Pisklę jest opłacalnym, dostępnym i szeroko dostępnym organizmem modelowym do różnych badań. W tym miejscu szczegółowo opisano szereg protokołów, aby zrozumieć mechanizmy molekularne leżące u podstaw rozwoju i regeneracji ucha wewnętrznego ptaków.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Metody in ovo i ex ovo do badania rozwoju ucha wewnętrznego ptaków
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Ucho wewnętrzne odbiera dźwięk i utrzymuje równowagę za pomocą ślimaka i przedsionka. Odbywa się to za pomocą dedykowanego typu komórki mechanosensorycznej znanej jako komórka rzęsata. Podstawowe badania w uchu wewnętrznym doprowadziły do dogłębnego zrozumienia, jak funkcjonują komórki rzęsate i jak rozregulowanie może prowadzić do utraty słuchu i zawrotów głowy. W tych badaniach mysz była wybitnym systemem modelowym. Jednak myszy, podobnie jak wszystkie ssaki, utraciły zdolność do zastępowania komórek rzęsatych. Tak więc, próbując zrozumieć terapie komórkowe w celu przywrócenia funkcji ucha wewnętrznego, badania uzupełniające na innych gatunkach kręgowców mogą dostarczyć dalszych informacji. Nabłonek słuchowy ptaków, brodawka podstawna (BP), jest arkuszem nabłonka składającym się z mechanosensorycznych komórek rzęsatych (HC) interkalowanych przez komórki podporowe (SC). Chociaż budowa anatomiczna brodawki podstawnej i ślimaka ssaków różni się, mechanizmy molekularne rozwoju ucha wewnętrznego i słuchu są podobne. To sprawia, że brodawka podstawna jest użytecznym systemem nie tylko do badań porównawczych, ale także do zrozumienia regeneracji. Tutaj opisujemy techniki preparacji i manipulacji ucha wewnętrznego kurczaka. Technika ta pokazuje metody genetyczne i hamowania małych cząsteczek, które stanowią potężne narzędzie do badania molekularnych mechanizmów rozwoju ucha wewnętrznego. W tym artykule omawiamy techniki elektroporacji in ovo w celu genetycznego zaburzenia brodawki podstawnej za pomocą delecji CRIPSR-Cas9, a następnie rozwarstwienia brodawki podstawnej. Pokazujemy również hodowlę narządów BP i optymalne wykorzystanie matryc hodowlanych, aby obserwować rozwój nabłonka i komórek rzęsatych.
Wprowadzenie
Ucho wewnętrzne wszystkich kręgowców wywodzi się z prostego nabłonka znanego jako otic placode1,2. W ten sposób powstaną wszystkie elementy strukturalne i typy komórek niezbędne do przekazywania informacji mechanosensorycznych związanych ze słuchem i percepcją równowagi. Komórki rzęsate (HC), czujnik rzęskowy ucha wewnętrznego, są otoczone komórkami podporowymi (SC). HC przekazują informacje do słuchowego tyłomózgowia przez neurony ósmego nerwu czaszkowego. Są one również generowane z otic placode3. Pierwotna transdukcja dźwięku jest osiągana na wierzchołkowej powierzchni słuchowego HC,....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Protokoły dotyczące pozyskiwania, hodowli i wykorzystania zapłodnionych jaj kurzych i niewyklutych embrionów zostały zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję Etyki Zwierząt Narodowego Centrum Nauk Biologicznych, Bengaluru, Karnataka.
1. Elektroporacja in ovo prekursorów słuchowych piskląt
- Projektowanie i klonowanie sgRNA w celu wyeliminowania genu CRISPR/Cas9
- Aby stworzyć nokauty genów, zaprojektuj RNA przewodnika, aby zakłócić regiony eksonu genu, najlepiej bliżej końca 5' regionu kodującego.
- Wybierz potencjalne przewodnikowe RNA za pomocą narzędzia internetowego CRISPOR
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
W układzie do elektroporacji rozmieszczenie elektrod może wpływać na obszar transfekcji. Elektrodę dodatnią umieszcza się pod żółtkiem, a ujemną nad embrionem (Rysunek 1A). Skutkuje to wyższą ekspresją GFP w znacznej części ucha wewnętrznego i w obu organach przedsionkowych (Rysunek 1B) oraz w słuchowej papillae basilaris (Rysunek 1C,D), co potwierdza przeprowadzenie transfekcji.
W celu o.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Pisklę jest opłacalnym i wygodnym dodatkiem do organizmów modelowych, które laboratorium może wykorzystać do badań ucha wewnętrznego. Opisane tutaj metody są rutynowo stosowane w naszym laboratorium i uzupełniają trwające badania nad uchem wewnętrznym ssaków. Elektroporacja in ovo służy do wprowadzania manipulacji genetycznych do genomu piskląt. Elektroporacja może być również wykorzystana do wprowadzenia konstruktów kodujących białka fluorescencyjne ukierunkowane na określone organelle lub struktury subkomórkow.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają żadnych sprzecznych interesów, które mogliby ujawnić.
Podziękowania
Z wdzięcznością dziękujemy za wsparcie od NCBS, TIFR, Infosys-TIFR Leading Edge Research Grant, DST-SERB oraz Royal National Institute for the Deaf. Chcielibyśmy podziękować Centralnej Organizacji Rozwoju Drobiu i Instytutowi Szkoleniowemu, Hesaraghatta, Bengaluru. Jesteśmy wdzięczni CIFF i EM oraz wsparciu laboratoryjnemu w NCBS. Dziękujemy Yoshiko Takahashi i Koichi Kawakami za konstrukty Tol2-eGFP i T2TP oraz Guyowi Richardsonowi za HCA i przeciwciało G19 Pcdh15. Jesteśmy wdzięczni członkom Earlab za ich ciągłe wsparcie i cenne informacje zwrotne na temat protokołu.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12379 | |
| Alexa Fluor 647 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A22287 | |
| Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease V3 | Zintegrowane technologie DNA 1081061 | Przeciwciało anty-GFP białka Cas9 o wysokiej wierności | |
| Abcam | ab290 | Królik poliklonalny do | |
| GFP Surowica bydlęca Albumina | Sigma-Aldrich | A9647 | |
| Dwuwodny chlorek wapnia | Thermo Fisher Scientific | Q12135 | |
| Kolagen I, ogon szczura | Thermo Fisher Scientific | A1048301 | |
| Suszarka do punktów krytycznych Leica EM CPD300 | Elektroporator Leica | ||
| CUY-21 | Nepagene | ||
| Dimetylosulfotlenek (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| DM5000B Mikroskop szerokokątny | Leica | ||
| DMEM, wysoka zawartość glukozy, suplement GlutaMAX, pirogronian | Thermo Fisher Scientific | 10569010 | |
| Dumont #5 Kleszcze | Narzędzia naukowe | 11251-20 | |
| Dumont #55 Kleszcze | Narzędzia naukowe | 11255-20 | |
| Fast Green FCF | Sigma-Aldrich | F7252 | |
| Fluoroshield | Sigma-Aldrich | F6182 | |
| FLUOVIEW 3000 Laserowy mikroskop skaningowy | Olympus | ||
| Aldehyd glutarowy (25 %) | Sigma-Aldrich | 340855 | |
| Kozie przeciwciało wtórne anty-mysie IgG, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11001 | |
| Kozia anty-mysia IgG wtórna Przeciwciało, Alexa Fluor 594 | Thermo Fisher Scientific | A-11032 | |
| Kozie przeciwciało wtórne anty-królicze IgG, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11008 | |
| Kozia surowica Sterylnie filtrowane | HiMedia | RM10701 | Inaktywowany termicznie |
| zrównoważony roztwór soli Hanksa (HBSS) | Thermo Fisher Scientific | 14025092 | |
| LSM980 Airyscan Mikroskop | Zeiss | ||
| Millicell Cell Culture Insert, 30 mm, hydrofilowy PTFE, 0,4 µ m | Sigma-Aldrich | PICM03050 | |
| MVX10 Mikroskop stereoskopowy | Olympus | ||
| MYO7A przeciwciało | DSHB | 138-1 | Mysz monoklonalna do niekonwencjonalnej miozyny-VIIa |
| MZ16 Mikroskop preparacyjny | Suplement Leica | ||
| N-2 (100X) | Nożyczki Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| Noyes, 14 cm (5,5 ' ') | World Precision Instruments | 501237 | |
| tetratlenek osmu (4%) | Sigma-Aldrich | 75632 | |
| Paraformaldehyd | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| PC-10 Puller | Narishige | ||
| pcU6_1sgRNA | Addgene | 92395 | Mini wektor ze zmodyfikowanym promotorem kurczaka U6 |
| Sól | sodowa penicyliny GSigma-Aldrich | P3032 | |
| Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36934 | |
| SMZ1500 Mikroskop preparacyjny | Bufor | ||
| 0,2 m | Mikroskopia elektronowa Sciences | 11652 | |
| Sód chlorek | HiMedia | GRM853 | |
| Sputtre Coater K550X | Emitech | ||
| Standard Kapilary szklane 3 cale, OD 1,0 mm, bez filamentu | Precision Instruments | 1B100-3 | |
| Sacharoza | Sigma-Aldrich | 84097 | |
| MERLIN Compact VP | Zeiss | ||
| Tiokarbohydrazyd | Alfa Aesar | L01205 | |
| TWEEN 20 | Sigma-Aldrich | P1379 |
Bibliografia
- Sai, X., Ladher, R. K. Early steps in inner ear development: induction and morphogenesis of the otic placode. Frontiers in Pharmacology. 6, 19(2015).
- Groves, A. K., Fekete, D. M. Shaping sound in space: the regulation of inner ear patterning. Dev....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
