Czuła metoda wizualna do wykrywania bakterii wytwarzających siarkowodór

Summary

Tutaj prezentujemy protokół wykrywania bakterii wytwarzających siarkowodór z zmodyfikowanym protokołem używanym do wytrącania siarczku bizmutu (BS). Kluczowymi zaletami tej metody jest to, że jest łatwa do oceny i nie wymaga specjalistycznego sprzętu.

Abstract

Siarkowodór (_H2S) to toksyczny gaz wytwarzany przez bakterie podczas proteolizy aminokwasów i białek zawierających siarkę, który odgrywa ważną rolę w zdrowiu człowieka. Test produkcyjny_H2Sjest jednym z ważnych testów identyfikacji biochemicznej bakterii. Tradycyjne metody są nie tylko żmudne i czasochłonne, ale także podatne na hamowanie rozwoju bakterii ze względu na toksyczne działanie soli metali ciężkich w pożywce zawierającej siarkę, co często prowadzi do negatywnych wyników. W tym miejscu opracowaliśmy prostą i czułą metodę wykrywania_H2Sw bakteriach. Ta metoda jest zmodyfikowaną wersją wytrącania siarczku bizmutu (BS), w której wykorzystuje się 96-dołkowe przezroczyste płytki mikromiareczkowe. Kulturę bakteryjną połączono z roztworem bizmutu zawierającym L-cysteinę i hodowano przez 20 minut, na końcu której zaobserwowano osad. Granica wykrywalności wizualnej dla_H2Swynosiła 0,2 mM. Opierając się na wizualnej zmianie koloru, można osiągnąć proste, wysokowydajne i szybkie wykrywanie bakterii wytwarzających_H2S. Podsumowując, metoda ta może być stosowana do identyfikacji produkcji_H2Su bakterii.

Introduction

Bakterie wytwarzające siarkowodór mogą wykorzystywać aminokwasy i białka zawierające siarkowodór do produkcji siarkowodoru (H₂S). Produkcja_H2Swystępuje zwykle w bakteriach z rodziny Gram-ujemnych Enterobacteriaceae, a także u członków Citrobacter spp., Proteus spp., Edwardsiella spp. i Shewanella spp.¹. Bakterie te mają zdolność redukowania siarczanu do siarkowodoru (_H2S) w celu uzyskania energii. Siarkowodór jest zaangażowany w rozwój oporności bakterii na leki. _H2Schroni bakterie przed toksycznością reaktywnych form tlenu (ROS), antagonizując w ten sposób przeciwbakteryjne działanie antybiotyków^2,3. _H2Sma również ważne działanie fizjologiczne w utrzymaniu homeostazy. Na poziomie suprafizjologicznym wykazano, że_H2Sjest głęboko toksyczny dla organizmu. W organizmie człowieka_H2Spełni inną rolę jako cząsteczka sygnalizacji gazowej, która bierze udział w różnych procesach fizjologicznych i patologicznych. _H2Smoże regulować skurczową funkcję serca i odgrywa ważną rolę fizjologiczną w rozluźnianiu naczyń krwionośnych, hamowaniu przebudowy naczyń krwionośnych i ochronie mięśnia sercowego^4,5. _H2Sodgrywa również ważną rolę w regulacji układu nerwowego i przewodu pokarmowego^6,7. Stwierdzono, że po wystawieniu na działanie antybiotykobójczych antybiotyków bakterie wytwarzają śmiertelne reaktywne formy tlenu (ROS), co prowadzi do śmierci komórki^8,9,10,11.

Jako powszechny test biochemiczny w mikrobiologicznych kursach laboratoryjnych, test siarkowodoru jest ważnym eksperymentem w identyfikacji bakterii, zwłaszcza bakterii z rodziny Enterobacteriaceae. Obecnie test siarkowodoru jest zwykle wykonywany na dużej liczbie aminokwasów zawierających siarkę i pożywce octanu ołowiu zaszczepionej badanymi bakteriami. Po okresie inkubacji (2-3 dni) wyniki są oceniane poprzez obserwację, czy pożywka hodowlana lub pasek papieru z octanu ołowiu jest poczerniały z powodu produkcji octanu ołowiu¹¹. Jednak te tradycyjne metody są nie tylko żmudne i czasochłonne, ale także podatne na zahamowanie rozwoju bakterii ze względu na toksyczne działanie soli metali ciężkich w pożywce zawierającej siarkę, co często prowadzi do negatywnych wyników. Metoda oparta na bizmucie została opracowana do wykrywania H₂S^12,13. _H2Smoże reagować z bizmutem, tworząc wytrącanie czarnego siarczku bizmutu. Aby przeprowadzić reformę tego testu biochemicznego, należy ustalić prostą i szybką metodę, która nie ma skutków ubocznych dla wzrostu bakterii. W tym miejscu opracowaliśmy prostą metodę wykrywania bakterii wytwarzających siarkowodór hodowanych w środowisku in vitro przy użyciu siarczku bizmutu jako substratu w 96-dołkowej płytce do mikromiareczkowania.

Protocol

1. Szczepy bakteryjne

UWAGA: Do tego eksperymentu użyto dziewięciu standardowych szczepów, w tym Salmonella paratyphi A, Salmonella paratyphi B, Fusobacterium nucleatum, Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa PAO1, Aeromonas hydrophila YJ-1, Proteus vuigaris i Klebsiella pneumoniae (Tabela 1). Salmonella paratyphi (Salmonella paratyphi) A, Fusobacterium nucleatum, Pseudomonas aeruginosa i Proteus vuigaris mogą wytwarzać_H2S, jak opisano w poprzedniej literaturze¹.

1. Przygotowanie kultury bakteryjnej
   1. Przenieść jedną kolonię bakteryjną Salmonella paratyphi A, Salmonella paratyphi B, Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa PAO1, Aeromonas hydrophila YJ-1 i Klebsiella pneumoniae z płytki agarowej Luria-Bertani (LB) do 100 ml pożywki LB i hodować w temperaturze 37 °C przez 12-16 godzin, aż stężenie bakterii wyniesie około 1 x 10⁹ komórek/ml (jak wskazuje OD₆₀₀ = 1).
   2. Przenieść jedną kolonię bakteryjną Fusobacterium nucleatum i Proteus vuigaris z płytek agarowych bulionu sojowego z tryptykazą (TSB) do 100 ml pożywki TSB i hodować w temperaturze 37 °C beztlenowo przez 24 godziny, aż stężenie bakterii wyniesie około 1 x 10⁹ komórek/ml (jak wskazuje OD₆₀₀ = 1).

2. Test wykrywania H₂S

1. Test produkcji siarkowodoru
   1. Zmieszać 100 μl kultury bakteryjnej ze 100 μl nowo przygotowanego roztworu bizmutu (pH 8,0; 10 mM chlorku bizmutu (III), 0,4 M trietanoloamino-HCl, 20 mM jednowodnego 5-fosforanu pirydoksalu, 20 mM EDTA i 40 mM L-cysteiny) w 96-dołkowych płytkach do mikromiareczkowania i hodować przez 20 minut w temperaturze 37 °C. Dla każdego szczepu bakteryjnego należy przeprowadzić analizę w trzech egzemplarzach.
   2. Po 20 minutach sprawdź, czy kolor się zmienił. Jeśli kolor roztworu zmieni się z jasnożółtego na, oznacza to, że bakterie są w stanie wytworzyć_H2S. Powtórz ten pomiar 3x.
2. Czułość metody
   1. Określić czułość metody przy użyciu różnych stężeń wodorosiarczku sodu (NaHS): 2 mM, 1 mM, 0,8 mM, 0,6 mM, 0,4 mM, 0,2 mM, 0,1 mM i 0 mM, zmieszanych z roztworem BS ¹⁴.
   2. Określić obecność HS⁻/S²⁻, obserwując tworzenie się czarnego osadu BS. Oceń kolor studni za pomocą skali wizualnej od produkcji bez produkcji koloru (-) do produkcji najciemniejszego czarnego koloru (++++++).

Results

Wykrywanie bakterii wytwarzających siarkowodór
Skuteczność testu_H2Sbadano przy użyciu czystych kultur wybranych szczepów bakterii, jak podano w tabeli 1. Wyniki wykazały, że Salmonella paratyphi B, Fusobacterium nucleatum, Enterococcus faecalis, Pseudomonas aeruginosa i Proteus vuigaris mogą wytwarzać_H2Sz czarnym osadem BS, podczas gdy Salmonella paratyphi A, Staphylococcus aureus, Aeromonas hydrophila

Discussion

Test produkcji siarkowodoru jest jednym z konwencjonalnych testów fenotypowych służących do identyfikacji i różnicowania szczepów bakterii. Wiele gatunków bakterii może wytwarzać siarkowodór w swoim naturalnym środowisku, takim jak woda wodna. Te gatunki bakterii obejmują Salmonella sp., Citrobacter sp., Proteus sp., Pseudomonas sp., niektóre szczepy Klebsiella sp., Escherichia coli i niektóre gatunki beztlenowych Clostridia^15,16

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chlorek bizmutu (III)	Shanghai Macklin Biochemical Co., Ltd	7787-60-2
EDTA	Nanjing Chemical Reagent Co., Ltd	60-00-4
Enterococcus faecalis	ATCC	19433
Fusobacterium  Jądro	ATCC	25586
Klebsiella pneumoniae	ATCC	43816
L-cysteina	Amresco	52-90-4
Proteus  vuigaris	CMCC	49027
Salmonella paratyphi A	CMCC	50001
Salmonella paratyphi B	CMCC	50094
Staphylococcus  złocisty	ATCC	25923
Trietanoloamina-HCl	Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd.	Nr kat. 637-39-8