) Kość podchrzęstną analizowano 4 tygodnie po interwencji chirurgicznej i wyrażono jako stosunek ipsilateralnego do przeciwległego %BV / TV. (C) Liczba osteofitów i (D) objętość osteofitów analizowano 2 tygodnie po indukcji. Ocenę histologiczną 4 tygodnie po indukcji (E) uszkodzenia chrząstki przyśrodkowej kości piszczelowej i udowej oraz (F) zapalenia błony maziowej oceniano metodami standaryzowanymi19,20. Dane są wyrażone jako średnia ± odchylenie standardowe, n ≥ 5. Dane porównano za pomocą ANOVA z powtarzanymi pomiarami z poprawką do testu Šídáka (A), sparowanym testem t (A) lub standardowym testem t-Studenta (B-F). *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ns = nieistotne. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Plik uzupełniający 1: Warunki leczenia i inkubacji do zatapiania parafiny. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby przeprowadzić chirurgiczną indukcję pourazowej choroby zwyrodnieniowej stawów (PTOA), zdecydowanie zaleca się wsparcie asystenta (np. w celu przygotowania myszy, podczas gdy operator skupia się na operacji). Ułatwia to chirurgię aseptyczną, zmniejszając w ten sposób ryzyko infekcji i zwiększając skuteczność interwencji w dużych eksperymentach. Podczas operacji łatwo jest stracić płaszczyznę ostrości, dlatego mikroskop z pedałami do ustawiania ostrości jest cenną funkcją pomagającą utrzymać sterylność przez cały czas trwania operacji. Pozycja myszy i kolana ma kluczowe znaczenie. Kolano musi być skierowane do góry i wystarczająco zgięte, aby zmaksymalizować otwarcie przestrzeni stawu kolanowego, ułatwiając łatwiejszy dostęp do więzadła w celu wprowadzenia mikroostrza w celu zarysowania powierzchni kłykcia. Identyfikacja MMTL może być trudna, zwłaszcza gdy poduszeczka tłuszczowa jest większa niż zwykle lub występuje niewielkie krwawienie. Aby uniknąć krwawień, popchnij poduszeczkę tłuszczową do góry, aby zapobiec rozdarciom i późniejszemu krwawieniu. Jeśli poduszeczka tłuszczowa jest duża, może to potrwać trochę dłużej, ale cierpliwie kontynuuj popychanie jej do góry.

MMTL znajduje się dość blisko kłykcia piszczelowego, dlatego należy uważać, aby nie uszkodzić chrząstki podczas umieszczania dolnego ostrza zakrzywionych nożyczek sprężynowych pod MMTL. Zakrzywione ostrza powinny być skierowane w stronę przyśrodkową i lekko do góry, równolegle do kłykcia. Aby uzyskać najlepsze przekroje MMTL, upewnij się, że nożyczki są ostre. Sprawdź, czy łąkotka może poruszać się przyśrodkowo po przecięciu więzadła, ponieważ czasami pozostaje mały nasad, który wymaga dalszego cięcia. Podczas wprowadzania mikroostrza do zarysowania kłykcia, musi ono być prostopadłe do kłykcia. Pierwsze zadrapanie należy wykonać bliżej środka stawu, ale należy uważać, aby nie uszkodzić więzadła krzyżowego przedniego. Następnie przejdź w stronę przyśrodkową, a następnie za łąkotkę. Zadrapania mogą być widoczne jako słabe białe linie na chrząstce. Ponieważ najczęściej używamy klipsów, początkowe nacięcie wykonuje się po stronie bocznej, a więc klipsy umieszcza się z boku nogi po zamknięciu rany. Dzięki temu klipsy nie ocierają się o kolano, gdy mysz odzyskuje ruch. W przypadku stosowania szwów zdecydowanie zaleca się stosowanie szwów podskórnych. Jeśli używasz szwów zewnętrznych, myszy prawdopodobnie gryzą szwy i otwierają ranę, co zwiększa ryzyko infekcji. Prawidłowo wykonana operacja nie może trwać dłużej niż 5-10 minut, od nacięcia do zamknięcia rany, minimalizując w ten sposób odsłonięcie chrząstki i wszelkie dodatkowe niekontrolowane uszkodzenia, które mogą wystąpić. Po operacji myszy bardzo szybko wracają do zdrowia i niemal natychmiast mogą wejść do klatki i normalnie się poruszać. Jeśli myszy nie są aktywne, należy skonsultować się z odpowiednim ekspertem w jednostce.

W celu behawioralnej oceny bólu oceniono dynamiczne przenoszenie ciężaru. Jednak ta metoda może być uważana za mniej czułą niż inne testy bólu wywołanego, takie jak test von Freya15. Zaleca się stosowanie więcej niż jednej metody monitorowania i oceny bólu. Zmiany obserwowane 2 tygodnie po interwencji w DCS, mimo że przemijające, wskazują na ogólnie zmniejszone obciążenie nogi zwyrodnieniowej stawów w porównaniu z nogą zdrową. Dlatego 2 tygodnie po interwencji DCS można wykorzystać do oceny wczesnej choroby zwyrodnieniowej stawów lub bólu urazu w modelach mysich. Wizualizacja zmineralizowanych osteofitów za pomocą μCT pozwala na trójwymiarową kwantyfikację, którą można również dopasować do sekcji histologicznych12, dodając kolejny wymiar do badania powstawania i ewolucji osteofitów. W naszej grupie obecność osteofitów była zmienna w modelu DMM między operatorami i w ich obrębie (2,3 ± 1 vs. 1,2 ± 1, n > 7, P = 0,0183), podczas gdy indukcja DCS zdecydowanie prowadziła do wytwarzania osteofitów we wszystkich przypadkach niezależnie od operatora (2,6 ± 0,7 vs. 2,4 ± 0,5, n > 7, P = 0,711). Ponadto w modelu DCS jest znacznie więcej i większych osteofitów w porównaniu z DMM. Tym samym DCS jest idealnym modelem do badania powstawania osteofitów. Kwantyfikacja osteosklerozy ograniczona do obszaru obciążenia kości podchrzęstnej jest również poprawą w wykrywaniu niewielkich zmian. Porównanie przedziału przyśrodkowego operowanej nogi z nogą przeciwległą oferuje również sposób na normalizację w stosunku do wewnętrznego fenotypu kości tej konkretnej myszy12. Dodanie zadrapań chrząstki w modelu DCS jest kontrolowanym sposobem wywoływania skoncentrowanego uszkodzenia chrząstki podczas operacji, co przyspiesza wiele aspektów choroby. Jedną z konsekwencji procedury eksperymentalnej obejmującej celowe uszkodzenie samej chrząstki jest to, że to sztuczne uszkodzenie musi zostać wykluczone lub skorygowane w systemie klasyfikacji chrząstki. Ze względu na to ograniczenie nie zalecamy stosowania tego modelu, jeśli głównym celem badania jest zrozumienie wpływu choroby zwyrodnieniowej stawów na samą chrząstkę. Wreszcie, zdecydowanie zaleca się również, aby co najmniej dwóch zaślepionych strzelców oceniło uszkodzenia chrząstki i wyniki zapalenia błony maziowej. Potwierdza to i wzmacnia standaryzację systemów punktacji.

Ograniczeniem tego badania jest to, że zakres zmienności wszystkich parametrów porównujących modele DCS i DMM nie został w pełni oceniony. Problem ten zostanie rozwiązany w przyszłości w ramach bardziej obszernych badań, które mogłyby również obejmować ocenę zmienności między operatorami z różnych instytucji.

Podsumowując, przyspieszona patogeneza choroby zwyrodnieniowej stawów w obecnym modelu DCS pozwala na odwzorowanie pourazowej choroby zwyrodnieniowej stawów i stanowi potężne i solidne narzędzie badawcze do zbadania i wyjaśnienia mechanizmów patofizjologicznych leżących u podstaw tej przewlekłej, wyniszczającej choroby stawów. Dodatkowo umożliwia badanie choroby zwyrodnieniowej stawów w krótszym czasie, koncentrując się na osteofitogenezie, bólu zwyrodnieniowym stawów i wpływie uszkodzenia chrząstki na cały staw.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chcielibyśmy podziękować za pracę Gemmy Charlesworth i Mandie Prior z Uniwersytetu w Liverpoolu, które zdobyły obrazy μCT użyte w tej publikacji. Prace zostały sfinansowane przez Versus Arthritis (granty 20199 i 22483). Lynette Dunning została sfinansowana przez Versus Arthritis (grant 20199). Kendal McCulloch został sfinansowany ze stypendium doktoranckiego UWS. Carmen Huesa została sfinansowana przez Versus Arthritis (granty 20199 i 22483).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
#11 Ostrze skalpela (i rękojeść skalpela).Światowe instrumenty precyzyjne500240uzyskują dostęp do torebki stawowej
15° Kąt cięcia Nóż mikrochirurgicznyMSPREF7503zarysować chrząstkę
6-0 vicryl rapideDowolny dostawca materiałów medycznych-alternatywna metoda zamykania rany
Zestaw anestezjologicznyOgólny (wielu różnych dostawców) -
Antybakteryjny nakładacz do skóry (hibiskub)Amazonka-Do sterylizacji chirurgicznego obszaru skóry
Aplikator do klipsów 7 mmŚwiatowe instrumenty precyzyjne500343zamknięcia rany
BalanceGeneric (wielu różnych dostawców)-Do ważenia myszy
zakrzywione kleszczePrecyzyjne narzędzia naukowe500232przesunięcia więzadła rzepki na bok
Buprenorfina (wetergeza)Dostarczana przez jednostkę, ponieważ jest to lek na receptę-Analgezja
Analizator CTBruker3d. Oprogramowanie SUITECtvol
Bruker3D. Oprogramowanie SUITE
Oprogramowanie Przeglądarka danychBruker3D. Oprogramowanie SUITEOprogramowanie
Dynamiczny sprzęt do przenoszenia ciężarówBiosebBIO-DWB-DUALMierzy obciążenie kończyn i posiada klatkę, matę ciśnieniową i oprogramowanie do analizy
EDTAMerckE988410% roztwór w PBS (lub wodzie) do odwapnienia kości pH 7,4
EtanolGeneric (wielu różnych dostawców)-do osadzania odwapnionych kości
Fast Green FCFMerckF7252Do barwienia sekcji
Lodowaty kwas octowyMerck1005706Do barwienia przekrojów
Roztwór hematoksylinyMerckGHS132Barwienie jądrowe w sekcjach parafinowych.
Mikro-pęseta Hoskins #21.Cameron chirurgiczny ograniczonyPHF1085przesunąć poduszkę
tłuszczową IzofluoranDostarczany przez jednostkę, ponieważ jest to lek na receptę-Myszy
Charlesriver-C57Bl6/J samiec w wieku 8 tygodni (aby umożliwić aklimatyzację w jednostce)
Skaner tomografii mikrokomputerowejBrukerSKYSCAN 1272 CMOSµ
Taśma papierowa chirurgiczna CT MicroporeFisherScientific12787597przytrzymaj nogę w pozycji
Wosk parafinowyOgólny (wielu różnych dostawców)-do osadzania odwapnionych kości
Klipsy do ran ze stali nierdzewnej Reflex 7 mm lubnarzędzia do nauki precyzyjnej12032-07zamykanie rany
Zmywacz do klipsów 7 mm Światoweinstrumenty precyzyjne500347usunąć klipsy do ran
Mikrotom rotacyjnyOgólny (wielu różnych dostawców)-Do cięcia sekcji tkanki zatopionej w parafinie.
Safranin-OMerckS2255Do barwienia sekcji
Ząbkowane zakrzywione kleszczePrecyzyjne narzędzia naukowe15915trzymają skórę
Sterylna serwetaGeneric (wielu różnych dostawców)-Aby zapewnić sterylność obszaru operacyjnego
Sterylna serweta z otworem na kluczOgólny (wielu różnych dostawców)-Aby zakryć mysz i odsłonić nogę
Sterylna sól fizjologicznaOgólny (wielu różnych dostawców)
Sterylna serweta chirurgicznaOgólna (wielu różnych dostawców)-utrzymuj sterylne środowisko dla narzędzi chirurgicznych
Sterylna serweta chirurgiczna z otworem na kluczOgólny (wielu różnych dostawców) -zakryj mysz i trzymaj nogę przez otwór na klucz
Nożyczki prosteInstrumenty precyzyjne World14393otwórz ranę
Mikroskop operacyjny.Ogólny (wielu różnych dostawców)-Regulowana ostrość.
Nożyczki sprężynowe Vannas z ostrzami 2 mm.Narzędzia do nauki precyzyjnej15000-04tną generyczny ksylen MMTL
(wielu różnych dostawców)-do osadzania odwapnionych kości

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Arthritis Research UK. The State of Musculoskeletal Health 2018. Arthritis Research UK. , (2018).
  2. Mahir, L., et al. Impact of knee osteoarthritis on the quality of life. Annals of Physical and Rehabilitation Medicine. 59, 159(2016).
  3. Chen, D., et al. Osteoarthritis: toward a comprehensive understanding of pathological mechanism. Bone Research. 5, 16044(2016).
  4. Glasson, S. S., Blanchet, T. J., Morris, E. A. The surgical destabilization of the medial meniscus (DMM) model of osteoarthritis in the 129/SvEv mouse. Osteoarthritis and Cartilage. 15 (9), 1061-1069 (2007).
  5. Sophocleous, A., Huesa, C. Osteoarthritis mouse model of destabilization of the medial meniscus. Methods in Molecular Biology. 1914, 281-293 (2019).
  6. McCulloch, K., et al. Accelerated post traumatic osteoarthritis in a dual injury murine model. Osteoarthritis and Cartilage. 27 (12), 1800-1810 (2019).
  7. Fan, X., Wu, X., Crawford, R., Xiao, Y., Prasadam, I. Macro, micro, and molecular changes of the osteochondral interface in osteoarthritis development. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 659654(2021).
  8. Hwang, H. S., Park, I. Y., Hong, J. I., Kim, J. R., Kim, H. A. Comparison of joint degeneration and pain in male and female mice in DMM model of osteoarthritis. Osteoarthritis and Cartilage. 29 (5), 728-738 (2021).
  9. Loga, I. S., et al. Does pain at an earlier stage of chondropathy protect female mice against structural progression after surgically induced osteoarthritis. Arthritis & Rheumatology. 72 (12), 2083-2093 (2020).
  10. Ma, H. L., et al. Osteoarthritis severity is sex dependent in a surgical mouse model. Osteoarthritis and Cartilage. 15 (6), 695-700 (2007).
  11. Cicero, L., Fazzotta, S., Palumbo, V. D., Cassata, G., Lo Monte, A. I. Anesthesia protocols in laboratory animals used for scientific purposes. Acta Biomedica. 89 (3), 337-342 (2018).
  12. Huesa, C., et al. Proteinase-activated receptor 2 modulates OA-related pain, cartilage and bone pathology. Annals of the Rheumatic Diseases. 75 (11), 1989-1997 (2016).
  13. Tappe-Theodor, A., King, T., Morgan, M. M. Pros and cons of clinically relevant methods to assess pain in rodents. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 100, 335-343 (2019).
  14. Stewart, K., Schroeder, V. A. Lab animal research. blood withdrawal I. JoVE Science Education Database. , Cambridge, MA. (2018).
  15. Chaplan, S. R., Bach, F. W., Pogrel, J. W., Chung, J. M., Yaksh, T. L. Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw. Journal of Neuroscience Methods. 53 (1), 55-63 (1994).
  16. Lakes, E. H., Allen, K. D. Gait analysis methods for rodent models of arthritic disorders: reviews and recommendations. Osteoarthritis and Cartilage. 24 (11), 1837-1849 (2016).
  17. Das Neves Borges, P., Forte, A. E., Vincent, T. L., Dini, D., Marenzana, M. Rapid, automated imaging of mouse articular cartilage by microCT for early detection of osteoarthritis and finite element modelling of joint mechanics. Osteoarthritis and Cartilage. 22 (10), 1419-1428 (2014).
  18. vander Kraan, P. M., vanden Berg, W. B. Osteophytes: relevance and biology. Osteoarthritis and Cartilage. 15 (3), 237-244 (2007).
  19. Glasson, S. S., Chambers, M. G., Van Den Berg, W. B., Little, C. B. The OARSI histopathology initiative - recommendations for histological assessments of osteoarthritis in the mouse. Osteoarthritis and Cartilage. 18, SUPPL 3 17-23 (2010).
  20. Jackson, M. T., et al. Depletion of protease-activated receptor 2 but not protease-activated receptor 1 may confer protection against osteoarthritis in mice through extracartilaginous mechanisms. Arthritis and Rheumatology. 66 (12), 3337-3348 (2014).
  21. Pinamont, W. J., et al. Standardized histomorphometric evaluation of osteoarthritis in a surgical mouse model. Journal of Visualized Experiments. (159), e60991(2020).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Model choroby zwyrodnieniowej staw wdestabilizacja kotki przy rodkowejmodel uszkodzenia chrz stkipourazowa choroba zwyrodnieniowa staw wformowanie si osteofit wwi zad o piszczelkowo kotkowe przy rodkowemikrotomografia komputerowadynamiczne obci enieskleroza ko ci podchrz stnejuszkodzenie chrz stki

Powiązane artykuły