Model tętniaka aorty brzusznej myszy wywołany fosforanem wapnia

Podsumowanie

Ten protokół opisuje mysi model tętniaka aorty brzusznej (AAA) wywołanego fosforanem wapnia w celu zbadania cech patologicznych i mechanizmów molekularnych AAA.

Streszczenie

Tętniak aorty brzusznej (AAA) jest zagrażającą życiu chorobą sercowo-naczyniową, która występuje na całym świecie i charakteryzuje się nieodwracalnym rozszerzeniem aorty brzusznej. Obecnie stosuje się kilka chemicznie indukowanych mysich modeli AAA, z których każdy symuluje inny aspekt patogenezy AAA. Model AAA indukowany fosforanem wapnia jest szybkim i opłacalnym modelem w porównaniu z modelami AAA indukowanymi angiotensyną II i elastazą. Zastosowanie kryształów CaPO₄ do aorty myszy powoduje degradację włókien elastycznych, utratę komórek mięśni gładkich, stan zapalny i odkładanie się wapnia związane z rozszerzeniem aorty. W tym artykule przedstawiono standardowy protokół dla modelu AAA indukowanego przez CaPO₄. Protokół obejmuje przygotowanie materiału, chirurgiczne zastosowanie CaPO₄ do przydanki podnerkowej aorty brzusznej, pobranie aort w celu uwidocznienia tętniaków aorty oraz analizy histologiczne u myszy.

Wprowadzenie

Tętniak aorty brzusznej (AAA) jest śmiertelną chorobą sercowo-naczyniową charakteryzującą się trwałym rozszerzeniem aorty brzusznej, z wysoką śmiertelnością po wystąpieniu pęknięcia. AAA jest związane ze starzeniem się, paleniem tytoniu, płcią męską, nadciśnieniem tętniczym i hiperlipidemią¹. Wykazano, że kilka procesów patologicznych przyczynia się do powstawania AAA, w tym proteoliza włókien macierzy zewnątrzkomórkowej, infiltracja komórek odpornościowych i utrata komórek mięśni gładkich naczyń krwionośnych. Obecnie mechanizmy patologiczne AAA pozostają nieuchwytne i nie ma sprawdzonych leków na leczenie AAA¹. Badania nad ludzkim AAA są ograniczone ze względu na istnienie niewielu próbek ludzkiej aorty; w związku z tym ustanowiono i szeroko przyjęto kilka zwierzęcych modeli AAA wywołanych modyfikacją chemiczną, w tym podskórny wlew angiotensyny II (AngII), inkubację elastazy okołonaczyniowej lub śródświetlnej oraz okołonaczyniowe zastosowanie fosforanu wapnia2. Powszechnie stosowanym modelem mysim jest zastosowanie fosforanu wapnia (CaPO₄) do przydanki aorty brzusznej podnerkowej, co jest opłacalne i nie wymaga modyfikacji genetycznej.

Bezpośrednie okołoaortalne zastosowanie CaCl₂ do tętnicy szyjnej królików w celu wywołania zmiany tętniaka zostało początkowo zgłoszone przez Gertza i wsp.³ i później zostało zastosowane do aort brzusznych myszy. Model został opracowany przez Yamanouchi i wsp. w celu przyspieszenia rozszerzenia aorty przy użyciu kryształów CaPO₄ u myszy⁴. Naciekanie CaPO₄ do aort myszy podsumowuje wiele patologicznych cech obserwowanych u ludzkich AAA, w tym głęboką infiltrację makrofagów, degradację macierzy zewnątrzkomórkowej i odkładanie się wapnia. Czynniki ryzyka ludzkiego AAA, takie jak hiperlipidemia, zwiększają również AAA indukowane przez CaPO₄ u myszy⁵. W przeciwieństwie do AAA indukowanego perfuzją AngII u myszy ApoE^-/- lub LDLR^-/-, AAA indukowane przez CaPO₄ występuje w podnerkowym obszarze aorty, który naśladuje ludzkie AAA. Obecnie metoda ta jest szeroko stosowana do oceny podatności na rozwój AAA u genetycznie zmodyfikowanych myszy i oceny efektów anty-AAA leków^6,7.

Protokół

Badania na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Centrum Nauk o Zdrowiu Uniwersytetu Pekińskiego i zostały zatwierdzone przez Komisję Etyki Biomedycznej Uniwersytetu Pekińskiego (LA2015142). Wszystkie myszy przeznaczone do operacji zostały znieczulone izofluranem (1,5%-2%), a znieczulenie było dokładnie monitorowane, aby uniknąć bólu lub dyskomfortu u myszy.

1. Przygotowanie

1. Wytnij paski o szerokości 0,3 cm z bezpudrowych gumowych rękawiczek i gazy.
2. Kup 8-10-tygodniowe samce myszy C57BL/6J. Trzymaj zwierzęta w klimatyzowanym pomieszczeniu z 12-godzinnym cyklem światła i ciemności oraz swobodnym dostępem do jedzenia i wody.
3. Przed zabiegiem należy autoklawować gazę, waciki, nożyczki i kleszcze.
4. Zaopatrz się w betadynę, 70% etanol i antyseptyczne mycie rąk.
5. Załóż maskę, fartuch i sterylne rękawiczki.

2. Zabieg chirurgiczny

1. Tabletki karprofenu do żucia (dawka 5 mg/kg) należy podawać 8-10-tygodniowej myszy C57BL/6J na 2-4 godziny przed zabiegiem. Następnie umieść mysz w komorze indukcyjnej (206 mm x 210 mm x 140 mm) z izofluranem o natężeniu przepływu 1,5%-2%.
   1. Monitoruj mysz przez około 5 minut, aż oddychanie zostanie wyraźnie spowolnione. Upewnij się, że mysz nie reaguje na stymulację bólu przed zabiegiem.
2. Nałóż maść okulistyczną na oczy i zapewnij wsparcie termiczne za pomocą poduszki grzewczej lub koca. Potwierdzaj głębokość znieczulenia szczyptą palca u nogi co 15 minut podczas zabiegu chirurgicznego.
3. Ogol włosy na brzuchu myszy za pomocą elektrycznej maszynki do strzyżenia lub kremu do depilacji. Przetrzyj i przetrzyj ogolony obszar betadyną, a następnie 70% etanolem, kilka razy okrężnymi ruchami. Zmień rękawice, aby zachować sterylność.
4. Użyj nożyczek, aby wykonać nacięcie ~1,5 cm w dolnej części brzucha wzdłuż linii środkowej brzucha.
5. Użyj sterylnego bawełnianego wacika zwilżonego solą fizjologiczną, aby ostrożnie usunąć jelito, aż aorta podnerkowa będzie widoczna.
6. Wypreparuj tkankę łączną i tłuszcz z aorty podnerkowej na odcinek około 0,5 cm. Zwróć uwagę na małe naczynia po stronie grzbietowej i unikaj ich rozrywania się. Nie ma potrzeby oddzielania aorty brzusznej od żyły głównej jamy brzusznej.
7. Zapakuj kawałek nasączonego solą fizjologiczną gumowego paska rękawicy pod aortę brzuszną i główną żyłę brzuszną. Użyj bawełnianego wacika, aby zetrzeć nadmiar płynu.
8. Zapakuj kawałek gazy nasączonej 0,5 M CaCl₂ na przydankę podnerkowego naczynia brzusznego na 10 minut. W przypadku grupy myszy pozorowanych zastąp 0,5 M CaCl₂ zwykłą solą fizjologiczną.
9. Usuń gazę i zapakuj kolejny kawałek gazy nasączony roztworem PBS na 5 minut, aby wytworzyć kryształy CaPO₄ in situ w przydance aorty.
10. Ostrożnie zdejmij gumowy pasek rękawicy i gazę. Zresetuj przewód pokarmowy myszy.
11. Zszyj nacięcie brzucha i skórę szwem 5-0.
12. Umieść mysz na poduszce grzewczej, aż mysz odzyska przytomność. Zapewnij zakwaterowanie w celu rehabilitacji bólu pooperacyjnego i analgezji, zgodnie z lokalną komisją etyki zwierząt.
13. Trzymaj mysz w domu przez kolejne 14 dni. Uważnie monitoruj mysz po zabiegu i obserwuj co najmniej 1 raz dziennie. Natychmiast przeprowadź sekcję zwłok, jeśli w tym okresie umrą jakieś myszy.

3. Pobieranie do obrazowania aort

1. 14 dni po operacji należy złożyć ofiary myszy za pomocą CO₂ .
2. Rozetnij brzusznie jamę piersiową i brzuszną myszy i rozetnij prawy przedsionek.
3. Przeprowadź perfuzję myszy z buforem PBS przez lewą komorę serca, aby usunąć krew z aorty, a następnie perfuzję z 4% paraformaldehydem, jak opisano wcześniej⁸.
4. Zbierz aortę pod stereoskopem.
5. Pobrane aorty należy umieścić w probówkach zawierających 5 ml 4% paraformaldehydu na 48 godzin.
6. Ostrożnie usuń tkankę przybyszową i tłuszcz pod stereoskopem i przypnij aortę do czarnej woskowej płytki za pomocą igieł owadzich.
7. Uzyskaj obrazy aorty.

4. Ocena degradacji włókien elastycznych

1. Pociąć tkanki tętniaka aorty na szeregowe kriosekcje (o grubości 7 μm).
2. Przeanalizuj włókna elastyczne za pomocą komercyjnego zestawu do barwienia elastycznego van Giesona (EVG) zgodnie z protokołem producenta.
3. Oceń degradację elastyny. Stopień 1: <25% degradacji; stopień 2: degradacja od 25% do 50%; stopień 3: degradacja od 50% do 75%; lub stopień 4: >75% degradacji.

Wyniki

14 dni po zastosowaniu CaPO₄, samce myszy C57BL/6J zostały poddane eutanazji, a ich aorty zostały zebrane i oczyszczone. Morfologia aort została zobrazowana w celu uwidocznienia powstawania AAA. Jak pokazano w Rysunek 1A-B, zastosowanie CaPO₄ doprowadziło do rozszerzenia podnerkowej aorty brzusznej. Histologicznie CaPO₄ spowodował dramatyczną degradację włókien elastycznych, co ilustrują pęknięcia elastyny (Rysunek ...

Dyskusja

Okołoortyczne zastosowanie CaPO₄ jest solidnym podejściem do indukcji AAA u myszy. W kilku badaniach wykorzystano model CaPO₄ i konsekwentnie stwierdzono, że jest to szybka i powtarzalna metoda badania AAA u myszy ^7,9. Uważa się, że model ten podsumowuje część cech ludzkiego tętniaka aorty i zapewnia mechanistyczny wgląd w patogenezę AAA, w tym stan zapalny i degradację macierzy zewnątrzkomórkowej.

Do czynników ry...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
CaCl2	MECKLIN	C805225
NaCl	Biomed	SH5001-01
PBS	HARVEYBIO	MB5051
Wentylator dla małych zwierząt	RWD	H1550501-012