Method Article

Ocena i manipulacja aktywnością neuronalną za pomocą dwufotonowej mikroskopii holograficznej

DOI:

10.3791/64205

⸱

September 16th, 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Anatomy and Molecular Cell Biology, Nagoya University Graduate School of Medicine, 2Division of Multicellular Circuit Dynamics, National Institute for Physiological Sciences, National Institutes of Natural Sciences, 3Department of System Science, Kobe University Graduate School of System Informatics, 4Department of Biology, Graduate School of Sciences, Kobe University, 5Department of Information Science, Kobe University Graduate School of System Informatics, 6Center of Optical Scattering Image Science, Kobe University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opracowaliśmy dwufotonowy mikroskop holograficzny, który może wizualizować, oceniać i manipulować aktywnością neuronalną przy użyciu wysokiej rozdzielczości czasoprzestrzennej, w celu wyjaśnienia patogenezy zaburzeń neuropsychiatrycznych, które są związane z nieprawidłową aktywnością neuronalną.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ostatnie osiągnięcia w bioobrazowaniu optycznym i optogenetyce umożliwiły wizualizację i manipulację zjawiskami biologicznymi, w tym aktywnością komórkową, u żywych zwierząt. W dziedzinie neurobiologii ujawniono szczegółową aktywność neuronalną związaną z funkcjami mózgu, takimi jak uczenie się i pamięć, i możliwe stało się sztuczne manipulowanie tą aktywnością w celu wyrażenia funkcji mózgu. Jednak konwencjonalna ocena aktywności neuronalnej za pomocą obrazowania dwufotonowego Ca2+ ma problem z niską rozdzielczością czasową. Ponadto manipulowanie aktywnością neuronalną przez konwencjonalną optogenetykę za pośrednictwem światłowodu może tylko jednocześnie regulować aktywność neuronów o tym samym tle genetycznym, co utrudnia kontrolowanie aktywności poszczególnych neuronów. Aby rozwiązać ten problem, opracowaliśmy niedawno mikroskop o wysokiej rozdzielczości czasoprzestrzennej do zastosowań biologicznych, łącząc optogenetykę z cyfrową technologią holograficzną, która może modyfikować femtosekundowe wiązki laserowe w podczerwieni. W tym miejscu opisujemy protokoły wizualizacji, oceny i manipulacji aktywnością neuronalną, w tym przygotowanie próbek i działanie dwufotonowego mikroskopu holograficznego (Rysunek 1). Protokoły te dostarczają dokładnych informacji czasoprzestrzennych na temat aktywności neuronalnej, które mogą być przydatne do wyjaśnienia patogenezy zaburzeń neuropsychiatrycznych, które prowadzą do nieprawidłowości w aktywności neuronalnej.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obrazowanie dwufotonowe Ca2+ jest użyteczną techniką do oceny aktywności neuronalnej. Może być używany do identyfikacji nie tylko aktywności neuronalnej wymaganej do zachowania i pamięci u normalnych zwierząt1,2, ale także nieprawidłowej aktywności neuronalnej, która występuje w mysich modelach zaburzeń neuropsychiatrycznych3,4. Technika ta została wykorzystana do wyjaśnienia neuronalnych podstaw funkcji mózgu. Jednakże, chociaż może dostarczać obrazy o wysokiej rozdzielczości i wysokiej jakości, jego rozdzielczość czasowa jest niższa niż w przypadku metody elektrofizjologicznej1,3.

Optogenetyka pomogła unowocześnić sposób, w jaki neuronaukowcy rozumieją funkcjonowanie mózgu5. Biorąc pod uwagę ograniczenia techniczne, w większości badań optogenetycznych wykorzystano schematy aktywacji o niskiej rozdzielczości przestrzennej, ograniczając w ten sposób rodzaje manipulacji aktywnością neuronalną, które można odpowiednio wykonać. Jednak manipulowanie aktywnością neuronalną w subtelniejszych skalach czasoprzestrzennych może być potencjalnie przydatne dla pełniejszego zrozumienia obliczeń neuronalnych i patogenezy zaburzeń neuropsychiatrycznych. Przestrzennie precyzyjna technologia holograficzna, która może kształtować femtosekundowe wiązki laserowe w bliskiej podczerwieni, obiecuje przezwyciężyć to wyzwanie i otwiera kilka nowych klas eksperymentalnych, które wcześniej były niemożliwe6,7. Technologia ta umożliwia neuronaukowcom odkrycie podstawowych aspektów i patologii sensorycznych, poznawczych i behawioralnych kodów neuronowych, które były poza zasięgiem.

Projekcja holograficzna polega na generowaniu pożądanych wzorów świetlnych w celu selektywnego dostępu do poszczególnych komórek i sieci funkcjonalnych. Eksperymenty in vivo wymagają optymalnej transmisji światła do komórek docelowych w żywym mózgu. Światło podczerwone wnika głębiej w żywą tkankę i może być wykorzystane do nieliniowego wzbudzenia dwufotonowego (2PE)8,9,10. W ten sposób dwufotonowa mikroskopia holograficzna, która łączy projekcję holograficzną i 2PE, może być używana do oceny i manipulowania aktywnością neuronalną w celu sondowania sieci komórkowych i funkcjonalnych in vivo. Niedawne biologiczne zastosowania dwufotonowej mikroskopii holograficznej wyjaśniły aktywność neuronalną i obwody wymagane do uczenia się w korze wzrokowej11,12, opuszka węchowa13 i hippocampus14.

Wiele laboratoriów na całym świecie zgłosiło ekscytujące wyniki i ulepszenia dzięki swoim systemom stymulacji holograficznej15,16,17,18,19,20,21,22,23. W opisanym tutaj systemie system stymulacji holograficznej może być zbudowany jako urządzenie dodatkowe do konwencjonalnego mikroskopu. Przestrzenny modulator światła tylko w fazie (SLM) jest kluczowym urządzeniem do modulowania płaskiego czoła fali do dowolnego kształtu, a efekt interferencji służy do kontrolowania intensywności i lokalizacji ognisk. Rysunek 2 pokazuje stymulację holograficzną i obrazowanie ścieżek światła. Pierwsza ścieżka światła jest przeznaczona do obrazowania punktowego i składa się z głowicy skanującej i detektorów obrazu. Druga ścieżka światła służy do stymulacji holograficznej o długości fali 1040 nm i składa się z SLM1. Trzecia ścieżka światła służy do oświetlenia holograficznego o długości fali 920 nm i składa się z SLM2 i czujnika obrazu. Tryb obrazowania holograficznego może rejestrować intensywność z wielu obszarów zainteresowania poprzez oświetlenie wielu punktów w próbce. W ten sposób prędkość nagrywania można zwiększyć do kilkuset klatek na sekundę. Aby uzyskać obrazowanie punktowe lub obrazowanie z oświetleniem holograficznym, laser 920 nm został podzielony na dwie ścieżki za pomocą rozdzielacza wiązki o stałym stosunku 3:7. Wszystkie elementy optyczne zostały ustawione na płytki stykowej o wymiarach 600 mm × 600 mm. Modulowane światło wpadało przez port świetlny z boku mikroskopijnego ciała, podczas gdy światło obrazowania punktowego wpadało przez głowicę skanującą w górnej części mikroskopijnego ciała. Światła te zostały zintegrowane tuż nad soczewką obiektywu i tworzyły ogniska w płaszczyźnie próbki. Ponadto oprogramowanie wykonane na zamówienie sprawiło, że regularny przepływ pracy był prosty i spójny.

W tym artykule przedstawiono kompletny protokół użycia stymulacji holograficznej lub oświetlenia do pomiaru aktywności neuronalnej i oceny funkcjonalnej łączności między neuronami. W celach demonstracyjnych opisujemy tutaj operację mózgu ukierunkowaną na obszar kończyn tylnych pierwotnej kory somatosensorycznej (S1HL) mózgu myszy oraz metodę oceny i manipulowania aktywnością neuronalną za pomocą dwufotonowej mikroskopii holograficznej. Procedura eksperymentalna podzielona jest na cztery części. Najpierw płytka głowy została przymocowana do czaszki myszy za pomocą cementu dentystycznego. Po drugie, wektor wirusowy wyrażający jGCaMP8f lub GCaMP6m-P2A-ChRmine został stereotaktycznie wstrzyknięty do S1HL. Po trzecie, skalibrowano holograficzny system stymulacji lub oświetlenia. Po czwarte, po pooperacyjnym powrocie do zdrowia i ekspresji tych dwóch białek, przeprowadzono obrazowanie in vivo Ca2 + w celu oceny aktywności neuronalnej i funkcjonalnej łączności między neuronami za pomocą dwufotonowej mikroskopii holograficznej.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie protokoły eksperymentalne zostały zatwierdzone przez Komitety ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Szkoły Medycznej Uniwersytetu Nagoya (numer zatwierdzenia: M220295-003).

1. Implantacja płyty czołowej (Rysunek 1A)

  1. Podawać środek znieczulający (mieszaninę 74 mg/kg ketaminy i 10 mg/kg ksylazyny) dootrzewnowo w celu znieczulenia myszy. Często sprawdzaj stan znieczulenia myszy, oceniając odruchy pedałowania.
  2. Po znieczuleniu umieść mysz w instrumencie stereotaktycznym. Nałożyć maść do oczu (patrz Tabela materiałów), aby zapobiec wysychaniu rogówki po wszczepieniu płytki głowy.
  3. Ogolić obszar operacyjny i zdezynfekować skórę trzema naprzemiennymi rundami peelingów powidonowo-jodowych lub chlorheksydynowych, a następnie chusteczkami nasączonymi 70% alkoholem. Ostrożnie odsłoń czaszkę i wyczyść ją bawełnianymi wacikami.
    UWAGA: Wszystkie narzędzia chirurgiczne powinny być wysterylizowane, a wszystkie zabiegi powinny być wykonywane odpowiednio. Wszelkie pozostałe zanieczyszczenia (np. włosy lub zaschnięta krew) powodują reakcje zapalne. Dlatego wszelkie zanieczyszczenia należy usunąć pod stereoskopem za pomocą bawełnianych wacików zwilżonych sterylną wodą lub 70% alkoholem.
  4. Użyj współrzędnych stereotaktycznych - przednich i tylnych = 0,5 mm, przyśrodkowych i bocznych = 1,5 mm od bregmy - aby znaleźć środek kraniotomii i oznaczyć go markerem.
  5. Umieść wykonaną na zamówienie płytę na głowę na środku czaszki. Następnie nałóż cement dentystyczny (patrz Tabela materiałów), aby mocno przymocować go do czaszki. Wywieraj lekki nacisk, aż płyta głowy mocno zetknie się z przodem i tyłem czaszki.
    UWAGA: Ten krok zajmuje około 20 minut i ma kluczowe znaczenie dla redukcji artefaktów ruchowych w mózgu podczas obrazowania dwufotonowego. Wymiary płyty czołowej wynoszą 20 mm × 40 mm × 1 mm z otworem w kształcie płyty głównej z jedną krawędzią o długości 15 mm, dwoma sąsiednimi bokami o długości 3 mm i pozostałymi dwoma bokami o długości 10 mm.
  6. Wymieszaj ze sobą cement z żywicy adhezyjnej na bazie akrylu w następujący sposób: pół łyżki proszku, trzy krople płynu i jedną kroplę katalizatora (patrz Tabela materiałów). Aby zapobiec wysuszeniu, nałóż ten mieszany cement z żywicy adhezyjnej na nienaruszoną powierzchnię czaszki myszy z płytą głowy.
  7. Umieść mysz w ciepłej klatce, aż wyzdrowieje ze znieczulenia. Nie pozostawiaj myszy bez opieki, dopóki nie odzyska wystarczającej przytomności, aby utrzymać pozycję leżącą mostka.

2. Chirurgia i wstrzyknięcie wirusa adenowirusowego (AAV) (Rysunek 1B)

  1. Wykonaj kraniotomię lub wstrzyknięcie wirusa bez usuwania cementu z żywicy adhezyjnej z czaszki 1 dzień po implantacji płytki głowy.
    UWAGA: Podczas tego zabiegu należy podać znieczulenie (mieszaninę 74 mg/kg ketaminy i 10 mg/kg ksylazyny) dootrzewnowo myszy.
  2. Aby uniknąć obrzęku mózgu, należy podawać deksametazon fosforanu sodu (1,32 mg/kg) dootrzewnowo na 1 godzinę przed zabiegiem.
  3. Znieczulij mysz za pomocą płytki czołowej 1% znieczuleniem izofluranem za pomocą waporyzatora (system dostarczania znieczulenia), jednocześnie utrzymując temperaturę ciała za pomocą poduszki grzewczej. Nałóż maść do oczu, aby zapobiec wysuszeniu rogówki.
  4. Pod stereoskopem wykonaj okrężną kraniotomię o średnicy około 2 mm za pomocą wiertła dentystycznego. Aby zmniejszyć uszkodzenie mózgu, należy ostrożnie obsługiwać wiertło dentystyczne, wykonując stały lekki ruch i lekko naciskając w dół.
  5. Usuń fragmenty kości kilka razy za pomocą systemu ssącego. Po usunięciu fragmentów kości użyj roztworu sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (ACSF), aby usunąć i zmyć wszelkie zanieczyszczenia pozostałe na powierzchni mózgu. Powtórz tę procedurę czyszczenia kilka razy, aby stłumić reakcje zapalne.
    UWAGA: Roztwór ACSF (140 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 5 mM HEPES, 2,0 mM CaCl2 i 1,0 mM MgCl2) przechowywano w temperaturze 4 °C przez 1 miesiąc po rozpuszczeniu i przefiltrowaniu odczynnika (wielkość porów = 0,22 μm).
  6. Za pomocą systemu wtrysku ciśnieniowego (patrz Tabela materiałów) ustaw odpowiednie ciśnienie (około 10 PSI w impulsach o czasie trwania 4 ms), aby wstrzyknąć 500 nL roztworu AAV przez szklaną kapilarnę o średnicy końcówki 10-20 μm (przygotowanej za pomocą ściągacza do mikropipet) przez 10 minut.
  7. Określ, czy roztwór AAV jest podawany do mózgu, sprawdzając, czy poziom roztworu AAV w szklanej kapilarze stopniowo spada.
  8. Pozostaw szklaną kapilarnę na miejscu na dodatkowe 10 minut, aby zapobiec przepływowi wstecznemu. Powtórz trzy razy, aby podać w sumie 1,5 μl roztworu AAV do mózgu.
  9. Aby ocenić i manipulować aktywnością neuronalną w komórkach piramidalnych warstwy 2/3 (L2/3), wstrzyknąć roztwór AAV (do obrazowania Ca2+: AAV2/1-Syn-jGCaMP8f-WPRE przy 1,28 ×10 14 genomach wektorowych/ml, rozcieńczony 1:1 w soli fizjologicznej; do obrazowania Ca2+ z optogenetyką: AAV2/8-CaMKII-GCaMP6m-P2A-ChRmine-Kv2.1-WPRE w 1,73 ×10 14 genomy wektorowe / ml, rozcieńczone 1:1 w soli fizjologicznej) do tylnej części łapy pierwszorzędowej kory somatosensorycznej myszy typu dzikiego (S1, wyśrodkowany na 0,5 mm z tyłu i 1,5 mm z boku od bregmy, głębokość 150 μm od powierzchni).
    UWAGA: Roztwór AAV należy wstrzykiwać 2-3 tygodnie i 1-2 tygodnie przed obrazowaniem odpowiednio w celu uzyskania ekspresji jGCaMP8f i GCaMP6m-P2A-ChRmine.
  10. Po nałożeniu 2% (w/v) niskotopliwej agarozy na powierzchnię mózgu S1 za pomocą mikropipety, umieść szklane okienko nad kraniotomią z dwoma szkłami nakrywkowymi. Przymocuj dwie szklanki nakrywkowe (o małej średnicy 2,0 mm i dużej średnicy 4,5 mm; patrz Tabela materiałów) za pomocą kleju utwardzanego promieniami UV.
  11. Dociśnij szkło nakrywkowe do agarozy, gdy jest jeszcze płynne; zapobiega to tworzeniu się pęcherzyków powietrza w agarozie. Uszczelnij krawędzie okna czaszki dentystycznym i adhezyjnym cementem żywiczym (Rysunek 1C).
  12. Wyjmij mysz z instrumentu stereotaktycznego i umieść ją z powrotem w klatce. Umieść mysz w ciepłej klatce i nie wracaj do klatki z innymi zwierzętami, dopóki w pełni nie wyzdrowieje ze znieczulenia. Ostrożnie utrzymuj sterylne warunki podczas operacji przeżycia.
  13. Przez pierwsze 72 godziny po zabiegu sprawdzaj stan zdrowia myszy, obserwując ogólne zachowanie. Jeśli występują jakiekolwiek nieprawidłowości w ogólnym zachowaniu, należy wstrzyknąć podskórnie środki przeciwzapalne i przeciwbólowe.

3. Przygotowanie do holograficznego systemu stymulacji lub oświetlenia (Rysunek 3)

  1. Skalibruj system stymulacji holograficznej, umieszczając powierzchnię czerwonego szkiełka fluorescencyjnego (odlewane podłoże akrylowe) na płaszczyźnie próbki. Przełącz mikroskop w tryb obrazowania na żywo ze słabym światłem wzbudzenia i uruchom plik calibration_GUI.m. Sprawdź panel parametrów i kliknij przycisk Zapisz.
  2. Kliknij przycisk Skanowanie z w okienku kroku 1. Automatycznie wygeneruje trzy losowe punkty we wszystkich 21 płaszczyznach osiowych, w odległości 2 μm od każdej płaszczyzny.
  3. Przesuń suwak i sprawdź obraz na żywo. Znajdź idealną płaszczyznę, na której plamki wydają się najmniejsze i najjaśniejsze, a następnie kliknij przycisk Zapisz. Spowoduje to automatyczne wygenerowanie przesuniętego sferycznego czoła fali dla hologramu cyfrowego.
    UWAGA: Jeśli nie uda Ci się znaleźć najjaśniejszych punktów fluorescencji, zmień minimalne i maksymalne wartości zakresu skanowania i spróbuj ponownie.
  4. Kliknij przycisk Przejdź w okienku kroku 2, a następnie kliknij sześć miejsc w lewym kwadracie. Sprawdź obraz na żywo. Jeśli istnieje sześć rozpoznawalnych plamek fluorescencyjnych, wpisz ich osie x i y w polach edycji i kliknij przycisk Zapisz. Spowoduje to automatyczne wygenerowanie współczynników transformacji afinicznej w celu skoordynowania kalibracji między stymulacją holograficzną a systemem obrazowania.
    UWAGA: Numer pary osi i numer klikniętego punktu muszą być zgodne w kolejności. Jeśli nie masz pewności lub jeśli na obrazie nie ma plam, spróbuj ponownie i wygeneruj unikalny wzór plamki lub wybierz mniejszy zakres wokół środka pola widzenia (FOV).
  5. Kliknij przycisk Skanuj w okienku kroku 3. Wygeneruje 441 cyfrowych hologramów, aby wykonać skanowanie pojedynczego punktu w polu widzenia w 21 × 21 krokach.
    1. Najpierw sprawdź obrazy podczas zmiany wzorów w polu listy. Następnie dostosuj moc lasera, aby uzyskać obrazy punktowe w zakresie dynamicznym urządzenia do obrazowania (na przykład, aby uniknąć nadmiernego nasycenia obrazów).
    2. Następnie dostosuj czas interwału w polu edycji; czas interwału powinien być więcej niż dwa razy większy niż czas interwału nagrywania. Na koniec przełącz urządzenie do przetwarzania obrazu w tryb nagrywania i kliknij przycisk Odtwórz. Jeśli odtwarzanie zostanie zakończone, w oknie poleceń pojawią się napisy "wyświetl OK". Zatrzymaj nagrywanie i ułóż nagrane obrazy sekwencyjne w stos przy użyciu metody maksymalnej intensywności.
  6. Kliknij przycisk Generuj WM w okienku kroku 4 i wybierz obraz ułożony w stos z góry. Następnie zamknij okno calibration_GUI. Automatycznie wygeneruje mapę wagi, aby skompensować niezrównoważoną intensywność w każdym miejscu.
    UWAGA: Bardziej szczegółowy opis można znaleźć w 2; kod Matlaba można pobrać stąd (https://github.com/ZenKG/SLM_control).

4. Obrazowanie Ca2+ przy użyciu czujnika obrazu z oświetleniem holograficznym (Rysunek 4)

  1. Umieść mysz z wstrzykniętą krwią przeciwdrobnoustrojową z płytką na głowę pod mikroskopem (Rysunek 1D).
    UWAGA: Podczas tej procedury mysz jest skrępowana w stanie czuwania, ale jest w stanie uciec przed nieprzyjemnymi bodźcami.
  2. Wykonaj obrazowanie dwufotonowe (tryb skanowania punktowego) za pomocą mikroskopu holograficznego i lasera Ti:sapphire z blokadą trybu dostrojonego do 920 nm z obiektywem 25x (patrz tabela materiałów).
  3. Włącz komercyjne oprogramowanie do obrazowania (patrz Spis materiałów). W trybie obrazowania na żywo dostosuj napięcie detektora obrazu (patrz Tabela materiałów) i moc lasera obrazującego, aby zoptymalizować jasność neuronów wyrażających jGCaMP8f. Uchwyć obrazy neuronów wyrażających to białko.
    UWAGA: Natężenie lasera obrazującego (920 nm) wynosi 20-30 mW. Pole widzenia wynosiło 512 μm × 512 μm na głębokości 100-150 μm od powierzchni kory mózgowej.
  4. Aby oświetlić określone neurony wyrażające jGCaMP8f za pomocą oświetlenia holograficznego, uruchom plik skryptu SLMcontrol.m. Kliknij obraz referencyjny i wybierz obraz uzyskany powyżej. Następnie kliknij przycisk Spot, aby wybrać określone piksele na neuronach na obrazie, klikając ciągłym myszką (Rysunek 4A). Jeśli wybór jest zakończony, naciśnij przycisk Enter na klawiaturze, aby go sfinalizować.
    UWAGA: Hologram cyfrowy jest automatycznie obliczany i wyświetlany na SLM. Do tego wzorca można również powrócić, klikając pole listy. Rozdzielczość przestrzenna pojedynczej plamki generowanej przez SLM wynosiła około 1,2 μm wzdłuż kierunku poprzecznego i ~8,3 μm wzdłuż osi optycznej. Użyliśmy soczewki obiektywowej o wysokiej aperturze numerycznej (1,1), aby uzyskać bardziej zlokalizowaną stymulację holograficzną. Tabela 1 podsumowuje poprzednie raporty i ten system w odniesieniu do rozdzielczości przestrzennej stymulacji holograficznej.
  5. Aby wykryć aktywność neuronalną z wysoką rozdzielczością czasową za pomocą czujnika obrazu (patrz tabela materiałów), ustaw czas ekspozycji, obszar obrazowania i binning (Rysunek 4B) przed wykonaniem akwizycji obrazu (Rysunek 4C).
    UWAGA: Intensywność holograficznego lasera oświetleniowego (920 nm), który w sposób ciągły stymuluje jeden neuron, wynosi 2 mW, co jest wystarczające do wykrycia aktywności neuronalnej. Na przykład, aby osiągnąć częstotliwość odświeżania 100 Hz dla obrazowania, czas ekspozycji wynosi 9 ms, obszar obrazowania wynosi 400 μm × 400 μm, a binning wynosi 4.
  6. Po eksperymencie przywróć mysz do jej domowej klatki.

5. Obrazowanie dwufotonowe (tryb skanowania punktowego) z optogenetyką przy użyciu mikroskopu holograficznego (Rysunek 2)

  1. Powtórz kroki 4.1 i 4.2.
  2. Włącz komercyjne oprogramowanie do obrazowania (patrz Spis materiałów). W trybie obrazowania na żywo dostosuj napięcie detektora obrazu (patrz tabela materiałów) i moc lasera obrazującego, aby zoptymalizować jasność neuronów wyrażających GCaMP6m-P2A-ChRmine. Uchwyć obrazy neuronów wyrażających te białka (Rysunek 1E).
  3. Powtórz krok 4.4.
  4. Aby zbadać funkcjonalną łączność w neuronach L2/3, użyj SLM do generowania holograficznych wzorców stymulacji optogenetycznej (ChRmine; 1,040 nm) i połącz je z obrazowaniem dwufotonowym Ca2+ (GCaMP6m; 920 nm, 512 × 512 pikseli, 2 Hz lub 30 Hz, 2-krotny zoom cyfrowy, tryb skanowania punktowego; Rysunek 4D-H).
    1. Dla tego protokołu ustaw intensywność lasera obrazującego na 920 nm, przy 10-20 mW, a FOV na 256 μm × 256 μm mierzone na głębokości 100-150 μm od powierzchni kory mózgowej. Ustaw czas zatrzymania piksela na 1,5 μs dla 2 Hz lub 100 ns dla 30 Hz.
    2. Aby sprawdzić, czy pojedynczy bodziec holograficzny spowodował odpowiedź wapniową w neuronach, użyj zarówno 2 Hz, jak i 30 Hz jako częstotliwości obrazowania. Ustaw intensywność lasera do stymulacji holograficznej (1,040 nm), który stymuluje pojedynczy neuron o mocy 10 mW, co jest wystarczające do wywołania aktywności neuronalnej (Rysunek 4D).
      UWAGA: Rozdzielczość przestrzenna pojedynczej plamki generowanej przez SLM wynosi około 1,2 μm wzdłuż kierunku poprzecznego i ~8,3 μm wzdłuż osi optycznej. Zakres dostępnej objętości w kierunku poprzecznym wynosi około 500 μm × 500 μm i 100 μm w kierunku osiowym. Ponadto, za pomocą obrazowania Ca2+ przy częstotliwości odświeżania 2 Hz lub 30 Hz, potwierdziliśmy, że nie tylko jeden neuron, ale wiele neuronów może być jednocześnie stymulowanych holograficznie (Rysunek 4E).
  5. Wykonaj akwizycję obrazu za pomocą następującego protokołu: jednocześnie zobrazuj odpowiedź Ca2+ przy 920 nm z 10 bodźcami holograficznymi przy 1 040 nm w odstępach 8 s (0,125 Hz) przez czas trwania 50 ms po okresie bazowym wynoszącym 10 s. Po zakończeniu wszystkich eksperymentów myszy są poddawane eutanazji.
    UWAGA: Stan nieustalony Ca2+, jeśli był obecny, był wywoływany przez stymulację holograficzną, a ich szczyt pojawiał się w ciągu 1 sekundy po stymulacji (Rysunek 4F-H).

6. Analiza obrazu i ocena funkcjonalnej łączności (Rysunek 4)

  1. Otwórz obrazy RAW zapisane w krokach 4.5 lub 5.5 za pomocą ImageJ. Aby skompensować przemieszczenie w płaszczyźnie ogniskowej, należy użyć wtyczki ImageJ TurboReg.
    UWAGA: Jeśli korekcja za pomocą TurboReg nie jest wystarczająca, zaleca się użycie CaImAn (http://github. com/simonsfoundation) w celu skorygowania przemieszczenia płaszczyzny ogniskowej.
  2. Aby ocenić aktywność neuronalną, określ obszary zainteresowania (ROI) w L2/3 za pomocą zautomatyzowanego algorytmu (CaImAn). Wykrywaj i analizuj stany nieustalone Ca2+ po zdefiniowaniu podstawowej intensywności fluorescencji (F0) i wartości progowej.
    UWAGA: F0 to 35. percentyl wartość intensywności fluorescencji uzyskana w okresie obrazowania podstawowego. Stan nieustalony Ca2+ jest oznaczony przez ΔF/F0 (ΔF = F-F0), gdzie F jest chwilowym sygnałem fluorescencji. Jeśli wartość ΔF jest większa niż 2 S.D. od F0, oceniamy znaczący stan nieustalony Ca2+.
  3. Aby zdefiniować łączność funkcjonalną w neuronach L2/3, stymuluj neurony docelowe i mierz odpowiedzi GCaMP6m w stymulowanych i otaczających neuronach, odpowiednio (Rysunek 4F-H).

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prezentowane są reprezentatywne nagrania uzyskane przy użyciu opisanej tutaj metody. In vivo (in vivo) Obrazowanie Ca2+ przy użyciu mikroskopii holograficznej wymaga 2-4 tygodni od implantacji płytki głowy i wstrzyknięcia AAV do pozyskania danych. Dlatego, aby uzyskać stabilne wyniki, ważne jest, aby zmniejszyć artefakty ruchowe w mózgu. Implantacja płytki głowy (krok 1.5) i umieszczenie okienka czaszki (krok 2.9) są bardzo ważnymi krokami w tym procesie. Ponadto ważne jest również, aby wybrać AAV (AAV2/8-CaMKII-GCaMP6m-P2A-ChRmine-Kv2.1), który jednocześnie wyraża wskaźnik wapnia i opsynę w pojedynczym neuronie (krok 2.8).

Rysunek 4A pokazuje miejsce do holograficznego oświetlenia pozyskanego obrazu neuronu za pomocą specjalnie przygotowanego skryptu MATLAB. Jeśli oświetlenie holograficzne z powodzeniem oświetliło neurony wyrażające jGCaMP8f, ślady Ca2+ można uzyskać za pomocą czujnika obrazu (Rysunek 4B), jak pokazano na Rysunek 4C.

Funkcjonalna łączność między neuronami została oceniona za pomocą stymulacji holograficznej (Rysunek 4D), jak pokazano w Rysunek 4E. Ponieważ funkcjonalna łączność między neuronami jest jedną z właściwości obwodów neuronalnych, która ulega zmianie w patogenezie modelu bólu mouse24, opisujemy prostą procedurę jej oceny. Rysunek 4F przedstawia typowy obraz neuronów L2/3 w S1HL zobrazowany za pomocą GCaMP6m. Kiedy jeden neuron (pomarańczowe kółko) był stymulowany holograficznie, inny neuron (czerwone kółko) był jednocześnie aktywny; w związku z tym liczba funkcjonalnych połączeń między neuronami wynosiła jeden (Rysunek 4G).

figure-results-1
Rysunek 1: Schematyczny zarys procedury eksperymentalnej. (A) Mocowanie płyty głowy do czaszki. (B) Stereotaktyczne wstrzyknięcie AAV w obszar tylnej łapy pierwszorzędowej kory somatosensorycznej (S1HL). (C) Implantacja okna czaszkowego. Aby ocenić i manipulować aktywnością neuronalną, obrazowanie Ca2 + in vivo wykonuje się u obudzonych myszy (D) ze stymulacją holograficzną (E). Ślady błysku wskazują na stymulację holograficzną lub oświetlenie. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: System używany w mikroskopie holograficznym. (A) Obrazy holograficznej stymulacji i ścieżek świetlnych oświetlenia (po lewej) w pobliżu mikroskopu (w środku) z czujnikiem obrazu (po prawej). (B) Są to powiększone obrazy holograficznej stymulacji i ścieżek świetlnych oświetlenia wokół odpowiednich SLM (po lewej i prawej stronie) oraz punktowa ścieżka światła skanującego wokół głowicy skanującej (środkowa i prawa). (C) Schemat ścieżek optycznych stymulacji i obrazowania. SLM tylko fazowe są używane do wyświetlania hologramów cyfrowych, a ekspander wiązki (kombinacja L1 i L2) oraz system przekaźnikowy 4f (kombinacja L3 i L4 do stymulacji holograficznej oraz L4 i L5 do oświetlenia holograficznego) są umieszczane przed i po odpowiednich SLM, aby upewnić się, że każdy cyfrowy hologram jest obrazowany w źrenicy wyjściowej soczewki obiektywu zanurzonego w wodzie, z lekko niedopełnionym rozmiarem obrazu. Aby wygasić szczątkowe komponenty zerowego rzędu, blok belki jest umieszczany w płaszczyźnie pośredniej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Schemat blokowy kalibracji systemu stymulacji holograficznej lub oświetlenia. Ten schemat blokowy opisuje kroki kalibracji systemu stymulacji lub oświetlenia holograficznego do przestrzeni próbki i systemu obrazowania. Odwiedź krok 3, przygotowanie do stymulacji holograficznej lub systemu oświetlenia, aby uzyskać szczegółowe instrukcje i pobrać przykładowy program. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Reprezentatywne wyniki obrazowania i funkcjonalnej łączności za pomocą mikroskopu holograficznego. (A) Aby oświetlić określone neurony wyrażające jGCaMP8f lub GCaMP6m-P2A-ChRmine, przechwytywany jest obraz neuronów, a następnie tworzona jest plamka na neuronie za pomocą specjalnie przygotowanego skryptu MATLAB. (B) Ustawienia przetwornika obrazu (czas ekspozycji, obszar obrazowania i binning). (C) Reprezentatywny obraz i ślady neuronów wyrażających jGCaMP8f w obrazowaniu 100 Hz z oświetleniem holograficznym i czujnikiem obrazu. (D) Ten wykres pokazuje odpowiedź neuronalną na stymulację holograficzną (1,040 nm) przy każdej mocy lasera (dane z neuronów eksprymujących GCaMP6m-P2A-ChRmine przy częstotliwości obrazowania 2 Hz [n = 16]). Słupki błędu wskazują błąd standardowy średniej. (E) Reprezentatywne ślady Ca2+ podczas stymulacji holograficznej (niebieskie pionowe linie) 10 różnych neuronów przy częstotliwości obrazowania 2 Hz (po lewej) i 30 Hz (po prawej). W śladach Ca2+ 2 Hz i 30 Hz ten sam kolor oznacza ten sam neuron. (F) Schemat ideowy oceniający funkcjonalne połączenia między neuronami. Kiedy pomarańczowy neuron jest stymulowany, czerwone neurony reagują w tym samym czasie, co wskazuje, że istnieje funkcjonalna łączność między tymi neuronami. (G) Typowy obraz neuronów S1HL wyrażających GCaMP6m w WT. Pasek skali = 10 μm. (H) Typowe ślady Ca2+ podczas stymulacji holograficznej (niebieskie pionowe linie) przy 2 Hz (górna) i 30 Hz (dolna) częstotliwość obrazowania. Stymulowany neuron jest zakreślony na pomarańczowo, neurony reagujące są zakreślone na czerwono, a neurony niereagujące są zakreślone na szaro. Reakcję neuronalną na stymulację holograficzną można wykryć zarówno przy prędkościach obrazowania 2 Hz, jak i 30 Hz. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

cala piksela
Nasza konfiguracja 6 Prakash, R. i wsp. 25 Marshel, J. H. i wsp. 12Robinson, N. T. M. i wsp. 14
Rozdzielczość boczna1,2 μm1,27 μm―2,22 μm
Rozdzielczość osiowa8,3 μm56,86 μm15,5 μm10,26 μm
Obiektyw obiektywu/Przysłona numeryczna25x/1,120x/0,516x/0,816x/0,8

Tabela 1: Podsumowanie poprzednich raportów i tego systemu do przestrzennej rozdzielczości stymulacji holograficznej. Opisana jest rozdzielczość boczna, rozdzielczość osiowa oraz soczewka obiektywu używana podczas pomiaru.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby zrozumieć funkcjonowanie mózgu, konieczna jest dokładna ocena obwodów neuronalnych leżących u podstaw funkcji mózgu poprzez wyodrębnienie dynamiki aktywności neuronalnej. Ponadto konieczne jest określenie, w jaki sposób te obwody neuronalne są zmieniane, aby wyjaśnić patogenezę zaburzeń neuropsychiatrycznych. Rzeczywiście, wiadomo, że aktywność neuronalna jest podwyższona w mysich modelach choroby Alzheimera4 i zespołu łamliwego chromosomu X26 oraz u myszy z upośledzoną funkcją istoty białej3. Co więcej, w mysim modelu bólu zapalnego zwiększona synchronizacja aktywności neuronalnej i funkcjonalnej łączności między neuronami jest związana z objawami24. Dwufotonowa mikroskopia holograficzna pozwala nam jednocześnie obserwować aktywność poszczególnych neuronów i funkcjonalne połączenia między neuronami, co jest niezbędne do zrozumienia obwodów neuronalnych. Użyliśmy soczewki obiektywowej o powiększeniu 25x z aperturą numeryczną = 1,1 o długości fali 1 040 nm. Teoretyczna funkcja rozpiętości punktowej to rozkład Gaussa o pełnej szerokości w połowie maksimum 0,5 μm w bok i 1,7 μm osiowo. Jednak rzeczywista apertura numeryczna jest mniejsza niż 1,1, a zmierzona wielkość plamki na koraliku fluorescencyjnym wynosi 1,2 μm bocznie i 8,3 μm osiowo. Biorąc pod uwagę, że średnica neuronu wynosi około 15 μm, a błąd kalibracji mieści się w granicach 3 μm, celowanie jest ogólnie dobre. Jednak na komórki w kierunku osiowym może mieć wpływ dłuższy rozmiar plamki6. Tutaj opisaliśmy wstrzykiwanie wirusa, operację, kalibrację stymulacji holograficznej lub systemów oświetlenia oraz protokoły obrazowania do oceny i manipulowania aktywnością neuronalną u żywych myszy za pomocą naszego systemu mikroskopowego.

Wykonanie wszystkich procedur eksperymentalnych zajmuje 2-4 tygodnie, od implantacji płytki głównej i wstrzyknięcia wirusa po pozyskiwanie danych do obrazowania Ca2+ in vivo za pomocą mikroskopii holograficznej. Proces ten jest złożony i pracochłonny, a ostateczny sukces eksperymentu zależy od wielu czynników, w tym od stanu okna czaszkowego, na które wpływa stan zapalny pooperacyjny, właściwego doboru wskaźnika Ca2+ i opsyny oraz od tego, czy artefakty ruchowe w uzyskanych obrazach można skorygować. W szczególności dla pomyślnego wyniku ważne są dwa kroki. Pierwsza dotyczy mocowania płytki głowy i chirurgii; Bardzo ważne jest, aby płyta głowicy była mocno przymocowana do głowy myszy za pomocą cementu dentystycznego. Ponadto ważne jest, aby podczas operacji wielokrotnie czyścić fragmenty kości i zakrzepłą krew za pomocą zimnego ACSF. Ponieważ przestrzeganie tej procedury zmniejsza stan zapalny, z powodzeniem zaobserwowaliśmy dynamikę mikrogleju, komórek odpowiedzialnych za układ odpornościowy mózgu, bez aktywacji ich procesów i kolców lub mikrostruktur neuronów27,28. Drugą kwestią jest ocena i manipulacja aktywnością neuronalną. Wybraliśmy AAV2/8-CaMKII-GCaMP6m-P2A-ChRmine-Kv2.1 do jednoczesnej ekspresji wskaźnika Ca2 + i opsyny w jednym neuronie. Dzieje się tak, ponieważ trudno jest skutecznie zainfekować jeden neuron różnymi typami AAV. Innym powodem tego wyboru było to, że ChRmine może skutecznie aktywować aktywność neuronalną przy 1040 nm za pomocą lasera dwufotonowego12. Ostatnio doniesiono, że ChRmine, mutując swoją strukturę w oparciu o informacje strukturalne uzyskane za pomocą mikroskopii krioelektronowej, poprawia swoją funkcję29, co jest uważane za przydatne do analizy funkcji docelowych w dziedzinie neuronauki. W świetle tych problemów konieczne jest podzielenie się skutecznymi metodami oceny i manipulowania neuronami podczas odczytywania aktywności neuronalnej i zapisywania informacji za pomocą mikroskopii holograficznej.

Ostatnie postępy w obrazowaniu i optogenetyce ujawniły szczegółową aktywność neuronalną zaangażowaną w funkcje mózgu, takie jak uczenie się i pamięć, i możliwe jest sztuczne manipulowanie tą aktywnością neuronalną w celu wyrażenia funkcji mózgu30. Jednak konwencjonalne metody manipulowania aktywnością neuronalną są wysoce inwazyjne ze względu na wprowadzenie światłowodów do mózgu i dlatego, że grupa komórek wyrażających opsynę jest jednocześnie stymulowana, co uniemożliwia manipulowanie aktywnością neuronalną z precyzją czasową i przestrzenną. Nasza metoda może manipulować aktywnością neuronalną poprzez stymulację tylko określonych neuronów w mózgu, umożliwiając w ten sposób manipulowanie aktywnością neuronalną z określonymi wzorcami stymulacji i wysoką rozdzielczością czasoprzestrzenną. Ponadto ważne jest, aby zauważyć, że funkcjonalna łączność między neuronami może być oceniona tylko w niewielkiej liczbie neuronów za pomocą eksperymentów z wycinkami mózgu31; Jednak technika ta pozwala na jednoczesną ocenę wielu neuronów u żywych zwierząt.

Jednym z głównych ograniczeń obecnych mikroskopów holograficznych jest konieczność naprawienia głowicy myszy, co ogranicza zachowanie myszy. Niedawno opracowano zminiaturyzowany mikroskop dwufotonowy32, a wraz z dalszą miniaturyzacją urządzenia możliwe może być obrazowanie in vivo Ca2+ ze stymulacją holograficzną u myszy poruszających się swobodnie. Ponadto potencjał tego mikroskopu można rozszerzyć poprzez poprawę rozdzielczości czasowej obrazowania i połączenie go z bardzo czułymi, wrażliwymi na napięcie białkami fluorescencyjnymi33.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Grants-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (19H04753, 19H05219, and 25110732 to H. W.), Grants-in-Aid for Transformative Research Areas (A) (20H05899 do H. W., 20H05886 do O. M. i 21H05587 do D. K.), Fostering Joint International Research (B) (20KK0170 do H. W.), Grant-in-Aid for Scientific Research (B) (18H02598 do H. W.), Grant-in-Aid for Scientific Research (A) (21H04663 do O. M.), Grant-in-Aid dla naukowców na wczesnym etapie kariery (20K15193 do X. Q.), JST CREST Grant Number JPMJCR1755, Japonia oraz JST A-STEP Grant Number JPMJTR204C.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
25x ObiektywNikonN25X-APO-MPObiektyw
A1MPNikonA1MPMikroskop
AnesIIBiomachineryAnesIISystem podawania znieczulenia
C2 plusNikonC2 plus
Mikroskop DECADRON  Fosforany  IniekcjaAspen21N024Unikaj obrzęku mózgu
Wiertło dentystyczneJotaC1. HP.005Wiertarka dentystyczna
Elektryczny mikrowtryskiwaczNARISHIGEIM-31System wtrysku ciśnieniowego
FEATHERSFEARGERFA-10Golenie
G-CEM ONE ADHEZYJNY PODKŁAD WZMACNIAJĄCY KLEJGCŻywica cementowa podkład do adhezji dentystycznej
G-CEM ONE neoGC43093Cement żywiczny do adhezji dentystycznej
Kapilara szklana z FilamentNARISHIGEGDC-1Szklany
kapilarny detektor obrazuHamamatsuH10770PA-40GaAsP fotokatoda fotopowielacza
Oprogramowanie do obrazowaniaNikonNISelementsOprogramowanie do obrazowania
Roztwór do inhalacji izofluranuPfizer229KARZnieczulenie
iXon EMCCD KameraAndoriXon Life 888Obraz czujnik
Ketaminadaiitisannkyous9-018506Znieczulenie
Leica-M60LeicaM60Stereoskop
LiniconLiniconLV-125Pompa próżniowa
z blokadą trybu Ti:szafirowy Chameleon Ultra II KoherentnyChameleon Discovery NXLaser femtosekundowy
Mos-CureU-VIXmini 365Przenośne źródło światła LED UV
PEN BrightSHOFU INC.PEN BrightDentystyczne urządzenie do utwardzania światłem
ŚciągaczSUTTER instaumentP-97Ściągacz
Przyrząd stereotaktyczny (dla myszy)NARISHIGESR-6M-HInstrument stereotaktyczny
Stereotaktyczny mikromanipulatorNARISHIGESM-15RStereotaktyczny mikromanipulator
Super-Bond CATALYST VSUN MEDICAL8070Cement z żywicy adhezyjnej dentystycznej
Super-Bond Dental Adhesive MonomerSUN MEDICAL8071Monomer kleju dentystycznego
Super-Bond Teeth Color Polymer PowderSUN MEDICAL145052000Kolor zębów w proszku
polimerowym Tarivid  Okulistyka  Maść 0,3%Santen Pharmaceutical TRN3952Maść do oczu
UlTIMATE XLNSKLaboratorium dentystyczne Jednostka sterująca mikromotorem
Kleje optyczne utwardzane promieniami UVTHORLABSNOA61Kleje optyczne utwardzane promieniami UV
KsylazynaBayerKP0F2BKZnieczulenie
2110271 Y141446

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Masamizu, Y., et al. Two distinct layer-specific dynamics of cortical ensembles during learning of a motor task. Nature Neuroscience. 17 (7), 987-994 (2014).
  2. Peters, A. J., Chen, S. X., Komiyama, T. Emergence of reproducible spatiotemporal activity during motor learning. Nature. 510 (7504), 263-267 (2014).
  3. Kato, D., et al. Motor learning requires myelination to reduce asynchrony and spontaneity in neural activity. Glia. 68 (1), 193-210 (2020).
  4. Busche, M. A., et al. Tau impairs neural circuits, dominating amyloid-β effects, in Alzheimer models in vivo. Nature Neuroscience. 22 (1), 57-64 (2019).
  5. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).
  6. Quan, X., Kato, D., Daria, V., Matoba, O., Wake, H. Holographic microscope and its biological application. Neuroscience Research. 179, 57-64 (2022).
  7. Adesnik, H., Abdeladim, L. Probing neural codes with two-photon holographic optogenetics. Nature Neuroscience. 24 (10), 1356-1366 (2021).
  8. Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
  9. Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
  10. Svoboda, K., Denk, W., Kleinfeld, D., Tank, D. W. In vivo dendritic calcium dynamics in neocortical pyramidal neurons. Nature. 385 (6612), 161-165 (1997).
  11. Carrillo-Reid, L., Han, S., Yang, W., Akrouh, A., Yuste, R. Controlling visually guided behavior by holographic recalling of cortical ensembles. Cell. 178 (2), 447-457 (2019).
  12. Marshel, J. H., et al. Cortical layer-specific critical dynamics triggering perception. Science. 365 (6453), (2019).
  13. Gill, J. V., et al. Precise holographic manipulation of olfactory circuits reveals coding features determining perceptual detection. Neuron. 108 (2), 382-393 (2020).
  14. Robinson, N. T. M., et al. Targeted activation of hippocampal place cells drives memory-guided spatial behavior. Cell. 183 (6), 1586-1599 (2020).
  15. Packer, A. M., Russell, L. E., Dalgleish, H. W., Häusser, M. Simultaneous all-optical manipulation and recording of neural circuit activity with cellular resolution in vivo. Nature Methods. 12 (2), 140-146 (2015).
  16. Mardinly, A. R., et al. Precise multimodal optical control of neural ensemble activity. Nature Neuroscience. 21 (6), 881-893 (2018).
  17. Yang, W., Carrillo-Reid, L., Bando, Y., Peterka, D. S., Yuste, R. Simultaneous two-photon imaging and two-photon optogenetics of cortical circuits in three dimensions. Elife. 7, 32671(2018).
  18. Forli, A., et al. Two-photon bidirectional control and imaging of neuronal excitability with high spatial resolution in vivo. Cell Reports. 22 (11), 3087-3098 (2018).
  19. Pégard, N. C., et al. Three-dimensional scanless holographic optogenetics with temporal focusing (3D-SHOT). Nature Communications. 8 (1), 1228(2017).
  20. Dal Maschio, M., Donovan, J. C., Helmbrecht, T. O., Baier, H. Linking neurons to network function and behavior by two-photon holographic optogenetics and volumetric imaging. Neuron. 94 (4), 774-789 (2017).
  21. Russell, L. E., et al. All-optical interrogation of neural circuits in behaving mice. Nature Protocols. 17 (7), 1579-1620 (2022).
  22. Oron, D., Papagiakoumou, E., Anselmi, F., Emiliani, V. Two-photon optogenetics. Progress in Brain Research. 196, 119-143 (2012).
  23. Hernandez, O., et al. Three-dimensional spatiotemporal focusing of holographic patterns. Nature Communications. 7, 11928(2016).
  24. Okada, T., et al. Pain induces stable, active microcircuits in the somatosensory cortex that provide a therapeutic target. Science Advances. 7 (12), 8261(2021).
  25. Prakash, R., et al. Two-photon optogenetic toolbox for fast inhibition, excitation and bistable modulation. Nature Methods. 9 (12), 1171-1179 (2012).
  26. Gonçalves, J. T., Anstey, J. E., Golshani, P., Portera-Cailliau, C. Circuit level defects in the developing neocortex of Fragile X mice. Nature Neuroscience. 16 (7), 903-909 (2013).
  27. Akiyoshi, R., et al. Microglia enhance synapse activity to promote local network synchronization. eNeuro. 5 (5), (2018).
  28. Haruwaka, K., et al. Dual microglia effects on blood brain barrier permeability induced by systemic inflammation. Nature Communications. 10 (1), 5816(2019).
  29. Kishi, K. E., et al. Structural basis for channel conduction in the pump-like channelrhodopsin ChRmine. Cell. 185 (4), 672-689 (2022).
  30. Deisseroth, K. Optogenetics: 10 years of microbial opsins in neuroscience. Nature Neuroscience. 18 (9), 1213-1225 (2015).
  31. Ko, H., et al. The emergence of functional microcircuits in visual cortex. Nature. 496 (7443), 96-100 (2013).
  32. Zong, W., et al. Large-scale two-photon calcium imaging in freely moving mice. Cell. 185 (7), 1240-1256 (2022).
  33. Villette, V., et al. ultrafast two-photon imaging of a high-gain voltage indicator in awake behaving mice. Cell. 179 (7), 1590-1608 (2019).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Two Photon MicroscopyHolographic MicroscopyNeural Activity ManipulationOptogenetic StimulationCalcium ImagingSpatial Light ModulatorFunctional ConnectivityGCaMP ImagingSomatosensory CortexNeuropsychiatric Disorders

Related Articles