Izolacja mysiej mezenchymy jelitowej skutkująca wysoką wydajnością telocytów

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół izolacji mysich mezenchymów jelitowych, w tym telocytów. Mogą one być wykorzystywane do kilku zastosowań, takich jak współhodowla z organoidami pochodzącymi od myszy lub ludzi, w celu wsparcia wzrostu i lepszego odzwierciedlenia sytuacji w oryginalnej tkance.

Streszczenie

Mysie jelito cienkie, czyli mezenchyma jelita grubego, jest wysoce heterogeniczna, zawiera różne typy komórek, w tym śródbłonek krwi i limfy, nerwy, fibroblasty, miofibroblasty, komórki mięśni gładkich, komórki odpornościowe i niedawno zidentyfikowany typ komórek, telocyty. Telocyty to unikalne komórki mezenchymalne o długich procesach cytoplazmatycznych, osiągające odległość od dziesiątek do setek mikronów od ciała komórki. Telocyty stały się ostatnio ważnym składnikiem niszy jelitowych komórek macierzystych, dostarczającym białek Wnt, które są niezbędne do proliferacji komórek macierzystych i progenitorowych.

Chociaż dostępne są protokoły dotyczące izolowania mezenchymy z jelita myszy, nie jest jasne, czy te procedury pozwalają na efektywną izolację telocytów. Skuteczne izolowanie telocytów wymaga specjalnych dostosowań protokołu, które pozwoliłyby na dysocjację silnego kontaktu komórka-komórka między telocytami a sąsiednimi komórkami bez wpływu na ich żywotność. W tym przypadku dostępne protokoły izolacji mezenchymów jelitowych zostały dostosowane, aby wspierać pomyślną izolację i hodowlę mezenchymów zawierających stosunkowo wysoką wydajność żywotnych telocytów jednokomórkowych.

Uzyskana zawiesina jednokomórkowa może być analizowana za pomocą kilku technik, takich jak barwienie immunologiczne, sortowanie komórek, obrazowanie i eksperymenty mRNA. Protokół ten daje mezenchymę o wystarczająco konserwatywnych właściwościach antygenowych i funkcjonalnych telocytów i może być stosowany do wielu zastosowań. Na przykład mogą być używane do kohodowli z organoidami pochodzącymi od myszy lub ludzi, aby wspierać wzrost organoidów bez suplementacji czynnikiem wzrostu, aby lepiej odzwierciedlić sytuację w oryginalnej tkance.

Wprowadzenie

Zarówno jelito cienkie, jak i okrężnica są tkankami wysoce regeneracyjnymi ze względu na obecność komórek macierzystych, które namnażają się i napędzają regenerację¹. Mezenchyma otaczająca nabłonek zapewnia wsparcie strukturalne i funkcjonalne poprzez wydzielanie białek macierzy zewnątrzkomórkowej i cząsteczek sygnałowych², które modulują odpowiedź komórek nabłonkowych. Telocyty to duże komórki mezenchymalne, opisywane do tej pory głównie przez mikroskopię elektronową jako komórki z długimi procesami cytoplazmatycznymi zwanymi telopodami, które nakładają się na siebie, tworząc sieć labiryntową^3,4,5,6,7. Ostatnio telocyty jelitowe wykazujące ekspresję czynnika transkrypcyjnego FOXL1 stały się ważnym składnikiem niszy komórek macierzystych dostarczającym białka Wnt, które są kluczowe dla funkcji komórek macierzystych i progenitorowych. Telocyty jelitowe wyrażają wysoki poziom kluczowych białek szlaku sygnałowego, takich jak Wnt, Bmp, Tgfb i Shh, a także wielu czynników wzrostu⁸.

Biorąc pod uwagę, że telocyty są kluczowym składnikiem niszy komórek macierzystych in vivo, opracowanie protokołów do ich izolacji i hodowli ex vivo pozwoli na ich wykorzystanie jako źródła molekuł sygnałowych i czynników wzrostu, aby wspierać wzrost i różnicowanie ex vivo. Korzystając z dobrze ugruntowanych protokołów, krypty nabłonka okrężnicy lub jelita grubego mogą być izolowane i tworzyć struktury 3D znane jako organoidy^9,10,11. Trójwymiarowe organoidy stanowią potężne narzędzie do badania zarówno fizjologii, jak i patologii nabłonka jelitowego ex vivo. W systemie ex vivo organoidy opierają się na egzogennej suplementacji czynników zapewniających przetrwanie i wzrost¹⁰. Wyizolowana mezenchyma może być hodowana zarówno z organoidami pochodzącymi od myszy, jak i ludzi i stosowana jako źródło czynników wzrostu, zamiast suplementacji egzogennej, aby lepiej odzwierciedlić sytuację w oryginalnej tkance. Badanie telocytów ex vivo ma wiele zalet w bardziej szczegółowym badaniu normalnych lub patologicznych zachowań komórkowych, mechanizmów homeostazy tkanek i interakcji komórka-komórka.

Chociaż dostępne są protokoły opisujące, jak izolować mezenchymę z jelita myszy, nie jest jasne, czy te procedury prowadzą do efektywnej izolacji telocytów. Skuteczna izolacja telocytów wymaga specjalnych korekt protokołu, które pozwoliłyby na dysocjację silnego kontaktu komórka-komórka między telocytami a sąsiednimi komórkami, bez wpływu na ich żywotność. Aby przezwyciężyć te ograniczenia, w artykule przedstawiono zmodyfikowany protokół, który konsekwentnie daje wysoce żywotną, jednokomórkową zawiesinę zawierającą stosunkowo dużą ilość telocytów o wystarczająco konserwatywnych właściwościach antygenowych i funkcjonalnych. Te telocyty mogą być wykorzystywane do kilku zastosowań, w tym do wspólnej hodowli z organoidami pochodzącymi od myszy lub ludzi, w celu wspierania wzrostu bez suplementacji czynnikiem wzrostu. To z kolei lepiej oddaje sytuację w tkance pierwotnej.

Użyliśmy mysiego modelu FOXL1-Cre: Rosa-mTmG⁸, w którym telocyty są znakowane związaną z błoną wersją zielonego białka fluorescencyjnego (GFP) na zielono, co pozwala badaczowi śledzić telocyty w całości; wszystkie inne komórki mezenchymalne są oznaczone na czerwono związanym z błoną tdTomato. Obecny protokół został zmodyfikowany z protokołu izolującego mezenchymę jelitową < sup class="xref">12 w celu poprawy wydajności i żywotności telocytów.

Protokół

Wszystkie procedury opisane poniżej zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) na Uniwersytecie Hebrajskim w Jerozolimie.

1. Przygotowanie odczynników i

1. Podgrzej łaźnię wodną do temperatury 37 °C.
2. Przygotuj wszystkie roztwory z Tabeli 1.

2. Izolacja mezenchymy jelitowej

1. Poddać mysz eutanazji przez wdychanie CO_{2 ,} a następnie zwichnięcie szyjki macicy.
2. Umieść mysz w pozycji leżącej na plecach i spryskaj brzuch 70% EtOH. Podnieś skórę brzucha i przetnij wzdłuż linii środkowej, aby odsłonić jamę otrzewnej (patrz Rysunek 1 I, II).
3. Zlokalizuj żołądek, odetnij od przełyku i powoli wyciągnij jelito z jamy otrzewnej. Oczyść nadmiar tłuszczu i tkanki łącznej za pomocą kleszczy. Wyciąć jelito cienkie z dwunastnicy na około 0,5 cm od jelita ślepego (Ryc. 1 III,IV).
4. Umyj jelito na szalce Petriego zawierającej zimny sterylny PBS. Za pomocą nożyczek z końcówką kulową otwórz rurkę jelitową wzdłużnie i wypłucz kał (Rysunek 1 V). Przenieś jelito do nowego naczynia zawierającego świeży zimny PBS i ponownie umyj.
5. Pokrój jelito cienkie na segmenty o długości 1 cm i przenieś do stożkowej probówki o pojemności 15 ml wypełnionej 8 ml PBS. Potrząsaj probówką ręcznie w jednym lub dwóch cyklach/s przez 1 min.
6. Przenieść segmenty za pomocą kleszczyków do stożkowej probówki o pojemności 50 ml wypełnionej 20 ml świeżo przygotowanego roztworu A (patrz Tabela 1). Umieścić probówki w inkubatorze z wytrząsarką orbitalną w temperaturze 37 °C na 20 minut. Po inkubacji energicznie potrząsać probówką ręcznie z prędkością czterech lub pięciu cykli/s przez 1 minutę w celu dysocjacji nabłonka.
7. Powtórz krok 2.6 raz.
8. Przenieść segmenty do nowej probówki o pojemności 50 ml wypełnionej 10 ml sterylnego PBS i odwrócić probówkę w jednym lub dwóch cyklach/s przez 1 minutę.
9. Przenieś segmenty do nowej probówki o pojemności 15 ml wypełnionej 10 ml sterylnego PBS i delikatnie przechylaj w górę i w dół w jednym lub dwóch cyklach/s przez 2 minuty.
10. Pod szafką bezpieczeństwa biologicznego użyj kleszczy, aby umieścić segmenty na sterylnej chusteczce laboratoryjnej, aby je wysuszyć. Po wysuszeniu pokrój segmenty dalej na 0,5 cm kawałki.
11. Przenieś małe segmenty za pomocą kleszczy na 6-dołkową płytkę wypełnioną 4 ml wstępnie podgrzanego roztworu do wytrawiania na dołek. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 50 minut. Delikatnie potrząsaj talerzem ręcznie co 20 minut.
12. Przenieść segmenty za pomocą pipety Pasteura do stożkowej probówki o pojemności 15 ml wypełnionej 4 ml DMEM. Potrząsaj probówką ręcznie z prędkością czterech lub pięciu cykli/s przez 1 minutę, aby uzyskać zawiesinę jednokomórkową.
13. Przefiltrować zawiesinę przez sitko o średnicy 100 μm do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Odwirować filtrat o stężeniu 700 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
14. Odrzucić supernatant przez aspirację i ponownie zawiesić osad komórkowy w 5 ml 2% FBS/PBS. Odwirować zawiesinę o stężeniu 700 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
15. Odrzucić supernatant przez aspirację, ponownie zawiesić osad komórkowy z 12 ml pożywki hodowlanej i zasiać 1 ml na basenie na dwie 6-dołkowe płytki. Następnego dnia umyj i odessaj wszelkie umierające komórki, a zużytą pożywkę zastąp świeżą pożywką.
    UWAGA: W celu optymalnego utrzymania kultury zaleca się zmianę pożywki co 2 dni. W zależności od szczepu myszy, tła genetycznego i wieku, potrzeba od 4 dni do 2 tygodni, aby mezenchyma była gotowa do eksperymentów z kokulturą. W przypadku dalszych eksperymentów z kokulturą, mezenchyma powinna osiągnąć konfluencję, wykazując płaską i w pełni rozciągniętą morfologię komórkową, jak pokazano na Rysunek 2. Ogólnie rzecz biorąc, komórki o okrągłej morfologii nie są żywotne ani funkcjonalne.

Rysunek 1: Sekcja myszy. (I) Umieść mysz w pozycji leżącej i spryskaj brzuch 70% EtOH. Podnieś skórę brzucha. (II) Otwórz jamę otrzewnej wzdłużnie wzdłuż linii środkowej. (III) Delikatnie ciągnąc za żołądek, odciąć przełyk. (IV) Uszczypnij żołądek i powoli wyciągnij jelito. (V) Włóż końcówkę nożyczek z końcówką kulową do światła i otwórz rurkę jelitową wzdłużnie. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

3. Zawiesina mezenchymy do pasażu lub kohodowli

1. Ponownie zawiesić mezenchymę z 2 ml 0,25% trypsyny-0,5 mM EDTA/studzienka na 6-dołkowej płytce. Inkubować przez 5 minut w temperaturze 37 °C. Po inkubacji, jeśli kilka komórek nie zaczęło jeszcze odłączać się od naczynia, inkubować przez dodatkowe 2 minuty.
2. Za pomocą skrobaka do komórek delikatnie zeskrob powierzchnię studni. Przenieść zawiesinę komórek do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Dodać 2 ml DMEM-F12/studzienka i delikatnie pipetować zawiesinę w górę i w dół.
   UWAGA: Ważne jest, aby nie przepełniać rurki więcej niż 50% objętości rurki. Dlatego zaleca się stosowanie stożkowej probówki o pojemności 15 ml wypełnionej 8 ml zawiesiny na każde dwie studzienki.
3. Policz komórki.
   UWAGA: W pełni zlewająca się studzienka daje od 2 × 10⁶ komórek i 2,5 × 10⁶ komórek.
4. Rozcieńczyć zawiesinę komórkową, aby uzyskać gęstość wysiewu 3-5 × 10⁵ komórek/ml. Wirować przez 5 minut w temperaturze 500 × g w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant przez staranne zasysanie.
   UWAGA: Ważne jest, aby usunąć jak najwięcej płynu.
5. Zawiesić osad komórkowy w podgrzanym podłożu hodowlanym i na płytce.

4. Analiza cytometrii przepływowej do oczyszczania telocytów

1. Uzyskać osad komórek mezenchymalnych (krok 2.14). Zawiesić osad komórkowy w 1 ml buforu FACS i przefiltrować przez sitko o średnicy 40 μm.
2. Inkubować zawiesinę komórkową z przeciwciałami CD326 (1:100), CD45 (1:400) i CD31 (1:250) sprzężonymi z allofikocyjaniną (APC) w 400 μl buforu FACS przez 15 minut w temperaturze pokojowej, aby wykluczyć z rodzaju odpowiednio komórki nabłonka, układu odpornościowego i śródbłonka.
3. Przemyć komórki, dodając 1 ml buforu FACS i odwirować w temperaturze 700 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Zawiesić w 400 μl buforu FACS i dodać 4',6-diamidyno-2-fenyloindol (DAPI, 5 mg/ml, 1:1,000) do analiz cytometrii przepływowej. Bramkować pojedyncze komórki zgodnie z wysokością SSC według obszaru SSC. Bramkowanie żywych komórek DAPI i wyłączanie CD45 ⁺ / CD31 + / CD326 ⁺, aby posortować telocyty GFP⁺, jak pokazano na Rysunek 3.

Wyniki

Powyższy protokół izolacji mezenchymów jelitowych został zmodyfikowany z protokołów opisanych zarówno w Wu et al.¹² jak i Shoshkes-Carmel et al.⁸. Protokół opisany w Wu i wsp. dotyczy okrężnicy, a ten autorstwa Shoshkes-Carmel i wsp. dotyczy jelita cienkiego, dlatego warunki trawienia różnią się kombinacją enzymów, koncentracją pracy i czasem inkubacji między tymi dwoma protokołami. W tym przypadku opisany protokół został z powodzeniem zastosowany do izolacji i hodowli mezenchymalnych komórek jelitowych, w tym telocytów. Krótko mówiąc, przeprowadziliśmy sekcję jelita cienkiego od dwunastnicy do jelita krętego za pomocą mysiego modelu FOXL1-Cre: Rosa-mTmG ⁸, w którym telocyty były znakowane błoną-GFP (zielony), podczas gdy inne komórki mezenchymalne były znakowane błoną-tdTomato (czerwony). Oddzieliliśmy tkankę za pomocą enzymów trawiących i wysialiśmy mezenchymę na 6-dołkowej płytce. Po dysocjacji telocyty tracą swoje cechy komórkowe, wykazując okrągłą morfologię komórkową (Figura 2A), co znajduje odzwierciedlenie w niedostatecznej kwantyfikacji komórek GFP⁺ w dniu 1 w porównaniu z kolejnymi dniami (Figura 2F). Po kilku dniach telocyty wykazują małą morfologię rozciągniętych komórek z krótkimi procesami komórkowymi (Rysunek 2B, C). Jednak 7-10 dni po wysiewie telocyty odzyskują swoje cechy komórkowe, wykazując dużą morfologię rozciągniętych komórek z długimi procesami cytoplazmatycznymi (Rysunek 2D, E) i są gotowe do użycia w kokulturze z organoidami i wspierają ich wzrost.

Rysunek 2: Hodowana mezenchyma wyizolowana z FOXL1Cre: jelito myszy Rosa-mTmG. telocyty FOXL1⁺ są znakowane GFP, podczas gdy inne komórki mezenchymalne to tdTomato⁺. (A-E) Reprezentatywne obrazy hodowanej mezenchymy wyizolowanej przy użyciu obecnego protokołu, posianej na płytce 6-dołkowej i zobrazowanej po 1 (A), 4 (B, C) i 7 (D,E) dniach hodowli. Podziałka = 100 μm. (F) Kwantyfikacja stosunku komórek GFP / tdPomidor na pole widzenia (procenty) w 1, 4 i 7 dniu hodowli. Skróty: FOXL1 = białko L1 Forkhead box; GFP = zielone białko fluorescencyjne. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Aby ocenić ten protokół izolacji i ujawnić skład komórki, przeanalizowaliśmy uzyskaną zawiesinę komórek za pomocą cytometrii przepływowej (Rysunek 3). Ogólnie rzecz biorąc, 69% izolowanych komórek było żywotnych w oparciu o barwienie DAPI (Rysunek 3 III); spośród żywych komórek 60,9% reprezentowało zanieczyszczenie nabłonka oraz komórki odpornościowe i śródbłonka (CD326⁺, CD45⁺ i CD31⁺; Rysunek 3 IV). Frakcja telocytów (GFP⁺) rozproszyła się odpowiednio powyżej 100 tys. i 70 tys. FSC i SSC (Ryc. 3 VI) i stanowiła prawie 10% z bramkowanej mezenchymii (żywe CD45^-, CD326^-, CD31^-) (Rysunek 3 V).

Rysunek 3: Strategia bramkowania cytometrii przepływowej do sortowania telocytów z izolowanej mezenchymy jelitowej dorosłej myszy. (I) Wykluczono zdarzenia niskiego poziomu rozproszenia bocznego. (II) Pojedyncze komórki zostały bramkowane zgodnie z wysokością SSC według obszaru SSC. (III) Zdarzenia DAPI⁺ zostały bramkowane w celu wykluczenia martwych komórek z sortowania. (IV) Zdarzenia ^{DAPI-CD45 +} / CD326 ⁺ / CD31 ⁺ zostały bramkowane w celu wykluczenia odpowiednio komórek immunologicznych, nabłonkowych i śródbłonka. (V) telocyty GFP⁺ stanowiły 10,3% komórek DAPI-CD45^- / CD326^- /CD31^-. (VI) Analiza bramkowania wstecznego ujawniła współrzędne telocytów GFP⁺ na wykresie FSC-A/SSC-A. Skróty: SSC-A = obszar piku bocznego; FSC-A = obszar piku rozproszenia do przodu; SSC-H = wysokość piku bocznego rozproszenia; DAPI = 4',6-diamidyn-2-fenyloindol; GFP = białko zielonej fluorescencji; APC = allofikocyjanina. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Równolegle, wyizolowaliśmy również mezenchymę z jelita myszy C57Bl6 typu dzikiego (WT), w którym frakcja telocytów została oceniona za pomocą kombinacji markerów powierzchniowych wcześniej analizowanych na mezenchymie wyizolowanym z mysiego modelu FOXL1Cre: Rosa-mTmG, w którym frakcja telocytów była znakowana GFP. Odkryliśmy, że podzbiór telocytów można zdefiniować przez dodatnie barwienie CD201 i podoplaniny (GP38) (Figura 4). Co więcej, użycie tych markerów w barwieniu immunologicznym 1 dzień po izolacji i hodowli potwierdziło, że chociaż komórki nie wykazywały jeszcze swoich cech komórkowych, uzyskały ekspresję tych markerów molekularnych, wykazując barwienie w 70%-80% telocytów GFP⁺ (Figura 5).

Frakcja telocytów zdefiniowana przez markery powierzchniowe nie jest identyczna z tą uzyskaną za pomocą myszy reporterowej sterowanej przez FOXL1; telocyt jest wysoce heterogeniczny i zawiera kilka podzbiorów. Konieczne jest połączenie markera powierzchniowego z znakowaniem FOXL1 w celu zdefiniowania telocytów. W jelicie cienkim myszy FOXL1Cre: Rosa-mTmG 60%-70% komórek GFP⁺ jest CD201 dodatnich, a 65%-80% jest dodatnich dla GP38. W przypadku stosowania markerów powierzchniowych należy pamiętać, że niewłaściwe przechowywanie i powtarzające się cykle zamrażania i rozmrażania przeciwciał zmniejszają skuteczność wiązania. Ponadto trawienie enzymatyczne może zaburzać ekspresję markerów powierzchniowych. Zaobserwowaliśmy, że ekspresja CD138, transbłonowego proteoglikanu ulegającego ekspresji na komórkach mezenchymalnych, została zakłócona i znacznie zmniejszona wraz z dysocjacją.

Rysunek 4: Analiza FACS zawiesiny mezenchymy jednokomórkowej wyizolowanej z FOXL1Cre: Jelito cienkie myszy Rosa-mTmG przy użyciu obecnego protokołu. Analiza FACS na pojedynczych komórkach (I-II), (III) ^DAPI, (IV-VI) Lin^-(CD45^-, CD326^-, CD31^-) komórkach GFP⁺, wykazująca, że (VII) 65,3% GFP⁺ i 31,2% Tomato⁺ są dodatnie dla GP38, podczas gdy (VIII) 60,5% GFP⁺ i 22,6% Tomato⁺ są dodatnie dla CD201. Skróty: SSC-A = obszar piku bocznego; FSC-A = obszar piku rozproszenia do przodu; SSC-H = wysokość piku bocznego rozproszenia; DAPI = 4',6-diamidyn-2-fenyloindol; GFP = białko zielonej fluorescencji; APC = allofikocyjanina; PE = fikoerytryna. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Mezenchyma hodowlana pierwszego dnia, utrwalona i wybarwiona pod kątem markerów mezenchymalnych. (A-D) Reprezentatywne obrazy hodowli mezenchymy wybarwionej dla GP38. (F-I) Reprezentatywne obrazy mezenchymy hodowlanej barwionej na obecność CD201. Podziałka = 100 μm. (E) Kwantyfikacja podwójnie dodatnich wyników Tomato⁺ GP38⁺ i Tomato⁺ CD201⁺ z całkowitej liczby pomidorów^+. (J) Kwantyfikacja podwójnie dodatnich GFP⁺ GP38⁺ i GFP⁺ CD201⁺ na podstawie całkowitej GFP⁺. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rozwiązanie A:	HBSS uzupełniony o 2% FBS, 1 mM DL-ditiotreitol (DTT), 2 mM EDTA (pH 8,0).
Uzupełnione podłoże 1640 (CM1640):	Pożywka RPMI 1640 uzupełniona 10% FBS, Pen/Strep (100 jednostek penicyliny/ml, 100 μg streptomycyny/ml).
Roztwór do wytrawiania:	100 U / ml kolagenazy typu VIII, 75 mg / ml DNazy I w 4 ml wstępnie podgrzanego CM1640. Uwaga: Dodaj kolagenazę i DNazę I tuż przed rozpoczęciem procedury trawienia.
Pożywki hodowlane:	Pożywka DMEM-F12 uzupełniona o 10 μg/ml gentamycyny, 10 mM HEPES, glutaminę, Pen/Strep (100 jednostek penicyliny/ml, 100 μg streptomycyny/ml).
Bufor FACS:	PBS uzupełniony o 5% FBS i 1 mM EDTA.

Tabela 1: Skład wszystkich rozwiązań użytych w protokole.

Tabela uzupełniająca S1: Główne różnice między obecnym protokołem a dwoma protokołami referencyjnymi są wymienione tutaj. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

W tym miejscu opracowaliśmy protokół izolacji mezenchymy z jelita cienkiego myszy przy użyciu mysiego modelu myszy FOXL1-Cre: Rosa26-mTmG, który umożliwia naukowcom odróżnienie telocytów od innych komórek mezenchymalnych. W tym protokole należy wykonać kilka krytycznych kroków. Po pierwsze, ważne jest, aby energicznie wstrząsnąć probówką z prędkością czterech lub pięciu cykli/s, aby usunąć większość komórek nabłonka podczas izolacji mezenchymy. Czas inkubacji trawienia enzymatycznego musi być zoptymalizowany w oparciu o wydajność trawienia. Podczas inkubacji płytki należy delikatnie wstrząsać poziomo przez kilka sekund co 20 minut. Gdy tkanka stanie się podobna do włókna, inkubację należy zatrzymać, przechodząc do kroku protokołu 2.12. Wystawienie tkanki na długi czas trawienia może skutkować niską żywotnością i wydajnością komórek. Po trawieniu enzymatycznym probówkę należy mechanicznie wstrząsnąć, aby uwolnić więcej pojedynczych komórek do zawiesiny; Idealnie byłoby, gdyby roztwór wyglądał na mętny i nie były widoczne żadne fragmenty tkanki. Jeśli tak nie jest, należy przedłużyć trawienie enzymatyczne do 60 minut.

Utrzymanie sterylnych warunków i unikanie potencjalnego skażenia bakteryjnego jest jednym z kluczowych kroków podczas pracy z pierwotną hodowlą tkankową. Należy używać sterylnych narzędzi presektoryjnych, odczynników i; Rękawice należy zmienić, a obszar roboczy należy oczyścić po zakończeniu pracy ze zwierzętami. Po uzyskaniu zawiesiny komórek prace należy prowadzić pod laminarnym kapturem biologicznym. Po posiewie komórki powinny być inkubowane przez noc bez zakłóceń, ponieważ może to wpłynąć na przyleganie. Ponadto ważne jest, aby wymienić pożywkę hodowlaną dzień po wysiewie, ponieważ nieprzylegające komórki mogą wpływać na żywotność hodowli.

Markery powierzchniowe użyte w tym protokole silnie reagowały ze swoimi epitopami; jednak możliwe jest, że trawienie enzymatyczne może wpływać na reaktywność wiązania, a tym samym na wyniki analizy FACS. Kolejnym ograniczeniem tego protokołu jest niedostateczna reprezentacja warstwy mięśniowej. Aby poprawić skuteczność izolacji komórek warstwy mięśniowej, zalecamy mechaniczne oddzielenie mięśnia od warstw błony śluzowej i oddzielne trawienie enzymatyczne dla każdej z warstw. Do dysocjacji nabłonka od zrębu można zastosować separację mechaniczną lub środki chelatujące (EDTA lub DTT); Jednak trawienie enzymatyczne w celu uzyskania pojedynczych komórek zostało zoptymalizowane w tym protokole.

Izolacja mezenchymii jelitowej została wcześniej opisana⁸; zeskrobanie kosmków szkiełkiem nakrywkowym spowodowałoby utratę części mezenchymii wzdłuż kosmków, zwłaszcza komórek mezenchymalnych końca kosmków, takich jak telocyty Lgr5 ⁺ końcówki kosmków¹³. W tym protokole wykorzystujemy kolagenazę typu VIII zamiast dyspazy II i trypsynę w połączeniu z DNazą I, ponieważ kolagenaza skuteczniej uwalnia komórki mezenchymalne z macierzy. Chociaż wydłuża to czas przetwarzania (>90 min vs. 35 min), oba protokoły dały podobne wskaźniki żywotności komórek; Obecny protokół poprawił ogólną wydajność komórek mezenchymalnych, a dokładniej frakcji telocytów. Obecny protokół dał około 10% telocytów GFP⁺ , potwierdzonych zarówno przez wizualizację, jak i analizę FACS, podczas gdy wcześniejszy protokół dał 2% telocytów GFP⁺ . Główne różnice między obecnym protokołem a dwoma protokołami referencyjnymi wymieniono w tabeli uzupełniającej S1.

Identyfikacja komórek FOXL1⁺GFP⁺ jako telocytów podnabłonkowych opiera się na badaniach in vivo . Potrzeba opracowania i modyfikacji dostępnych protokołów izolacji mezenchymy w celu uzyskania wyższej wydajności telocytów oraz wiedza o tym, jak to osiągnąć, opierały się na naszym zrozumieniu struktury i funkcji telocytów FOXL1 ⁺ in vivo, jako dużych komórek z długimi projekcjami komórkowymi ściśle połączonymi z komórkami nabłonkowymi.

Co ciekawe, telocyty ex vivo GFP⁺ wykazują cechy komórkowe podobne do ich cech in vivo w jelicie i dlatego sugeruje się, że służą jako idealne wsparcie dla wzrostu organoidów. Chociaż protokół ten omawia głównie izolację telocytów z jelita cienkiego, podobny protokół z niewielką modyfikacją może być stosowany i łatwo stosowany w przypadku komórek mezenchymalnych okrężnicy, takich jak niedawno opisana komórka zrębu jelitowego regulowana MAP3K2 (MRISC)¹².

Gdy komórki mezenchymalne rozciągną się i osiągną zbieg, można je wykorzystać do kilku dodatkowych zastosowań, takich jak kohodowla 3D z organoidami pochodzącymi od myszy lub ludzi, przy użyciu Matrigelu wolnego od czynnika wzrostu. Mezenchyma zazwyczaj tworzy sieć w pełni wspierającą tworzenie i wzrost organoidów bez suplementacji egzogennego czynnika wzrostu. Zrąb jelitowy ma wewnętrzne cechy 3D, które mogą zapewnić nabłonkowi mechaniczne wsparcie¹⁴. Dlatego protokół ten może być również wykorzystany do wyizolowania mezenchymy, która ma zostać zintegrowana z rusztowaniem drukowanym biologicznie w 3D i wykorzystana do dalszych eksperymentów z ksenoprzeszczepami.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Probówki wirówkowe 15 ml	Corning	430052
Probówki wirówkowe 50 ml	Corning	430828
5 ml polistyrenowa probówka okrągłodenna z nasadką sitka komórkowego	Corning	352235
6-dołkowa płytka do hodowli komórkowych	Costar	3516
APC Anti-Mouse CD31	Biolegend	102509
APC Anti-Mouse CD326	Biolegend	118213
APC Anti-Mouse CD45	Biolegend	103111
Cell Lifter	Corning	3008
Sitko do komórek 100μ m Nylon Żółty	Corning	CLS431752
Kolagenaza typ VIII	Sigma	C2139-500MG
DL-Ditiothreitol (DTT)	Sigma	43815-1G
DMEM/F-12 (HAM) 1:1	Biological Industries	01-170-1A
DNase I	Sigma	DN25-1G
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Biologiczny Przemysł	01-055-1A
buforowana fosforanem Dulbecco	Sigma	D1283-500ML	10x
EDTA 0,5 M, pH 8,0	Przemysł biologiczny	01-862-1B
FBS	Przemysł biologiczny	04-007-1A
Gentamycyna	Sigma	G1914-250MG	100x
Gluta Max-I	Gibco	35050-038	100x
Hank' s Zrównoważony roztwór soli (HBSS)	Przemysł biologiczny	02-017-5A	10x
HEPES	Gibco	15630-080	100x
Penicylina-Streptomycyna (Pen/Strep)	Przemysł biologiczny	03-033-1B	100x
RPMI 1640 średni	Gibco	21875-034
Trypsyna EDTA Roztwór B	Sartorius	03-052-1A