Ten protokół opisuje wysokoprzepustowy przepływ pracy dla sterowanej przez sztuczną inteligencję segmentacji obszarów zainteresowania potwierdzonych patologicznie na podstawie barwionych, cienkich obrazów skrawków tkanek w celu wzbogacenia populacji komórek z rozdzielczością histologiczną za pomocą mikrodysekcji laserowej. Strategia ta obejmuje nowatorski algorytm umożliwiający przenoszenie znaczników oznaczających interesujące populacje komórek bezpośrednio do mikroskopów laserowych.
Artykuł metodologiczny
Uprzemysłowiona, sterowana sztuczną inteligencją mikrodysekcja laserowa do mikroskalowej analizy proteomicznej mikrośrodowiska guza
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Mikrośrodowisko guza (TME) reprezentuje złożony ekosystem składający się z dziesiątek różnych typów komórek, w tym populacji komórek nowotworowych, zrębowych i odpornościowych. Aby scharakteryzować zmienność na poziomie proteomu i niejednorodność guza na dużą skalę, potrzebne są metody wysokoprzepustowe do selektywnej izolacji dyskretnych populacji komórkowych w nowotworach złośliwych guzów litych. Protokół ten opisuje wysokoprzepustowy przepływ pracy, możliwy dzięki sztucznej inteligencji (AI), który segmentuje obrazy cienkich skrawków tkanek barwionych hematoksyliną i eozyną (H&E) na potwierdzone patologicznie obszary zainteresowania w celu selektywnego zbierania populacji komórek z rozdzielczością histologiczną za pomocą mikrodysekcji laserowej (LMD). Strategia ta obejmuje nowatorski algorytm umożliwiający przenoszenie regionów oznaczających populacje komórek będących przedmiotem zainteresowania, opatrzonych adnotacjami za pomocą oprogramowania do obrazowania cyfrowego, bezpośrednio do mikroskopów laserowych, umożliwiając w ten sposób łatwiejsze zbieranie danych. Przeprowadzono pomyślną implementację tego przepływu pracy, demonstrując użyteczność tej zharmonizowanej metody do selektywnego pobierania populacji komórek nowotworowych z TME w celu ilościowej, multipleksowanej analizy proteomicznej za pomocą spektrometrii mas o wysokiej rozdzielczości. Strategia ta w pełni integruje się z rutynowym przeglądem histopatologicznym, wykorzystując cyfrową analizę obrazu w celu wzbogacenia populacji komórkowych będących przedmiotem zainteresowania i jest w pełni uogólniona, umożliwiając zharmonizowane pobieranie populacji komórek z TME do analiz multiomicznych.
Wprowadzenie
TME reprezentuje złożony ekosystem wypełniony bardzo różnorodnym wachlarzem typów komórek, takich jak komórki nowotworowe, komórki zrębu, komórki odpornościowe, komórki śródbłonka, inne typy komórek mezenchymalnych i adipocyty, wraz ze złożoną macierzą zewnątrzkomórkową1. Ten ekosystem komórkowy różni się w obrębie różnych miejsc chorobowych i między nimi, co skutkuje złożoną heterogenicznością guza2,3. Ostatnie badania wykazały, że nowotwory heterogenne i guzy o niskiej komórkowości guza (niskiej czystości) często korelują ze złym rokowaniem choroby2,3.
Aby zrozumieć molekularne zależności między populacjami komórek nowotworowych i nienowotworowych w TME na dużą skalę, niezbędne są standaryzowane i wysokoprzepustowe strategie selektywnego zbierania odrębnych populacji komórkowych do dalszej analizy multiomicznej. Proteomika ilościowa stanowi szybko rozwijającą się i coraz ważniejszą technikę pozwalającą na pogłębienie wiedzy na temat biologii nowotworów. Do tej pory większość badań wykorzystujących proteomikę dotyczyła białek ekstrahowanych z preparatów z całych tkanek nowotworowych (np. kriopulwerowanych), co prowadzi do niedostatku w zrozumieniu heterogeniczności na poziomie proteomu w klasie TME4,5,6.
Rozwój strategii pobierania próbek, które płynnie integrują się i wykorzystują informacje z przepływów pracy patologii klinicznej, umożliwi nową generację proteomiki histologicznej, która jest wysoce komplementarna do złotego standardu, diagnostycznych przepływów pracy. LMD umożliwia bezpośrednie i selektywne zbieranie subpopulacji komórkowych lub regionów zainteresowania (ROI) poprzez mikroskopową kontrolę histologicznie barwionych cienkich skrawków tkanek7. Ostatnie znaczące postępy w patologii cyfrowej i analizie opartej na sztucznej inteligencji wykazały zdolność do identyfikowania unikalnych cech składowych i ROI w TME w sposób zautomatyzowany, z których wiele koreluje ze zmianami molekularnymi i klinicznymi cechami choroby, takimi jak oporność na terapię i rokowanie choroby8.
Przepływ pracy opisany w przedstawionym tutaj protokole wykorzystuje komercyjne rozwiązania programowe do selektywnego opisywania ROI guza w cyfrowych obrazach histopatologicznych i wykorzystuje opracowane przez nas narzędzia programowe do przenoszenia tych ROI guza do mikroskopów laserowych w celu automatycznego zbierania dyskretnych populacji komórkowych, które bezproblemowo integrują się z dalszymi przepływami pracy analizy multiomicznej. Ta zintegrowana strategia znacznie skraca czas operatora LMD i minimalizuje czas, przez jaki tkanki muszą znajdować się w temperaturze otoczenia. Integracja zautomatyzowanego wyboru cech i zbierania LMD z wysokoprzepustową proteomiką ilościową została wykazana poprzez analizę różnicową TME z dwóch reprezentatywnych podtypów histologicznych nabłonkowego raka jajnika, surowiczego raka jajnika o wysokim stopniu złośliwości (HGSOC) i raka jasnokomórkowego jajnika (OCCC).
Protokół
Wszystkie protokoły badań zostały zatwierdzone do użytku zgodnie z zatwierdzonym przez Western IRB protokołem "Zintegrowana analiza molekularna raka endometrium i jajnika w celu identyfikacji i walidacji klinicznie informacyjnych biomarkerów" uznanych za wyłączone na mocy amerykańskiego rozporządzenia federalnego 45 CFR 46.102(f). Wszystkie protokoły eksperymentalne obejmujące dane z udziałem ludzi w tym badaniu były zgodne z Deklaracją Helsińską. Uzyskano świadomą zgodę od wszystkich uczestników biorących udział w badaniu.
UWAGA: Następujące odczynniki używane w całym protokole są znanymi lub podejrzewanymi czynnikami rakotwórczymi i/lub zawierają niebezpieczne materiały: etanol, woda DEPC, roztwór Hematoksyliny Mayera, roztwór Eozyny Y, metanol, acetonitryl i kwas mrówkowy. Obowiązkowe jest właściwe obchodzenie się z nimi, zgodnie z opisem w odpowiednich kartach charakterystyki (SDS), oraz stosowanie odpowiednich środków ochrony indywidualnej (PPE).
1. Generowanie domyślnego pliku danych listy kształtów (.sld) zawierającego referencje kalibratora
UWAGA: Kroki protokołu opisane w tej sekcji są specyficzne dla użycia z odwróconym mikroskopem laserowym i powiązanym oprogramowaniem (zobacz Tabelę Materiałów). Utworzenie domyślnego pliku .sld jest konieczne tylko raz na mikroskop laserowy. Wynikowy plik może być używany do wycinania powierników na wszystkie slajdy PEN używane później. Przybliżony czas: 5 min (tylko raz).
- Otwórz oprogramowanie LMD i załaduj szkiełko z membraną naftalanu etylenu (PEN) na stolik LMD stroną zadrukowaną do dołu, z etykietą znajdującą się najbliżej użytkownika. Usuń zaznaczenie pola Zamknij wiersze po prawej stronie okna programu.
- Użyj funkcji PtoP (point to point) w dużym powiększeniu (63x), aby narysować trzy strzałki "V", które posłużą jako punkty odniesienia kalibracji. Zaczynając od jednego zewnętrznego punktu na literze V, narysuj linię do punktu środkowego litery V i kliknij pojedynczym kliknięciem. Następnie narysuj drugą linię od środkowego punktu litery V do końca drugiego zewnętrznego punktu litery V i kliknij dwukrotnie, aby utworzyć pojedynczy, niezamknięty kształt litery V z dwóch linii.
UWAGA: Te odniesienia do kalibracji należy umieścić w trzech rogach suwaka: z przodu po prawej, z tyłu po prawej, z tyłu po lewej. - Wybierz opcję AF (autofokus) przed cięciem. Przytnij suwak w pozycji 1, przesuń go do każdej z pozostałych pozycji suwaka i dokładnie prześledź nacięcia kalibracyjne.
- Zapisz plik .sld i wybierz opcję Zapisz bez kalibracji w wyskakującym oknie dialogowym, aby uniknąć wcięcia wzorców kalibracji w membranę.
UWAGA: Reprezentatywny plik .sld zawierający standardowe wzorce odniesienia dla czterech pozycji szkiełka znajduje się w pliku uzupełniającym 1.
2. Przygotowanie slajdów LMD
UWAGA: Kroki protokołu opisane w tej sekcji są specyficzne dla użycia z odwróconym mikroskopem laserowym i powiązanym oprogramowaniem (zobacz Tabelę Materiałów). Przybliżony czas: 5 min.
- Upewnij się, że szkiełko jest całkowicie suche przed przecięciem referencyjnych wskaźników kalibracji. Otwórz oprogramowanie LMD i otwórz domyślny plik kalibracyjny .sld w opcji Importuj kształty.
- Wybierz opcję AF (autofokus) przed cięciem. Załaduj szkiełko (szkiełka) chusteczką skierowaną w dół, a etykietę wsunąć bliżej operatora do uchwytu szkiełka na stoliku LMD.
- Korzystając z mikroskopu laserowego i domyślnego pliku .sld kalibracji, wytnij wzorce kalibracji w membranie PEN.
- OPCJONALNIE: Wytnij wzorce kalibracji w membranie PEN przed lub po umieszczeniu odcinka tkanki na szkiełku. Jeśli wzorce kalibracji są wycinane przed umieszczeniem tkanki, upewnij się, że tkanka i/lub utrwalacz nie nakładają się na kalibratory, gdy tkanka jest umieszczana na szkiełku w kroku 2.5. Jeśli wzorce kalibracji zostaną odcięte po umieszczeniu tkanki, należy przerwać po zakończeniu kroku 2.4 i przejść do sekcji 3.
- Przeglądaj wszystkie kalibratory indywidualnie, aby upewnić się, że każde cięcie jest kompletne i widoczne.
UWAGA: Użyj funkcji Move and Cut, aby ręcznie skierować laser na wszelkie wzorce kalibracji, które nie przecięły całkowicie membrany PEN. - Umieścić zamrożony lub utrwalony w formalinie wycinek tkanki zatopionej w parafinie (FFPE) na szkiełku zawierającym elementy wzorcujące.
3. Barwienie tkanek
UWAGA: Przybliżony czas: 30 min.
- Zamrożone szkiełka tkankowe LMD zamocować w 70% etanolu (EtOH) zawierającym odczynniki koktajlowe inhibitorów fosfatazy na 5 minut.
- Myć szkiełka w wodzie z pirokarbominianu dietylu (DEPC) zawierającej odczynniki koktajlowe inhibitorów fosfatazy przez 1 min.
- Myj szkiełka w wodzie DEPC przez 1 minutę.
- Inkubować szkiełka w roztworze hematoksyliny Mayera przez 3 minuty.
- Opłucz szkiełka w wodzie DEPC przez 3 minuty.
- Opłucz szkiełka w świeżej wodzie DEPC przez 1 minutę.
- Inkubować szkiełka w wodnym roztworze Eozyny Y przez 1 s.
- Przepłukać szkiełka 2 x 5 s w 95% EtOH.
- Przepłukać szkiełka 3 x 10 s w 100% EtOH.
- Wytrzyj nadmiar EtOH z tyłu szkiełek i pozostaw szkiełka do wyschnięcia na powietrzu.
- Przechowywać szkiełka w temperaturze -80 °C, jeśli LMD nie ma być wykonane natychmiast.
4. Obrazowanie slajdów
UWAGA: Kroki protokołu opisane w tej sekcji są specyficzne dla zeskanowanych slajdów (zobacz Tabelę materiałów) i wynikowych obrazów zapisanych jako pliki .svs. Należy używać dowolnego skanera i powiązanego z nim oprogramowania, które generuje pliki obrazów w formacie, który może otworzyć oprogramowanie do analizy obrazu (patrz tabela materiałów). Obsługiwane typy plików korzystające z piramidalnych formatów tiff to m.in. JPG, TIF, MRXS, QPTIFF, komponent TIFF, SVS, AFI, SCN, LIF, DCM, OME. TIFF, ND2, VSI, NDPI, NDPIS, CZI, BIF, KFB i ISYNTAX. Przybliżony czas: 5 min.
- Włącz skaner i otwórz oprogramowanie skanera slajdów. Załaduj szkiełko z tkanką skierowaną do góry na stolik z pojedynczym szkiełkiem w skanerze. Upewnij się, że szkiełko jest całkowicie suche i delikatnie umieść szkiełko nakrywkowe na chusteczce. Nie używaj etanolu ani olejku immersyjnego pod szkiełkiem nakrywkowym.
- Przechwyć obraz mikrograficzny przy użyciu ustawień skalibrowanych tak, aby dostosować się do membrany PEN zamiast szklanego tła i zignorować barwienie membrany tła, zgodnie z instrukcjami producenta.
- Dostosuj obszar obrazowania, przeciągając i zmieniając rozmiar wewnętrznego zielonego obwodu, aby uchwycić cały obszar membrany PEN, zgodnie z potrzebami. Dodaj cztery punkty ostrości na tkance, klikając dwukrotnie obraz przeglądu migawki, oraz trzy punkty ostrości na membranie w pobliżu wzorców kalibracji (po jednym punkcie ostrości na każdy z trzech wzorców kalibracji).
UWAGA: Cztery punkty ostrości można umieścić prawie w dowolnym miejscu na wycinku tkanki, chociaż umieszczenie ich na tkance, która jest zbyt ciemno poplamiona i wydaje się, może spowodować niepowodzenie skanowania. - W menu Widok wybierz opcję Monitor wideo. Ręcznie wyreguluj ostrość za pomocą suwaka precyzyjnej i/lub makro ostrości, w zależności od potrzeb, dla każdego punktu wokół tkanki LMD. Uchwyć skan obrazu w dużym powiększeniu (20x). Upewnij się, że wszystkie wzorce kalibracji są widoczne i wyraźne na zapisanym obrazie.
5. Automatyczny wybór funkcji za pomocą oprogramowania do analizy obrazu
- Dla całych zbiorów guzów (przybliżony czas: 5 min; w zależności od przypadku):
- Otwórz oprogramowanie do analizy obrazu (patrz tabela materiałów). Wybierz Otwórz obrazy i z wyskakującego okienka wybierz plik obrazu .svs wygenerowany na podstawie skanowania slajdu na skanerze AT2.
UWAGA: Reprezentatywny plik obrazu .svs znajduje się w pliku uzupełniającym 2. - Przejdź do zakładki Adnotacje. Wybierz narzędzie Pióro na pasku narzędzi Adnotacja i narysuj kształt wokół tkanki.
- Wybierz kształt i kliknij obraz prawym przyciskiem myszy. Z menu rozwijanego Zaawansowane wybierz opcję Partycjonowanie (kafelkowe). Ustaw rozmiar kafelka i odstęp między odpowiednio 500 i 40, a następnie wybierz przycisk OK, aby wygenerować kafelki. Zaznacz i usuń kształt obwodu użyty do wygenerowania kafelków w kroku 5.1.2.
- Wybierz menu rozwijane Akcje warstwy | Eksportuj, aby zapisać adnotacje kafelkowe jako plik adnotacji.
UWAGA: Reprezentatywny plik adnotacji dla całej kolekcji tkanki nowotworowej znajduje się w pliku uzupełniającym 3. - Utwórz folder dla sesji lub projektu i zapisz plik adnotacji w podfolderze oznaczonym unikatowym identyfikatorem slajdu.
- Przejdź do zakładki Adnotacje. Wybierz listę rozwijaną Działania na warstwie | Usuń wszystkie warstwy, aby usunąć wszystkie adnotacje z obrazu. Wybierz narzędzie Pióro i narysuj krótką linię od wewnętrznej końcówki grotu strzałki dla każdego odniesienia kalibracji. Narysuj linie ze znaków w następującej kolejności: lewy górny, prawy górny, prawy dolny róg.
- Wybierz menu rozwijane Akcje warstwy | Eksportuj, aby zapisać adnotacje linii jako plik adnotacji. Dodaj _calib do nazwy pliku i umieść go w podfolderze zawierającym współrzędne kształtów sąsiadujących.
UWAGA: Reprezentatywny plik adnotacji _calib znajduje się w pliku uzupełniającym 4. - Skopiuj adres głównego folderu projektu lub sesji. Otwórz skrypt generujący import XML, "Malleator" (dostępny za pośrednictwem https://github.com/GYNCOE/Mitchell.et.al.2022), korzystając ze zintegrowanego środowiska programistycznego IDLE i wklej adres folderu projektu między cudzysłowy na dole skryptu.
- Wybierz menu rozwijane Uruchom | Uruchom moduł, aby wykonać skrypt.
UWAGA: Plik importu .xml LMD zostanie wygenerowany w podfolderze utworzonym dla obrazu/slajdu. Reprezentatywny plik .xml znajduje się w pliku uzupełniającym 5.
- Otwórz oprogramowanie do analizy obrazu (patrz tabela materiałów). Wybierz Otwórz obrazy i z wyskakującego okienka wybierz plik obrazu .svs wygenerowany na podstawie skanowania slajdu na skanerze AT2.
- Tylko dla kolekcji wzbogaconych LMD (przybliżony czas: 15 min; w zależności od wielkości liter):
- Otwórz oprogramowanie do analizy obrazu (patrz tabela materiałów). Wybierz pozycję Otwórz obrazy i w wyskakującym okienku wybierz plik obrazu .svs wygenerowany na podstawie skanowania slajdu.
- Przejdź do zakładki Adnotacje. Wybierz i użyj narzędzia Adnotacja prostokąta, aby narysować ramkę wokół tkanki.
- Wybierz adnotację pola i kliknij obraz prawym przyciskiem myszy. Wybierz menu rozwijane Zaawansowane | Opcja partycjonowania (kafelkowego). Ustaw rozmiar kafelka i odstęp między odpowiednio 500 i 40, a następnie wybierz przycisk OK, aby wygenerować kafelki. Zaznacz i usuń adnotację pola obwodu używaną do generowania kafelków w kroku 5.2.2.
- Wybierz menu rozwijane Akcje warstwy | Eksportuj, aby zapisać adnotacje kafelkowe jako plik adnotacji.
- Umieść zapisaną kopię algorytmu "Dapọ" Pythona (dostępnego za pośrednictwem https://github.com/GYNCOE/Mitchell.et.al.2022), opracowanego w celu scalania warstw adnotacji sklasyfikowanych przez sztuczną inteligencję, w tym samym folderze, co plik adnotacji kafelkowych.
- Skopiuj nazwę pliku adnotacji z kafelkami. Otwórz program w języku Python przy użyciu zintegrowanego środowiska programistycznego IDLE i wklej nazwę pliku adnotacji kafelkowej między cytatami u dołu programu.
- Wybierz menu rozwijane Uruchom | Uruchom moduł. Poczekaj na wygenerowanie nowego pliku, w którym wszystkie adnotacje kafelkowe zostaną scalone w jednej warstwie.
- Otwórz oprogramowanie do analizy obrazu i przejdź do zakładki Adnotacje. Wybierz menu rozwijane Akcje warstwy | Usuń wszystkie warstwy, aby usunąć wszystkie adnotacje z obrazu.
- Wybierz menu rozwijane Akcje warstwy | Importuj lokalny plik adnotacji. W oknie podręcznym wybierz scalony plik adnotacji, który został wygenerowany przez skrypt. Upewnij się, że wszystkie zaimportowane kafelki znajdują się w tej samej warstwie adnotacji.
- Przejdź do zakładki Klasyfikator i postępuj zgodnie z instrukcjami producenta, aby wygenerować kształty dla ROI. Przed uruchomieniem klasyfikatora wybierz żądaną warstwę adnotacji (tj. warstwę guza lub zrębu), zaznaczając pole lub pola ROI na karcie Adnotacje w obszarze Zaawansowane opcje klasyfikatora. Użyj opcji Warstwa adnotacji z menu Akcje klasyfikatora, aby uruchomić klasyfikator.
- Po zakończeniu analizy klasyfikatora przejdź do zakładki Adnotacje i wybierz warstwę adnotacji wygenerowaną na podstawie analizy. Wybierz menu rozwijane Akcje warstwy | Usuń wszystkie warstwy oprócz bieżącej, aby usunąć z obrazu wszystkie inne warstwy adnotacji.
- Wybierz menu rozwijane Akcje warstwy | Eksportuj, aby zapisać adnotacje jako plik adnotacji. Utwórz folder dla sesji lub projektu i zapisz plik adnotacji w podfolderze oznaczonym unikatowym identyfikatorem slajdu.
UWAGA: Reprezentatywny plik adnotacji dla sklasyfikowanej kolekcji tkanek wzbogaconych LMD znajduje się w pliku uzupełniającym 6. - Przejdź do zakładki Adnotacje, wybierz listę rozwijaną Działania na warstwie | Usuń wszystkie warstwy, aby usunąć wszystkie adnotacje z obrazu. Wybierz narzędzie Pióro i narysuj krótką linię od każdego wzorca kalibracji. Narysuj linie ze znaków w następującej kolejności: lewy górny, prawy górny, prawy dolny róg.
- Wybierz menu rozwijane Akcje warstwy | Eksportuj, aby zapisać adnotacje linii jako plik adnotacji. Dodaj _calib do nazwy pliku i umieść go w podfolderze zawierającym współrzędne kształtów sąsiadujących.
- Skopiuj adres głównego folderu projektu lub sesji. Otwórz skrypt generujący import XML "Malleator" (dostępny za pośrednictwem https://github.com/GYNCOE/Mitchell.et.al.2022), korzystając ze zintegrowanego środowiska programistycznego IDLE, a następnie wklej adres folderu projektu między cudzysłowy na dole skryptu.
- Wybierz menu rozwijane Uruchom | Uruchom moduł, aby wykonać skrypt.
UWAGA: .xml plik importu LMD zostanie wygenerowany w podfolderze utworzonym dla obrazu/slajdu.
6. Mikrodysekcja laserowa
UWAGA: Kroki protokołu opisane w tej sekcji są specyficzne dla użycia z odwróconym mikroskopem laserowym i powiązanym oprogramowaniem (zobacz Tabelę Materiałów). Przybliżony czas: 2 h; W zależności od przypadku.
- Załaduj oznaczone szkiełko membranowe (zawierające wzorce kalibracji) z tkanką skierowaną w dół i stroną z etykietą bliżej operatora do uchwytu szkiełka na stoliku mikroskopu laserowego.
- Wybierz opcję Importuj kształty z menu rozwijanego Plik. Wybierz plik importu LMD .xml wygenerowany dla slajdu. Wybierz Nie w oknie podręcznym, aby uniknąć wczytywania punktów odniesienia z pliku, lub Nie w drugim oknie podręcznym, aby uniknąć używania wcześniej zapisanych punktów odniesienia do kalibracji.
- Postępuj zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi w aplikacji LMD i wyrównaj krzyżyk kalibracji do każdego z trzech wskaźników kalibracji na suwaku. Poszukaj wzorców kalibracji, które pojawiają się w lewym górnym, prawym górnym i prawym dolnym rogu obrazu szkiełka w oprogramowaniu do analizy obrazu, które będą odpowiadać punktom odniesienia odpowiednio w prawym, prawym tylnym i lewym tylnym rogu odwróconego szkiełka LMD na stoliku mikroskopu. Przełączaj się między używaniem soczewki obiektywu 5x do lokalizacji i obiektywu 63x, aby wyrównać każdy punkt odniesienia kalibracji. Wybierz opcję Nie w oknie podręcznym, aby uniknąć zapisywania punktów odniesienia do pliku, i OK w drugim oknie podręcznym, aby potwierdzić, że slajd został wstawiony.
- Przesuń soczewkę obiektywu 5x na miejsce i wybierz Tak w wyskakującym okienku, aby użyć rzeczywistego powiększenia. Gdy pojawią się zaimportowane kształty, ustaw ostrość aparatu na tkance.
- Podświetl i zaznacz wszystkie kształty w oknie Lista kształtów, przeciągnij je na miejsce, używając jednej lub dwóch adnotacji w polu widzenia jako odniesień, a następnie wyrównaj pionową oś Z do cięcia za pomocą lasera.
- Przejrzyj zaimportowane kształty i przypisz je do odpowiedniej pozycji rury do pobrania. Naciśnij przycisk Start Cut, aby uruchomić laser.
UWAGA: Zaimportowane kształty w pliku .xml zostaną automatycznie przypisane do pozycji "bez wersalików" w oknie Lista kształtów. Aby pobrać tkankę, importowane kształty muszą zostać ponownie przypisane do pozycji zawierającej załadowaną rurkę.
7. Trawienie białek za pomocą technologii cyklu ciśnieniowego (PCT)
UWAGA: Przybliżony czas: 4 h (3 godziny bez czasu suszenia wirówką próżniową).
- Umieścić 0,5 ml probówki zawierające zakryte mikroprobówki PCT zawierające pobraną tkankę LMD w 20 μl 100 mM TEAB/10% acetonitrylu w termocyklerze i podgrzewać w temperaturze 99 °C przez 30 minut, a następnie schłodzić do 50 °C przez 10 minut.
- Wiruj probówki przez 30 s z prędkością 4,000 × g, a następnie wyjmij mikroprobówki z probówek o pojemności 0,5 ml. Za pomocą narzędzia MicroCap usuń i wyrzuć MicroCaps z PCT MicroTubes. Dodaj trypsynę (patrz tabela materiałów) w proporcji 1 μg na 30mm2 tkanki i włóż MicroPestle do MicroTube za pomocą narzędzia MicroCap.
- Przenieś mikroprobówki do kartridża barocyklera i zmontuj cały wkład. Umieść wkład w komorze ciśnieniowej barocyklera i zabezpiecz pokrywę. Cykl barocykliczny przy 45 000 psi przez 50 s i ciśnienie atmosferyczne przez 10 s w temperaturze 50 °C przez 60 cykli.
- Po zakończeniu cyklu barocyklicznego przenieś mikroprobówki do probówki mikrowirówkowej o pojemności 0,5 ml i wiruj przez 2 minuty przy 4 000 × g.
- Wyjmij mikroprobówkę z probówki mikrowirówki o pojemności 0,5 ml za pomocą nasadki. Ostrożnie wyjmij tłuczek za pomocą nasadki i opłucz dolną połowę tłuczka 20 μl wody klasy do chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas (LC-MS) i zbierz płukanie do czystej probówki mikrowirówkowej o pojemności 0,5 ml.
- Delikatnie postukaj w mikroprobówkę o blat stołu, aby przesunąć płyn na dno i przenieść cały roztwór z mikroprobówki do probówki mikrowirówkowej o pojemności 0,5 ml.
- Dodaj 20 μl wody klasy LC-MS do mikroprobówki i delikatnie postukaj nią w blat stołu. Przenieś roztwór myjący do probówki o pojemności 0,5 ml i powtórz ten etap płukania jeszcze raz.
- Wirówka próżniowa w celu wysuszenia próbek do ~2 μL i dodania 100 μL 100 mM TEAB, pH 8,0.
- Oznaczyć stężenie peptydu za pomocą testu kolorymetrycznego (test kwasu bicinchoninowego (BCA); patrz tabela materiałów) zgodnie z protokołem producenta.
8. Etykietowanie znaczników TMT (Tandem-mass) i sprzątanie EasyPep
UWAGA: Przybliżony czas: 7 h 20 min (2 h 20 min bez czasu suszenia wirówki próżniowej).
- Przed otwarciem doprowadzić odczynniki do znakowania izobarycznego TMT do temperatury otoczenia. Dodać 500 μl 100% acetonitrylu do każdej fiolki TMT (5 mg). Inkubować przez 10 minut z okazjonalnym wirowaniem.
- Rozpuścić 5 μg próbki peptydu w 100 μL 100 mM TEAB o pH 8,0 i dodać 10 μl danego odczynnika TMT. Skonstruuj i uwzględnij pule referencyjne reprezentujące każdą pojedynczą próbkę w eksperymencie w każdym zestawie próbek multipleksu TMT, aby ułatwić kwantyfikację próbek w wielu multipleksach TMT9. Inkubować reakcje przez 1 godzinę w temperaturze otoczenia, od czasu do czasu wstrząsając/stukając.
- Ugasić reakcję znakowania TMT przez dodanie 10 μl 5% hydroksyloaminy i inkubować przez 30 minut w temperaturze otoczenia, od czasu do czasu stukając. Po schłodzeniu połączyć próbki znakowane TMT w jednej probówce i wysuszyć do około 200 μl.
- Dodać 1 800 μl 0,1% kwasu mrówkowego. Sprawdź pH za pomocą papieru pH: jeśli pH ~ 3, dodaj 1 ml 0,1% kwasu mrówkowego; jeśli pH >3, dodaj 10-20 μl 5% kwasu mrówkowego do pH ~3. Dodać 0,1% kwasu mrówkowego, aby uzyskać końcową objętość 3 ml.
- Usuń wypustkę na dole kolumny do czyszczenia peptydów, zdejmij nasadkę i umieść ją w stożkowej probówce o pojemności 15 ml. Przenieś próbkę oznaczoną TMT do kolumny i kontynuuj czyszczenie zgodnie z protokołem producenta.
- Wirować próżniowo w celu wysuszenia eluowanych peptydów do ~20 μl, przenieść do fiolki LC przy użyciu 25 mM wodorowęglanu amonu do końcowej objętości 80 μl i przystąpić do frakcjonowania offline.
9. Frakcjonowanie i łączenie próbek TMT multiplex
UWAGA: Przybliżony czas: 3 h 30 min (1 h 30 min bez czasu suszenia wirówki próżniowej).
- Frakcjonować multipleksy peptydowe znakowane TMT za pomocą podstawowej chromatografii z odwróconymi fazami na 96 frakcji, rozwijając rosnący gradient liniowy (0,69% min-1) fazy ruchomej B (acetonitryl) do fazy ruchomej A (10 mM NH4HCO3, pH 8,0).
- Wygeneruj 36 połączonych frakcji, łącząc dołki na próbki. Wirować próżniowo do suchych frakcji do ~2 μL i ponownie zawiesić w 25 mM wodorowęglanu amonu (końcowe stężenie 1,5 μg/10 μL), odwirować przy 15 000 × g przez 10-15 minut i przenieść do fiolek LC w celu analizy MS.
10. Tandemowa spektrometria mas do chromatografii cieczowej (LC-MS/MS)
UWAGA: Przybliżony czas: Metoda instrumentu i projekt eksperymentalny zależne.
- Skalibruj spektrometr mas zgodnie z instrukcjami/protokołami producenta.
- Przygotuj świeże fazy ruchome i wzorce oraz wykonaj odpowiednie przygotowania przed uruchomieniem LC (w tym między innymi rozpuszczalniki czyszczące, powietrze płuczące i skrypty testowe szczelności dla przyrządu do odniesienia [patrz Tabela materiałów]). Przed rozpoczęciem analiz należy zrównoważyć kolumny wstępne i analityczne oraz pętlę próbki.
- Przed i pomiędzy kolejnymi analizami multipleksu TMT należy sprawdzić, czy system LC-MS spełnia wcześniej określone wskaźniki wydajności przy użyciu trawień peptydowych znakowanych TMT w ramach zapewniania jakości/kontroli jakości (QA/QC) oraz (np. MSPE (patrz Tabela materiałów), HeLa).
- Załaduj fiolki z autosamplerem w odpowiednie miejsca w autosamplerze LC. Analizuj poszczególne frakcje odpowiednią metodą gradientu/MS. Przeplatać przebieg "płukania" wzorcem peptydów (np. kalibracja czasu retencji peptydów [PRTC]) mniej więcej raz dziennie w celu oceny wydajności chromatograficznej i widma masy. Po przeprowadzeniu analizy każdej serii frakcji próbek multipleksu TMT uruchom standardy porównawcze QA/QC TMT, aby ocenić wydajność systemu.
- Uruchom procedury oceny spektrometru mas zgodnie ze wzorcami porównawczymi QA/QC TMT, aby ocenić wydajność po próbce, a następnie skalibruj system, jak w kroku 10.1 dla następnego zestawu próbek.
11. Analiza danych bioinformatycznych
UWAGA: Przybliżony czas: Zależy od projektu eksperymentalnego.
- Przenieś wszystkie przykładowe dane (np. pliki .raw) do odpowiedniej pamięci sieciowej/dysku komputera.
- Przeszukaj wszystkie frakcje razem za pomocą żądanej aplikacji do analizy danych (np. Proteome Discover, Mascot) przy użyciu odpowiednich parametrów9 w referencyjnej bazie danych białek specyficznych dla gatunku, aby wygenerować dopasowania spektralne peptydów (PSM) i wyodrębnić intensywność sygnału jonów reporterowych TMT. Filtruj PSM w oparciu o odpowiednie wskaźniki kontroli jakości i agreguj znormalizowane, medianowe ilości kolportaży reporterowych TMT przekształcone logarytmem2 w globalną obfitość białka, zgodnie z wcześniejszym opisem3,9.
- Porównaj zmiany białek w interesujących ich warunkach za pomocą żądanego oprogramowania do analizy różnicowej.
Wyniki
Cienkie przekroje tkanek świeżo zamrożonych od dwóch pacjentów z HGSOC i dwóch z OCCC przeanalizowano przy użyciu zintegrowanego, opartego na AI procesu identyfikacji ROI tkankowych, segmentacji, LMD oraz ilościowej analizy proteomicznej (Rysunek 1). Reprezentatywne, barwione H&E przekroje tkanek dla każdego guza zostały ocenione przez certyfikowanego patologa; komórkowość guza wynosiła od 70% do 99%. Tkanki pocięto na cienkie przekroje na slajdach z membraną PEN (Plik uzupełniający 2) i wykonano wstępne cięcia z użyciem znaczników kalibracyjnych (Plik uzupełniający 1), co umożliwiło integrację danych o orientacji przestrzennej z adnotacji wygenerowanych w oprogramowaniu do analizy obrazu (patrz Tabela materiałów) z orientacją w układzie współrzędnych kartezjańskich w oprogramowaniu LMD. Po barwieniu H&E wykonano wysokorozdzielcze obrazy (20x) slajdów PEN zawierających tkankę wraz z kalibratorami.
Populacje komórek nowotworowych i stresalnych na mikrografiach zostały wysegmentowane przy użyciu oprogramowania do analizy obrazu (patrz. Tabela materiałów) do selektywnego pobierania za pomocą LMD, wraz z próbkami reprezentującymi cały cienki przekrój tkanki (np. całą tkankę guza) (Rysunek 1). Niespecyficzne adnotacje dla całych zbiorów tkanek nowotworowych wygenerowano poprzez podzielenie całego przekroju tkanki na kafelki o 500 µm2pozostawiając 40 µm odstęp między płytkami w celu zachowania integralności błony PEN i zapobiegania zwijaniu się błony podczas LMD. Na preparatach do wzbogacania LMD z rozdzielczością histologiczną klasyfikator AI w oprogramowaniu do analizy obrazu (patrz) Tabela materiałów) został wytrenowany w celu rozróżnienia komórek nowotworowych i komórek zrębu oraz tła w postaci pustego szkiełka przedmiotowego. Reprezentatywne obszary nowotworu, zrębu i pustego szkiełka zostały zaznaczone ręcznie, a następnie za pomocą narzędzia klasyfikującego przeprowadzono segmentację tych ROI w całym przekroju tkanki. Zsegmentowane warstwy reprezentujące całą tkankę, nabłonek nowotworowy oraz zrąb zostały zapisane osobno jako indywidualne pliki .annotation (Plik uzupełniający 3 i Plik uzupełniający 6). W oddzielnej kopii pliku obrazu (bez adnotacji podzielonych obszarów ROI) naniesiono krótką linię od środkowego końca każdego z trzech kalibratorów powierniczych, którą zapisano jako plik .annotation, używając tej samej nazwy pliku co w przypadku plików warstw adnotacji LMD, ale z dodanym przyrostkiem „_calib” (Plik uzupełniający 4). Linie te wykorzystano do koregistracji pozycji kalibratorów membrany PEN z danymi listy kształtów adnotacji wyrysowanymi w oprogramowaniu do analizy obrazu.
Niniejsze badanie przedstawia dwa algorytmy napisane w języku Python, „Malleator” i „Dapọ”, które wspierają ten proces LMD sterowany przez AI i są dostępne pod adresem https://github.com/GYNCOE/Mitchell.et.al.2022. Algorytm Malleator wyodrębnia konkretne współrzędne kartezjańskie dla wszystkich poszczególnych adnotacji (ROI tkanki i kalibratory) z powiązanych plików .annotation i łączy je w jeden plik importu w formacie Extensible Markup Language (XML) (Supplemental File 5). W szczególności algorytm Malleator wykorzystuje nazwę katalogu z folderu nadrzędnego jako dane wejściowe do przeszukiwania wszystkich folderów w podkatalogach i generuje pliki .xml dla wszelkich podfolderów, które nie posiadają jeszcze scalonego pliku .xml. Algorytm Malleator scala wszystkie warstwy adnotacji w oprogramowaniu do analizy obrazu (patrz Table of Materials) w jedną warstwę i konwertuje dane z listy kształtów wygenerowanych przez AI, zapisane w zastrzeżonym typie pliku .annotation, na format .xml kompatybilny z oprogramowaniem LMD. Po scaleniu plików adnotacji i kalibratora wygenerowany przez algorytm plik .xml jest zapisywany i importowany do oprogramowania LMD. Konieczne są niewielkie korekty w celu ręcznego dostosowania wyrównania adnotacji, co służy również do rejestracji pionowej (płaszczyzna z) pozycji stolika preparatu w mikroskopie laserowym. Algorytm Dapọ jest stosowany specjalnie do kolekcji wzbogaconych metodą LMD. Podzielone kafelki są automatycznie przypisywane do poszczególnych warstw adnotacji przez oprogramowanie do analizy obrazu. Algorytm Dapọ scala wszystkie podzielone kafelki w jedną warstwę adnotacji przed użyciem narzędzia Classifier, co skraca czas analizy Classifier dla kolekcji wzbogaconych metodą LMD.
Całe guzy oraz próbki tkanek wzbogacone metodą LMD poddano trawieniu, znakowaniu odczynnikami TMT, multipleksowaniu, frakcjonowaniu offline oraz analizie. poprzez ilościowa proteomika oparta na spektrometrii mas, zgodnie z wcześniejszym opisem9Średnia wydajność peptydów (43-60 µg) i odzyskiwania (0,46-0.59 µg/mm2) dla próbek pobranych przy użyciu tego sterowanego przez AI schematu postępowania były porównywalne z wcześniejszymi doniesieniami9,10Łącznie 5 971 białek poddano wspólnej kwantyfikacji we wszystkich próbkach (Tabela uzupełniająca S1). Nienadzorowane grupowanie hierarchiczne z wykorzystaniem 100 białek o największej zmienności doprowadziło do segregacji histotypów HGSOC i OCCC z próbek wzbogaconych metodą LMD oraz próbek całego guza (Rycina 2A), podobnie jak opisano wcześniej11Z kolei próbki zmarzniętej stromy wzbogaconej metodą LMD, pochodzące zarówno z HGSOC, jak i OCCC, grupowały się razem i niezależnie od próbek guza wzbogaconych metodą LMD oraz próbek całego guza. spośród 5 971 zquantyfikowanych białek 215 uległo istotnym zmianom (LIMMA skorygowane p < 0,05) pomiędzy całymi próbkami guza pochodzącymi z preparatów HGSOC i OCCC (Tabela uzupełniająca S2). Zmienione białka porównano z tymi, które zostały zidentyfikowane przez Hughesa i współpracowników w celu odróżnienia tkanki nowotworowej HGSOC od OCCC.11Z 76 białek sygnaturowych ilościowo określonych przez Hughesa i współpracowników, 57 zostało współokreślonych ilościowo w tym zbiorze danych i wykazało wysoką korelację (Rho Spearmana = 0,644, p < 0.001) (Rycina 2B).
Rysunek 1: Podsumowanie zintegrowanego schematu pracy dla zautomatyzowanego wyboru obszaru zainteresowania (ROI) tkanek do mikrosekcji laserowej w celu przeprowadzenia późniejszej ilościowej analizy proteomicznej. Znaczniki kalibracyjne są wycinane na szkiełkach z membraną PEN, aby współrejestrować dane o orientacji położenia z segmentów ROI tkanek wyznaczonych przez AI w oprogramowaniu do analizy obrazu, HALO, z poziomym pozycjonowaniem na mikroskopie LMD. Algorytm Malleator służy do łączenia adnotowanych danych segmentacyjnych ze wszystkich warstw adnotacji dla szkiełka z plikiem referencyjnym _calib oraz do konwersji tych danych do pliku .xml kompatybilnego z oprogramowaniem LMD. Tkanki pobrane za pomocą LMD do analizy proteomicznej są trawione i analizowane metodą wysokoprzepustowej ilościowej proteomiki zgodnie z wcześniejszym opisem9. Skróty: LMD = mikrosekcja laserowa; ROI = obszar zainteresowania; TMT = tandemowy znacznik masowy; Quant. = kwantyfikacja; Ident. = identyfikacja; LC-MS/MS = chromatografia cieczowa sprzężona z tandemową spektrometrią mas. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 2: Analiza białek w próbkach wzbogaconych metodą LMD i w całych próbkach guza. (A) Nienadzorowana hierarchiczna analiza skupień 100 białek o największej zmienności w próbkach wzbogaconych metodą LMD oraz całych próbkach guza w HGSOC i OCCC. (B) Korelacja log2 zmiany krotności (fold-change) zawartości białek pomiędzy próbkami całych guzów HGSOC i OCCC w niniejszym badaniu (Mitchell et al., oś X) a podobnym badaniem przeprowadzonym przez Hughes et al. (oś Y)11. Skróty: LMD = mikrodysekcja laserowa; HGSOC = wysokozłośliwy surowiczy rak jajnika; OCCC = jasnokomórkowy rak jajnika; log2FC = log2-transformowana zawartość proteomiczna. Aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.
Tabela uzupełniająca S1: Zawartość 5 971 białek współkwantyfikowanych we wszystkich próbkach wzbogaconych metodą LMD oraz próbkach całego guza z preparatów tkankowych HGSOC i OCCC. Skróty: LMD = mikrodysekcja laserowa; HGSOC = wysokostopniowy surowiczy rak jajnika; OCCC = jasnokomórkowy rak jajnika. Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.
Tabela uzupełniająca S2: Białka o różnym poziomie ekspresji (215) w próbkach całego guza z HGSOC w porównaniu z OCCC (LIMMA adj. p < 0,05). Skróty: HGSOC = wysokiego stopnia surowiczy rak jajnika; OCCC = jasnokomórkowy rak jajnika. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.
Plik uzupełniający 1: Reprezentatywny plik z listą kształtów (.sld) zawierający standardowe punkty odniesienia kalibratora dla czterech pozycji preparatu. Plik można zaimportować do oprogramowania LMD. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.
Plik uzupełniający 2: Reprezentatywny plik obrazu .svs wysokiej rozdzielczości (20x) przekroju tkanki barwionego H&E. Plik można otworzyć i przeglądać za pomocą oprogramowania do analizy obrazu lub oprogramowania LMD. Skróty: H&E = hematoksylina i eozyna; LMD = laserowa mikrodyssekcja. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.
Plik uzupełniający 3: Reprezentatywny plik .annotation dla podzielonych segmentów całego guza. Plik ten można zaimportować do oprogramowania do analizy obrazów. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.
Plik uzupełniający 4: Reprezentatywny plik _calib.annotation segmentów punktów orientacyjnych kalibratora. Informacje o współrzędnych reprezentują pozycjonowanie orientacyjne krótkich linii kalibracyjnych wyrysowanych z każdego grotu punktu orientacyjnego. Plik można zaimportować do oprogramowania do analizy obrazu. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.
Plik uzupełniający 5: Reprezentatywny plik języka rozszerzalnego (.xml) wygenerowany przez algorytm Malleator. Plik ten można zaimportować do oprogramowania do mikrodysekcji laserowej. Aby pobrać ten plik, kliknij tutaj.
Plik uzupełniający 6: Reprezentatywny plik .annotation podzielonych segmentów sklasyfikowanych przez AI dla kolekcji wzbogaconych metodą LMD. Plik ten można zaimportować do oprogramowania do analizy obrazu. Skróty: AI = sztuczna inteligencja; LMD = mikrodysekcja laserowa. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.
Dyskusja
Chociaż istnieje wiele precedensów badawczych mających na celu opracowanie i/lub ulepszenie przepływów pracy w celu wzbogacenia docelowych subpopulacji komórkowych z FFPE i/lub świeżo mrożonych tkanek oraz metodologii utrzymania jakości próbki podczas przetwarzania 9,12,13,14,15, istnieje znaczna potrzeba opracowania zautomatyzowanych strategii przygotowania klinicznych próbek tkanek do analiz molekularnych w celu zmniejszenia zmienności i zwiększyć powtarzalność. Ten przepływ pracy opisuje ustandaryzowany, półautomatyczny protokół, który integruje istniejące narzędzia oprogramowania do analizy obrazu (patrz Tabela materiałów) do histologicznego zbierania dyskretnych populacji komórek za pomocą LMD z klinicznych próbek tkanek.
Przestrzennie rozdzielcze wzbogacanie LMD w ROI wychwytujące dyskretne populacje komórek stanowi etap przetwarzania tkanek nowej generacji przed analizami multiomicznymi w celu poprawy charakterystyki molekularnej i identyfikacji oraz ułatwienia odkrywania selektywnych biomarkerów komórkowych. Protokół ten ulepsza istniejące metodologie poprzez zmniejszenie często długiej ekspozycji skrawków tkanek na środowisko otoczenia, co wiąże się z ręczną segmentacją ROI przez histologa (co może zająć >1-2 godziny przed pobraniem LMD). Ten przepływ pracy umożliwia wstępną identyfikację zwrotu z inwestycji za pomocą klasyfikacji i segmentacji sterowanej przez sztuczną inteligencję. Ograniczenie czasu przebywania w tkance zmniejszy fałszywe zmiany w ocenach wysoce labilnych celów molekularnych, takich jak fosfopeptydy i mRNA, lub w technikach analitycznych opartych na przeciwciałach, które opierają się na białku docelowym w swojej naturalnej konformacji w celu wykrywania.
Jednym z kluczowych elementów umożliwiających integrację oprogramowania do analizy obrazu (patrz Tabela materiałów) z przepływem pracy LMD jest wycięcie na szkiełku podstawowym wzorców wzorcowych, które są wyraźnie widoczne na zeskanowanym obrazie slajdu. Upewnienie się, że kalibratory mają precyzyjny ("czysty") punkt na dole kształtu litery "V", pozwala na wybór precyzyjnego punktu w oprogramowaniu do analizy obrazu, z którego mają być rysowane linie kalibratora, zgodnie z opisem w krokach 5.1.6 i 5.2.13. Wyrównanie tych punktów podczas importu do oprogramowania LMD ma kluczowe znaczenie dla prawidłowego nałożenia adnotacji (ułatwione dzięki wygenerowaniu kompatybilnego pliku .xml za pomocą algorytmów "Malleator" i/lub "Dapọ") na odpowiedni zwrot z inwestycji tkanki na fizycznym szkiełku LMD. Konieczne jest podświetlenie wszystkich kształtów i zbiorowe "przeciągnij i upuść" na miejsce, nawet jeśli wyrównanie jest precyzyjne po zaimportowaniu do oprogramowania LMD, aby zarejestrować pionowe (w płaszczyźnie z) położenie stolika na szkiełku w mikroskopie laserowym. Na tym etapie można również wprowadzić drobne korekty w położeniu adnotacji nad zwrotem z inwestycji w tkankę, jeśli zajdzie taka potrzeba.
Ograniczeniem obecnej wersji algorytmu Malleatora jest to, że nie jest ona kompatybilna z predefiniowanymi narzędziami do kształtu adnotacji dostarczanymi przez oprogramowanie do analizy obrazu (patrz Tabela materiałów), chociaż przyszłe aktualizacje/wersje algorytmu będą miały na celu poprawę tej kompatybilności. Plik adnotacji dla kształtów rysowanych za pomocą tych narzędzi zawiera tylko dwa zestawy sparowanych współrzędnych x i y dla każdej adnotacji, bez pełnej orientacji przestrzennej wokół tych punktów. Obecne użycie tych narzędzi powoduje, że adnotacje są przekształcane w linie proste zdefiniowane tylko przez dwa punkty podczas procesu importu. Ręczne definiowanie segmentów zwrotu z inwestycji w tkanki jest wymagane do pomyślnej konwersji do formatu XML i importu LMD. Można to zrobić, ręcznie definiując każdy zwrot z inwestycji za pomocą indywidualnych odręcznych adnotacji wielokątnych specyficznych dla obszaru docelowego lub stosując przybliżoną okrągłą lub prostokątną adnotację we wszystkich segmentach zwrotu z inwestycji w tkankę, jeśli jest to pożądane, i będzie to zgodne z tym przepływem pracy.
Podczas gdy przedstawiony tutaj przepływ pracy został zademonstrowany w analizie proteomicznej świeżo mrożonych próbek ludzkich tkanek rakowych, ten oparty na sztucznej inteligencji przepływ pracy LMD może być równie dobrze stosowany z tkankami FFPE, typami tkanek nienowotworowych i tymi pochodzącymi ze źródeł innych niż ludzie. Może również wspierać inne procesy profilowania molekularnego, w tym analizy transkryptomiczne, genomiczne lub fosfoproteomiczne. Ten przepływ pracy może również wykorzystywać inne zastosowania oprogramowania do analizy obrazu (patrz tabela materiałów), w tym z funkcjami związanymi ze zliczaniem komórek lub innymi modułami analitycznymi, w tym modułem "Multiplex IHC" lub "Tissue Microarray (TMA) Add-on". Przyszłe zastosowania tego przepływu pracy mogą również skorzystać ze wstępnego zdefiniowania liczby komórek w segmencie ROI, zapewniając w ten sposób równoważne dane wejściowe dla komórek w wielu kolekcjach, lub poprzez zastosowanie alternatywnych metod definiowania interesujących komórkowych wskaźników ROI, takich jak immunohistochemia lub socjologia komórki.
Oświadczenia
T.P.C. jest członkiem ThermoFisher Scientific, Inc SAB i otrzymuje fundusze na badania od AbbVie.
Podziękowania
Finansowanie tego projektu zostało częściowo zapewnione przez Defense Health Program (HU0001-16-2-0006 i HU0001-16-2-00014) dla Uniwersytetu Służb Mundurowych dla Centrum Doskonałości Ginekologicznej Onkologicznej. Sponsorzy nie odgrywali żadnej roli w projektowaniu, wykonywaniu, interpretacji ani pisaniu badania. zrzeczenie się: Poglądy wyrażone w niniejszym dokumencie są poglądami autorów i nie odzwierciedlają oficjalnej polityki Departamentu Wojsk Lądowych/Marynarki Wojennej/Sił Powietrznych, Departamentu Obrony ani rządu Stanów Zjednoczonych.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 1260 System Infinity II | Agilent Technologies Inc | System LC offline | |
| 96 MicroCaps (150 uL) luzem | Pressure Biosciences Inc | MC150-96 | |
| 96 MicroPestles luzem | Pressure Biosciences Inc | MP-96 | |
| 96 MicroTubes luzem (bez nakrętek) | Pressure Biosciences Inc | MT-96 | |
| 9mm Zestawy przezroczystych gwintów z certyfikatem MS | Fisher Scientific | 03-060-058 | Fiolka na próbkę do frationacji LC i spektrometrii mas |
| offline Acetonitryl, Optima LC/MS Grade | Fisher Chemical | A995-4 | Rozpuszczalnik fazy ruchomej |
| Aperio AT2 | Leica Microsystems | 23AT2100 | Skaner do slajdów |
| Axygen Probówki do PCR z płaską nakrętką 0,5 ml | Fisher Scientific | 14-222-292 | Probówki na próbki; rozmiar pasuje do probówek PCT i termocyklera |
| Barocykler 2320EXT | Pressure Biosciences Inc | 2320-EXT | Barocykler |
| Zestaw do oznaczania białek BCA | Fisher Scientific | P123225 | |
| cKompletne, Mini, wolny od EDTA koktajl inhibitorów proteazy | Roche | 11836170001 | |
| Easy-nLC 1200 | Naukowa | chromatografia cieczowa Thermo Fisher | |
| Zestaw do przygotowywania próbek EasyPep Maxi | Thermo Fisher Scientific | NCI5734 | Kolumna do czyszczenia próbek po etykiecie |
| EASY-SPRAY C18 2UM 50CM X 75 | Fisher Scientific | ES903 | Kolumna analityczna |
| Eozyna Y Roztwór | Sigma Aldrich | HT110216 | |
| Kwas mrówkowy, 99+ % | Thermo Fisher Scientific | 28905 | Mobilny dodatek fazowy |
| wersja ggplot2 3.3.5 | CRAN | https://cran.r-project.org/web/packages/ggplot2/ | |
| HALO | Indica Labs | Oprogramowanie do analizy obrazu | |
| IDLE ( Zintegrowane środowisko programistyczne i edukacyjne) | Python Software Foundation | ||
| iheatmapr wersja 0.5.1 | CRAN | https://cran.r-project.org/web/packages/iheatmapr/ | |
| iRT Kit | Biognosys | Ki-3002-1 | LC-MS QAQC Standard |
| limma wersja 3.42.2 | Bioconductor | https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/limma.html | |
| Stolik skanujący LMD Ultra LMT350 | LMD 11888453 Leica Microsystems | wyposażony w uchwyt do probówek | |
| PCT LMD7 (wersja oprogramowania 8.2.3.7603) | Aparatura LMD Leica Microsystems | (mikroskop, laser, kamera, komputer, tablet) | |
| analizy | Matrix | Server | |
| białka ludzkiego zgodny ze specyfikacją masy, Digest | Promega | V6951 | LC-MS QAQC Standard |
| Mayer' s Roztwór hematoksyniny | Sigma Aldrich | MHS32 | |
| PEN Szkiełka szklane z membraną | Leica Microsystems | 11532918 | |
| Mieszanina kalibracyjna czasu retencji peptydów | Thermo Fisher Scientific | 88321 | LC-MS QAQC |
| Standardowy koktajl inhibitorów fosfatazy 2 | Sigma Aldrich | P5726 | |
| Koktajl inhibitorów fosfatazy 3 | Sigma Aldrich | P0044 | |
| Pierce LTQ Velos ESI Roztwór do kalibracji jonów dodatnich | Thermo Fisher Scientific | 88323 | Roztwór do kalibracji przyrządu |
| PM100 C18 3UM 75UMX20MM NV 2PK | Fisher Scientific | 164535 | Wykrywacz |
| proteomu | Thermo Fisher Scientific | OPTON-31040 | Oprogramowanie do analizy danych |
| Python | Python Software Foundation | ||
| Q Exactive HF-X | Thermo Fisher Scientific | Spektrometr | |
| mas R wersja 3.6.0 | CRAN | https://cran-archive.r-project.org/bin/windows/base/old/2.6.2/ | |
| RColorBrewer wersja 1.1-2 | CRAN | https://cran.r-project.org/web/packages/RColorBrewer/ | |
| Rozpuszczalny zestaw Smart Digest | Thermo Fisher Scientific | 3251711 | Odczynnik do trawienia |
| TMTpro 16plex Label Zestaw odczynników | Thermo Fisher Scientific | A44520 | izobaryczne odczynniki do znakowania TMT |
| Termocykler Veriti 60 well Applied | Biosystems | 4384638 | Thermocycler |
| Water, Optima LC/MS Grade | Fisher Chemical | W6-4 | Rozpuszczalnik fazy ruchomej |
| ZORBAX Extend 300 C18, 2,1 x 12,5 mm, 5 i mikro; m, kaseta ochronna (ZGC) | Agilent Technologies Inc | 821125-932 | Kolumna pułapki LC |
| offline ZORBAX Extend 300 C18, 2,1 x 150 mm, 3,5 i mikro; m | Agilent Technologies Inc | 763750-902 | Kolumna analityczna LC offline |
Bibliografia
- Motohara, T., et al. An evolving story of the metastatic voyage of ovarian cancer cells: cellular and molecular orchestration of the adipose-rich metastatic microenvironment. Oncogene. 38 (16), 2885-2898 (2019).
- Aran, D., Sirota, M., Butte, A. J. Systematic pan-cancer analysis of tumour purity. Nature Communications. 6, 8971(2015).
- Hunt, A. L., et al. Extensive three-dimensional intratumor proteomic heterogeneity revealed by multiregion sampling in high-grade serous ovarian tumor specimens. iScience. 24 (7), 102757(2021).
- Dou, Y., et al. Proteogenomic characterization of endometrial carcinoma. Cell. 180 (4), 729-748 (2020).
- Zhang, H., et al. Integrated proteogenomic characterization of human high-grade serous ovarian cancer. Cell. 166 (3), 755-765 (2016).
- Gillette, M. A., et al. Proteogenomic characterization reveals therapeutic vulnerabilities in lung adenocarcinoma. Cell. 182 (1), 200-225 (2020).
- Silvestri, A., et al. Protein pathway biomarker analysis of human cancer reveals requirement for upfront cellular-enrichment processing. Laboratory Investigation. 90 (5), 787-796 (2010).
- Echle, A., et al. Deep learning in cancer pathology: a new generation of clinical biomarkers. British Journal of Cancer. 124 (4), 686-696 (2021).
- Lee, S., et al. Molecular analysis of clinically defined subsets of high-grade serous ovarian cancer. Cell Reports. 31 (2), 107502(2020).
- Xuan, Y., et al. Standardization and harmonization of distributed multi-center proteotype analysis supporting precision medicine studies. Nature Communications. 11 (1), 5248(2020).
- Hughes, C. S., et al. Quantitative profiling of single formalin fixed tumour sections: proteomics for translational research. Scientific Reports. 6 (1), 34949(2016).
- Espina, V., et al. A portrait of tissue phosphoprotein stability in the clinical tissue procurement process. Molecular & Cellular Proteomics. 7 (10), 1998-2018 (2008).
- Espina, V., Heiby, M., Pierobon, M., Liotta, L. A. Laser capture microdissection technology. Expert Review of Molecular Diagnostics. 7 (5), 647-657 (2007).
- Havnar, C. A., et al. Automated dissection protocol for tumor enrichment in low tumor content tissues. Journal of Visualized Experiments. (169), e62394(2021).
- Mueller, C., et al. One-step preservation of phosphoproteins and tissue morphology at room temperature for diagnostic and research specimens. PLoS One. 6 (8), (2011).
Przedruki i uprawnienia
