Uprzemysłowiona, sterowana sztuczną inteligencją mikrodysekcja laserowa do mikroskalowej analizy proteomicznej mikrośrodowiska guza

TME reprezentuje złożony ekosystem wypełniony bardzo różnorodnym wachlarzem typów komórek, takich jak komórki nowotworowe, komórki zrębu, komórki odpornościowe, komórki śródbłonka, inne typy komórek mezenchymalnych i adipocyty, wraz ze złożoną macierzą zewnątrzkomórkową¹. Ten ekosystem komórkowy różni się w obrębie różnych miejsc chorobowych i między nimi, co skutkuje złożoną heterogenicznością guza^2,3. Ostatnie badania wykazały, że nowotwory heterogenne i guzy o niskiej komórkowości guza (niskiej czystości) często korelują ze złym rokowaniem choroby^2,3.

Aby zrozumieć molekularne zależności między populacjami komórek nowotworowych i nienowotworowych w TME na dużą skalę, niezbędne są standaryzowane i wysokoprzepustowe strategie selektywnego zbierania odrębnych populacji komórkowych do dalszej analizy multiomicznej. Proteomika ilościowa stanowi szybko rozwijającą się i coraz ważniejszą technikę pozwalającą na pogłębienie wiedzy na temat biologii nowotworów. Do tej pory większość badań wykorzystujących proteomikę dotyczyła białek ekstrahowanych z preparatów z całych tkanek nowotworowych (np. kriopulwerowanych), co prowadzi do niedostatku w zrozumieniu heterogeniczności na poziomie proteomu w klasie TME4^,5,6.

Rozwój strategii pobierania próbek, które płynnie integrują się i wykorzystują informacje z przepływów pracy patologii klinicznej, umożliwi nową generację proteomiki histologicznej, która jest wysoce komplementarna do złotego standardu, diagnostycznych przepływów pracy. LMD umożliwia bezpośrednie i selektywne zbieranie subpopulacji komórkowych lub regionów zainteresowania (ROI) poprzez mikroskopową kontrolę histologicznie barwionych cienkich skrawków tkanek⁷. Ostatnie znaczące postępy w patologii cyfrowej i analizie opartej na sztucznej inteligencji wykazały zdolność do identyfikowania unikalnych cech składowych i ROI w TME w sposób zautomatyzowany, z których wiele koreluje ze zmianami molekularnymi i klinicznymi cechami choroby, takimi jak oporność na terapię i rokowanie choroby⁸.

Przepływ pracy opisany w przedstawionym tutaj protokole wykorzystuje komercyjne rozwiązania programowe do selektywnego opisywania ROI guza w cyfrowych obrazach histopatologicznych i wykorzystuje opracowane przez nas narzędzia programowe do przenoszenia tych ROI guza do mikroskopów laserowych w celu automatycznego zbierania dyskretnych populacji komórkowych, które bezproblemowo integrują się z dalszymi przepływami pracy analizy multiomicznej. Ta zintegrowana strategia znacznie skraca czas operatora LMD i minimalizuje czas, przez jaki tkanki muszą znajdować się w temperaturze otoczenia. Integracja zautomatyzowanego wyboru cech i zbierania LMD z wysokoprzepustową proteomiką ilościową została wykazana poprzez analizę różnicową TME z dwóch reprezentatywnych podtypów histologicznych nabłonkowego raka jajnika, surowiczego raka jajnika o wysokim stopniu złośliwości (HGSOC) i raka jasnokomórkowego jajnika (OCCC).

Wszystkie protokoły badań zostały zatwierdzone do użytku zgodnie z zatwierdzonym przez Western IRB protokołem "Zintegrowana analiza molekularna raka endometrium i jajnika w celu identyfikacji i walidacji klinicznie informacyjnych biomarkerów" uznanych za wyłączone na mocy amerykańskiego rozporządzenia federalnego 45 CFR 46.102(f). Wszystkie protokoły eksperymentalne obejmujące dane z udziałem ludzi w tym badaniu były zgodne z Deklaracją Helsińską. Uzyskano świadomą zgodę od wszystkich uczestników biorących udział w badaniu.

UWAGA: Następujące odczynniki używane w całym protokole są znanymi lub podejrzewanymi czynnikami rakotwórczymi i/lub zawierają niebezpieczne materiały: etanol, woda DEPC, roztwór Hematoksyliny Mayera, roztwór Eozyny Y, metanol, acetonitryl i kwas mrówkowy. Obowiązkowe jest właściwe obchodzenie się z nimi, zgodnie z opisem w odpowiednich kartach charakterystyki (SDS), oraz stosowanie odpowiednich środków ochrony indywidualnej (PPE).

1. Generowanie domyślnego pliku danych listy kształtów (.sld) zawierającego referencje kalibratora

UWAGA: Kroki protokołu opisane w tej sekcji są specyficzne dla użycia z odwróconym mikroskopem laserowym i powiązanym oprogramowaniem (zobacz Tabelę Materiałów). Utworzenie domyślnego pliku .sld jest konieczne tylko raz na mikroskop laserowy. Wynikowy plik może być używany do wycinania powierników na wszystkie slajdy PEN używane później. Przybliżony czas: 5 min (tylko raz).

1. Otwórz oprogramowanie LMD i załaduj szkiełko z membraną naftalanu etylenu (PEN) na stolik LMD stroną zadrukowaną do dołu, z etykietą znajdującą się najbliżej użytkownika. Usuń zaznaczenie pola Zamknij wiersze po prawej stronie okna programu.
2. Użyj funkcji PtoP (point to point) w dużym powiększeniu (63x), aby narysować trzy strzałki "V", które posłużą jako punkty odniesienia kalibracji. Zaczynając od jednego zewnętrznego punktu na literze V, narysuj linię do punktu środkowego litery V i kliknij pojedynczym kliknięciem. Następnie narysuj drugą linię od środkowego punktu litery V do końca drugiego zewnętrznego punktu litery V i kliknij dwukrotnie, aby utworzyć pojedynczy, niezamknięty kształt litery V z dwóch linii.
   UWAGA: Te odniesienia do kalibracji należy umieścić w trzech rogach suwaka: z przodu po prawej, z tyłu po prawej, z tyłu po lewej.
3. Wybierz opcję AF (autofokus) przed cięciem. Przytnij suwak w pozycji 1, przesuń go do każdej z pozostałych pozycji suwaka i dokładnie prześledź nacięcia kalibracyjne.
4. Zapisz plik .sld i wybierz opcję Zapisz bez kalibracji w wyskakującym oknie dialogowym, aby uniknąć wcięcia wzorców kalibracji w membranę.
   UWAGA: Reprezentatywny plik .sld zawierający standardowe wzorce odniesienia dla czterech pozycji szkiełka znajduje się w pliku uzupełniającym 1.

2. Przygotowanie slajdów LMD

UWAGA: Kroki protokołu opisane w tej sekcji są specyficzne dla użycia z odwróconym mikroskopem laserowym i powiązanym oprogramowaniem (zobacz Tabelę Materiałów). Przybliżony czas: 5 min.

1. Upewnij się, że szkiełko jest całkowicie suche przed przecięciem referencyjnych wskaźników kalibracji. Otwórz oprogramowanie LMD i otwórz domyślny plik kalibracyjny .sld w opcji Importuj kształty.
2. Wybierz opcję AF (autofokus) przed cięciem. Załaduj szkiełko (szkiełka) chusteczką skierowaną w dół, a etykietę wsunąć bliżej operatora do uchwytu szkiełka na stoliku LMD.
3. Korzystając z mikroskopu laserowego i domyślnego pliku .sld kalibracji, wytnij wzorce kalibracji w membranie PEN.
   1. OPCJONALNIE: Wytnij wzorce kalibracji w membranie PEN przed lub po umieszczeniu odcinka tkanki na szkiełku. Jeśli wzorce kalibracji są wycinane przed umieszczeniem tkanki, upewnij się, że tkanka i/lub utrwalacz nie nakładają się na kalibratory, gdy tkanka jest umieszczana na szkiełku w kroku 2.5. Jeśli wzorce kalibracji zostaną odcięte po umieszczeniu tkanki, należy przerwać po zakończeniu kroku 2.4 i przejść do sekcji 3.
4. Przeglądaj wszystkie kalibratory indywidualnie, aby upewnić się, że każde cięcie jest kompletne i widoczne.
   UWAGA: Użyj funkcji Move and Cut, aby ręcznie skierować laser na wszelkie wzorce kalibracji, które nie przecięły całkowicie membrany PEN.
5. Umieścić zamrożony lub utrwalony w formalinie wycinek tkanki zatopionej w parafinie (FFPE) na szkiełku zawierającym elementy wzorcujące.

3. Barwienie tkanek

UWAGA: Przybliżony czas: 30 min.

1. Zamrożone szkiełka tkankowe LMD zamocować w 70% etanolu (EtOH) zawierającym odczynniki koktajlowe inhibitorów fosfatazy na 5 minut.
2. Myć szkiełka w wodzie z pirokarbominianu dietylu (DEPC) zawierającej odczynniki koktajlowe inhibitorów fosfatazy przez 1 min.
3. Myj szkiełka w wodzie DEPC przez 1 minutę.
4. Inkubować szkiełka w roztworze hematoksyliny Mayera przez 3 minuty.
5. Opłucz szkiełka w wodzie DEPC przez 3 minuty.
6. Opłucz szkiełka w świeżej wodzie DEPC przez 1 minutę.
7. Inkubować szkiełka w wodnym roztworze Eozyny Y przez 1 s.
8. Przepłukać szkiełka 2 x 5 s w 95% EtOH.
9. Przepłukać szkiełka 3 x 10 s w 100% EtOH.
10. Wytrzyj nadmiar EtOH z tyłu szkiełek i pozostaw szkiełka do wyschnięcia na powietrzu.
11. Przechowywać szkiełka w temperaturze -80 °C, jeśli LMD nie ma być wykonane natychmiast.

4. Obrazowanie slajdów

UWAGA: Kroki protokołu opisane w tej sekcji są specyficzne dla zeskanowanych slajdów (zobacz Tabelę materiałów) i wynikowych obrazów zapisanych jako pliki .svs. Należy używać dowolnego skanera i powiązanego z nim oprogramowania, które generuje pliki obrazów w formacie, który może otworzyć oprogramowanie do analizy obrazu (patrz tabela materiałów). Obsługiwane typy plików korzystające z piramidalnych formatów tiff to m.in. JPG, TIF, MRXS, QPTIFF, komponent TIFF, SVS, AFI, SCN, LIF, DCM, OME. TIFF, ND2, VSI, NDPI, NDPIS, CZI, BIF, KFB i ISYNTAX. Przybliżony czas: 5 min.

1. Włącz skaner i otwórz oprogramowanie skanera slajdów. Załaduj szkiełko z tkanką skierowaną do góry na stolik z pojedynczym szkiełkiem w skanerze. Upewnij się, że szkiełko jest całkowicie suche i delikatnie umieść szkiełko nakrywkowe na chusteczce. Nie używaj etanolu ani olejku immersyjnego pod szkiełkiem nakrywkowym.
2. Przechwyć obraz mikrograficzny przy użyciu ustawień skalibrowanych tak, aby dostosować się do membrany PEN zamiast szklanego tła i zignorować barwienie membrany tła, zgodnie z instrukcjami producenta.
3. Dostosuj obszar obrazowania, przeciągając i zmieniając rozmiar wewnętrznego zielonego obwodu, aby uchwycić cały obszar membrany PEN, zgodnie z potrzebami. Dodaj cztery punkty ostrości na tkance, klikając dwukrotnie obraz przeglądu migawki, oraz trzy punkty ostrości na membranie w pobliżu wzorców kalibracji (po jednym punkcie ostrości na każdy z trzech wzorców kalibracji).
   UWAGA: Cztery punkty ostrości można umieścić prawie w dowolnym miejscu na wycinku tkanki, chociaż umieszczenie ich na tkance, która jest zbyt ciemno poplamiona i wydaje się, może spowodować niepowodzenie skanowania.
4. W menu Widok wybierz opcję Monitor wideo. Ręcznie wyreguluj ostrość za pomocą suwaka precyzyjnej i/lub makro ostrości, w zależności od potrzeb, dla każdego punktu wokół tkanki LMD. Uchwyć skan obrazu w dużym powiększeniu (20x). Upewnij się, że wszystkie wzorce kalibracji są widoczne i wyraźne na zapisanym obrazie.

5. Automatyczny wybór funkcji za pomocą oprogramowania do analizy obrazu

1. Dla całych zbiorów guzów (przybliżony czas: 5 min; w zależności od przypadku):
   1. Otwórz oprogramowanie do analizy obrazu (patrz tabela materiałów). Wybierz Otwórz obrazy i z wyskakującego okienka wybierz plik obrazu .svs wygenerowany na podstawie skanowania slajdu na skanerze AT2.
      UWAGA: Reprezentatywny plik obrazu .svs znajduje się w pliku uzupełniającym 2.
   2. Przejdź do zakładki Adnotacje. Wybierz narzędzie Pióro na pasku narzędzi Adnotacja i narysuj kształt wokół tkanki.
   3. Wybierz kształt i kliknij obraz prawym przyciskiem myszy. Z menu rozwijanego Zaawansowane wybierz opcję Partycjonowanie (kafelkowe). Ustaw rozmiar kafelka i odstęp między odpowiednio 500 i 40, a następnie wybierz przycisk OK, aby wygenerować kafelki. Zaznacz i usuń kształt obwodu użyty do wygenerowania kafelków w kroku 5.1.2.
   4. Wybierz menu rozwijane Akcje warstwy | Eksportuj, aby zapisać adnotacje kafelkowe jako plik adnotacji.
      UWAGA: Reprezentatywny plik adnotacji dla całej kolekcji tkanki nowotworowej znajduje się w pliku uzupełniającym 3.
   5. Utwórz folder dla sesji lub projektu i zapisz plik adnotacji w podfolderze oznaczonym unikatowym identyfikatorem slajdu.
   6. Przejdź do zakładki Adnotacje. Wybierz listę rozwijaną Działania na warstwie | Usuń wszystkie warstwy, aby usunąć wszystkie adnotacje z obrazu. Wybierz narzędzie Pióro i narysuj krótką linię od wewnętrznej końcówki grotu strzałki dla każdego odniesienia kalibracji. Narysuj linie ze znaków w następującej kolejności: lewy górny, prawy górny, prawy dolny róg.
   7. Wybierz menu rozwijane Akcje warstwy | Eksportuj, aby zapisać adnotacje linii jako plik adnotacji. Dodaj _calib do nazwy pliku i umieść go w podfolderze zawierającym współrzędne kształtów sąsiadujących.
      UWAGA: Reprezentatywny plik adnotacji _calib znajduje się w pliku uzupełniającym 4.
   8. Skopiuj adres głównego folderu projektu lub sesji. Otwórz skrypt generujący import XML, "Malleator" (dostępny za pośrednictwem https://github.com/GYNCOE/Mitchell.et.al.2022), korzystając ze zintegrowanego środowiska programistycznego IDLE i wklej adres folderu projektu między cudzysłowy na dole skryptu.
   9. Wybierz menu rozwijane Uruchom | Uruchom moduł, aby wykonać skrypt.
      UWAGA: Plik importu .xml LMD zostanie wygenerowany w podfolderze utworzonym dla obrazu/slajdu. Reprezentatywny plik .xml znajduje się w pliku uzupełniającym 5.
2. Tylko dla kolekcji wzbogaconych LMD (przybliżony czas: 15 min; w zależności od wielkości liter):
   1. Otwórz oprogramowanie do analizy obrazu (patrz tabela materiałów). Wybierz pozycję Otwórz obrazy i w wyskakującym okienku wybierz plik obrazu .svs wygenerowany na podstawie skanowania slajdu.
   2. Przejdź do zakładki Adnotacje. Wybierz i użyj narzędzia Adnotacja prostokąta, aby narysować ramkę wokół tkanki.
   3. Wybierz adnotację pola i kliknij obraz prawym przyciskiem myszy. Wybierz menu rozwijane Zaawansowane | Opcja partycjonowania (kafelkowego). Ustaw rozmiar kafelka i odstęp między odpowiednio 500 i 40, a następnie wybierz przycisk OK, aby wygenerować kafelki. Zaznacz i usuń adnotację pola obwodu używaną do generowania kafelków w kroku 5.2.2.
   4. Wybierz menu rozwijane Akcje warstwy | Eksportuj, aby zapisać adnotacje kafelkowe jako plik adnotacji.
   5. Umieść zapisaną kopię algorytmu "Dapọ" Pythona (dostępnego za pośrednictwem https://github.com/GYNCOE/Mitchell.et.al.2022), opracowanego w celu scalania warstw adnotacji sklasyfikowanych przez sztuczną inteligencję, w tym samym folderze, co plik adnotacji kafelkowych.
   6. Skopiuj nazwę pliku adnotacji z kafelkami. Otwórz program w języku Python przy użyciu zintegrowanego środowiska programistycznego IDLE i wklej nazwę pliku adnotacji kafelkowej między cytatami u dołu programu.
   7. Wybierz menu rozwijane Uruchom | Uruchom moduł. Poczekaj na wygenerowanie nowego pliku, w którym wszystkie adnotacje kafelkowe zostaną scalone w jednej warstwie.
   8. Otwórz oprogramowanie do analizy obrazu i przejdź do zakładki Adnotacje. Wybierz menu rozwijane Akcje warstwy | Usuń wszystkie warstwy, aby usunąć wszystkie adnotacje z obrazu.
   9. Wybierz menu rozwijane Akcje warstwy | Importuj lokalny plik adnotacji. W oknie podręcznym wybierz scalony plik adnotacji, który został wygenerowany przez skrypt. Upewnij się, że wszystkie zaimportowane kafelki znajdują się w tej samej warstwie adnotacji.
   10. Przejdź do zakładki Klasyfikator i postępuj zgodnie z instrukcjami producenta, aby wygenerować kształty dla ROI. Przed uruchomieniem klasyfikatora wybierz żądaną warstwę adnotacji (tj. warstwę guza lub zrębu), zaznaczając pole lub pola ROI na karcie Adnotacje w obszarze Zaawansowane opcje klasyfikatora. Użyj opcji Warstwa adnotacji z menu Akcje klasyfikatora, aby uruchomić klasyfikator.
   11. Po zakończeniu analizy klasyfikatora przejdź do zakładki Adnotacje i wybierz warstwę adnotacji wygenerowaną na podstawie analizy. Wybierz menu rozwijane Akcje warstwy | Usuń wszystkie warstwy oprócz bieżącej, aby usunąć z obrazu wszystkie inne warstwy adnotacji.
   12. Wybierz menu rozwijane Akcje warstwy | Eksportuj, aby zapisać adnotacje jako plik adnotacji. Utwórz folder dla sesji lub projektu i zapisz plik adnotacji w podfolderze oznaczonym unikatowym identyfikatorem slajdu.
       UWAGA: Reprezentatywny plik adnotacji dla sklasyfikowanej kolekcji tkanek wzbogaconych LMD znajduje się w pliku uzupełniającym 6.
   13. Przejdź do zakładki Adnotacje, wybierz listę rozwijaną Działania na warstwie | Usuń wszystkie warstwy, aby usunąć wszystkie adnotacje z obrazu. Wybierz narzędzie Pióro i narysuj krótką linię od każdego wzorca kalibracji. Narysuj linie ze znaków w następującej kolejności: lewy górny, prawy górny, prawy dolny róg.
   14. Wybierz menu rozwijane Akcje warstwy | Eksportuj, aby zapisać adnotacje linii jako plik adnotacji. Dodaj _calib do nazwy pliku i umieść go w podfolderze zawierającym współrzędne kształtów sąsiadujących.
   15. Skopiuj adres głównego folderu projektu lub sesji. Otwórz skrypt generujący import XML "Malleator" (dostępny za pośrednictwem https://github.com/GYNCOE/Mitchell.et.al.2022), korzystając ze zintegrowanego środowiska programistycznego IDLE, a następnie wklej adres folderu projektu między cudzysłowy na dole skryptu.
   16. Wybierz menu rozwijane Uruchom | Uruchom moduł, aby wykonać skrypt.
       UWAGA: .xml plik importu LMD zostanie wygenerowany w podfolderze utworzonym dla obrazu/slajdu.

6. Mikrodysekcja laserowa

UWAGA: Kroki protokołu opisane w tej sekcji są specyficzne dla użycia z odwróconym mikroskopem laserowym i powiązanym oprogramowaniem (zobacz Tabelę Materiałów). Przybliżony czas: 2 h; W zależności od przypadku.

1. Załaduj oznaczone szkiełko membranowe (zawierające wzorce kalibracji) z tkanką skierowaną w dół i stroną z etykietą bliżej operatora do uchwytu szkiełka na stoliku mikroskopu laserowego.
2. Wybierz opcję Importuj kształty z menu rozwijanego Plik. Wybierz plik importu LMD .xml wygenerowany dla slajdu. Wybierz Nie w oknie podręcznym, aby uniknąć wczytywania punktów odniesienia z pliku, lub Nie w drugim oknie podręcznym, aby uniknąć używania wcześniej zapisanych punktów odniesienia do kalibracji.
3. Postępuj zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi w aplikacji LMD i wyrównaj krzyżyk kalibracji do każdego z trzech wskaźników kalibracji na suwaku. Poszukaj wzorców kalibracji, które pojawiają się w lewym górnym, prawym górnym i prawym dolnym rogu obrazu szkiełka w oprogramowaniu do analizy obrazu, które będą odpowiadać punktom odniesienia odpowiednio w prawym, prawym tylnym i lewym tylnym rogu odwróconego szkiełka LMD na stoliku mikroskopu. Przełączaj się między używaniem soczewki obiektywu 5x do lokalizacji i obiektywu 63x, aby wyrównać każdy punkt odniesienia kalibracji. Wybierz opcję Nie w oknie podręcznym, aby uniknąć zapisywania punktów odniesienia do pliku, i OK w drugim oknie podręcznym, aby potwierdzić, że slajd został wstawiony.
4. Przesuń soczewkę obiektywu 5x na miejsce i wybierz Tak w wyskakującym okienku, aby użyć rzeczywistego powiększenia. Gdy pojawią się zaimportowane kształty, ustaw ostrość aparatu na tkance.
5. Podświetl i zaznacz wszystkie kształty w oknie Lista kształtów, przeciągnij je na miejsce, używając jednej lub dwóch adnotacji w polu widzenia jako odniesień, a następnie wyrównaj pionową oś Z do cięcia za pomocą lasera.
6. Przejrzyj zaimportowane kształty i przypisz je do odpowiedniej pozycji rury do pobrania. Naciśnij przycisk Start Cut, aby uruchomić laser.
   UWAGA: Zaimportowane kształty w pliku .xml zostaną automatycznie przypisane do pozycji "bez wersalików" w oknie Lista kształtów. Aby pobrać tkankę, importowane kształty muszą zostać ponownie przypisane do pozycji zawierającej załadowaną rurkę.

7. Trawienie białek za pomocą technologii cyklu ciśnieniowego (PCT)

UWAGA: Przybliżony czas: 4 h (3 godziny bez czasu suszenia wirówką próżniową).

1. Umieścić 0,5 ml probówki zawierające zakryte mikroprobówki PCT zawierające pobraną tkankę LMD w 20 μl 100 mM TEAB/10% acetonitrylu w termocyklerze i podgrzewać w temperaturze 99 °C przez 30 minut, a następnie schłodzić do 50 °C przez 10 minut.
2. Wiruj probówki przez 30 s z prędkością 4,000 × g, a następnie wyjmij mikroprobówki z probówek o pojemności 0,5 ml. Za pomocą narzędzia MicroCap usuń i wyrzuć MicroCaps z PCT MicroTubes. Dodaj trypsynę (patrz tabela materiałów) w proporcji 1 μg na 30^mm2 tkanki i włóż MicroPestle do MicroTube za pomocą narzędzia MicroCap.
3. Przenieś mikroprobówki do kartridża barocyklera i zmontuj cały wkład. Umieść wkład w komorze ciśnieniowej barocyklera i zabezpiecz pokrywę. Cykl barocykliczny przy 45 000 psi przez 50 s i ciśnienie atmosferyczne przez 10 s w temperaturze 50 °C przez 60 cykli.
4. Po zakończeniu cyklu barocyklicznego przenieś mikroprobówki do probówki mikrowirówkowej o pojemności 0,5 ml i wiruj przez 2 minuty przy 4 000 × g.
5. Wyjmij mikroprobówkę z probówki mikrowirówki o pojemności 0,5 ml za pomocą nasadki. Ostrożnie wyjmij tłuczek za pomocą nasadki i opłucz dolną połowę tłuczka 20 μl wody klasy do chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas (LC-MS) i zbierz płukanie do czystej probówki mikrowirówkowej o pojemności 0,5 ml.
6. Delikatnie postukaj w mikroprobówkę o blat stołu, aby przesunąć płyn na dno i przenieść cały roztwór z mikroprobówki do probówki mikrowirówkowej o pojemności 0,5 ml.
7. Dodaj 20 μl wody klasy LC-MS do mikroprobówki i delikatnie postukaj nią w blat stołu. Przenieś roztwór myjący do probówki o pojemności 0,5 ml i powtórz ten etap płukania jeszcze raz.
8. Wirówka próżniowa w celu wysuszenia próbek do ~2 μL i dodania 100 μL 100 mM TEAB, pH 8,0.
9. Oznaczyć stężenie peptydu za pomocą testu kolorymetrycznego (test kwasu bicinchoninowego (BCA); patrz tabela materiałów) zgodnie z protokołem producenta.

8. Etykietowanie znaczników TMT (Tandem-mass) i sprzątanie EasyPep

UWAGA: Przybliżony czas: 7 h 20 min (2 h 20 min bez czasu suszenia wirówki próżniowej).

1. Przed otwarciem doprowadzić odczynniki do znakowania izobarycznego TMT do temperatury otoczenia. Dodać 500 μl 100% acetonitrylu do każdej fiolki TMT (5 mg). Inkubować przez 10 minut z okazjonalnym wirowaniem.
2. Rozpuścić 5 μg próbki peptydu w 100 μL 100 mM TEAB o pH 8,0 i dodać 10 μl danego odczynnika TMT. Skonstruuj i uwzględnij pule referencyjne reprezentujące każdą pojedynczą próbkę w eksperymencie w każdym zestawie próbek multipleksu TMT, aby ułatwić kwantyfikację próbek w wielu multipleksach TMT⁹. Inkubować reakcje przez 1 godzinę w temperaturze otoczenia, od czasu do czasu wstrząsając/stukając.
3. Ugasić reakcję znakowania TMT przez dodanie 10 μl 5% hydroksyloaminy i inkubować przez 30 minut w temperaturze otoczenia, od czasu do czasu stukając. Po schłodzeniu połączyć próbki znakowane TMT w jednej probówce i wysuszyć do około 200 μl.
4. Dodać 1 800 μl 0,1% kwasu mrówkowego. Sprawdź pH za pomocą papieru pH: jeśli pH ~ 3, dodaj 1 ml 0,1% kwasu mrówkowego; jeśli pH >3, dodaj 10-20 μl 5% kwasu mrówkowego do pH ~3. Dodać 0,1% kwasu mrówkowego, aby uzyskać końcową objętość 3 ml.
5. Usuń wypustkę na dole kolumny do czyszczenia peptydów, zdejmij nasadkę i umieść ją w stożkowej probówce o pojemności 15 ml. Przenieś próbkę oznaczoną TMT do kolumny i kontynuuj czyszczenie zgodnie z protokołem producenta.
6. Wirować próżniowo w celu wysuszenia eluowanych peptydów do ~20 μl, przenieść do fiolki LC przy użyciu 25 mM wodorowęglanu amonu do końcowej objętości 80 μl i przystąpić do frakcjonowania offline.

9. Frakcjonowanie i łączenie próbek TMT multiplex

UWAGA: Przybliżony czas: 3 h 30 min (1 h 30 min bez czasu suszenia wirówki próżniowej).

1. Frakcjonować multipleksy peptydowe znakowane TMT za pomocą podstawowej chromatografii z odwróconymi fazami na 96 frakcji, rozwijając rosnący gradient liniowy (0,69% ^min-1) fazy ruchomej B (acetonitryl) do fazy ruchomej A (10 mM NH₄HCO₃, pH 8,0).
2. Wygeneruj 36 połączonych frakcji, łącząc dołki na próbki. Wirować próżniowo do suchych frakcji do ~2 μL i ponownie zawiesić w 25 mM wodorowęglanu amonu (końcowe stężenie 1,5 μg/10 μL), odwirować przy 15 000 × g przez 10-15 minut i przenieść do fiolek LC w celu analizy MS.

10. Tandemowa spektrometria mas do chromatografii cieczowej (LC-MS/MS)

UWAGA: Przybliżony czas: Metoda instrumentu i projekt eksperymentalny zależne.

1. Skalibruj spektrometr mas zgodnie z instrukcjami/protokołami producenta.
2. Przygotuj świeże fazy ruchome i wzorce oraz wykonaj odpowiednie przygotowania przed uruchomieniem LC (w tym między innymi rozpuszczalniki czyszczące, powietrze płuczące i skrypty testowe szczelności dla przyrządu do odniesienia [patrz Tabela materiałów]). Przed rozpoczęciem analiz należy zrównoważyć kolumny wstępne i analityczne oraz pętlę próbki.
3. Przed i pomiędzy kolejnymi analizami multipleksu TMT należy sprawdzić, czy system LC-MS spełnia wcześniej określone wskaźniki wydajności przy użyciu trawień peptydowych znakowanych TMT w ramach zapewniania jakości/kontroli jakości (QA/QC) oraz (np. MSPE (patrz Tabela materiałów), HeLa).
4. Załaduj fiolki z autosamplerem w odpowiednie miejsca w autosamplerze LC. Analizuj poszczególne frakcje odpowiednią metodą gradientu/MS. Przeplatać przebieg "płukania" wzorcem peptydów (np. kalibracja czasu retencji peptydów [PRTC]) mniej więcej raz dziennie w celu oceny wydajności chromatograficznej i widma masy. Po przeprowadzeniu analizy każdej serii frakcji próbek multipleksu TMT uruchom standardy porównawcze QA/QC TMT, aby ocenić wydajność systemu.
5. Uruchom procedury oceny spektrometru mas zgodnie ze wzorcami porównawczymi QA/QC TMT, aby ocenić wydajność po próbce, a następnie skalibruj system, jak w kroku 10.1 dla następnego zestawu próbek.

11. Analiza danych bioinformatycznych

UWAGA: Przybliżony czas: Zależy od projektu eksperymentalnego.

1. Przenieś wszystkie przykładowe dane (np. pliki .raw) do odpowiedniej pamięci sieciowej/dysku komputera.
2. Przeszukaj wszystkie frakcje razem za pomocą żądanej aplikacji do analizy danych (np. Proteome Discover, Mascot) przy użyciu odpowiednich parametrów⁹ w referencyjnej bazie danych białek specyficznych dla gatunku, aby wygenerować dopasowania spektralne peptydów (PSM) i wyodrębnić intensywność sygnału jonów reporterowych TMT. Filtruj PSM w oparciu o odpowiednie wskaźniki kontroli jakości i agreguj znormalizowane, medianowe ilości kolportaży reporterowych TMT przekształcone logarytmem₂ w globalną obfitość białka, zgodnie z wcześniejszym opisem^3,9.
3. Porównaj zmiany białek w interesujących ich warunkach za pomocą żądanego oprogramowania do analizy różnicowej.

Świeżo zamrożone cienkie skrawki tkanek od dwóch pacjentów z HGSOC i dwóch pacjentów z OCCC zostały przeanalizowane przy użyciu tego zintegrowanego, opartego na sztucznej inteligencji przepływu pracy identyfikacji zwrotu z inwestycji w tkanki, segmentacji, LMD i ilościowej analizy proteomicznej (Rysunek 1). Reprezentatywne skrawki tkanek wybarwione H&E dla każdego guza zostały ocenione przez certyfikowanego patologa; Komórkowość guza wahała się od 70% do 99%. Tkanki zostały cienko przecięte na szkiełkach membranowych PEN (plik uzupełniający 2) i wstępnie przycięte za pomocą wzorców kalibratora (plik uzupełniający 1), co umożliwiło integrację danych orientacji pozycyjnej z adnotacji wygenerowanych w oprogramowaniu do analizy obrazu (patrz tabela materiałów) z orientacją współrzędnych kartezjańskich w oprogramowaniu LMD. Po barwieniu H&E wykonano obrazy o wysokiej rozdzielczości (20x) preparatów PEN zawierających tkankę oraz kalibratory.

Populacje komórek nowotworowych i zrębowych na mikrofotografiach zostały podzielone na segmenty za pomocą oprogramowania do analizy obrazów (patrz Tabela materiałów) w celu selektywnego pobrania za pomocą LMD, wraz z pobraniem reprezentującym cały cienki przekrój tkanki (np. cała tkanka nowotworowa) (Rysunek 1). Niedyskryminujące adnotacje dla kolekcji całych tkanek nowotworowych zostały wygenerowane poprzez podzielenie całego odcinka tkanki za pomocą płytek o wielkości 500 μm2, pozostawiając 40 μm odstępu między płytkami, aby zachować integralność błony PEN i zapobiec zwijaniu się błony podczas LMD. Na szkiełkach do wzbogacania LMD w rozdzielczości histologicznej, klasyfikator AI w oprogramowaniu do analizy obrazu (patrz Tabela materiałów) został przeszkolony w rozróżnianiu komórek nowotworowych i zrębowych, wraz z czystym szklanym tłem szkiełka. Reprezentatywne obszary guza, zrębu i pustego szkła zostały ręcznie podświetlone, a narzędzie klasyfikatora użyto do segmentacji tych ROI w całym przekroju tkanki. Segmentowane warstwy reprezentujące całą tkankę, nabłonek guza i zrąb zostały zapisane oddzielnie jako indywidualne pliki adnotacji (plik uzupełniający 3 i plik uzupełniający 6). W oddzielnej kopii pliku obrazu (bez partycjonowanych adnotacji ROI) krótka linia od najbardziej środkowego końca każdego z trzech kalibratorów odniesienia została opatrzona adnotacją i zapisana jako plik adnotacji przy użyciu tej samej nazwy pliku, co każdy z plików warstwy adnotacji LMD, ale dołączona z sufiksem "_calib" (Plik uzupełniający 4). Linie te zostały wykorzystane do jednoczesnej rejestracji pozycji kalibratorów membran PEN z danymi listy kształtów adnotacji narysowanymi w oprogramowaniu do analizy obrazu.

Niniejsze badanie dostarcza dwa algorytmy, "Malleator" i "Dapọ" w Pythonie, które wspierają ten sterowany przez sztuczną inteligencję przepływ pracy LMD, które są dostępne na https://github.com/GYNCOE/Mitchell.et.al.2022. Algorytm Malleator wyodrębnia określone współrzędne kartezjańskie dla wszystkich indywidualnych adnotacji (zwrot z inwestycji w tkanki i kalibratory) ze sparowanych plików adnotacji i łączy je w jeden plik importu Extensible Markup Language (XML) (plik uzupełniający 5). W szczególności algorytm Malleator używa nazwy katalogu z folderu nadrzędnego jako danych wejściowych do przeszukiwania wszystkich folderów podkatalogów i generuje pliki .xml dla wszystkich podfolderów, które nie mają jeszcze .xml scalonego pliku. Algorytm Malleator łączy wszystkie warstwy adnotacji w oprogramowaniu do analizy obrazu (patrz Tabela materiałów) w jedną warstwę i przekształca dane listy kształtów wygenerowane przez sztuczną inteligencję, które są zapisywane jako zastrzeżony typ pliku .annotation, na .xml format zgodny z oprogramowaniem LMD. Po scaleniu plików adnotacji i kalibratora, wygenerowany przez algorytm plik .xml jest zapisywany i importowany do oprogramowania LMD. Niewielkie korekty są niezbędne do ręcznego dostosowania wyrównania adnotacji, co służy również do rejestracji pionowego (w płaszczyźnie z) położenia stolika na szkiełku w mikroskopie laserowym. Algorytm Dapọ jest używany specjalnie dla kolekcji wzbogaconych o LMD. Podzielone kafelki są automatycznie przypisywane do poszczególnych warstw adnotacji przez oprogramowanie do analizy obrazu. Algorytm Dapọ scala wszystkie podzielone kafelki w jedną warstwę adnotacji przed użyciem narzędzia Klasyfikator, skracając w ten sposób czas wykonywania analizy klasyfikatora dla kolekcji wzbogaconych o LMD.

Całe próbki guza i tkanek wzbogaconych LMD zostały strawione, oznaczone odczynnikami TMT, multipleksowane, frakcjonowane offline i analizowane za pomocą ilościowej proteomiki opartej na MS, jak wcześniej opisano9. Średnia wydajność peptydów (43-60 μg) i odzysk (0,46-0,59 μg/mm2) dla próbek pobranych przy użyciu tego przepływu pracy opartego na sztucznej inteligencji były porównywalne z poprzednimi raportami9,10. Łącznie 5 971 białek zostało ocenionych ilościowo we wszystkich próbkach (tabela uzupełniająca S1). Nienadzorowane hierarchiczne grupowanie przy użyciu 100 najbardziej zmiennych białek spowodowało segregację histotypów HGSOC i OCCC z próbek wzbogaconych LMD i całych guzów (Figura 2A), podobna do tej wcześniej opisanej 11. W przeciwieństwie do tego, próbki zrębu wzbogacone LMD zarówno z HGSOC, jak i OCCC grupowały się razem i niezależnie od próbek guza wzbogaconego LMD i całych guzów. Spośród 5 971 oznaczonych ilościowo białek, 215 było znacząco zmienionych (LIMMA adj. p < 0,05) między całymi kolekcjami guza z próbek HGSOC i OCCC (tabela uzupełniająca S2). Te zmienione białka porównano z tymi, które zostały zidentyfikowane w celu różnicowania tkanki nowotworowej HGSOC i OCCC przez Hughes et al.11. Spośród 76 białek sygnaturowych określonych ilościowo przez Hughesa i wsp., 57 zostało poddanych współocenie ilościowej w tym zestawie danych i było silnie skorelowanych (Spearman Rho = 0,644, p < 0,001) (Figura 2B).

Rysunek 1: Podsumowanie zintegrowanego przepływu pracy dla zautomatyzowanego wyboru obszaru zainteresowania tkanki do mikrodysekcji laserowej dla dalszej proteomiki ilościowej. Wzorce kalibracji są wycinane na szkiełkach membranowych PEN w celu jednoczesnego rejestrowania danych o orientacji pozycyjnej z segmentów ROI tkanek pochodzących od sztucznej inteligencji w oprogramowaniu do analizy obrazu, HALO, z pozycjonowaniem poziomym w mikroskopie LMD. Algorytm Malleator służy do scalania danych segmentacji z adnotacjami na wszystkich warstwach adnotacji dla slajdu z plikiem referencyjnym _calib oraz do konwersji go na plik .xml zgodny z oprogramowaniem LMD. Tkanka pobrana z LMD do analizy proteomicznej jest trawiona i analizowana za pomocą wysokoprzepustowej proteomiki ilościowej, jak opisano wcześniej9. Skróty: LMD = mikrodysekcja laserowa; ROI = obszar zainteresowania; TMT = tandemowa etykieta masowa; Quant. = kwantyfikacja; Ident. = identyfikacja; LC-MS/MS = chromatografia cieczowa – tandemowa spektrometria mas. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Analiza białek w próbkach wzbogaconych LMD i całych guzach. (A) Nienadzorowana hierarchiczna analiza skupień 100 najbardziej zróżnicowanych białek w próbkach wzbogaconych w LMD HGSOC i OCCC oraz całych guzach. (B) Korelacja obfitości białek logarytmicznie zmienno-krotnych między HGSOC i OCCC w całym guzie w niniejszym badaniu (Mitchell i wsp., oś x) i podobnym badaniu przeprowadzonym przez Hughes i wsp. (oś y)11. Skróty: LMD = mikrodysekcja laserowa; HGSOC = surowiczy rak jajnika o wysokim stopniu złośliwości; OCCC = rak jasnokomórkowy jajnika; log2FC = logarytm2 przekształcona liczebność proteomiczna. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela uzupełniająca S1: Obfitość 5 971 białek współmierzonych we wszystkich próbkach wzbogaconych LMD i całych guzach z próbek tkanek HGSOC i OCCC. Skróty: LMD = mikrodysekcja laserowa; HGSOC = surowiczy rak jajnika o wysokim stopniu złośliwości; OCCC = rak jasnokomórkowy jajnika. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela uzupełniająca S2: Białka o zróżnicowanej ekspresji (215) w całych kolekcjach guzów z HGSOC vs OCCC (LIMMA adj. p < 0,05). Skróty: HGSOC = surowiczy rak jajnika o wysokim stopniu złośliwości; OCCC = rak jasnokomórkowy jajnika. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Plik uzupełniający 1: Plik z danymi reprezentatywnej listy kształtów (.sld) zawierający standardowe wzorce wzorców dla czterech pozycji slajdów. Plik można zaimportować do oprogramowania LMD. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 2: Reprezentatywny plik .svs przedstawiający wycinek tkanki o wysokiej rozdzielczości (20x) barwiony H&E. Plik można otwierać i przeglądać za pomocą oprogramowania do analizy obrazu lub oprogramowania LMD. Skrót: H&E = hematoksylina i eozyna; LMD = mikrodysekcja laserowa. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 3: Reprezentatywny plik adnotacji z podzielonymi na części całymi segmentami guza. Plik można zaimportować do oprogramowania do analizy obrazu. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 4: Reprezentatywny plik adnotacji _calib segmentów odniesienia kalibratora. Informacje o współrzędnych reprezentują orientalne położenie krótkich linii kalibratora wyznaczonych z każdego odniesienia grotu strzałki. Plik można zaimportować do oprogramowania do analizy obrazu. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 5: Reprezentatywny plik rozszerzalnego języka znaczników (.xml) wygenerowany przez algorytm Malleator. Plik można zaimportować do oprogramowania do mikrodysekcji laserowej. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 6: Reprezentatywny plik adnotacji z podzielonymi segmentami sklasyfikowanymi przez AI dla kolekcji wzbogaconych o LMD. Plik można zaimportować do oprogramowania do analizy obrazu. Skróty: AI = sztuczna inteligencja; LMD = mikrodysekcja laserowa. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

T.P.C. jest członkiem ThermoFisher Scientific, Inc SAB i otrzymuje fundusze na badania od AbbVie.