Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Szybkie i skuteczne czasoprzestrzenne monitorowanie prawidłowej i nieprawidłowej metylacji cytozyny w nienaruszonych zarodkach danio pręgowanego

1.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64190

⸱

18 sierpnia 2022

 , 
1Department of Environmental Sciences, University of California, Riverside

W tym artykule

Podsumowanie

Ten artykuł opisuje protokół szybkiego i efektywnego czasoprzestrzennego monitorowania normalnej i nieprawidłowej metylacji cytozyny w nienaruszonych zarodkach danio pręgowanego.

Streszczenie

Metylacja cytozyny jest wysoce konserwatywna wśród gatunków kręgowców i, jako kluczowy czynnik programowania epigenetycznego i stanu chromatyny, odgrywa kluczową rolę we wczesnym rozwoju embrionalnym. Modyfikacje enzymatyczne napędzają aktywną metylację i demetylację cytozyny do 5-metylocytozyny (5-mC), a następnie utlenianie 5-mC do 5-hydroksymetylocytozyny, 5-formylocytozyny i 5-karboksylcytozyny. Przeprogramowanie epigenetyczne jest krytycznym okresem podczas rozwoju in utero, a narażenie matki na chemikalia może potencjalnie przeprogramować epigenom u potomstwa. Może to potencjalnie powodować niekorzystne skutki, takie jak natychmiastowe konsekwencje fenotypowe, długoterminowy wpływ na podatność na choroby u dorosłych oraz międzypokoleniowe skutki dziedzicznych cech epigenetycznych. Chociaż sekwencjonowanie oparte na wodorosiarczynach umożliwia badaczom badanie metylacji cytozyny w rozdzielczości par zasad, podejścia oparte na sekwencjonowaniu są zbyt kosztowne i jako takie wykluczają możliwość monitorowania metylacji cytozyny na różnych etapach rozwoju, wielu stężeń na substancję chemiczną i replikacji zarodków na leczenie. Ze względu na łatwość zautomatyzowanego obrazowania in vivo, manipulacji genetycznych, szybki czas rozwoju ex utero i hodowlę podczas embriogenezy, zarodki danio pręgowanego są nadal wykorzystywane jako fizjologicznie nienaruszony model do odkrywania szlaków za pośrednictwem ksenobiotyków, które przyczyniają się do niekorzystnych skutków we wczesnym rozwoju embrionalnym. Dlatego, korzystając z dostępnych na rynku przeciwciał specyficznych dla 5 mC, opisujemy opłacalną strategię szybkiego i wydajnego czasoprzestrzennego monitorowania metylacji cytozyny w indywidualnych, nienaruszonych zarodkach danio pręgowanego poprzez wykorzystanie immunohistochemii całościowej, zautomatyzowanego obrazowania o wysokiej zawartości i wydajnego przetwarzania danych przy użyciu języka programowania przed analizą statystyczną. Zgodnie z obecnym stanem wiedzy, metoda ta jest pierwszą, która z powodzeniem wykryła i określiła ilościowo poziomy 5-mC in situ w zarodkach danio pręgowanego we wczesnym okresie rozwoju. Metoda umożliwia wykrycie metylacji DNA w obrębie masy komórkowej, a także ma zdolność wykrywania metylacji cytozyny matczynych mRNA zlokalizowanych w żółtku podczas przejścia od matczynego do zygotycznego. Ogólnie rzecz biorąc, metoda ta będzie przydatna do szybkiej identyfikacji substancji chemicznych, które mogą potencjalnie zakłócać metylację cytozyny in situ podczas przeprogramowania epigenetycznego.

Wprowadzenie

Modyfikacje enzymatyczne napędzają aktywną metylację i demetylację cytozyny do 5-metylocytozyny (5-mC), a następnie utlenianie 5-mC do 5-hydroksymetylcytozyny, 5-formylocytozyny i 5-karboksylcytozyny1,2. Fosforan tris(1,3-dichloro-2-propylu) (TDCIPP) jest szeroko stosowanym środkiem zmniejszającym palność w Stanach Zjednoczonych, który, jak wykazano wcześniej, zmienia trajektorię metylacji cytozyny po wczesnej ekspozycji embrionalnej od 0,75 godziny po zapłodnieniu (HPF) do wczesnej gastrulacji (6 HPF)3,4,5,6,7,8. U kręgowców 5-mC i jego zmodyfikowane pochodne mają kluczowe znaczenie dla regulacji wczesnego rozwoju embrionalnego9. Zapłodnienie zarodka wyzwala demetylację rodzicielskiego DNA, a następnie degradację mRNA matki, aktywację genomu zygotycznego i remetylację genomu zygotycznego9. Biologicznie istotne procesy wykorzystujące metylację cytozyny obejmują modyfikację histonów, rekrutację maszynerii transkrypcyjnej, metylację RNA, przeprogramowanie epigenetyczne i określenie struktury chromatyny10,11. Metylacja cytozyny jest również zachowana wśród gatunków kręgowców, co podkreśla znaczenie zrozumienia i zbadania, w jaki sposób nieprawidłowa metylacja cytozyny może wpływać na trajektorię rozwoju organizmu11. Co więcej, rozwój in utero jest wrażliwy na narażenie matki i może powodować niekorzystne skutki, takie jak natychmiastowe konsekwencje fenotypowe, długoterminowy wpływ na podatność na choroby dorosłych i międzypokoleniowe skutki dziedzicznych cech epigenetycznych12,13,14.

Długie odcinki par cytozyna-guanina, czyli wyspy CpG, były głównymi ogniskami badaczy, którzy dążą do scharakteryzowania dynamiki metylacji cytozyny w całym genomie15,16,17. Strategie oparte na wodorosiarczynach, takie jak sekwencjonowanie wodorosiarczynów w całym genomie, sekwencjonowanie wodorosiarczynów o zmniejszonej reprezentacji i sekwencjonowanie amplikonów wodorosiarczynowych, stanowią złoty standard w badaniu metylacji cytozyny w rozdzielczości par zasad. Jednak podejścia oparte na sekwencjonowaniu są zbyt kosztowne i jako takie wykluczają możliwość monitorowania metylacji cytozyny na różnych etapach rozwoju, wielu stężeń na substancję chemiczną i replikacji zarodków podczas leczenia. Ponadto podejścia oparte na sekwencjonowaniu nie dostarczają informacji o lokalizacji przestrzennej, co ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia potencjalnie dotkniętych typów komórek i obszarów w rozwijającym się zarodku. Podobnie, globalne testy metylacji DNA, takie jak analiza restrykcyjna zależna od metylacji, testy immunologiczne sprzężone z enzymami 5-mC (ELISA) i chromatografia cieczowa ze spektrometrią mas 5-metylo-2'-deoksycytydyny (5-mC) (LC-MS) opierają się na homogenatach komórkowych lub tkankowych i jako takie wykluczają możliwość monitorowania lokalizacji i wielkości metylacji cytozyny w przestrzeni i czasie w nienaruszonych próbkach12,18.

Ze względu na łatwość zautomatyzowanego obrazowania in vivo, manipulacji genetycznych, szybkiego czasu rozwoju ex utero i hodowli podczas embriogenezy, zarodki danio pręgowanego są nadal szeroko stosowane jako fizjologicznie nienaruszone modele do odkrywania ścieżek za pośrednictwem ksenobiotyków, które przyczyniają się do niekorzystnych wyników podczas wczesnego rozwoju embrionalnego. W związku z tym, wykorzystując komercyjnie dostępne przeciwciała swoiste dla 5-mC, poniższy protokół opisuje opłacalną strategię szybkiego i wydajnego czasoprzestrzennego monitorowania metylacji cytozyny w pojedynczych, nienaruszonych zarodkach danio pręgowanego poprzez wykorzystanie immunohistochemii całościowej (IHC), zautomatyzowanego obrazowania o wysokiej zawartości i wydajnego przetwarzania danych przy użyciu języka programowania przed analizą statystyczną.

Zgodnie z aktualnym wiedzą, ta metoda jest pierwszą metodą monitorującą 5-mC w nienaruszonych zarodkach danio młodego. Metoda umożliwia wykrycie metylacji DNA w obrębie masy komórkowej, a także ma zdolność wykrywania metylacji cytozyny matczynych mRNA zlokalizowanych w żółtku podczas przejścia od matczynego do zygotycznego. Ogólnie rzecz biorąc, metoda ta będzie przydatna do szybkiej identyfikacji substancji chemicznych, które mogą potencjalnie zakłócać metylację cytozyny in situ podczas przeprogramowania epigenetycznego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Dorośli hodowcy byli traktowani zgodnie z zatwierdzonym przez Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) protokołem użytkowania zwierząt (#20180063) na Uniwersytecie Kalifornijskim w Riverside.

1. Pobieranie zarodków danio pręgowanego i ekspozycja chemiczna

  1. Dodaj pułapki hodowlane w zbiorniku do zbiorników zawierających dojrzałe płciowo i zdolne do reprodukcji dorosłe samce i samice danio pręgowanego. Dodaj co najmniej trzy pułapki na zbiornik o pojemności 6 litrów co najmniej 12 godzin przed zbiorem o godzinie ~9:00, co jest przybliżonym czasem zapłodnienia i tarła jaj w zbiornikach.
  2. Przygotuj świeży roztwór ekspozycyjny rano w dniu pobrania. Roztwór ekspozycyjny przygotowuje się za pomocą pipety o pojemności 5 ml i dodając 5,0 ml wody systemowej wolnej od cząstek stałych do szklanej szalki Petriego o średnicy 60 mm.
  3. Następnie za pomocą szklanej pipety mikrokapilarnej o pojemności 10 μl przenieść 10 μl nośnika (dimetylosulfotlenku lub DMSO) lub chemicznego roztworu podstawowego do wody systemowej w szklanym naczyniu.
  4. Zakręć szklaną szalką Petriego, aby upewnić się, że roztwór podstawowy się rozproszy. Dodaj kolejne 5,0 ml wody systemowej do szklanej szalki Petriego. Zamieszaj szklaną szalkę Petriego, aby homogenizować roztwór ekspozycyjny.
  5. Powtórzyć dla każdej grupy poddanej działaniu substancji w powtórzeniach po cztery, aby uzyskać cztery kontrpróby na badanie.
  6. Po przygotowaniu roztworów ekspozycyjnych przykryj szklane naczynia szklanymi pokrywkami, aby zminimalizować parowanie.
  7. Wyjmując pułapki hodowlane z każdego zbiornika, ostrożnie pozwól, aby woda z każdej pułapki spłynęła do zbiornika przed wyjęciem ze zbiorników. Upewnij się, że pułapki pozostają prawą stroną do góry.
  8. Przenieś pułapki hodowlane do zlewu laboratoryjnego i opłucz je za pomocą butelki ze spryskiwaczem wypełnionej wodą z odwróconej osmozy (RO) do siatki rybackiej uprzednio nasączonej 10% wybielaczem i spłukanej wodą. Opłucz zarodki, aż wszystkie zanieczyszczenia zostaną usunięte i pozostaną tylko czyste zarodki.
  9. Przenieś zarodki z sieci rybackiej za pomocą wypełnionej wodą butelki do zraszania RO do plastikowej szalki Petriego o średnicy 100 mm. Losowo posortuj 50 żywych zarodków po 0,75 godziny po zapłodnieniu (hpf) i usuń nadmiar wody RO.
  10. Za pomocą mikroszpatułki umieść posortowane zarodki w roztworze leczniczym. Wszystkie zarodki muszą znajdować się w roztworze do napełniania lub roztworze leczniczym nie wcześniej niż o godz. 9.45. Zakręć szklanymi naczyniami, aby upewnić się, że zarodki są równomiernie pokryte roztworem leczniczym.
  11. Po ustawieniu czterech powtórzonych szalek (N = 50 na kontrpróbę) dla każdej grupy poddanej działaniu substancji, umieścić szklaną pokrywkę na szalkach ekspozycyjnych i przenieść wszystkie szalki do inkubatora o kontrolowanej temperaturze ustawionej na 28 °C do uzyskania 2 hpf, 4 hpf, 6 hpf, 8 hpf lub 10 hpf.
  12. Przygotować świeży 4% paraformaldehyd (PFA) co najmniej 4 godziny przed zakończeniem ekspozycji i przechowywać w temperaturze 4 °C.
    1. Włączyć płytę grzejną do 115 °C, przygotować 20 ml 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) (2 ml 10x PBS + 18 ml wody RO) w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml i odważyć 800 mg paraformaldehydu.
    2. W dygestorium chemicznym przenieść 1x roztwór PBS do kolby Erlenmeyera o pojemności 250 ml, dodać 800 mg paraformaldehydu, a następnie dodać 2 μl 10 N NaOH. Umieść termometr w kolbie, umieść kolbę na płycie grzejnej i obserwuj temperaturę podczas mieszania.
    3. Gdy temperatura osiągnie 62-65 °C, wyjmij 4% PFA z płyty grzejnej i pozwól mu ostygnąć do temperatury pokojowej (RT). Przechowywać 4% PFA w temperaturze 4 °C.
  13. Po upływie czasu ekspozycji należy wyjąć zarodki z inkubatora i przenieść wszystkie żywe zarodki do probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml. Odessać roztwór resztkowy za pomocą pipety o pojemności 1 ml. Nie odsysaj żadnych zarodków.
  14. Dodać 500 μl schłodzonego 4% PFA do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i wymieszać zarodki w 4% PFA, kilkakrotnie odwracając. Pozwól zarodkom związać się w 4% PFA przez noc.
    UWAGA: Nie zaleca się, aby zarodki pozostawały w PFA dłużej niż 12 godzin.

2. Dechorionacja zarodków

  1. Następnego dnia odessać 4% PFA, ponownie zawiesić zarodki w 1x PBS i delikatnie pipetować w górę iw dół przez 30 sekund. W razie potrzeby należy przerwać stosowanie protokołu na tym etapie i przechowywać zarodki w 1x PBS w temperaturze 4 °C przez okres do 48 godzin.
  2. Za pomocą plastikowej pipety transferowej ostrożnie przenieś utrwalone zarodki do szklanego naczynia wypełnionego wodą RO i delikatnie obracaj przez 30 sekund. Powtórz ten krok jeszcze raz.
  3. Użyj igieł strzykawkowych w powiększeniu 5,0x przy użyciu standardowego mikroskopu stereoskopowego, aby ręcznie usunąć zakrętówkę wszystkich zarodków. Zrób to, używając końcówki igły, aby nakłuć kosmówkę i delikatnie oderwać ją od żółtka i masy komórkowej4.
  4. Po dekorionacji zarodków należy użyć szklanej pipety mikrokapilarnej, aby przenieść do 25 nienaruszonych zarodków do jednego kosza immunochemicznego (IHC) i umieścić kosz IHC na płytce 96-dołkowej. Użyj pipety o pojemności 1 ml, aby zassać wodę RO z każdej studzienki.

3. Immunohistochemia z użyciem przeciwciała specyficznego dla 5-mC

  1. Ponownie zawiesić zarodki w 500 μl buforu blokującego (1x PBST + 2% surowicy owczej + 2 mg/ml albuminy surowicy bydlęcej) na dołek i owinąć płytkę parafilmem i folią aluminiową, aby chronić je przed światłem. Inkubować w temperaturze 4 °C przez 4 godziny na wytrząsarce orbitalnej (100 obr./min).
  2. Usuń folię parafilmową i aluminium i użyj pipety o pojemności 1 ml, aby zassać bufor blokujący z każdej studzienki. Zastąp go 500 μl monoklonalnego mysiego przeciwciała anty-5-mC w roztworze monoklonalnym 1:100 w buforze blokującym. Inkubować wszystkie zarodki z pierwszorzędowymi przeciwciałami, z wyjątkiem podzbioru zarodków kontrolnych na nośniku, które będą inkubowane z buforem blokującym w celu uwzględnienia szumu tła. Na tym etapie należy uważać, aby nie naruszyć integralności zarodków ani nie zasysać zarodków.
  3. Ponownie owinąć płytkę w parafilm i folię aluminiową i pozostawić płytkę do inkubacji w temperaturze 4 °C przez noc na wytrząsarce orbitalnej (100 obr./min).
  4. Następnego dnia usuń pierwszorzędowy roztwór przeciwciała z każdej studzienki i zastąp go 1x PBS + 0,1% Tween-20 (1x PBST). Umyj każdą studzienkę trzy razy 1x PBST przez 15 minut na pranie na wytrząsarce orbitalnej (100 obr./min).
  5. Zastąp 1x PBST rozcieńczeniem 1:500 koziego przeciwciała anty-mysiego IgG w buforze blokującym i inkubuj wszystkie zarodki z przeciwciałem drugorzędowym. Pozostawić płytkę do inkubacji w temperaturze 4 °C przez noc na wytrząsarce orbitalnej (100 obr./min).
  6. Następnego dnia usunąć przeciwciało wtórne i przemyć pozostały roztwór trzykrotnie 1x PBST przez 15 minut na przemycie na wytrząsarce orbitalnej (100 obr./min).
    UWAGA: W tym miejscu protokół może zostać zatrzymany na okres do 48 godzin, jeśli kosze IHC są przechowywane w czystych studzienkach wypełnionych 1x PBS.
  7. Użyj pipety o pojemności 1 ml, aby odessać 1x PBST z każdej studzienki i umieść kosz IHC w szklanej szalce Petriego wypełnionej wodą RO. Pod standardowym mikroskopem stereoskopowym losowo posortuj nienaruszone zarodki na 96-dołkową płytkę, co daje jeden zarodek na dołek.
  8. Za pomocą pipety o pojemności 1 ml usuń całą wodę RO z poszczególnych studzienek i zastąp ją 200 μl 1x PBS. Odwirować płytkę przez 3 minuty przy 1 x g.

4. Automatyczne obrazowanie zarodków na płytkach 96-dołkowych

  1. Zobrazuj zarodki za pomocą obiektywu 2x w świetle przechodzącym i FITC przy użyciu systemu badań przesiewowych o wysokiej zawartości (tabela materiałów).
    UWAGA: Fluorescencyjny obraz każdego zarodka został uchwycony automatycznie przy użyciu wyżej wymienionego powiększenia i filtra FITC19.
    1. Wybierz opcję Autofokus, aby upewnić się, że ostrość aparatu znajduje się na spodzie płyty i jest przesunięta o grubość dna.
    2. Wybierz długość fali FITC o czasie naświetlania 100 ms i ustaw autofokus na laser z przesunięciem Z. Obserwuj i potwierdź prawidłową akwizycję obrazu w kilku studzienkach przed rozpoczęciem akwizycji płytki.
      UWAGA: Przyrząd automatycznie pobiera obrazy ze wszystkich wybranych studzienek zawierających zarodki. 96-dołkowa płytka wymagała około 30 minut na akwizycję obrazu i przechowywanie danych. Przez cały okres akwizycji temperatura wewnętrzna w systemie obrazowania była utrzymywana na poziomie RT.
  2. Po pozyskaniu obrazu przeprowadź analizę danych przy użyciu systemu badań przesiewowych o wysokiej zawartości i niestandardowej procedury automatycznej analizy obrazu. Wybierz każdy zarodek na 96-dołkowej płytce do analizy pod kątem całkowitej powierzchni i zintegrowanej intensywności fluorescencji.
    UWAGA: Analiza obejmowała dostarczenie obrazów, które zawierały nakładki punktów danych z analizy.
  3. Następnie uporządkuj punkty danych w tabelach i wyeksportuj je z systemu klasyfikowania o wysokiej zawartości, przechodząc do obszaru Miara i wybierając pozycję Otwórz dziennik danych do arkusza kalkulacyjnego. Fragmenty akwizycji płyt i analizy danych są przedstawione na Rysunek 1.

5. Analiza danych

  1. Prześlij wyeksportowany arkusz kalkulacyjny do programu komputerowego, w którym pakiet deployer (dplyr) jest używany do sortowania, sumowania danych dla każdego dołka i filtrowania według numeru odwiertu. Pakiet writexl jest następnie używany do eksportowania zsumowanych danych do arkusza kalkulacyjnego. Kod programu 5mC jest pokazany w pliku uzupełniającym 1.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Ogólnym celem niniejszego protokołu jest ustalenie, czy dana terapia wpływa na względną obfitość 5-mC poprzez ocenę całkowitego obszaru i względnej intensywności fluorescencji w utrwalonych i znakowanych zarodkach ryb zebrafish. Po zakończeniu protokołu można wykorzystać stereomikroskop fluorescencyjny, aby w pierwszej kolejności stwierdzić, czy immunohistochemia (IHC) całego preparatu przebiegła pomyślnie. W przypadku obserwacji znakowanych zarodków przy użyciu filtra FITC lub GFP, wynik dodatni jest wskazywany przez po...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Podczas tego protokołu należy wykonać kilka kroków, które są krytyczne. Po pierwsze, podczas dekorionacji zarodków ważne jest, aby skierować igłę z dala od tkanki zarodka/woreczka żółtkowego/masy komórkowej, ponieważ te części rozwijającego się zarodka są bardzo delikatne i łatwe do nakłucia. Po drugie, przenosząc oznakowane zarodki do poszczególnych studzienek, użyj szklanej pipety do transferu zarodków, ponieważ będą one przylegać do plastikowej pipety. Po trzecie, podczas wykonywania całego montażu IHC należy upewnić ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie są im znane żadne konkurencyjne interesy finansowe ani powiązania osobiste, które mogłyby mieć wpływ na pracę opisaną w tym artykule.

Podziękowania

Wsparcie badawcze zostało zapewnione przez UCR Graduate Division Fellowship dla SAB, stypendium NRSA T32 Training Program Fellowship (T32ES018827) dla SAB, a także grant National Institutes of Health (R01ES027576) i USDA National Institute of Food and Agriculture Hatch Project (1009609) dla DCV.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Probówki do mikrowirówek 1,5 mlFisher Scientific540225
10- i mikro; Szklana pipeta mikrokapilarnaL Fisher Scientific211762B
100-mm plastikowa szalka PetriegoFisher Scientific08757100D
10x sól fizjologiczna buforowana fosforanami Fisher ScientificBP399500
Pipeta 1 ml Fisher Scientific 13690032
250 ml Kolba ErlenmeyeraFisher ScientificFB501250
Pipeta 5 mlFisher Scientific13690033
60-milimetrowa szklana szalka Petriego z pokrywkamiFisher Scientific08747A
płytkaFisher Scientific720089
AlexaFluor 488-sprzężona kozia anty-mysia IgG przeciwciało Fisher ScientificA21121
Albumina surowicy bydlęcejFisher ScientificBP67110
DMSOFisher ScientificBP2311
Płyta grzewcza Fisher Scientific1110016SH
Pułapki hodowlane w zbiornikachSiedliska wodneN/ATen produkt nie jest już dostępny po przejęciu Aquatic Habitats przez Pentair.  Badacze mogą korzystać ze standardowych zbiorników hodowlanych poza systemem dostępnych u wielu dostawców.
ImageXpress Micro XLS Widefield High-Content Screening SystemUrządzenia molekularneN/AKażdy system przesiewowy o wysokiej zawartości wyposażony w światło przechodzące i filtr FITC będzie odpowiedni.
Kosz do immunochemii (IHC)N/AN/AWyprodukowano we własnym zakresie przy użyciu probówek do mikrowirówek z usuniętą stożkową częścią i dnem wyposażonym w siatkę, dozowaną do płytek 24- lub 48-dołkowych.
MetaXpress 6.0.3.1658 Urządzenia molekularneNie dotyczyOdpowiednie będzie dowolne oprogramowanie zdolne do ilościowego określenia całkowitej powierzchni i zintegrowanej intensywności fluorescencji.
MikroszpatułkaFisher Scientific2140115
Monoklonalne mysie przeciwciało anty-5-mCMillipore SigmaMABE146
NaOHFisher ScientificBP359-500
Wytrząsarka orbitalna Fisher Scientific50998290
Parafilm Fisher Scientific1337412
Paraformaldehyd Fisher Scientific18612139
Plastikowa pipeta transferowaFisher Scientific1368050
RstudioRStudioN/ARStudio to oprogramowanie typu open source, które można pobrać ze strony https://www.rstudio.com.
Surowica owczaMillipore SigmaS3772-5ML
StereomikroskopLeica10450103
Inkubator z kontrolowaną temperaturą Fisher ScientificPR505755L
Tween-20 Fisher ScientificP7949-500ML
96-dołkowa

Bibliografia

  1. Zhang, H. -Y., Xiong, J., Qi, B. -L., Feng, Y. -Q., Yuan, B. -F. The existence of 5-hydroxymethylcytosine and 5-formylcytosine in both DNA and RNA in mammals. Chemical Communications. 52 (4), 737-740 (2016).
  2. Huang, W., et al. Formation and determination of the oxidation products of 5-methylcytosine in RNA. Chemical Science. 7 (8), 5495-5502 (2016).
  3. Avila-Barnard, S., et al. Tris(1,3-dichloro-2-propyl) phosphate disrupts the trajectory of cytosine methylation within developing zebrafish embryos. Environmental Research. 211, 113078(2022).
  4. Dasgupta, S., Cheng, V., Volz, D. C. Utilizing zebrafish embryos to reveal disruptions in dorsoventral patterning. Current Protocols. 1 (6), 179(2021).
  5. Vliet, S. M. F., et al. Maternal-to-zygotic transition as a potential target for niclosamide during early embryogenesis. Toxicology and Applied Pharmacology. 380, 114699(2019).
  6. Kupsco, A., Dasgupta, S., Nguyen, C., Volz, D. C. Dynamic alterations in DNA methylation precede Tris(1,3-dichloro-2-propyl)phosphate-induced delays in zebrafish epiboly. Environmental Science & Technology Letters. 4 (9), 367-373 (2017).
  7. Dasgupta, S., et al. Complex interplay among nuclear receptor ligands, cytosine methylation, and the metabolome in driving tris(1,3-dichloro-2-propyl)phosphate-induced epiboly defects in zebrafish. Environmental Science & Technology. 53 (17), 10497-10505 (2019).
  8. McGee, S. P., Cooper, E. M., Stapleton, H. M., Volz, D. C. Early zebrafish embryogenesis is susceptible to developmental TDCPP exposure. Environmental Health Perspectives. 120 (11), 1585-1591 (2012).
  9. Geiman, T. M., Muegge, K. DNA methylation in early development. Molecular Reproduction and Development. 77 (2), 105-113 (2010).
  10. Wossidlo, M., et al. 5-Hydroxymethylcytosine in the mammalian zygote is linked with epigenetic reprogramming. Nature Communications. 2 (1), 1-8 (2011).
  11. Rottach, A., Leonhardt, H., Spada, F. DNA methylation-mediated epigenetic control. Journal of Cellular Biochemistry. 108 (1), 43-51 (2009).
  12. Egger, G., Liang, G., Aparicio, A., Jones, P. A. Epigenetics in human disease and prospects for epigenetic therapy. Nature. 429 (6990), 457-463 (2004).
  13. Ooi, S. K. T., O'Donnell, A. H., Bestor, T. H. Mammalian cytosine methylation at a glance. Journal of Cell Science. 122 (16), 2787-2791 (2009).
  14. Baylin, S. B., Jones, P. A. A decade of exploring the cancer epigenome-biological and translational implications. Nature Reviews Cancer. 11 (10), 726-734 (2011).
  15. Robertson, K. D. DNA methylation and chromatin-unraveling the tangled web. Oncogene. 21 (35), 5361-5379 (2002).
  16. Robertson, K. D. DNA methylation and human disease. Nature Reviews Genetics. 6 (8), 597-610 (2005).
  17. Greenberg, M. V. C., Bourc'his, D. The diverse roles of DNA methylation in mammalian development and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (10), 590-607 (2019).
  18. Yuan, B. -F., Feng, Y. -Q. Recent advances in the analysis of 5-methylcytosine and its oxidation products. Trends in Analytical Chemistry. 54, 24-35 (2014).
  19. Lantz-McPeak, S., et al. Developmental toxicity assay using high content screening of zebrafish embryos. Journal of Applied Toxicology. 35 (3), 261-272 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Wykrywanie 5-metylocytozynyprzeprogramowanie epigenetyczneimmunohistochemia całego preparatuobrazowanie wysokoprzepustowematernalne efekty epigenetyczneprzesiewowe badanie ekspozycji chemicznejzautomatyzowana analiza obrazukwantyfikacja metylacji DNA
Szybkie i skuteczne czasoprzestrzenne monitorowanie prawidłowej i nieprawidłowej metylacji cytozyny w nienaruszonych zarodkach danio pręgowanego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.