Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Metody in ovo i ex ovo do badania rozwoju ucha wewnętrznego ptaków

2.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64172

⸱

16 czerwca 2022

 ,  ,  ,  , 
1National Centre for Biological Sciences, Tata Institute of Fundamental Research, 2The University of Trans-Disciplinary Health Sciences and Technology

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Pisklę jest opłacalnym, dostępnym i szeroko dostępnym organizmem modelowym do różnych badań. W tym miejscu szczegółowo opisano szereg protokołów, aby zrozumieć mechanizmy molekularne leżące u podstaw rozwoju i regeneracji ucha wewnętrznego ptaków.

Streszczenie

Ucho wewnętrzne odbiera dźwięk i utrzymuje równowagę za pomocą ślimaka i przedsionka. Odbywa się to za pomocą dedykowanego typu komórki mechanosensorycznej znanej jako komórka rzęsata. Podstawowe badania w uchu wewnętrznym doprowadziły do dogłębnego zrozumienia, jak funkcjonują komórki rzęsate i jak rozregulowanie może prowadzić do utraty słuchu i zawrotów głowy. W tych badaniach mysz była wybitnym systemem modelowym. Jednak myszy, podobnie jak wszystkie ssaki, utraciły zdolność do zastępowania komórek rzęsatych. Tak więc, próbując zrozumieć terapie komórkowe w celu przywrócenia funkcji ucha wewnętrznego, badania uzupełniające na innych gatunkach kręgowców mogą dostarczyć dalszych informacji. Nabłonek słuchowy ptaków, brodawka podstawna (BP), jest arkuszem nabłonka składającym się z mechanosensorycznych komórek rzęsatych (HC) interkalowanych przez komórki podporowe (SC). Chociaż budowa anatomiczna brodawki podstawnej i ślimaka ssaków różni się, mechanizmy molekularne rozwoju ucha wewnętrznego i słuchu są podobne. To sprawia, że brodawka podstawna jest użytecznym systemem nie tylko do badań porównawczych, ale także do zrozumienia regeneracji. Tutaj opisujemy techniki preparacji i manipulacji ucha wewnętrznego kurczaka. Technika ta pokazuje metody genetyczne i hamowania małych cząsteczek, które stanowią potężne narzędzie do badania molekularnych mechanizmów rozwoju ucha wewnętrznego. W tym artykule omawiamy techniki elektroporacji in ovo w celu genetycznego zaburzenia brodawki podstawnej za pomocą delecji CRIPSR-Cas9, a następnie rozwarstwienia brodawki podstawnej. Pokazujemy również hodowlę narządów BP i optymalne wykorzystanie matryc hodowlanych, aby obserwować rozwój nabłonka i komórek rzęsatych.

Wprowadzenie

Ucho wewnętrzne wszystkich kręgowców wywodzi się z prostego nabłonka znanego jako otic placode1,2. W ten sposób powstaną wszystkie elementy strukturalne i typy komórek niezbędne do przekazywania informacji mechanosensorycznych związanych ze słuchem i percepcją równowagi. Komórki rzęsate (HC), czujnik rzęskowy ucha wewnętrznego, są otoczone komórkami podporowymi (SC). HC przekazują informacje do słuchowego tyłomózgowia przez neurony ósmego nerwu czaszkowego. Są one również generowane z otic placode3. Pierwotna transdukcja dźwięku jest osiągana na wierzchołkowej powierzchni słuchowego HC, poprzez mechanicznie czułą wiązkę włosów4. Odbywa się to za pośrednictwem zmodyfikowanych wypukłości na bazie aktyny zwanych stereociliami, które są ułożone w stopniowany wzór klatki schodowej5. Ponadto zmodyfikowana rzęska pierwotna, zwana kinocilium, organizuje tworzenie wiązki włosów i przylega do najwyższego rzędu stereocilia6,7,8. Architektura stereocilii ma kluczowe znaczenie dla tej roli w przekształcaniu bodźców mechanicznych pochodzących z energii akustycznej na elektryczne sygnały neuronowe9. Uszkodzenie słuchu HC spowodowane starzeniem się, infekcją, urazem otoakustycznym lub wstrząsem ototoksycznym może spowodować częściową lub całkowitą utratę słuchu, która u ssaków jest nieodwracalna10.

Zaproponowano komórkowe terapie zastępcze, które mogłyby naprawić takie uszkodzenia11,12. Podejście do tych badań polegało na zrozumieniu normalnego rozwoju komórki rzęsatej ssaków i zapytaniu, czy programy rozwojowe mogą zostać ponownie zainicjowane w komórkach podobnych do komórek progenitorowych, które mogą istnieć w uchu wewnętrznym13. Drugim podejściem było spojrzenie poza ssaki, na kręgowce inne niż ssaki, u których zachodzi silna regeneracja słuchowych komórek rzęsatych, takich jak ptaki14,15. U ptaków regeneracja komórek rzęsatych zachodzi głównie poprzez odróżnicowanie komórki podporowej do stanu podobnego do progenitorowego, po której następuje asymetryczny podział mitotyczny w celu wytworzenia komórki rzęsatej i komórki wspierającej16. Ponadto zaobserwowano również bezpośrednie różnicowanie komórki podporowej w celu wytworzenia komórki rzęsatej 17.

Chociaż mechanizmy rozwoju słuchowego ptaków wykazują znaczne podobieństwa do mechanizmów u ssaków, istnieją różnice18. Różnicowanie HC i SC w BP piskląt jest widoczne od 7 dnia embrionalnego (E) i z czasem staje się coraz wyraźniejsze. Za pomocą E12 można uwidocznić dobrze wzorzystą i dobrze spolaryzowaną brodawkę podstawną (BP), a za pomocą E17 dobrze rozwinięte komórki rzęsate można zobaczyć19. Te punkty czasowe dają wgląd w mechanizmy różnicowania, wzorca i polaryzacji, a także dojrzewania komórek rzęsatych. Zrozumienie, czy takie mechanizmy są konserwatywne, czy rozbieżne, jest ważne, ponieważ dostarczają one wglądu w głęboką homologię pochodzenia mechanosensorycznych komórek rzęsatych.

Tutaj demonstrujemy szereg technik wykonywanych we wczesnych i późnych stadiach embrionalnych do badania procesów komórkowych, takich jak proliferacja, specyfikacja losu, różnicowanie, tworzenie wzorów i utrzymanie przez cały okres rozwoju narządu ucha wewnętrznego. Uzupełnia to inne protokoły dotyczące zrozumienia rozwoju ucha wewnętrznego w hodowli eksplantatów20,21,22. Najpierw omówimy wprowadzenie egzogennego DNA lub RNA do prekursorów BP w otocyście E3.5 za pomocą elektroporacji in ovo. Chociaż manipulacje genetyczne mogą dostarczyć cennych informacji, wygenerowane w ten sposób fenotypy mogą być plejotropowe, a w konsekwencji mylące. Jest to szczególnie ważne w późniejszym rozwoju ucha wewnętrznego, gdzie podstawowe procesy, takie jak przebudowa cytoszkieletu, odgrywają wiele ról w podziale komórek, morfogenezie tkanek i specjalizacji komórkowej. Przedstawiamy protokoły hamowania farmakologicznego w hodowanych eksplantatach, które oferują korzyści w kontrolowaniu dawkowania oraz czasu i czasu trwania leczenia, oferując precyzyjną czasoprzestrzenną manipulację mechanizmami rozwojowymi.

Różne metody hodowli narządów mogą być stosowane w zależności od czasu trwania leczenia małymi inhibitorami. Tutaj pokazujemy dwie metody hodowli narządów, które pozwalają na wgląd w morfogenezę nabłonka i specjalizację komórkową. Metoda hodowli 3D wykorzystująca kolagen jako matrycę do hodowli przewodu ślimakowego umożliwia solidną hodowlę i wizualizację na żywo rozwijającego się ciśnienia tętniczego. Aby zrozumieć powstawanie stereocilii, przedstawiamy metodę hodowli błonowej, w której tkanka nabłonkowa jest hodowana na sztywnej matrycy, co umożliwia swobodny wzrost wypukłości aktyny. Obie metody umożliwiają dalsze przetwarzanie, takie jak obrazowanie żywych komórek, immunohistochemia, skaningowa mikroskopia elektronowa (SEM), rejestracja komórek itp. Techniki te stanowią mapę drogową dla skutecznego wykorzystania pisklęcia jako systemu modelowego do zrozumienia i manipulowania rozwojem, dojrzewaniem i regeneracją nabłonka słuchowego ptaków.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Protokoły dotyczące pozyskiwania, hodowli i wykorzystania zapłodnionych jaj kurzych i niewyklutych embrionów zostały zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję Etyki Zwierząt Narodowego Centrum Nauk Biologicznych, Bengaluru, Karnataka.

1. Elektroporacja in ovo prekursorów słuchowych piskląt

  1. Projektowanie i klonowanie sgRNA w celu wyeliminowania genu CRISPR/Cas9
    1. Aby stworzyć nokauty genów, zaprojektuj RNA przewodnika, aby zakłócić regiony eksonu genu, najlepiej bliżej końca 5' regionu kodującego.
    2. Wybierz potencjalne przewodnikowe RNA za pomocą narzędzia internetowego CRISPOR23. Ustaw dane przeglądarki na Gallus gallus, a sekwencję motywu sąsiadującego z protospacerem (PAM) na 5'- NGG -3'. Program określa przewodnikowe RNA z sekwencji wejściowej i przypisuje różne wyniki w zależności od aktywności na miejscu i poza nim. Wybierz cztery najlepsze przewodniki do dalszych badań.
    3. W celu zaprojektowania specyficznych dla matrycy oligonukleotydów do produkcji przewodnika (g)RNA, należy usunąć sekwencję PAM (5′-NGG -3′) z danych wyjściowych narzędzia do projektowania gRNA. Nie jest to potrzebne do celowania, ale zawiera sekwencję rozpoznawania rozszczepienia Cas9. Zsyntetyzuj dwa oczyszczone HPLC komplementarne oligonukleotydy z miejscem restrykcyjnym BsmBI na obu końcach, dla każdego potencjalnego gRNA.
    4. Sklonuj sekwencję prowadzącą w ramce za pomocą rusztowania tracrRNA wybranego wektora (tutaj użyto pcU6_1sgRNA wektora24).
    5. Rozpuścić oligonukleotydy sgRNA w stężeniu 100 μM w wodzie wolnej od DNazy/RNaz. Wyżarzanie dwóch światłowodów sensownych i antysensownych należy przeprowadzić za pomocą termocyklera o następujących parametrach: 95 °C przez 3 min, następnie 37 °C przez 15 min, a następnie obniżyć do 4 °C.
    6. Korzystając ze standardowych technik biologii molekularnej, jak opisano w25, ustaw trawienie restrykcyjne wyżarzonych oligonukleotydów i pcU6_1sgRNA wektor klonowania enzymem BsmBI przez noc. Konfiguracja ligacji z oczyszczonym w żelu liniowym wektorem pcU6_1sgRNA trawionym przez BsmBI i strawionymi oligonukleukleotykami sgRNA. Przekształć się w kompetentną komórkę DH5-alfa i sekwencję potwierdź uzyskany klon.
  2. Obchodzenie się z jajami i okienkowanie
    1. Kupuj świeżo złożone jaja i czyść je, przecierając je 70% etanolem, aby zapobiec zanieczyszczeniu. Inkubować w temperaturze 37-38 °C, przy wilgotności 45% przez 3,5-4 dni.
    2. Po inkubacji umieść jajo na boku na co najmniej 5 minut przed otwarciem. Pozwala to zarodkowi na przemieszczenie się na wierzch żółtka. Użyj kleszczy, aby zrobić małe otwory na górze i końcu jajka, tak aby mogła przejść przez nie igła 21G.
    3. Aby zapobiec uszkodzeniom podczas okienkowania, usuń albuminę, aby opuścić zarodek z dala od skorupy. Aby to zrobić, użyj strzykawki o pojemności 5 ml i igły 21G, aby ostrożnie pobrać 2 ml albuminy z otworu na końcu jajka. Użyj przezroczystej taśmy, aby zakryć otwór na końcu.
    4. Aby zrobić okienko na jajko, przyklej przezroczystą taśmę do górnej części skorupki jajka. Rozetnij okno o długości około 2 cm i szerokości 1,5 cm za pomocą nożyczek do łuków sprężynowych i odsłoń zarodek. Użyj kleszczy, aby otworzyć błony kosmówkowe pokrywające zarodek, umożliwiając dostęp do zarodka.
  3. Plazmidy mikroiniekcyjne
    1. Do eksperymentu z nokautem genów przygotuj dwa roztwory: mieszankę knock-down zawierającą białko SpCas9 i plazmid prowadzący - pcU6_1sgRNA, oraz mieszankę plazmidu znacznikowego T2K-eGFP (jest to promotor ß-aktyny piskląt napędzający kasetę GFP otoczoną miejscami transpozonów Tol2) wraz z T2TP (transpozaza Tol2 sklonowana w Tol2 construct26,27). Znacznik służy do śledzenia wydajności elektroporacji.
    2. Podczas elektroporacji wielu plazmidów upewnij się, że końcowe stężenie DNA wynosi co najmniej 4 μg/μL. Wymieszaj trzy konstrukty, plazmid prowadzący - pcU6_1sgRNA, T2K-eGFP i T2TP, w stosunku 1:1:1 z 1 μg białka SpCas9, 30% sacharozy i 0,1% barwnika Fast Green w końcowej objętości 10 μL.
    3. Wyciągnij igły do mikroiniekcji ze standardowych szklanych kapilar (długość 3 cale, średnica zewnętrzna 1,0 mm) za pomocą pionowego ściągacza do pipet. Za pomocą cienkich kleszczyków odłamać końcówkę kapilary po pociągnięciu, aby uzyskać średnicę końcówki około 50 μm ze zwężającym się końcem.
    4. Połóż zarodki w E3.5 na lewym boku z głową skierowaną w prawo. W ten sposób tylko prawy pęcherzyk uszny jest dostępny do mikroiniekcji. Mikrowstrzyknąć mieszankę knock-down do pęcherzyka usznego. Wstrzyknąć około 200 nl objętości mieszaniny roztworu DNA, aby wypełnić pęcherzyk uszny.
    5. Określ wydajność przewodnika za pomocą testu endonukleazy T728.
  4. Elektroporacja
    1. Dodaj kilka kropli 0,719% soli fizjologicznej na wierzch zarodka przed elektroporacją, aby obniżyć opór elektryczny i zapobiec przegrzaniu zarodka.
    2. Umieść elektrodę dodatnią przez otwór wykonany po stronie jaja, gdy albumina została usunięta. Manewruj elektrodą tak, aby znajdowała się pod żółtkiem. Umieść elektrodę ujemną na wypełnionej otocyście.
    3. Użyj elektroporacji, aby przetransfekować plazmidy do komórek zarodka. Użyj generatora impulsów kwadratowych i zastosuj pięć impulsów o napięciu 25 V i czasie trwania 100 ms każdy, w odstępach 50 ms. Określ warunki empirycznie na podstawie indywidualnego układu elektroporacji.
    4. Nawodnij zarodek po elektroporacji, dodając kilka kropli 0,719% soli fizjologicznej. Aby oczyścić zdenaturowaną albuminę z powierzchni elektrod, dokładnie spłucz ją wodą destylowaną. Ponownie zamknąć jajo przezroczystą taśmą i powrócić do wilgotnego inkubatora w temperaturze 37-38 °C w celu dalszej inkubacji.
      UWAGA: Zarodki mogą być hodowane aż do wyklucia po elektroporacji, jednak następuje gwałtowne zmniejszenie żywotności.

2. Rozwarstwienie brodawki podstawnej

  1. Użyj 70% etanolu do dezynfekcji stołu operacyjnego, stolika mikroskopowego i otoczenia. Sterylizuj ciepło lub alkohol sprzęt do mikrodysekcji, który zawiera minimalnie sprężynowe nożyczki, mikrołyżeczkę i dwie pary cienkich kleszczy.
  2. Przygotuj następujące płytki rozwarstwiające: szklaną szalkę Petriego z czarną silikonową podstawą, plastikową szalkę Petriego o średnicy 90 mm i szalkę Petriego o średnicy 60 mm. Schłodzić sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) lub zrównoważony roztwór soli Hanksa (HBSS) do sekcji.
  3. Delikatnie wbij jajko na szalkę Petriego o średnicy 90 mm. Zidentyfikuj zewnętrzne ucho pisklęcia. Odetnij zarodek, przecinając szyję tuż poniżej poziomu dolnej szczęki za pomocą nożyczek. Przenieść głowę na szalkę Petriego o średnicy 60 mm wypełnioną lodowatym PBS.
  4. Ustaw zarodek tak, aby górna część dzioba była skierowana w stronę eksperymentatora i przytrzymaj dziób za pomocą jednego z kleszczy #5. Wydłub oczy za pomocą drugich kleszczy #5. Przechodząc od rostralnego do ogonowego, przetnij czaszkę wzdłuż jej linii środkowej. Zgarnij mózg.
  5. Dodaj więcej lodowatego PBS lub HBSS i zlokalizuj dwie błyszczące struktury blisko poziomu małżowiny usznej. Są to otolity lageny na końcu przewodu ślimakowego i znajdują się blisko linii środkowej.
  6. Przeciąć mniej więcej między dwoma lagenami i znacznie powyżej i poniżej tego obszaru, aby odizolować dwoje uszu wewnętrznych. W ukośnym oświetleniu wyobraź sobie kontur ucha wewnętrznego. Usuń obcą tkankę i przedsionek.
  7. Przenieś izolowany ślimak na czarną silikonową płytkę bazową z lodowatym PBS. Za pomocą kleszczy #5 oderwij chrzęstną kapsułkę ślimakową, aby uzyskać przewód ślimakowy. Zlokalizuj pofałdowaną warstwę (tegmentum) przewodu ślimakowego i usuń za pomocą kleszczy #55, aby odsłonić ciśnienie krwi. Za pomocą kleszczy #55 usuń membranę tektorialną, aby odsłonić HC i SC.

3. Hodowla eksplantatów brodawek podstawnych

  1. Hodowla błonowa BP
    1. Weź sześciodołkową płytkę do hodowli tkankowej i ułóż jedną wkładkę membrany hodowlanej na dołek.
    2. Zebrać wypreparowaną brodawkę podstawną (eksplantat) w pipecie o pojemności 200 μl z 1x buforem HBSS i przenieść na membranę. Aby zapobiec przywieraniu tkanki do ścianki pipety, przed zasysaniem tkanki należy pobrać trochę pożywki.
    3. Ustaw eksplant tak, aby brodawka podstawna była skierowana do góry, tak aby włosy i komórki podporowe były widoczne z góry29. Po umieszczeniu eksplantatu należy powoli odsysać bufor HBSS z powierzchni błony hodowlanej. W tym procesie eksplant przyczepi się do błony hodowlanej.
    4. Dodać 1,2 ml zmodyfikowanej pożywki hodowlanej Eagle (DMEM) firmy Dulbecco między wkładką membranową a ścianką studzienki, aby wypełnić dołki płytki sześciodołkowej. Na jednej membranie hodowlanej o średnicy 30 mm można hodować do sześciu eksplantatów.
  2. Posiew kolagenu w przewodzie ślimakowym
    1. Przygotuj mieszaninę kolagenu, dodając 400 μl 3 mg/ml kolagenu z ogona szczura, 50 μl 10x DMEM, 30 μl 7,5%NaHCO3 i 5 μL HEPES do kaptura do hodowli tkankowej.
    2. Weź czterodołkową płytkę i dodaj trzy krople mieszanki kolagenu do każdej studzienki. Przenieś wypreparowany przewód ślimakowy do każdej kropli kolagenu. Inkubować płytkę przez 10 minut w temperaturze 37 °C, 5% CO2 w celu utwardzenia macierzy kolagenowej.
  3. Obróbka kultur małocząsteczkowymi
    1. Przygotować pożywki hodowlane (DMEM, suplement N-2, penicylina) z modulatorem farmakologicznym lub samym rozpuszczalnikiem (do stosowania jako kontrola). Zastąp pożywkę hodowlaną 700 μl pożywki uzupełnionej inhibitorem. Hodować eksplantaty w inkubatorze w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
    2. Wymieniaj 50% pożywek hodowlanych każdego dnia. Po odpowiednim czasie inkubacji usunąć pożywkę hodowlaną i użyć eksplantatów do dalszych testów.

4. Obrazowanie i analiza

  1. Analiza immunofluorescencyjna
    1. Usuń pożywki hodowlane ze studzienek i umyj eksplantaty dwukrotnie 1x HBSS. Za pomocą pipety dodaj 1 ml 4% paraformaldehydu (PFA) do studzienki i inkubuj przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
    2. Usuń PFA i umyj eksplantaty trzykrotnie 1x PBS w temperaturze pokojowej. Aby zebrać eksplantaty z błony hodowlanej, wykonaj małe nacięcie wokół błony zawierającej kawałek tkanki za pomocą małych nożyczek do sprężyn i przenieś tkankę wraz z błoną na 48-dołkową płytkę hodowlaną za pomocą kleszczy.
      UWAGA: Jeśli po utrwaleniu tkanki unoszą się na wodzie, należy je odessać pipetą o pojemności 200 μl i przenieść na płytki 48-dołkowe w celu dalszego przetwarzania. Unikaj siłowego oderwania tkanki od błony.
    3. W przypadku hodowli kropelek kolagenu użyj kleszczy, aby przenieść całą kroplę kolagenu na płytkę silikonową. Dodaj 200 μL 1x PBS i usuń kolagen za pomocą kleszczy, a następnie przenieś tkankę na 48-dołkową płytkę hodowlaną.
    4. Utrwalić eksplantaty za pomocą 1 ml 1x PBS uzupełnionego 0,3% Tween-20 (PBST) przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Inkubować eksplantaty z 200 μl buforu blokującego (10% surowicy koziej + 1% albuminy surowicy bydlęcej w PBST) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
    5. Inkubować eksplantaty z 200 μl roztworu przeciwciała pierwszorzędowego (1:300, w buforze blokującym) przez noc w temperaturze 4 °C. Usunąć roztwór przeciwciała pierwszorzędowego i dokładnie przemyć eksplantaty 5 x 20 minut PBST.
    6. Inkubować eksplantaty z 200 μl falloidyny i roztworem przeciwciała drugorzędowego (w buforze blokującym) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w ciemności. Usunąć falloidynę i roztwór przeciwciał drugorzędowych i dokładnie umyć eksplantaty 5 x 20 min PBST.
      UWAGA: Stężenie przeciwciał drugorzędowych i długość płukania należy określić dla każdego indywidualnego zastosowania obrazowania. W przypadku obrazowania za pomocą mikroskopii super rozdzielczości zwykle zwiększamy stężenie przeciwciała drugorzędowego z 1:500 do 1:200 i zwiększamy stężenie falloidyny z 1:400 do 1:200.
    7. Inkubować eksplantaty w roztworze DAPI (1:1000 w PBST) przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Usuń roztwór DAPI i umyj eksplantaty 3 x 5 min PBST.
    8. Użyj nośnika montażowego, aby zamontować eksplantaty na szkiełku z ciśnieniem ciśnienia skierowanym do góry (w stosunku do szkiełka nakrywkowego). Do obrazowania konfokalnego należy użyć nośnika montażowego zapobiegającego blaknięciu. Pozostaw nośnik montażowy do wyschnięcia przez noc w temperaturze pokojowej w ciemności. Zobrazuj bezpośrednio lub przechowuj szkiełka w temperaturze 4 °C do czasu obrazowania.
  2. Fiksacja OTOTO do analizy SEM
    1. Przygotuj wszystkie roztwory świeże i obchodź się z nimi zgodnie z lokalnymi wytycznymi bezpieczeństwa. Utrwalić eksplantaty z hodowli błonowej (od kroku 4.1.4) w 2,5% aldehydzie glutarowym w 0,1 M buforze kakodylanu sodu (pH 7,3) za pomocą 3 mM CaCl2. Utrwalanie w temperaturze 4 °C przez 24 do 72 godzin ze zmianą utrwalacza co 24 godziny.
    2. Usunąć utrwalacz i przemyć tkankę 0,1 M kakodylanem sodu 3 x 5 min w temperaturze pokojowej. Wtórne utrwalanie 1% OsO4 (rozcieńczonego z 4% OsO4 przy użyciu 0,1 M buforu kakodylanu sodu) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Wykonuj to i kolejne kroki, aż do odwodnienia w dygestorium.
    3. Płukać za pomocą 0,1 M buforu kakodylanu sodu 3 x 5 min w temperaturze pokojowej. Następnie spłucz w wodzie podwójnie destylowanej lub ultraczystej 3 x 5 min w temperaturze pokojowej.
    4. Przygotować 0,5% roztwór tiokarbohydrazydu (TCH) w ultraczystej wodzie. Mieszać w temperaturze 75 °C przez 10 minut i przefiltrować roztwór, gdy ostygnie do temperatury pokojowej.
      UWAGA: TCH jest wyjątkowo niebezpieczny. Użytkowanie musi zostać zatwierdzone przez lokalną komisję ds. bezpieczeństwa i należy zachować ostrożność podczas obsługi.
    5. Usuń ultraczystą wodę z próbki i dodaj 0,5% TCH kropla po kropli. Jeśli roztwór zmieni kolor na brązowy, należy zatrzymać i przepłukać próbkę ultraczystą wodą, a następnie ostrożnie dodać 0,5% roztwór TCH. Gdy roztwór będzie klarowny, zastąp go 0,5% TCH. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 minut30,31.
    6. Przepłukać próbkę ultraczystą wodą 3 x 5 minut w temperaturze pokojowej. Powtórz kroki 4.2.2, 4.2.3 i 4.2.5 jeszcze dwa razy, kończąc inkubacją OsO4, a następnie płukaniem.
    7. Odwodnić próbki w serii etanolu do 100% bezwodnego etanolu (EtOH). Inkubować najpierw w 25% ETOH przez 10 minut, następnie 50% ETOH przez 10 minut, 75% EtOH przez 10 minut, 95% ETOH przez 10 minut, a następnie inkubować łącznie 3x przez 10 minut każdy w 100% ETOH.
    8. Przeprowadzić suszenie w punkcie krytycznym przy użyciu ciekłego CO2 . Natychmiast zamontuj próbki na króćcu SEM za pomocą dwustronnej taśmy klejącej węglowej. Przystąp do napylania powłoki, aby zapewnić 5-10 nm powłoki. Jeśli obrazowanie nie zostanie wykonane natychmiast, należy przechowywać próbki w eksykatorze pod próżnią.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W układzie do elektroporacji rozmieszczenie elektrod może wpływać na obszar transfekcji. Elektrodę dodatnią umieszcza się pod żółtkiem, a ujemną nad embrionem (Rysunek 1A). Skutkuje to wyższą ekspresją GFP w znacznej części ucha wewnętrznego i w obu organach przedsionkowych (Rysunek 1B) oraz w słuchowej papillae basilaris (Rysunek 1C,D), co potwierdza przeprowadzenie transfekcji.

W celu o...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Pisklę jest opłacalnym i wygodnym dodatkiem do organizmów modelowych, które laboratorium może wykorzystać do badań ucha wewnętrznego. Opisane tutaj metody są rutynowo stosowane w naszym laboratorium i uzupełniają trwające badania nad uchem wewnętrznym ssaków. Elektroporacja in ovo służy do wprowadzania manipulacji genetycznych do genomu piskląt. Elektroporacja może być również wykorzystana do wprowadzenia konstruktów kodujących białka fluorescencyjne ukierunkowane na określone organelle lub struktury subkomórkow...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają żadnych sprzecznych interesów, które mogliby ujawnić.

Podziękowania

Z wdzięcznością dziękujemy za wsparcie od NCBS, TIFR, Infosys-TIFR Leading Edge Research Grant, DST-SERB oraz Royal National Institute for the Deaf. Chcielibyśmy podziękować Centralnej Organizacji Rozwoju Drobiu i Instytutowi Szkoleniowemu, Hesaraghatta, Bengaluru. Jesteśmy wdzięczni CIFF i EM oraz wsparciu laboratoryjnemu w NCBS. Dziękujemy Yoshiko Takahashi i Koichi Kawakami za konstrukty Tol2-eGFP i T2TP oraz Guyowi Richardsonowi za HCA i przeciwciało G19 Pcdh15. Jesteśmy wdzięczni członkom Earlab za ich ciągłe wsparcie i cenne informacje zwrotne na temat protokołu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Alexa Fluor 488 PhalloidinThermo Fisher ScientificA12379
Alexa Fluor 647 PhalloidinThermo Fisher ScientificA22287
Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease V3Zintegrowane technologie DNA 1081061Przeciwciało anty-GFP białka Cas9 o wysokiej wierności
Abcamab290Królik poliklonalny do
GFP Surowica bydlęca AlbuminaSigma-AldrichA9647
Dwuwodny chlorek wapniaThermo Fisher ScientificQ12135
Kolagen I, ogon szczuraThermo Fisher ScientificA1048301
Suszarka do punktów krytycznych Leica EM CPD300Elektroporator Leica
CUY-21Nepagene
Dimetylosulfotlenek (DMSO)Sigma-AldrichD8418
DM5000B Mikroskop szerokokątnyLeica
DMEM, wysoka zawartość glukozy, suplement GlutaMAX, pirogronianThermo Fisher Scientific10569010
Dumont #5 KleszczeNarzędzia naukowe11251-20
Dumont #55 KleszczeNarzędzia naukowe11255-20
Fast Green FCFSigma-AldrichF7252
FluoroshieldSigma-AldrichF6182
FLUOVIEW 3000 Laserowy mikroskop skaningowyOlympus
Aldehyd glutarowy (25 %)Sigma-Aldrich340855
Kozie przeciwciało wtórne anty-mysie IgG, Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificA-11001
Kozia anty-mysia IgG wtórna Przeciwciało, Alexa Fluor 594Thermo Fisher ScientificA-11032
Kozie przeciwciało wtórne anty-królicze IgG, Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificA-11008
Kozia surowica Sterylnie filtrowaneHiMediaRM10701Inaktywowany termicznie
zrównoważony roztwór soli Hanksa (HBSS)Thermo Fisher Scientific14025092
LSM980 Airyscan MikroskopZeiss
Millicell Cell Culture Insert, 30 mm, hydrofilowy PTFE, 0,4 µ mSigma-AldrichPICM03050
MVX10 Mikroskop stereoskopowyOlympus
MYO7A przeciwciałoDSHB138-1Mysz monoklonalna do niekonwencjonalnej miozyny-VIIa
MZ16 Mikroskop preparacyjnySuplement Leica
N-2 (100X)Nożyczki Thermo Fisher Scientific17502048
Noyes, 14 cm (5,5 ' ')World Precision Instruments501237
tetratlenek osmu (4%)Sigma-Aldrich75632
ParaformaldehydSigma-Aldrich158127
PC-10 PullerNarishige
pcU6_1sgRNAAddgene92395Mini wektor ze zmodyfikowanym promotorem kurczaka U6
Sólsodowa penicyliny GSigma-AldrichP3032
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)Thermo Fisher Scientific10010023
ProLong Gold Antifade MountantThermo Fisher ScientificP36934
SMZ1500 Mikroskop preparacyjnyBufor
0,2 mMikroskopia elektronowa Sciences11652
Sód chlorekHiMediaGRM853
Sputtre Coater K550XEmitech
Standard Kapilary szklane 3 cale, OD 1,0 mm, bez filamentuPrecision Instruments1B100-3
SacharozaSigma-Aldrich84097
MERLIN Compact VPZeiss
TiokarbohydrazydAlfa AesarL01205
TWEEN 20Sigma-AldrichP1379
kakodylanu sodu Nikon, World

Bibliografia

  1. Sai, X., Ladher, R. K. Early steps in inner ear development: induction and morphogenesis of the otic placode. Frontiers in Pharmacology. 6, 19(2015).
  2. Groves, A. K., Fekete, D. M. Shaping sound in space: the regulation of inner ear patterning. Development. 139 (2), 245-257 (2012).
  3. Driver, E. C., Kelley, M. W. Development of the cochlea. Development. 147 (12), (2020).
  4. Richardson, G. P., Petit, C. Hair-bundle links: genetics as the gateway to function. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 9 (12), 033142(2019).
  5. Tilney, L. G., Cotanche, D. A., Tilney, M. S. Actin filaments, stereocilia and hair cells of the bird cochlea. VI. How the number and arrangement of stereocilia are determined. Development. 116 (1), 213-226 (1992).
  6. Jones, C., et al. Ciliary proteins link basal body polarization to planar cell polarity regulation. Nature Genetics. 40 (1), 69-77 (2008).
  7. Sipe, C. W., Lu, X. Kif3a regulates planar polarization of auditory hair cells through both ciliary and non-ciliary mechanisms. Development. 138 (16), 3441-3449 (2011).
  8. May-Simera, H. L., Kelley, M. W. Cilia, Wnt signaling, and the cytoskeleton. Cilia. 1 (1), 1(2012).
  9. Ebrahim, S., et al. Stereocilia-staircase spacing is influenced by myosin III motors and their cargos espin-1 and espin-like. Nature Communications. 7, 10833(2016).
  10. Corwin, J. T., Cotanche, D. A. Regeneration of sensory hair cells after acoustic trauma. Science. 240 (4860), 1772-1774 (1988).
  11. Collado, M. S., Burns, J. C., Hu, Z., Corwin, J. T. Recent advances in hair cell regeneration research. Current Opinion in Otolaryngology & Head and Neck Surgery. 16 (5), 465-471 (2008).
  12. Edge, A. S., Chen, Z. Y. Hair cell regeneration. Current Opinion in Neurobiology. 18 (4), 377-382 (2008).
  13. Atkinson, P. J., Huarcaya Najarro, E., Sayyid, Z. N., Cheng, A. G. Sensory hair cell development and regeneration: similarities and differences. Development. 142 (9), 1561-1571 (2015).
  14. Brignull, H. R., Raible, D. W., Stone, J. S. Feathers and fins: non-mammalian models for hair cell regeneration. Brain Research. 1277, 12-23 (2009).
  15. Rubel, E. W., Furrer, S. A., Stone, J. S. A brief history of hair cell regeneration research and speculations on the future. Hearing Research. 297, 42-51 (2013).
  16. Stone, J. S., Cotanche, D. A. Hair cell regeneration in the avian auditory epithelium. The International Journal of Developmental Biology. 51 (6-7), 633-647 (2007).
  17. Roberson, D. W., Alosi, J. A., Cotanche, D. A. Direct transdifferentiation gives rise to the earliest new hair cells in regenerating avian auditory epithelium. Journal of Neuroscience Research. 78 (4), 461-471 (2004).
  18. Fritzsch, B., Beisel, K. W., Pauley, S., Soukup, G. Molecular evolution of the vertebrate mechanosensory cell and ear. The International Journal of Developmental Biology. 51 (6-7), 663-678 (2007).
  19. Tilney, L. G., DeRosier, D. J. Actin filaments, stereocilia, and hair cells of the bird cochlea. IV. How the actin filaments become organized in developing stereocilia and in the cuticular plate. Developmental Biology. 116 (1), 119-129 (1986).
  20. Oesterle, E. C., Tsue, T. T., Reh, T. A., Rubel, E. W. Hair-cell regeneration in organ cultures of the postnatal chicken inner ear. Hearing Research. 70 (1), 85-108 (1993).
  21. Honda, A., Freeman, S. D., Sai, X., Ladher, R. K., O'Neill, P. From placode to labyrinth: culture of the chicken inner ear. Methods. 66 (3), 447-453 (2014).
  22. Matsunaga, M., et al. Initiation of supporting cell activation for hair cell regeneration in the avian auditory epithelium: an explant culture model. Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, 583994(2020).
  23. Concordet, J. P., Haeussler, M. CRISPOR: intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens. Nucleic Acids Research. 46, 242-245 (2018).
  24. Gandhi, S., Piacentino, M. L., Vieceli, F. M., Bronner, M. E. Optimization of CRISPR/Cas9 genome editing for loss-of-function in the early chick embryo. Developmental Biology. 432 (1), 86-97 (2017).
  25. Green, M. R., Sambrook, J. Cloning and transformation with plasmid vectors. Cold Spring Harbor Protocols. 2021 (11), (2021).
  26. Sato, Y., et al. Stable integration and conditional expression of electroporated transgenes in chicken embryos. Developmental Biology. 305 (2), 616-624 (2007).
  27. Takahashi, Y., Watanabe, T., Nakagawa, S., Kawakami, K., Sato, Y. Transposon-mediated stable integration and tetracycline-inducible expression of electroporated transgenes in chicken embryos. Methods in Cell Biology. 87, 271-280 (2008).
  28. Mashal, R. D., Koontz, J., Sklar, J. Detection of mutations by cleavage of DNA heteroduplexes with bacteriophage resolvases. Nature Genetics. 9 (2), 177-183 (1995).
  29. Ogier, J. M., Burt, R. A., Drury, H. R., Lim, R., Nayagam, B. A. Organotypic culture of neonatal murine inner ear explants. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 170(2019).
  30. Davies, S., Forge, A. Preparation of the mammalian organ of Corti for scanning electron microscopy. Journal of Microscopy. 147, 89-101 (1987).
  31. Parker, A., Chessum, L., Mburu, P., Sanderson, J., Bowl, M. R. Light and electron microscopy methods for examination of cochlear morphology in mouse models of deafness. Current Protocols in Mouse Biology. 6 (3), 272-306 (2016).
  32. Bermingham, N. A., et al. Math1: an essential gene for the generation of inner ear hair cells. Science. 284 (5421), 1837-1841 (1999).
  33. Goodyear, R. J., Forge, A., Legan, P. K., Richardson, G. P. Asymmetric distribution of cadherin 23 and protocadherin 15 in the kinocilial links of avian sensory hair cells. The Journal of Comparative Neurology. 518 (21), 4288-4297 (2010).
  34. Bartolami, S., Goodyear, R., Richardson, G. Appearance and distribution of the 275 kD hair-cell antigen during development of the avian inner ear. The Journal of Comparative Neurology. 314 (4), 777-788 (1991).
  35. Funahashi, J., Nakamura, H. Electroporation in avian embryos. Methods in Molecular Biology. 461, 377-382 (2008).
  36. Nakamura, H., Funahashi, J. Electroporation: past, present and future. Development, Growth & Differentiation. 55 (1), 15-19 (2013).
  37. Olaya-Sanchez, D., et al. Fgf3 and Fgf16 expression patterns define spatial and temporal domains in the developing chick inner ear. Brain Structure & Function. 222 (1), 131-149 (2017).
  38. Jones, J. M., Warchol, M. E. Expression of the Gata3 transcription factor in the acoustic ganglion of the developing avian inner ear. The Journal of Comparative Neurology. 516 (6), 507-518 (2009).
  39. Serralbo, O., et al. Transgenesis and web resources in quail. Elife. 9, 56312(2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

brodawek podstawnychregeneracja kom rek rz skowychelektroporacja in ovohodowla ex ovosekcja zarodka kurczakanokaut CRISPR Cas9hodowla organ wmikroskopia superrozdzielczakom rki podporowe
Metody in ovo i ex ovo do badania rozwoju ucha wewnętrznego ptaków
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.