Artykuł metodologiczny

Analiza autonomicznej funkcji białka upośledzenia umysłowego Fragile X w obwodzie słuchowym za pomocą elektroporacji in ovo

DOI:

10.3791/64187

⸱

6 lipca 2022

 ,  ,  , 
1Division of Histology & Embryology, Key Laboratory for Regenerative Medicine of the Ministry of Education, College of Medicine, Jinan University, 2Department of Clinical Pathology, First Affiliated Hospital of Jinan University, 3Program in Neuroscience, Department of Biomedical Sciences, College of Medicine, Florida State University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Korzystając z elektroporacji in ovo, opracowaliśmy metodę selektywnego transfekowania wewnętrznego ucha słuchowego i jądra ślimakowego w zarodkach kurczaków, aby osiągnąć specyficzne dla danej grupy komórek eliminację delikatnego białka X w upośledzeniu umysłowym podczas dyskretnych okresów składania obwodów.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fragile X mental retardation protein (FMRP) jest białkiem wiążącym mRNA, które reguluje lokalną translację białek. Utrata lub dysfunkcja FMRP prowadzi do nieprawidłowych czynności neuronalnych i synaptycznych w zespole łamliwego chromosomu X (FXS), który charakteryzuje się niepełnosprawnością intelektualną, nieprawidłowościami sensorycznymi i problemami z komunikacją społeczną. Badania funkcji FMRP i patogenezy FXS prowadzono przede wszystkim z nokautem Fmr1 (gen kodujący FMRP) u zwierząt transgenicznych. W tym miejscu przedstawiamy metodę in vivo do określania autonomicznej funkcji komórki FMRP w okresie składania obwodów i tworzenia synaps przy użyciu zarodków kurzych. Metoda ta wykorzystuje elektroporację specyficzną dla etapu, miejsca i kierunku indukowanego lekiem systemu wektorowego zawierającego małe RNA spinki do włosów Fmr1 (shRNA) i reporter EGFP. Dzięki tej metodzie uzyskaliśmy selektywne knockdown FMRP w zwoju słuchowym (AG) i w jednym z jego celów pnia mózgu, jądrze magnocellularis (NM), zapewniając w ten sposób specyficzną dla komponentu manipulację w obwodzie AG-NM. Dodatkowo, mozaikowy wzór transfekcji umożliwia kontrolę wewnątrz zwierząt i porównania sąsiednich neuronów/włókien w celu zwiększenia niezawodności i czułości w analizie danych. System wektorów indukowalnych zapewnia czasową kontrolę początku edycji genów w celu zminimalizowania kumulujących się efektów rozwojowych. Połączenie tych strategii zapewnia innowacyjne narzędzie do analizy autonomicznej funkcji FMRP w rozwoju synaps i obwodów.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zespół łamliwego chromosomu X (FXS) to zaburzenie neurorozwojowe charakteryzujące się niepełnosprawnością intelektualną, nieprawidłowościami sensorycznymi i zachowaniami autystycznymi. W większości przypadków FXS jest spowodowany globalną utratą białka upośledzenia umysłowego w kształcie litery X (FMRP; kodowane przez gen Fmr1) rozpoczynającego się we wczesnych stadiach embrionalnych1. FMRP to białko wiążące RNA, które normalnie ulega ekspresji w większości neuronów i komórek glejowych w mózgu, a także w narządach zmysłów2,3,4. W mózgach ssaków FMRP jest prawdopodobnie związany z setkami mRNA, które kodują białka ważne dla różnych aktywności neuronalnych5. Badania na konwencjonalnych zwierzętach z nokautem Fmr1 wykazały, że ekspresja FMRP jest szczególnie ważna dla składania i plastyczności neurotransmisji synaptycznej6. Kilka modeli nokautu warunkowego i mozaikowego wykazało ponadto, że działania i sygnały FMRP różnią się w zależności od regionów mózgu, typów komórek i miejsc synaptycznych podczas kilku zdarzeń rozwojowych, w tym projekcji aksonalnej, wzorów dendrytycznych i plastyczności synaptycznej7,8,9,10,11,12,13,14. Ostrą funkcję FMRP w regulacji przekaźnictwa synaptycznego badano poprzez wewnątrzkomórkowe dostarczanie hamujących przeciwciał FMRP lub samego FMRP w wycinkach mózgu lub hodowanych neuronach15,16,17,18. Metody te nie dają jednak możliwości śledzenia konsekwencji spowodowanych błędnym wyrażeniem FMRP podczas opracowywania. W związku z tym opracowanie metod in vivo do badania autonomicznych funkcji komórek FMRP jest bardzo potrzebne i oczekuje się, że pomoże określić, czy zgłaszane anomalie u pacjentów z FXS są bezpośrednimi konsekwencjami utraty FMRP w powiązanych neuronach i obwodach, czy też wtórnymi konsekwencjami wynikającymi ze zmian w całej sieci podczas rozwoju19.

Słuchowy pień mózgu zarodków kurczaków oferuje wyjątkowo korzystny model do dogłębnych analiz funkcjonalnych regulacji FMRP w rozwoju obwodów i synaps. Łatwy dostęp do embrionalnych mózgów kurcząt i dobrze znana technika elektroporacji in ovo do manipulacji genetycznej w znacznym stopniu przyczyniły się do naszego zrozumienia rozwoju mózgu we wczesnych stadiach embrionalnych. W niedawno opublikowanym badaniu technika ta została połączona z zaawansowanymi narzędziami molekularnymi, które umożliwiają czasową kontrolę błędnej ekspresji FMRP20,21. W tym przypadku metodologia jest zaawansowana w celu indukowania selektywnych manipulacji neuronów presynaptycznych i postsynaptycznych oddzielnie. Metoda ta została opracowana w obwodzie słuchowym pnia mózgu. Sygnał akustyczny jest wykrywany przez komórki rzęsate w słuchowym uchu wewnętrznym, a następnie przekazywany do zwoju słuchowego (AG; nazywanego również zwojem spiralnym u ssaków). Neurony dwubiegunowe w AG unerwiają komórki rzęsate swoimi wyrostkami obwodowymi, a następnie wysyłają centralną projekcję (nerw słuchowy) do pnia mózgu, gdzie kończą się w dwóch pierwotnych jądrach ślimakowych, jądrze wielkokomórkowym (NM) i jądrze kątowym (NA). Neurony w NM są strukturalnie i funkcjonalnie porównywalne z kulistymi, krzaczastymi komórkami przednio-brzusznego jądra ślimakowego ssaków. W NM włókna nerwów słuchowych (ANF) synapsują się na somatach neuronów NM za pośrednictwem dużej cebulki końcowej Held terminals22. Podczas rozwoju neurony NM powstają z rombomerów 5 i 6 (r5/6) w tyłomózgowiu23, podczas gdy neurony AG pochodzą z neuroblastów znajdujących się w otocyst24. Tutaj opisujemy procedurę selektywnego obniżania ekspresji FMRP w presynaptycznych neuronach AG i osobno w postsynaptycznych neuronach NM.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Z jajami i zarodkami kurczaka obchodzono się z troską i szacunkiem, zgodnie z protokołami dla zwierząt zatwierdzonymi przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Jinan.

1. Przygotowanie jaj i plazmidów

  1. Przygotowanie jajek
    1. Świeże zapłodnione jaja kurze (Gallus gallus) należy pozyskać z Południowochińskiego Uniwersytetu Rolniczego i przechowywać w temperaturze 16 °C przed inkubacją. Aby uzyskać optymalną żywotność, wszystkie jaja należy ustawić do inkubacji w ciągu tygodnia od przybycia.
    2. Umieść jaja poziomo i inkubuj w temperaturze 38 °C przez 46-48 godzin do etapu Hamburger i Hamilton (HH) 1225 dla transfekcji cewy nerwowej lub przez 54-56 godzin do HH13 dla transfekcji otocysty. Ponieważ zwierzęcy słup jaja jest lżejszy niż biegun roślinny, umieszczenie poziome umieszcza zarodek na górze jaja, co ułatwia manipulację. Zachowaj ostrożność, aby jajko było poziome w tym i wszystkich następnych krokach.
    3. Lokalizacja zarodka pojawia się jako ciemny obszar na skorupce jaja podczas rzucania światła z dna jaja za pomocą latarki. Na pożądanych etapach HH użyj tej metody latarki, aby zaznaczyć ołówkiem położenie zarodka na skorupce jajka.
    4. Przetrzyj jajka gazą zawierającą 75% etanolu. Wywierć otwór w spiczastym końcu jaj za pomocą końcówki nożyczek i usuń 2 ml albuminy za pomocą strzykawki z igłą 18 G. Upewnij się, że otwór jest wystarczająco duży, aby umożliwić wprowadzenie igły. Wytrzyj wyciekającą albuminę gazą i uszczelnij otwór przezroczystą taśmą.
    5. Aby zminimalizować pęknięcia i zapobiec spadającym resztkom skorupki podczas okienkowania, przykryj wierzch jaj przezroczystą taśmą, centrując na ciemnym obszarze zaznaczonym ołówkiem.
  2. Ekstrakcja plazmidowego DNA
    1. Sklonuj shRNA kurczaka Fmr1 za pomocą systemu Tet-on opartego na transpozonach, jak opisano wcześniej20. System ten zawiera trzy plazmidy: pCAGGS-T2TP, pT2K-CAGGS-rtTA-M2 i pT2K-BI-TRE-EGFP-Fmr1 shRNA, zapewniając indukowany lekiem system wektorowy, dzięki któremu ekspresja Fmr1 shRNA i EGFP jest wyciszana po transfekcji i może być włączana przez indukcję doksycykliny (Dox).
      UWAGA: Te plazmidy nie są obecnie dostępne w repozytorium. Autorzy zgadzają się na dostarczenie plazmidów na uzasadnione żądanie.
    2. Ekstrahować plazmidowe DNA za pomocą zestawu do przygotowania wolnego od endotoksyn zgodnie z instrukcją producenta i wytrącić przez dodanie 1/15 objętości 7,5 M octanu sodu i 1 objętości 100% izopropanolu.
    3. Wytrącić plazmidy w temperaturze -20 °C przez noc i odwirować w temperaturze 13 000 x g przez 10 minut. Rozpuścić osad w buforze Tris-EDTA dostarczonym w zestawie do końcowego stężenia 4-5 μg/μL. Plazmidy można przechowywać w temperaturze -20 °C przez 12 miesięcy bez zmniejszenia wydajności transfekcji.
    4. W dniu elektroporacji dokładnie wymieszać 2 μl każdego plazmidu w sterylnej probówce wirówkowej za pomocą końcówki do pipety. Wynikowa objętość mieszaniny plazmidów wynosząca 6 μl wystarcza do elektroporacji trzech tuzinów jaj. Aby pomóc w wizualizacji plazmidu podczas elektroporacji, dodaj 1 μL 0,1% szybkiej zieleni (przygotowanej w sterylnym ddH2O) na każde 6 μl mieszaniny DNA26, co zmieni kolor mieszaniny plazmidu na niebieski.

2. Elektroporacja in ovo

  1. Badanie jaj w oknie i identyfikacja zarodków
    1. W dniu elektroporacji wyjmij jaja z inkubatora, po jednym tuzinie jaj na raz. Trzymanie jaj poza inkubatorem przez ponad 1 godzinę wprowadza zmiany rozwojowe i zmniejsza żywotność.
    2. Przetrzyj wszystkie narzędzia chirurgiczne gazą zawierającą 75% etanolu.
    3. Umieść każde jajko w specjalnie wykonanym piankowym uchwycie. Przetrzyj obszar pokryty taśmą 75% etanolem i wytnij okienko (1-2 cm2) na obwodzie znaku ołówka za pomocą małej pary nożyczek (Rysunek 1A). Podczas cięcia trzymaj nożyczki płasko, aby uniknąć uszkodzenia zarodka pod spodem.
    4. Umieść jajo z okienkiem pod mikroskopem stereoskopowym z 10-krotnym okularem i 2-krotnym zoomem i zidentyfikuj zarodek. Dostosuj kąt i jasność źródła światła, aby uzyskać lepszą wizualizację.
      UWAGA: Wizualizacja zarodka i identyfikacja cewy nerwowej na tym etapie wymaga praktyki i doświadczenia.
      1. W przypadku początkujących należy użyć następującego opcjonalnego wstrzykiwania atramentu, aby ułatwić identyfikację zarodka. Przygotuj wcześniej 10% roztwór atramentu indyjskiego w 0,01 M soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) i autoklawu. Napełnij strzykawkę o pojemności 1 ml roztworem atramentu, a następnie umieść igłę 27G. Zegnij igłę pod kątem 45° za pomocą kleszczy.
      2. Pod mikroskopem ostrożnie szturchnij od krawędzi obszaru opaca i włóż igłę pod zarodek. Wstrzyknij ~ 50 μL tuszu, który rozprowadzi się poniżej obszaru przejrzystego w celu wizualizacji zarodka. Tusz utworzy ciemne tło dla wyraźnej wizualizacji zarodka.
        UWAGA: Usunąć powietrze ze strzykawki przed włożeniem i wstrzyknięciem. Jeśli masz wprawę w wizualizacji, unikaj etapu wstrzykiwania atramentu, ponieważ zmniejsza to wskaźnik przeżycia.
  2. Iniekcja cewy nerwowej i elektroporacja
    UWAGA: Ta procedura jest wykonywana w HH12 w celu transfekcji neuronów NM w pniu mózgu.
    1. Wciągnąć szklane kapilary (o średnicy ~1 mm i długości 100 mm) do pipet za pomocą ściągacza do pipet. Pod mikroskopem preparacyjnym ostrożnie otwórz końcówkę igły kapilarnej do średnicy 10-20 μm za pomocą kleszczy. Pipety (zwykle 5-10 jednorazowo) należy przechowywać w pojemniku do przechowywania, aż do użycia.
    2. Napełnij pipetę kapilarną 0,5-1 μl mieszaniny plazmidowej, przykładając podciśnienie przez gumową rurkę na końcu pipety. Można to osiągnąć za pomocą strzykawki lub pompy powietrza.
    3. Umieść komórkę jajową pod mikroskopem tak, aby zarodek był ustawiony pionowo z ogonem blisko Ciebie (lub poziomo w przypadku wstrzykiwania pipet kapilarnych za pomocą manipulatora trójosiowego). Trzymaj pipetę kapilarną jedną ręką lub za pomocą manipulatora trójosiowego i wkręć końcówkę pipety w stronę r5/6 w kierunku od ogona do głowy.
      UWAGA: Najbardziej wysunięty do przodu obszar tyłomózgowia to r1, a każde kolejne wybrzuszenie wzdłuż cewy nerwowej jest indywidualnym rombomerem. R5/6 znajduje się na tym samym poziomie przednio-tylnym co otocysta, która jest łatwo rozpoznawalną strukturą przypominającą miseczkę (Rysunek 1B-C).
    4. Delikatnie wsuń końcówkę przez błonę witelinową do grzbietowej cewy nerwowej, a następnie lekko wyjmij pipetę, tak aby końcówka znalazła się w świetle cewy nerwowej. Wstrzyknąć mieszaninę plazmidów, przykładając ciśnienie powietrza, aż zabarwiony plazmid całkowicie dyfunduje do r5/6 i rozciąga się na r3 i r4,
      UWAGA: Nie jest konieczne wykonywanie szczeliny na membranie witeliny do wstrzykiwania.
    5. Sprawdź, czy wstrzyknięcie zakończyło się sukcesem, co osiąga się, gdy roztwór niebieskiego plazmidu szybko dyfunduje w dół cewy nerwowej bez wycieku (Rysunek 1B-C). Kiedy dochodzi do wycieku, niebieski szybko zanika.
    6. Natychmiast po wstrzyknięciu umieść platynową elektrodę bipolarną po obu stronach cewy neuronowej (Rysunek 1D). Dostarczyć dwa impulsy o napięciu 12 V i czasie trwania 50 ms za pomocą elektroporatora. Obserwuj pęcherzyki powietrza na końcach elektrody bipolarnej, z większą ilością po stronie ujemnej.
    7. Sprawdź, czy elektroporacja jest udana, co osiąga się, gdy zabarwiona mieszanina plazmidu dostanie się do tkanki cewy nerwowej w pobliżu dodatniej strony elektrody. Po elektroporacji ostrożnie wyjmij elektrodę bipolarną.
    8. Przykryj okienko na skorupce jajka kawałkiem przezroczystej folii, która jest wstępnie pocięta na 2 kwadraty i spryskana 75% etanolem. Umieść jajo z powrotem w inkubatorze.
    9. Oczyść elektrodę bipolarną, dostarczając 10-20 impulsów o napięciu 12 V i czasie trwania 50 ms w soli fizjologicznej przed przejściem do następnego jajka.
  3. Iniekcja otocysty i elektroporacja
    UWAGA: Ta procedura jest wykonywana w HH13 w celu transfekcji komórek rzęsatych i neuronów AG w uchu wewnętrznym.
    1. W HH13 (czyli ~ 2,5 dniu embrionalnym) zarodek obrócił się tak, że prawa strona głowy jest skierowana do góry. Pod mikroskopem umieść jajo tak, aby zarodek był pionowy, z ogonem blisko siebie. Przytrzymaj pipetę kapilarną i delikatnie szturchnij prawą otocystę w kierunku grzbietowo-bocznym (Rysunek 2A).
      UWAGA: Na tym etapie otocysta pojawia się jako mała okrągła struktura na szczycie ciała na tym samym poziomie przednio-tylnym co r5/6.
    2. Wstrzyknąć mieszaninę plazmidów pod ciśnieniem powietrza, aż otocysta zostanie wypełniona niebieskim roztworem27. Sprawdź, czy wstrzyknięcie jest udane, co osiąga się, gdy mieszanina niebieskiego plazmidu jest zamknięta w otocyście i nie przecieka.
    3. Natychmiast po wstrzyknięciu umieść elektrodę bipolarną na otocyście, jak pokazano na Rysunek 2B. Umieść dodatnią i ujemną stronę odpowiednio przed i za otocystą. Za pomocą elektroporatora można dostarczyć dwa impulsy o napięciu 12 V i czasie trwania 50 ms.
    4. Sprawdź, czy elektroporacja jest udana, co osiąga się, gdy mieszanina niebieskiego plazmidu dostanie się do tkanki otocysty w pobliżu dodatniej strony elektrody. Po elektroporacji ostrożnie wyjmij elektrodę bipolarną. Przykryj okienko na skorupce jajka przezroczystą folią i włóż jajo z powrotem do inkubatora.

3. Podawanie Dox w celu zainicjowania i utrzymania transkrypcji plazmidu

  1. Przygotowanie roztworu Dox
    1. Odmierzyć 100 mg proszku Dox pod kapturem chemicznym i rozpuścić go w 100 ml sterylnego PBS, aby uzyskać 1 mg/ml roztworu roboczego. Przefiltrować roztwór za pomocą filtra 0,22 μm i przechowywać 1 ml porcji w temperaturze -20 °C. Chronić przed światłem20,28.
  2. Administracja Dox
    1. W celu pełnej edycji genów, na 24 godziny przed pożądanym wiekiem, rozmrozić podwielokrotność Dox na lodzie. Upuść 50 μl Dox bezpośrednio na błonę kosmówkowo-omoczniową jaja za pomocą strzykawki penetrującej przezroczystą folię. Po wstrzyknięciu należy uszczelnić otwór igły przezroczystą folią lub taśmą.
    2. Aby utrzymać efekt knockdown, należy podawać Dox co drugi dzień, aż do pobrania tkanek w pożądanym stadium rozwojowym.

4. Sekcja i sekcja tkanek

  1. Pień mózgu
    1. W przypadku zarodków w stadium zarodkowym 3 (E3) i E6 należy otworzyć skorupkę jaja i przeciąć powiązaną błonę nożyczkami. Wyjąć zarodek i zanurzyć go w 4% paraformaldehydzie (PFA) w 0,1 M buforze fosforanowym.
    2. W przypadku zarodków E9 otwórz skorupkę jaja, odetnij zarodek nożyczkami i przenieś głowę na płytkę z silikonowym dnem wypełnioną PBS. Przygnij głowę przez oczodoły i rozetnij górną część czaszki. Ostrożnie umieść kleszcze pod mózgiem z obu stron i podnieś cały mózg z czaszki za pomocą ramion kleszczy. Zanurz mózg w 4% PFA.
    3. W przypadku zarodków E15 i E19 otwórz skorupkę jaja, odetnij głowę zarodka nożyczkami i umieść głowę na płytce z silikonowym dnem wypełnionej PBS. Rozetnij skórę na czubku głowy, aby odsłonić czaszkę.
    4. Naciąć czaszkę pionowo brzytwą, aby oddzielić przodomózgowie od ogonowego mózgu. Zanurz blok ogonowy w PBS, usuń górną część czaszki, a następnie zdejmij mózg z czaszki.
    5. Przypnij mózg przez płat wzrokowy i oddziel móżdżek od pnia mózgu. Uważaj, aby nie uszkodzić słuchowego pnia mózgu, który znajduje się tuż pod móżdżkiem. Usuń jak najwięcej opony twardej z pnia mózgu, a następnie zanurz ją w 4% PFA.
    6. Przechowywać zarodki i tkanki mózgowe w 4% PFA w temperaturze 4 °C przez noc, z wyjątkiem pni mózgu E19, które powinny być przechowywane w tych samych warunkach przez 24 godziny.
    7. Po utrwaleniu należy odwodnić tkankę w PBS zawierającą 30% sacharozy, aż do jej ustabilizowania, co zwykle trwa 1-3 dni, w zależności od wieku.
    8. Przeciąć pień mózgu (E15 i E19) na głębokości 30 μm w płaszczyźnie koronalnej za pomocą przesuwanego mikrotomu. Zebrać skrawki w PBS i przechowywać w temperaturze 4 °C przed barwieniem immunologicznym.
    9. W przypadku zarodków E3 i E6 oraz pni mózgu E9 przekrój pod kątem 50 μm poprzecznie. Zebrać skrawki w PBS i przechowywać w temperaturze 4 °C. Zamontuj skrawki na szkiełkach mikroskopowych pokrytych żelatyną przed barwieniem immunologicznym. Pobieranie grubszych odcinków w tym wieku ułatwia pracę z tkankami.
  2. Przewód słuchowy
    1. Po usunięciu pni mózgu z zarodków E9, E15 i E19, przewód słuchowy, który jest osadzony w kości skroniowej, jest łatwo rozpoznawalny leżąc pod czaszką, a kość skroniowa jest łatwo oddzielalna od otaczającej czaszki. W przypadku zarodków E9 należy przymocować całą kość skroniową do 4% PFA. W przypadku starszych zarodków należy usunąć strukturę kostną kości skroniowej, aby wyizolować przewód słuchowy i zamocować przewód słuchowy w 4% PFA.
    2. Utrzymuj wszystkie kości skroniowe i przewody słuchowe w 4% PFA w temperaturze 4 °C przez noc przed zagnieżdżeniem tkanek.
    3. Wykonaj osadzanie tkanek zgodnie z opisem. Przygotuj roztwór do zatapiania w następujący sposób: Namocz 10% żelatyny (ze skóry bydlęcej) w zimnej wodzie, aż granulki żelatyny napęcznieją i osiądną (około 30 min). Podgrzej mieszaninę do ~50 °C, aby rozpuścić żelatynę i dodaj 20% sacharozy do roztworu żelatyny i mieszaj do rozpuszczenia. Roztwór żelatyny i sacharozy przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do miesiąca.
    4. Przed użyciem podgrzać roztwór żelatyny i sacharozy w temperaturze 37 °C. Kości skroniowe/przewody słuchowe namoczyć w ciepłym roztworze żelatyny i sacharozy na 96-dołkowej płytce w temperaturze 37 °C, aż osiądną, zwykle 30-60 min.
    5. Wyłóż dno studzienek 12-dołkowej płytki paskiem przezroczystej folii. Dodaj warstwę ciepłego roztworu żelatyny i sacharozy i poczekaj, aż stwardnieje. Przenieś kość skroniową/przewód słuchowy do każdej studzienki.
    6. Wszczepić tkankę drugą warstwą ciepłego roztworu żelatyny i sacharozy. Dostosuj położenie tkanki tak, aby znajdowała się w środku żelu, a przewód słuchowy był zorientowany poziomo. Ostrożnie przenieś płytkę do lodówki o temperaturze 4 °C i poczekaj, aż żel stwardnieje.
    7. Wyciągnij przezroczysty pasek folii, aby wysunąć blok tkanki żelowej z dołka. Przytnij dodatkowy żel do kwadratowego bloku i wytnij róg bloku, aby określić orientację. Owiń blok żelatyny kawałkiem folii, zamroź na suchym lodzie, a następnie przechowuj w temperaturze -80 °C do momentu pokrojenia.
    8. Przeciąć blok na 20 μm wzdłuż długości przewodu słuchowego za pomocą kriostatu. Zamontuj sekcje bezpośrednio na szkiełkach mikroskopowych pokrytych żelatyną. Przechowywać szkiełka w temperaturze -80 °C przed barwieniem immunologicznym.
    9. Przed barwieniem immunologicznym zanurzyć szkiełka we wstępnie podgrzanym PBS (45 °C) na 5 minut w celu rozpuszczenia żelatyny, a następnie umyć szkiełka 3x PBS o temperaturze pokojowej w celu usunięcia pozostałości żelatyny.

5. Barwienie immunologiczne i obrazowanie mikroskopowe

UWAGA: Dwa rodzaje barwienia immunologicznego są wykonywane w zależności od tego, czy sekcje są zamontowane na szkiełkach, czy swobodnie pływające w PBS.

  1. Barwienie immunologiczne na szkiełkach
    1. Myj szkiełka 3x po 10 minut za pomocą PBS. Zakreśl obszar zawierający sekcje pisakiem olejowym, aby zapobiec wyciekowi płynu podczas barwienia. Przykryj skrawki roztworem blokującym zawierającym 5% normalnej surowicy koziej w PBS i inkubuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
    2. Rozcieńczyć pierwszorzędowe przeciwciała (końcowe stężenie patrz Tabela materiałów) w PBS zawierającym 0,3% TritonX-100 i 5% normalnej surowicy koziej. Usuń roztwór blokujący, a następnie przykryj skrawki roztworem przeciwciała pierwotnego. Inkubować szkiełka w temperaturze 4 °C przez noc w pojemniku zawierającym warstwę wody destylowanej na dnie.
    3. Przepłukać szkiełka 3x przez 10 minut za pomocą PBS. Na szkiełka nanieść fluorescencyjne przeciwciała drugorzędowe rozcieńczone w stosunku 1:500 w PBS zawierającym 0,3% TritonX-100. Inkubować szkiełka w temperaturze pokojowej przez 4 godziny, osłonięte przed światłem.
    4. Umyj szkiełka 3x za pomocą PBS. Delikatnie upuść dwie krople podłoża montażowego na szkiełka i przykryj sekcje szkiełkami nakrywkowymi. Należy uważać, aby nie wytworzyć pęcherzyków powietrza między szkiełkiem nakrywkowym a szkiełkiem.
  2. Barwienie immunologiczne dla całych zarodków i skrawków swobodnie pływających
    1. Umyj zarodki/skrawki PBS 3x przez 10 minut każdy w dołku. Rozcieńczyć pierwszorzędowe przeciwciała w PBS zawierające 0,3% TritonX-100 i 5% normalnej surowicy koziej w probówkach odśrodkowych. Przenieść każdy zarodek/skrawek do probówki ze szklanym haczykiem i inkubować na wytrząsarce z prędkością 60 obr./min przez noc w temperaturze 4 °C.
    2. Myj zarodki/skrawki 3x PBS przez 10 minut każdy w dołku. Przenieść każdy zarodek/skrawek do ciemnej probówki odśrodkowej wypełnionej fluorescencyjnym roztworem przeciwciał drugorzędowych i inkubować w temperaturze pokojowej przez 4 godziny na wytrząsarce.
    3. Umyj zarodki/skrawki 3x PBS w dołku. Za pomocą pędzla zamontuj sekcje na szkiełkach mikroskopowych pokrytych żelatyną w 15-centymetrowej naczyniu zawierającym PBS. Po lekkim wyschnięciu szkiełek (~5 min) nałóż dwie krople podłoża montażowego i umieść szkiełko nakrywkowe. Należy uważać, aby nie wytworzyć pęcherzyków powietrza między szkiełkiem nakrywkowym a szkiełkiem. Przechowuj całe tkanki montażowe w PBS do obrazowania.
  3. Obrazowania
    1. Wyobraź sobie całe tkanki montażowe w PBS w naczyniu z silikonowym dnem zawierającym proszek węglowy, który zapewnia czarne tło. Przechwytuj i przetwarzaj obrazy za pomocą komercyjnego pakietu oprogramowania Olympus do przetwarzania obrazów, jak opisano wcześniej29.
    2. Zobrazuj skrawki na szkiełkach za pomocą mikroskopu konfokalnego, jak opisano wcześniej20. Zobrazuj sekcje w jednej płaszczyźnie ogniskowej za pomocą obiektywów 10x, 20x i 63x. Przechwyć wszystkie obrazy tego samego zwierzęcia przy użyciu tych samych parametrów. Należy pamiętać o dostosowaniu poziomu lasera i ustawień akwizycji obrazu, aby uniknąć nasycenia sygnału.
    3. Wykonaj przetwarzanie obrazu za pomocą oprogramowania Fiji. Aby zilustrować, dostosuj jasność, kontrast i gamma obrazu za pomocą profesjonalnego oprogramowania do edycji obrazu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wykonując elektroporację in ovo w różnych miejscach i na różnych etapach rozwoju, osiągnęliśmy selektywne knockdown FMRP na peryferiach słuchowych lub w słuchowym pniu mózgu.

Knockdown FMRP w NM
Mały spinka do włosów RNA (shRNA) przeciwko kurczakowi Fmr1 został zaprojektowany i sklonowany do systemu wektorów Tet-On, jak opisano wcześniej20. Konfiguracja elektroporacji in ovo jest pokazana w Rysunek 1A<...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby określić autonomiczną funkcję FMRP, konieczne jest manipulowanie jego ekspresją w poszczególnych grupach komórek lub typach komórek. Ponieważ jedną z głównych funkcji FMRP jest regulacja powstawania i plastyczności synaptycznej, selektywne manipulowanie każdym składnikiem synaptycznym określonego obwodu jest warunkiem wstępnym pełnego zrozumienia mechanizmu FMRP w komunikacji synaptycznej. Wykorzystując elektroporację in ovo zarodków kurczaków, zademonstrowaliśmy metodę celow...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie było wspierane przez: grant Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (nr 32000697); Program Nauki i Technologii w Kantonie (202102080139); Fundacja Nauk Przyrodniczych Guangdong (2019A1515110625, 2021A1515010619); Fundusze na badania podstawowe dla uniwersytetów centralnych (11620324); grant badawczy Kluczowego Laboratorium Medycyny Regeneracyjnej, Ministerstwo Edukacji, Uniwersytet Jinan (nr ZSYXM202107); Fundusze na badania podstawowe dla Centralnych Uniwersytetów Chin (21621054); oraz Fundacja Medycznych Badań Naukowych prowincji Guangdong w Chinach (20191118142729581). Dziękujemy medycznemu centrum eksperymentalnemu Uniwersytetu Jinan. Dziękujemy dr Terrze Bradley za staranną redakcję manuskryptu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Inkubacja jaj
16 ° C LodówkaMAGATSłuży do przechowywania zapłodnionych jaj
Inkubator do jajSHANGHAI BOXUNGZX-9240MBE
Zapłodnione jajaFarma Uniwersytetu RolniczegoAby zapewnić optymalną żywotność, jaja należy zużyć w ciągu jednego tygodnia.
Preparat plazmidowy
WirówkaSigma10016
Fast greenSolarbioG1661Przygotować 0,1% roztwór roboczy w wodzie destylowanej i autoklawie.
Zestaw do przygotowania plazmidu MaxiQIAGEN12162Rozpuść plazmidowe DNA w buforze Tris-EDTA (TE); zestaw do przygotowania bez endotoksyn
Octan soduSigma-AldrichS2889Przygotować 7,5 M roztwór roboczy w wodzie wolnej od nuklazów.
Electroporration and Doxycyklin Administration
ElectroporatorBTXECM399
1 mL / 5 mL StrzykawkaGUANGZHOU KANGFULAI
Mikroskop preparacyjnyCNOPTECSZM-42
DoxcyclineSigma-AldrichD9891Do każdej dawki należy stosować świeże porcje i przechowywać w temperaturze -20 & stopień C.
Kapilara szklanaBEIBOBOMEIRD09100,9-1,1 mm * 100 mm
Parafilm laboratoryjnyPARAFILMPM996przezroczysta folia
Ściągacz do pipetCHENGDU INSTRUMENT FACTORYWD-2Stan ciągnięcia: 500 ° C dla 15 s
Platynowe elktrodyDomowej robotyŚrednica 0,5 mm, odstęp 1,5 mm.
Rurka gumowaSigma-AldrichA5177
Sekcja i utrwalenie tkanek
kleszczeRWDF11020-11Rozmiar końcówki: 0,05 * 0,01 mm
Inne narzędzia chirurgiczneRWD
ParaformaldehydSigma-Aldrich158127Świeżo przygotowany 4% roztwór PFA w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami może być przechowywany w temperaturze 4 stopni C przez okres do 1 tygodnia.
SYLGARD 184 Zestaw elastomerów silikonowychDOW01673921W przypadku czarnych płyt tła stosuje się proszek węglowy dopuszczony do kontaktu z żywnością.
Sectioning
CryostatLEICACM1850
GelatinSigma-AldrichG9391Ze skóry bydlęcej.
Przesuwny mikrotomLEICASM2010
Immunostaining
Alexa Fluor 488 koza anty-myszAbcamab1501131:500 rozcieńczenie, RRID: AB_2576208
Alexa Fluor 555 koza anty-królikAbcamab1500781:500 rozcieńczenie, RRID: AB_2722519
DAPIAbcamab2853901: 1000 rozcieńczalnik
Fluoromount-G podłoże montażowePołudniowy  BiotechSb-0100-01
Przeciwciało FMRPY. Wang, Uniwersytet Stanowy Florydy#8263Rozcieńczenie 1:1000, RRID: AB_2861242
Przeciwciało Islet-1DSHB39.3F7Rozcieńczenie 1:100, RRID: AB_1157901
Płytka NetwellaCorning3478
Przeciwciało neurofilamentoweSigma-AldrichN41421:1000 rozcieńczenie, RRID: AB_477272
Przeciwciało przeciwko parwalbuminieSigma-AldrichP3088Rozcieńczenie 1:10000, RRID: AB_477329
Przeciwciało SNAP25Abcamab66066Rozcieńczenie 1:1000, RRID:
AB_2192052Imaging
Adobe photoshopOprogramowanie doedycji obrazów
Mikroskop konfokalnyLEICASP8
Stereoskopowy fluorescencyjnyOLYMPUSMVX10
Pakiet oprogramowania do komercyjnego przetwarzania obrazówOlympus Image-Pro Plus 7.0OlYMPUS
. w Południowych Chinach ADOBE

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hagerman, R. J., et al. Fragile X syndrome. Nature Reviews Disease Primers. 3, 17065(2017).
  2. Hinds, H. L., et al. Tissue specific expression of FMR-1 provides evidence for a functional role in fragile X syndrome. Nature Genetics. 3 (1), 36-43 (1993).
  3. Frederikse, P. H., Nandanoor, A., Kasinathan, C. Fragile X Syndrome FMRP co-localizes with regulatory targets PSD-95, GABA receptors, CaMKIIalpha, and mGluR5 at fiber cell membranes in the eye lens. Neurochemical Research. 40 (11), 2167-2176 (2015).
  4. Zorio, D. A., Jackson, C. M., Liu, Y., Rubel, E. W., Wang, Y. Cellular distribution of the fragile X mental retardation protein in the mouse brain. Journal of Comparative Neurology. 525 (4), 818-849 (2017).
  5. Darnell, J. C., et al. FMRP stalls ribosomal translocation on mRNAs linked to synaptic function and autism. Cell. 146 (2), 247-261 (2011).
  6. Bakker, C. E., Oostra, B. A. Understanding fragile X syndrome: insights from animal models. Cytogenetic and Genome Research. 100 (1-4), 111-123 (2003).
  7. Hanson, J. E., Madison, D. V. Presynaptic FMR1 genotype influences the degree of synaptic connectivity in a mosaic mouse model of fragile X syndrome. Journal of Neuroscience. 27 (15), 4014-4018 (2007).
  8. Deng, P. Y., Sojka, D., Klyachko, V. A. Abnormal presynaptic short-term plasticity and information processing in a mouse model of fragile X syndrome. Journal of Neuroscience. 31 (30), 10971-10982 (2011).
  9. Patel, A. B., Hays, S. A., Bureau, I., Huber, K. M., Gibson, J. R. A target cell-specific role for presynaptic Fmr1 in regulating glutamate release onto neocortical fast-spiking inhibitory neurons. Journal of Neuroscience. 33 (6), 2593-2604 (2013).
  10. Patel, A. B., Loerwald, K. W., Huber, K. M., Gibson, J. R. Postsynaptic FMRP promotes the pruning of cell-to-cell connections among pyramidal neurons in the L5A neocortical network. Journal of Neuroscience. 34 (9), 3413-3418 (2014).
  11. Higashimori, H., et al. Selective deletion of astroglial FMRP dysregulates glutamate transporter GLT1 and contributes to Fragile X syndrome phenotypes in vivo. Journal of Neuroscience. 36 (27), 7079-7094 (2016).
  12. Hodges, J. L., et al. Astrocytic contributions to synaptic and learning abnormalities in a mouse model of Fragile X syndrome. Biological Psychiatry. 82 (2), 139-149 (2017).
  13. Gonzalez, D., et al. Audiogenic seizures in the Fmr1 knock-out mouse are induced by Fmr1 deletion in subcortical, VGlut2-expressing excitatory neurons and require deletion in the inferior colliculus. Journal of Neuroscience. 39 (49), 9852-9863 (2019).
  14. Bland, K. M., et al. FMRP regulates the subcellular distribution of cortical dendritic spine density in a non-cell-autonomous manner. Neurobiology of Disease. 150, 105253(2021).
  15. Pfeiffer, B. E., Huber, K. M. Fragile X mental retardation protein induces synapse loss through acute postsynaptic translational regulation. Journal of Neuroscience. 27 (12), 3120-3130 (2007).
  16. Pfeiffer, B. E., et al. Fragile X mental retardation protein is required for synapse elimination by the activity-dependent transcription factor MEF2. Neuron. 66 (2), 191-197 (2010).
  17. Deng, P. Y., et al. FMRP regulates neurotransmitter release and synaptic information transmission by modulating action potential duration via BK channels. Neuron. 77 (4), 696-711 (2013).
  18. Yang, Y. M., et al. Identification of a molecular locus for normalizing dysregulated GABA release from interneurons in the Fragile X brain. Molecular Psychiatry. 25 (9), 2017-2035 (2020).
  19. Razak, K. A., Dominick, K. C., Erickson, C. A. Developmental studies in fragile X syndrome. Journal of Neurodevelopmental Disorders. 12 (1), 13(2020).
  20. Wang, X., Zorio, D. A. R., Schecterson, L., Lu, Y., Wang, Y. Postsynaptic FMRP regulates synaptogenesis in vivo in the developing cochlear nucleus. Journal of Neuroscience. 38 (29), 6445-6460 (2018).
  21. Wang, X., et al. Temporal-specific roles of fragile X mental retardation protein in the development of the hindbrain auditory circuit. Development. 147 (21), (2020).
  22. Rubel, E. W., Fritzsch, B. Auditory system development: primary auditory neurons and their targets. Annual Review of Neuroscience. 25, 51-101 (2002).
  23. Cramer, K. S., Fraser, S. E., Rubel, E. W. Embryonic origins of auditory brain-stem nuclei in the chick hindbrain. Developmental Biology. 224 (2), 138-151 (2000).
  24. Chervenak, A. P., Hakim, I. S., Barald, K. F. Spatiotemporal expression of Zic genes during vertebrate inner ear development. Developmental Dynamics. 242 (7), 897-908 (2013).
  25. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
  26. Lu, T., Cohen, A. L., Sanchez, J. T. In ovo electroporation in the chicken auditory brainstem. Journal of Visualized Experiments. (124), e56628(2017).
  27. Evsen, L., Doetzlhofer, A. Gene transfer into the chicken auditory organ by in ovo micro-electroporation. Journal of Visualized Experiments. (110), e53864(2016).
  28. Schecterson, L. C., Sanchez, J. T., Rubel, E. W., Bothwell, M. TrkB downregulation is required for dendrite retraction in developing neurons of chicken nucleus magnocellularis. Journal of Neuroscience. 32 (40), 14000-14009 (2012).
  29. Wang, X. Y., et al. High glucose environment inhibits cranial neural crest survival by activating excessive autophagy in the chick embryo. Scientific Reports. 5, 18321(2015).
  30. Yu, X., Wang, X., Sakano, H., Zorio, D. A. R., Wang, Y. Dynamics of the fragile X mental retardation protein correlates with cellular and synaptic properties in primary auditory neurons following afferent deprivation. Journal of Comparative Neurology. 529 (3), 481-500 (2021).
  31. Li, H., et al. Islet-1 expression in the developing chicken inner ear. Journal of Comparative Neurology. 477 (1), 1-10 (2004).
  32. Carr, C. E., Boudreau, R. E. Central projections of auditory nerve fibers in the barn owl. Journal of Comparative Neurology. 314 (2), 306-318 (1991).
  33. Sandell, L. L., Butler Tjaden, N. E., Barlow, A. J., Trainor, P. A. Cochleovestibular nerve development is integrated with migratory neural crest cells. Developmental Biology. 385 (2), 200-210 (2014).
  34. Cramer, K. S., Bermingham-McDonogh, O., Krull, C. E., Rubel, E. W. EphA4 signaling promotes axon segregation in the developing auditory system. Developmental Biology. 269 (1), 26-35 (2004).
  35. Evsen, L., Sugahara, S., Uchikawa, M., Kondoh, H., Wu, D. K. Progression of neurogenesis in the inner ear requires inhibition of Sox2 transcription by neurogenin1 and neurod1. Journal of Neuroscience. 33 (9), 3879-3890 (2013).
  36. Curnow, E., Wang, Y. New animal models for understanding FMRP functions and FXS pathology. Cells. 11 (10), 1628(2022).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Fragile X SyndromeFMRP KnockdownChicken EmbryoSmall Hairpin RNAEGFP ReporterAuditory GanglionNucleus MagnocellularisNeural Tube Transfection

Powiązane artykuły