Method Article

Analiza autonomicznej funkcji białka upośledzenia umysłowego Fragile X w obwodzie słuchowym za pomocą elektroporacji in ovo

DOI:

10.3791/64187

⸱

July 6th, 2022

 ,  ,  , 
1Division of Histology & Embryology, Key Laboratory for Regenerative Medicine of the Ministry of Education, College of Medicine, Jinan University, 2Department of Clinical Pathology, First Affiliated Hospital of Jinan University, 3Program in Neuroscience, Department of Biomedical Sciences, College of Medicine, Florida State University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Korzystając z elektroporacji in ovo, opracowaliśmy metodę selektywnego transfekowania wewnętrznego ucha słuchowego i jądra ślimakowego w zarodkach kurczaków, aby osiągnąć specyficzne dla danej grupy komórek eliminację delikatnego białka X w upośledzeniu umysłowym podczas dyskretnych okresów składania obwodów.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fragile X mental retardation protein (FMRP) jest białkiem wiążącym mRNA, które reguluje lokalną translację białek. Utrata lub dysfunkcja FMRP prowadzi do nieprawidłowych czynności neuronalnych i synaptycznych w zespole łamliwego chromosomu X (FXS), który charakteryzuje się niepełnosprawnością intelektualną, nieprawidłowościami sensorycznymi i problemami z komunikacją społeczną. Badania funkcji FMRP i patogenezy FXS prowadzono przede wszystkim z nokautem Fmr1 (gen kodujący FMRP) u zwierząt transgenicznych. W tym miejscu przedstawiamy metodę in vivo do określania autonomicznej funkcji komórki FMRP w okresie składania obwodów i tworzenia synaps przy użyciu zarodków kurzych. Metoda ta wykorzystuje elektroporację specyficzną dla etapu, miejsca i kierunku indukowanego lekiem systemu wektorowego zawierającego małe RNA spinki do włosów Fmr1 (shRNA) i reporter EGFP. Dzięki tej metodzie uzyskaliśmy selektywne knockdown FMRP w zwoju słuchowym (AG) i w jednym z jego celów pnia mózgu, jądrze magnocellularis (NM), zapewniając w ten sposób specyficzną dla komponentu manipulację w obwodzie AG-NM. Dodatkowo, mozaikowy wzór transfekcji umożliwia kontrolę wewnątrz zwierząt i porównania sąsiednich neuronów/włókien w celu zwiększenia niezawodności i czułości w analizie danych. System wektorów indukowalnych zapewnia czasową kontrolę początku edycji genów w celu zminimalizowania kumulujących się efektów rozwojowych. Połączenie tych strategii zapewnia innowacyjne narzędzie do analizy autonomicznej funkcji FMRP w rozwoju synaps i obwodów.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zespół łamliwego chromosomu X (FXS) to zaburzenie neurorozwojowe charakteryzujące się niepełnosprawnością intelektualną, nieprawidłowościami sensorycznymi i zachowaniami autystycznymi. W większości przypadków FXS jest spowodowany globalną utratą białka upośledzenia umysłowego w kształcie litery X (FMRP; kodowane przez gen Fmr1) rozpoczynającego się we wczesnych stadiach embrionalnych1. FMRP to białko wiążące RNA, które normalnie ulega ekspresji w większości neuronów i komórek glejowych w mózgu, a także w narządach zmysłów2,3,4. W mózgach ssakó....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Z jajami i zarodkami kurczaka obchodzono się z troską i szacunkiem, zgodnie z protokołami dla zwierząt zatwierdzonymi przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Jinan.

1. Przygotowanie jaj i plazmidów

  1. Przygotowanie jajek
    1. Świeże zapłodnione jaja kurze (Gallus gallus) należy pozyskać z Południowochińskiego Uniwersytetu Rolniczego i przechowywać w temperaturze 16 °C przed inkubacją. Aby uzyskać optymalną żywotność, wszystkie jaja należy ustawić do inkubacji w ciągu tygodnia od przybycia.
    2. Umieść jaja poziomo i inkubuj w temperaturze 38 °C przez 46-48 godzin do etapu ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wykonując elektroporację in ovo w różnych miejscach i na różnych etapach rozwoju, osiągnęliśmy selektywne knockdown FMRP na peryferiach słuchowych lub w słuchowym pniu mózgu.

Knockdown FMRP w NM
Mały spinka do włosów RNA (shRNA) przeciwko kurczakowi Fmr1 został zaprojektowany i sklonowany do systemu wektorów Tet-On, jak opisano wcześniej20. Konfiguracja elektroporacji in ovo jest pokazana w Rysunek 1A<.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby określić autonomiczną funkcję FMRP, konieczne jest manipulowanie jego ekspresją w poszczególnych grupach komórek lub typach komórek. Ponieważ jedną z głównych funkcji FMRP jest regulacja powstawania i plastyczności synaptycznej, selektywne manipulowanie każdym składnikiem synaptycznym określonego obwodu jest warunkiem wstępnym pełnego zrozumienia mechanizmu FMRP w komunikacji synaptycznej. Wykorzystując elektroporację in ovo zarodków kurczaków, zademonstrowaliśmy metodę celow.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie było wspierane przez: grant Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (nr 32000697); Program Nauki i Technologii w Kantonie (202102080139); Fundacja Nauk Przyrodniczych Guangdong (2019A1515110625, 2021A1515010619); Fundusze na badania podstawowe dla uniwersytetów centralnych (11620324); grant badawczy Kluczowego Laboratorium Medycyny Regeneracyjnej, Ministerstwo Edukacji, Uniwersytet Jinan (nr ZSYXM202107); Fundusze na badania podstawowe dla Centralnych Uniwersytetów Chin (21621054); oraz Fundacja Medycznych Badań Naukowych prowincji Guangdong w Chinach (20191118142729581). Dziękujemy medycznemu centrum eksperymentalnemu Uniwersytetu Jinan. Dziękujemy dr ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Inkubacja jaj
16 ° C LodówkaMAGATSłuży do przechowywania zapłodnionych jaj
Inkubator do jajSHANGHAI BOXUNGZX-9240MBE
Zapłodnione jajaFarma Uniwersytetu RolniczegoAby zapewnić optymalną żywotność, jaja należy zużyć w ciągu jednego tygodnia.
Preparat plazmidowy
WirówkaSigma10016
Fast greenSolarbioG1661Przygotować 0,1% roztwór roboczy w wodzie destylowanej i autoklawie.
Zestaw do przygotowania plazmidu MaxiQIAGEN12162Rozpuść plazmidowe DNA w buforze Tris-EDTA (TE); zestaw do przygotowania bez endotoksyn
Octan soduSigma-AldrichS2889Przygotować 7,5 M roztwór roboczy w wodzie wolnej od nuklazów.
Electroporration and Doxycyklin Administration
ElectroporatorBTXECM399
1 mL / 5 mL StrzykawkaGUANGZHOU KANGFULAI
Mikroskop preparacyjnyCNOPTECSZM-42
DoxcyclineSigma-AldrichD9891Do każdej dawki należy stosować świeże porcje i przechowywać w temperaturze -20 & stopień C.
Kapilara szklanaBEIBOBOMEIRD09100,9-1,1 mm * 100 mm
Parafilm laboratoryjnyPARAFILMPM996przezroczysta folia
Ściągacz do pipetCHENGDU INSTRUMENT FACTORYWD-2Stan ciągnięcia: 500 ° C dla 15 s
Platynowe elktrodyDomowej robotyŚrednica 0,5 mm, odstęp 1,5 mm.
Rurka gumowaSigma-AldrichA5177
Sekcja i utrwalenie tkanek
kleszczeRWDF11020-11Rozmiar końcówki: 0,05 * 0,01 mm
Inne narzędzia chirurgiczneRWD
ParaformaldehydSigma-Aldrich158127Świeżo przygotowany 4% roztwór PFA w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami może być przechowywany w temperaturze 4 stopni C przez okres do 1 tygodnia.
SYLGARD 184 Zestaw elastomerów silikonowychDOW01673921W przypadku czarnych płyt tła stosuje się proszek węglowy dopuszczony do kontaktu z żywnością.
Sectioning
CryostatLEICACM1850
GelatinSigma-AldrichG9391Ze skóry bydlęcej.
Przesuwny mikrotomLEICASM2010
Immunostaining
Alexa Fluor 488 koza anty-myszAbcamab1501131:500 rozcieńczenie, RRID: AB_2576208
Alexa Fluor 555 koza anty-królikAbcamab1500781:500 rozcieńczenie, RRID: AB_2722519
DAPIAbcamab2853901: 1000 rozcieńczalnik
Fluoromount-G podłoże montażowePołudniowy  BiotechSb-0100-01
Przeciwciało FMRPY. Wang, Uniwersytet Stanowy Florydy#8263Rozcieńczenie 1:1000, RRID: AB_2861242
Przeciwciało Islet-1DSHB39.3F7Rozcieńczenie 1:100, RRID: AB_1157901
Płytka NetwellaCorning3478
Przeciwciało neurofilamentoweSigma-AldrichN41421:1000 rozcieńczenie, RRID: AB_477272
Przeciwciało przeciwko parwalbuminieSigma-AldrichP3088Rozcieńczenie 1:10000, RRID: AB_477329
Przeciwciało SNAP25Abcamab66066Rozcieńczenie 1:1000, RRID:
AB_2192052Imaging
Adobe photoshopOprogramowanie doedycji obrazów
Mikroskop konfokalnyLEICASP8
Stereoskopowy fluorescencyjnyOLYMPUSMVX10
Pakiet oprogramowania do komercyjnego przetwarzania obrazówOlympus Image-Pro Plus 7.0OlYMPUS
. w Południowych Chinach ADOBE

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hagerman, R. J., et al. Fragile X syndrome. Nature Reviews Disease Primers. 3, 17065(2017).
  2. Hinds, H. L., et al. Tissue specific expression of FMR-1 provides evidence for a functional role in fragile X syndrome. Nature Genetics. 3 (1....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Fragile X SyndromeFMRP KnockdownIn Ovo ElectroporationAuditory CircuitChicken EmbryoSmall Hairpin RNAEGFP ReporterAuditory GanglionNucleus MagnocellularisNeural Tube Transfection

Related Articles