Ten artykuł proponuje nową generację wieloparametrycznych platform analitycznych o zwiększonej przepustowości do charakterystyki podzbiorów pęcherzyków zewnątrzkomórkowych. Metoda opiera się na połączeniu multipleksowanych metod biodetekcji z analizami metrologicznymi i morfomechanicznymi za pomocą mikroskopii sił atomowych, w połączeniu ze spektroskopią Ramana, w celu kwalifikacji celów pęcherzykowych uwięzionych na biochipie mikromacierzy.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Multimodalna platforma analityczna na multipleksowanym chipie do obrazowania powierzchniowego rezonansu plazmonowego do analizy podzbiorów pęcherzyków zewnątrzkomórkowych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV) to pochodzące z błony, maleńkie pęcherzyki wytwarzane przez wszystkie komórki, o średnicy od 50 do kilkuset nanometrów i używane jako środek komunikacji międzykomórkowej. Stają się one obiecującymi narzędziami diagnostycznymi i terapeutycznymi dla różnych chorób. Istnieją dwa główne procesy biogenezy wykorzystywane przez komórki do produkcji EV różniących się wielkością, składem i zawartością. Ze względu na ich wysoką złożoność pod względem wielkości, składu i pochodzenia komórek, ich charakterystyka wymaga połączenia technik analitycznych. Projekt ten zakłada opracowanie nowej generacji wieloparametrycznych platform analitycznych o zwiększonej przepustowości do charakterystyki subpopulacji pojazdów elektrycznych. Aby osiągnąć ten cel, prace rozpoczynają się od stworzonej przez grupę platformy nanobioanalitycznej (NBA), która umożliwia oryginalne badanie pojazdów elektrycznych w oparciu o połączenie multipleksowanych metod biodetekcji z analizami metrologicznymi i morfomechanicznymi za pomocą mikroskopii sił atomowych (AFM) celów pęcherzykowych uwięzionych na biochipie mikromacierzy. Celem było zakończenie tego badania EV analizą fenotypową i molekularną za pomocą spektroskopii Ramana. Osiągnięcia te umożliwiają zaproponowanie multimodalnego i łatwego w użyciu rozwiązania analitycznego do dyskryminacji podzbiorów EV w płynach biologicznych o potencjale klinicznym
Wprowadzenie
Rosnące zainteresowanie badaniami nad EV w diagnostyce i terapeutyce1,2,3,4,5, w połączeniu z wyzwaniami, przed którymi stoi ta dziedzina, doprowadziło do opracowania i wdrożenia szerokiej gamy podejść i technik służących do ilościowego oznaczania lub charakteryzacji tych pęcherzyków. Najpowszechniej stosowanymi metodami identyfikacji EV są specyficzne dla białek immunoblotting i proteomika w celu potwierdzenia pochodzenia EV, transmisyjna mikroskopia elektronowa (TEM) w celu potwierdzenia ich struktury ora....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Przygotowanie podłoża złotego
UWAGA: Na chipach złotych przygotowano trzy rodzaje powierzchni: 1) powierzchnię niezmodyfikowaną, 2) chemicznie funkcjonalizowaną oraz 3) biofunkcjonalizowaną (ligandy szczepione na warstwie C11C16). Od tego momentu będą one określane odpowiednio jako „naked”, „C11C16” oraz „ligands”.
- Przygotowanie podłoża złota:
UWAGA: W ramach niniejszego protokołu złote bioczipy zostały wykonane wewnętrznie w pomieszczeniu czystym. Samodzielnie przygotowane bioczipy składały się z szkiełek przedmiotowych (SF11) z powłoką z chromu (2 nm C....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Wyznaczenie optymalnych warunków pH dla szczepienia ligandów
Różne ligandy wykorzystywane do przygotowania biochipów są testowane w zależności od pH oraz ich zdolności do oddziaływania z chemiczną warstwą tiolanową (Rysunek 3). Ligandy są rozcieńczane w buforze octanowym o różnych wartościach pH, a następnie wstrzykiwane na biochip funkcjonalizowany chemicznie warstwą C11C16. Roztwory są wstrzykiwane na powierzchnię w sposób losowy, a po każdym wstrzyknięciu ligandu poda.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Najnowsze metody identyfikacji EV, które są najczęściej stosowane, to immunoblotting specyficzny dla białka w celu potwierdzenia pochodzenia EV, TEM w celu potwierdzenia ich struktury oraz NTA w celu ilościowego określenia ich liczby i rozkładu wielkości w objętości próbki3. Niemniej jednak duże zainteresowanie EV w badaniach (bio)medycznych oraz ograniczenia istniejących narzędzi analitycznych skłoniły społeczność naukową do opracowania nowych metod charakterystyki, dyskryminacji i kwantyfikacji .......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Kelly Aubertin i Fabien Picot z głównego ośrodka IVETh (Paryż) są uznani za uczestników eksperymentów z obrazowaniem ramanowskim. Thierry Burnouf (Uniwersytet Medyczny w Tajpej, Tajwan) i Zuzana Krupova (z Helincourt, Francja) zostali uznani za dostarczycieli próbek EV pochodzących odpowiednio z próbek krwi płytkowej i mleka krowiego. Prace były wspierane przez region Bourgogne Franche-Comté oraz szkołę podyplomową EUR EIPHI (projekt NOWICJUSZ, 2021-2024). Część tych prac została wykonana przy użyciu platformy CLIPP oraz w pomieszczeniach czystych RENATECH w FEMTO-ENGINEERING, za co dziękujemy Rabah Zeggari.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Przeciwciało CD41a | Diaclone SAS (Francja) | 447528 | |
| CP920 | Microparticles GmbH, Niemcy | 448303 | |
| DXR3xi | Thermo Fisher Scientific | T1502 | |
| EDC | Sigma | A6272 | |
| Etanoloamina | Sigma | P5368-10PAK | |
| Evs pochodzące z koncentratów płytek krwi | Współpraca : Pr T. Burnouf (TMU, Tajpej) | S2889 | |
| Evs z mleka krowiego | Współpraca : Dr Z. Krupova (Excilone, Helincourt - Francja) | 3450 | |
| Aldehyd glutarowy | Sigma | 56845 | |
| Gwyddion | 853.223.020 | ||
| Napylanie magnetronowe | PLASSYS | SAB5300165 | |
| kwas merkapto-1-heksadekanowy | Sigma | G5882 | |
| Merkapto-1-undekanol | Sigma | O8001 | |
| Góry SPIP Te | Digital Surf | ||
| NanoWizard 3 Bioscience | Bruker-JPK | ||
| Glukozyd oktylowy (OG) | Przeciwciało przeciwko Sigmie | ||
| Ovalbumine | Bufor fosforanowy Sigma | ||
| Sól fizjologiczna (PBS) | Surowica | ||
| Rat (RSA) | Sigma | ||
| Bufor octanu sodu | Sigma | ||
| SPR-Biacore 3000 | GE Healthcare/ Cytiva life sciences | ||
| SPRi Biochip | Platforma | Biochipy zostały wyprodukowane we własnym zakresie w pomieszczeniu czystym, Besancon | |
| SPRi Plex II | Horiba Scientific | ||
| Sulfo-NHS | Sigma |
Bibliografia
- Silva, A. K. A., et al. Development of extracellular vesicle-based medicinal products: A position paper of the group "Extracellular Vesicle translatiOn to clinicaL perspectiVEs - EVOLVE France". Advanced Drug Delivery Reviews. 179, 114001(2021).
- Xunian, Z., Kalluri, R.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
