Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Multimodalna platforma analityczna na multipleksowanym chipie do obrazowania powierzchniowego rezonansu plazmonowego do analizy podzbiorów pęcherzyków zewnątrzkomórkowych

2.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64210

⸱

17 marca 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Université de Franche-Comté, CNRS UMR-6174, FEMTO-ST Institute, 2Lille Neuroscience & Cognition research centre, 3Institut Galien Paris-Saclay, CNRS UMR-8612 , Université Paris-Saclay, 4Interdisciplinary Lab Carnot Bourgogne LICB, CNRS UMR-6303, Université de Bourgogne Franche-Comté

W tym artykule

Podsumowanie

Ten artykuł proponuje nową generację wieloparametrycznych platform analitycznych o zwiększonej przepustowości do charakterystyki podzbiorów pęcherzyków zewnątrzkomórkowych. Metoda opiera się na połączeniu multipleksowanych metod biodetekcji z analizami metrologicznymi i morfomechanicznymi za pomocą mikroskopii sił atomowych, w połączeniu ze spektroskopią Ramana, w celu kwalifikacji celów pęcherzykowych uwięzionych na biochipie mikromacierzy.

Streszczenie

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV) to pochodzące z błony, maleńkie pęcherzyki wytwarzane przez wszystkie komórki, o średnicy od 50 do kilkuset nanometrów i używane jako środek komunikacji międzykomórkowej. Stają się one obiecującymi narzędziami diagnostycznymi i terapeutycznymi dla różnych chorób. Istnieją dwa główne procesy biogenezy wykorzystywane przez komórki do produkcji EV różniących się wielkością, składem i zawartością. Ze względu na ich wysoką złożoność pod względem wielkości, składu i pochodzenia komórek, ich charakterystyka wymaga połączenia technik analitycznych. Projekt ten zakłada opracowanie nowej generacji wieloparametrycznych platform analitycznych o zwiększonej przepustowości do charakterystyki subpopulacji pojazdów elektrycznych. Aby osiągnąć ten cel, prace rozpoczynają się od stworzonej przez grupę platformy nanobioanalitycznej (NBA), która umożliwia oryginalne badanie pojazdów elektrycznych w oparciu o połączenie multipleksowanych metod biodetekcji z analizami metrologicznymi i morfomechanicznymi za pomocą mikroskopii sił atomowych (AFM) celów pęcherzykowych uwięzionych na biochipie mikromacierzy. Celem było zakończenie tego badania EV analizą fenotypową i molekularną za pomocą spektroskopii Ramana. Osiągnięcia te umożliwiają zaproponowanie multimodalnego i łatwego w użyciu rozwiązania analitycznego do dyskryminacji podzbiorów EV w płynach biologicznych o potencjale klinicznym

Wprowadzenie

Rosnące zainteresowanie badaniami nad EV w diagnostyce i terapeutyce1,2,3,4,5, w połączeniu z wyzwaniami, przed którymi stoi ta dziedzina, doprowadziło do opracowania i wdrożenia szerokiej gamy podejść i technik służących do ilościowego oznaczania lub charakteryzacji tych pęcherzyków. Najpowszechniej stosowanymi metodami identyfikacji EV są specyficzne dla białek immunoblotting i proteomika w celu potwierdzenia pochodzenia EV, transmisyjna mikroskopia elektronowa (TEM) w celu potwierdzenia ich struktury oraz analiza śledzenia nanocząstek (NTA) w celu ilościowego oznaczenia ich liczby i rozkładu wielkości w objętości próbki.

Żadna z tych technik samodzielnie nie dostarcza jednak wszystkich informacji niezbędnych do charakteryzacji podtypów EV. Wrodzona heterogeniczność EV, wynikająca z różnorodności ich właściwości biochemicznych i fizycznych, utrudnia przeprowadzanie wiarygodnych i powtarzalnych analiz globalnych, szczególnie w przypadku EV zawartych w mieszaninie (próbce surowej). Dlatego też niezbędne są metody detekcji i charakteryzacji EV, zarówno indywidualne, jak i ogólne, które uzupełniałyby inne metody, będące szybszymi, lecz nieselektywnymi6.

Obrazowanie o wysokiej rozdzielczości za pomocą TEM (lub cryoTEM) lub AFM pozwala na określenie morfologii i metrologii EV z rozdzielczością nanometryczną7,8,9,10,11,12. Jednak głównym ograniczeniem stosowania mikroskopii elektronowej w przypadku obiektów biologicznych, takich jak EV, jest konieczność zastosowania próżni do przeprowadzenia badania, co wymaga utrwalenia i odwodnienia próbki. Taki sposób przygotowania utrudnia przełożenie obserwowanych struktur na morfologię EV w roztworze. Aby uniknąć odwodnienia próbki, do charakterystyki EV najodpowiedniejszą techniką jest cryoTEM13. Jest ona powszechnie stosowana do określania ultrastruktury EV. Immunoznakowanie pęcherzyków za pomocą biofunkcjonalizowanych nanocząstek złota umożliwia również identyfikację specyficznych subpopulacji EV i odróżnienie ich od innych cząsteczek obecnych w złożonej próbce biologicznej. Jednak ze względu na niewielką liczbę EV analizowanych za pomocą mikroskopii elektronowej, często trudno jest przeprowadzić charakterystykę reprezentatywną dla złożonej i heterogenicznej próbki.

Aby ukazać tę heterogeniczność rozmiarów, International Society for Extracellular Vesicles (ISEV) sugeruje analizę odpowiedniej liczby obrazów w szerokim polu, uzupełnionych o obrazy o mniejszej skali, aby z wysoką rozdzielczością uwidocznić pojedyncze EV14. AFM stanowi alternatywę dla metod optycznych i technik dyfrakcji elektronowej w badaniu EV. Technika ta wykorzystuje ostrą końcówkę zamocowaną na elastycznym wsporniku, która skanuje próbkę osadzoną na podłożu, linia po linii, i reguluje odległość między końcówką a obecnymi elementami poprzez pętlę sprzężenia zwrotnego. Umożliwia to charakteryzację topografii próbki oraz gromadzenie informacji morfomechanicznych15,16,17,18. EV mogą być skanowane za pomocą AFM po osadzeniu na atomowo płaskim podłożu lub po ich wychwyceniu na specyficznym podłożu funkcjonalizowanym przeciwciałami, peptydami lub aptamerami w celu charakterystyki poszczególnych subpopulacji18,19. Dzięki możliwości ilościowego określania i jednoczesnego badania struktury, biomechaniki oraz błonowej zawartości biomolekularnej EV w złożonych próbkach biologicznych bez konieczności wstępnego przygotowania, znakowania czy odwodnienia, AFM jest obecnie coraz częściej stosowany do precyzyjnej i multiparametrycznej charakterystyki EV w fizjologicznych warunkach temperatury i środowiska.

W niniejszej pracy zaproponowano metodologię wykorzystującą złoty biochip, który może zostać funkcjonalizowany (bio)chemicznie w formacie multipleksowym. Podłoże to stanowi fundament potężnej platformy analitycznej łączącej biodetekcję podzbiorów EV za pomocą rezonansu plazmonów powierzchniowych, a po adsorpcji, szczepieniu lub immunowychwyceniu EV na chipie, AFM umożliwia metrologiczną i morfomechaniczną charakterystykę tych pęcherzyków. W połączeniu z sygnaturą Ramana podzbiorów EV uchwyconych na chipie, platforma analityczna ta pozwala na kwalifikację EV obecnych w próbkach biologicznych w sposób bezetykietowy i bez konieczności przeprowadzania etapów przedanalitycznych. Niniejsza praca wykazuje, że połączenie zaawansowanych technik, wsparte rygorystyczną metodologią przygotowania podłoża i akwizycji danych, sprawia, że analiza EV jest pogłębiona, jednoznaczna i solidna.

Zasadą proponowanego podejścia jest przygotowanie złotego podłoża, adsorpcja/szczepienie lub wychwycenie podtypów EV, a następnie ich skanowanie za pomocą AFM w celu oszacowania rozmiaru i morfologii każdego podzbioru EV. Dodatkowo, zaadsorbowane EV są analizowane za pomocą spektroskopii Ramanowskiej. Podłoże to może w rzeczywistości reprezentować trzy rodzaje interfejsów o rosnącej złożoności: gołe, funkcjonalizowane chemicznie lub mikromacierze ligandowe. Przed opisaniem poszczególnych kroków protokołu, czytelników odsyłamy do schematycznej prezentacji podejścia opartego na nanobioanalitycznej platformie (NBA) w Rysunku 1, łączącej obrazowanie rezonansu plazmonowego powierzchni (SPRi), AFM i spektroskopię.

Schemat platformy NanoBioAnalytical z SPRi, AFM, biochipem; analiza EV za pomocą spektroskopii i profilowania.
Rysunek 1: Platforma NanoBioAnalytical. Podejście to łączy (A) obrazowanie powierzchniowego rezonansu plazmonowego, (B) mikroskopię sił atomowych oraz (nano)spektroskopię podczerwieni/Ramana, wszystkie zintegrowane na tym samym podłożu – multipleksowym chipie złotym. Skróty: NBA = platforma NanoBioAnalytical; SPRi = obrazowanie powierzchniowego rezonansu plazmonowego; AFM = mikroskopia sił atomowych; EV = pęcherzyki zewnątrzkomórkowe. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rdzeń złotego biochipu stanowi serce platformy, ponieważ wszystkie techniki charakterystyki bez użycia znaczników są przeprowadzane na tym biochipie. W zależności od potrzeb charakterystyki EV (zarówno całkowitej populacji EV, jak i ich podzbiorów) oraz ograniczeń i wymagań stosowanych metod, opracowano trzy rodzaje powierzchni złotego biochipu: „nagą”, chemicznie funkcjonalizowaną „C11/C16” lub biofunkcjonalizowaną ligandem, zwaną powierzchnią złotą „ligand”.

The goły biochip, nazywany „odsłoniętyumożliwia prostą adsorpcję pęcherzyków zewydzielniczych (EV) na złocie. Możliwe jest dobranie odpowiedniego buforu i przeprowadzenie tej adsorpcji w sposób pasywny (etapy inkubacji, a następnie płukania) lub monitorowanie jej w przepływie (w SPRi). Ponadto pasywną adsorpcję można przeprowadzić na całym chipie (jako makromacierz) lub zlokalizować w mikromacierzach przy użyciu mikropipetowego aplikatora. „Procedura w przepływie” pozwala badaczom na śledzenie kinetyki oraz poziomu adsorpcji EV. Podejście to, z wykorzystaniem gołego podłoża złota, stosuje się w sytuacjach, gdy interfejs warstwy chemicznej mógłby zakłócać metodę analityczną (np. w spektroskopii Ramana).

Chemicznie funkcjonalizowany biochip, nazywany „C11/C16”, służy do tworzenia gętego i stabilnego „dywanu” EV kowalencyjnie związanych z powierzchnią złota poprzez tworzenie pierwotnych wiązań amidowych z tiolami, gdy celem jest uzyskanie globalnego obrazu próbki EV. W tym przypadku złoto jest funkcjonalizowane mieszaniną tioli: merkapto-1-undekanolu (11-MUOH: „C11”) oraz kwasu merkapto-1-heksadekanowego (16-MHA: „C16”), a część tioli jest aktywowana chemicznie w celu ustanowienia wiązania kowalencyjnego z celami. Strategia ta może być realizowanay zarówno pasywnie (kroki inkubacji, a następnie płukania, albo w formie „macroarray”, albo w wielu mikrotablicach z użyciem mikrodozownika), jak i w warunkach przepływu (w SPRi), aby śledzić kinetykę i stopień szczepienia EV na powierzchni złota.

Kiedyś/Ten/Ta/To (proszę podać pełny tekst do przetłumaczenia) biochip biofunkcjonalizowany ligandem, nazywany "ligandyjest chemicznie aktywowany w celu kowalencyjnego szczepienia różnych ligandów (np. przeciwciał, receptorów), aby selektywnie wychwytywać (z powinowactwem) różne podgrupy EV współistniejące w próbce biologicznej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie podłoża złotego

UWAGA: Na chipach złotych przygotowano trzy rodzaje powierzchni: 1) powierzchnię niezmodyfikowaną, 2) chemicznie funkcjonalizowaną oraz 3) biofunkcjonalizowaną (ligandy szczepione na warstwie C11C16). Od tego momentu będą one określane odpowiednio jako „naked”, „C11C16” oraz „ligands”.

  1. Przygotowanie podłoża złota:
    UWAGA: W ramach niniejszego protokołu złote bioczipy zostały wykonane wewnętrznie w pomieszczeniu czystym. Samodzielnie przygotowane bioczipy składały się z szkiełek przedmiotowych (SF11) z powłoką z chromu (2 nm Cr) i złota (48 nm Au). Długość bioczipu wynosiła 28 mm, szerokość 12,5 mm, a grubość 0,5 mm.20.
    1. Zastosować rozpylanie magnetronowe DC15 do powlekania szkieł przedmiotowych metodą osadzania z fazy gazowej (PVD).
  2. Funkcjonalizacja chemiczna:
    1. Funkcjonalizować niezmodyfikowane płytki poprzez inkubację przez noc w mieszaninie merkapto-1-undekanolu (11-MUOH) w stosunku molowym 90%/10% C11) oraz kwas 16-merkaptoheksadekanowy (16-MHA: C16) w stężeniu 1 mM w bezwodnym etanolu, podczas mieszania i w temperaturze pokojowej.
      UWAGA: Ten etap pozwoli na utworzenie stabilnej, samoorganizującej się monowarstwy (SAM), która jest przydatna podczas szczepienia ligandów.
    2. Oczyścić biochip (delikatnie przemyć) absolutnym etanolem i wodą ultraczystą, wysuszyć w strumieniu azotu i przechowywać w warunkach pomieszczenia czystego.
    3. Aktywacja biochipu funkcjonalizowanego chemicznie:
      UWAGA: Od tego etapu eksperymenty muszą być przeprowadzane w laboratorium analitycznym.
      1. Oczyścić biochip wodą ultrapurystyczną poprzez delikatne przemywanie, a następnie wysuszyć go pod słabym strumieniem powietrza. Aby aktywować grupy karboksylowe C16, inkubować biochip w mieszaninie 200 mM etylo(dimetylaminopropylo)karbodiimidazolu/N-hydroksysukcynimidu (EDC) i 50 mmol/L N-hydroksy-sukcynimidem (Sulfo-NHS) przez co najmniej 30 min w ciemności w temperaturze pokojowej. Następnie należy przepłukać wodą przed przeprowadzeniem eksperymentów z szczepieniem.
  3. Przyszczepianie ligandów na funkcjonalizowanym biochipie:
    UWAGA: Immobilizację ligandów (lub pęcherzyków zewnątrzkomórkowych [EVs] w niektórych eksperymentach) na chipie można przeprowadzić albo pasywnie poza urządzeniem SPRi (inkubacja kropli na aktywowanym chipie), albo dynamicznie – w przepływie wewnątrz urządzenia SPRi. Stanowi to pęcherzyki zewnątrzkomórkowe- lub ligand-modyfikowane chipy. Rycina 2 przedstawia złoty biochip, mikropipetowy aplikator oraz biochip po naniesieniu 16 kropli ligandu o objętości 300 nL każda.
    1. Do szczepienia ligandów należy użyć cząsteczek takich jak przeciwciała (np. immunoglobuliny anty-CD41 [specyficzne dla EV pochodzących z natywnych płytek krwi, nazywanych N-PEV (pęcherzyki zewnątrzkomórkowe pochodzenia neuronalnego)], anty-CD61, anty-CD62P, anty-CD9 i anty-OVA (przeciwciało kontrolne przeciwko owalbumini) oraz Aneksynę V. Rozcieńczyć je w 200 µg/mL w roztworze kwasowym (od pH 4,5 do 6, w zależności od optymalnego pH dla aktywności lub funkcji ligandu).
      UWAGA: Optymalne pH dla szczepienia przeciwciał zostało określone wcześniej w eksperymentach z prekonicentracją przeprowadzonych na urządzeniu SPR w celu wyznaczenia optymalnego pH dla szczepienia ligandu (patrz Rycina 3). Ponieważ warunki szczepienia zmieniają się w zależności od stosowanych klonów przeciwciał, zaleca się ustalenie tych warunków przed przystąpieniem do eksperymentów SPRi.
    2. W celu przeprowadzenia procedury szczepienia, za pomocą spottera nanieś 300 nL roztworu EV/ligand.
      UWAGA: W obu dołkach, lewym i prawym, należy umieścić kawałek papieru zanurzony w wodzie, aby zapobiec odparowywaniu kropel. Krok ten jest istotny dla utrzymania EV/ligandów w optymalnych warunkach zapewniających ich stabilność i funkcjonalność.
    3. Po naniesieniu próbki (spottingu) biochip należy umieścić w kąpieli ultradźwiękowej (częstotliwość: 37 kHz, moc: 30%) przez 30 min inkubacji. Przemyć biochip od góry wodą ultraczystą i delikatnie umieścić go na pryzmacie o tym samym współczynniku załamania światła (RI) co biochip. Podczas ustawiania biochipu na szczycie pryzmatu dodać kroplę (~ 2.3 µL) oleju o tym samym współczynniku załamania (RI) co pryzmat, aby stworzyć jednolitą, cienką warstwę pomiędzy biochipem a pryzmatem.
      UWAGA: Krok ten zapewnia obecność jednorodnego ośrodka o tym samym współczynniku załamania światła (RI) na drodze optycznej. Na tym etapie ważne jest unikanie wprowadzania pęcherzyków powietrza do warstwy oleju, ponieważ zmieniłoby to właściwości optyczne na drodze światła i utrudniło dalszą analizę.

Układ złotej elektrody do analizy elektrochemicznej w ogniwie eksperymentalnym; wymiary elektrody 28x12,5 mm.
Rysunek 2Biochip i ręczny aplikator. Złoty biochip (po lewej), mikropipeta do nanoszenia próbek (w środku) oraz biochip po naniesieniu kropel liganda o objętości 300 nL każda (po prawej). Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

Sensogram SPR, wpływ pH na wiązanie białek, wykres biosensora optycznego, analiza sygnału w funkcji czasu.
Rycina 3: Testy prekonecentracji w celu wyznaczenia optymalnego pH dla szczepienia ligandów. Sensogram przedstawia poziom oddziaływania w funkcji czasu dla jednego liganda wstrzykiwanego losowo (przy różnych wartościach pH) w tym samym stężeniu przez 2 min na powierzchnię. OG to detergent, który pozwala na powrót linii bazowej między kolejnymi wstrzyknięciami. W tym przypadku sensogram wskazuje, że pH 6 umożliwiło największe szczepienie ligandów, z sygnałem SPRi wynoszącym 1091 RU. Skróty: OG = octyloglukozyd; RU = jednostka odpowiedzi (response unit). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

2. Obrazowanie powierzchniowego rezonansu plazmonowego

  1. Zamontuj biochip w systemie SPRi. Utrzymaj przepływ buforu PBS (buforu roboczego) na poziomie 50 µL/min.
    UWAGA: W przypadku pojawienia się pęcherzyków powietrza zwiększ przepływ do 500-1 000 µL/min i często wstrzykuj 40 mM oktyloglukozyd (OG), aby jak najszybciej je usunąć.
  2. Kondycjonowanie złotego biochipu w urządzeniu SPRi: Wybór kątów roboczych
    1. Kliknij menu rozwijane po lewej stronie oprogramowania, a następnie kliknij working directory (katalog roboczy), aby zdefiniować folder, w którym mają być zapisane dane eksperymentalne. Następnie kliknij Plasmon | Image acquisition (Plazmon | Akwizycja obrazu).
    2. Znajdź obraz (jak pokazano na Rysunku 4A), na którym widoczne są poszczególne plamy, i kliknij, aby wybrać ten obraz. Aby zdefiniować obszar zainteresowania (ROI), przedstawiony na Rysunku 4, kliknij albo automatic detection (automatyczna detekcja), albo manual definition (definicja ręczna) wewnątrz plam (Rysunek 4B) lub na chipie, aby odnieść się do konkretnej lokalizacji nawet bez plam (Rysunek 4C),.
    3. W przypadku stosowania biochipów multipleksowych wpisz nazwy rodzin ligandów, a następnie kliknij odpowiednie plamy.
      UWAGA: Rodzina ligandów odpowiada kilku plamom zfunkcjonalizowanym tym samym ligandem. Zazwyczaj chip zawiera co najmniej duplikaty, a często nawet triplikaty każdego ligandu.
    4. Kliknij finish species definition (zakończ definiowanie gatunków) i poczekaj na przejście do okna zawierającego uzyskane krzywe plazmonowe.
    5. Wybierz kąt roboczy. Przesuń czarną linię kursorem do optymalnego kąta roboczego i kliknij Move mirror to working angle (Przesuń lustro do kąta roboczego).
      UWAGA: Krzywa plazmonowa składa się z wartości zwierciadła (%) w funkcji kąta; oprogramowanie generuje drugą krzywą z wartością nachylenia (%) w funkcji kąta. Aby wybrać odpowiedni kąt roboczy, wybierz kąt o najwyższej wartości nachylenia.
      1. W przypadku etapu pasywacji (z użyciem albuminy) wykonywanego wewnątrz aparatu, wybierz kąt roboczy zapewniający optymalną czułość względem powierzchni, ustanawiając tym samym kontrolę jakości reaktywności powierzchni.
        UWAGA: Ten etap pasywacji jest istotny podczas przygotowania chipu do biodetekcji powinowactwa/wychwytu w celu zmniejszenia niespecyficznych oddziaływań między próbką a powierzchnią biochipu.
  3. Kliknij Kinetics (Kinetyka), aby rozpocząć monitorowanie kinetyczne w czasie rzeczywistym. Gdy oprogramowanie poprosi o zdefiniowanie kontroli negatywnej, wybierz na tym etapie no negative control (brak kontroli negatywnej) (pozwoli to na obserwację kinetyki na plamach kontroli negatywnej).
    1. Wstrzyknij albuminę surowicy szczurzej (RSA, 200 µg/mL, przygotowaną w buforze octanowym, pH 4,5) z przepływem 50 µL/min przez 4 min, aby spasywować powierzchnię wokół plam i ewentualnie wypełnić puste przestrzenie wewnątrz plam z ligandami.
      UWAGA: RSA jest wstrzykiwana w celu pokrycia części biochipu, która nie jest związana z żadnymi ligandami.
    2. Wstrzyknij etanolaminę (1 M) z przepływem 20 µL/min przez 10 min , aby zdezaktywować grupy karboksylowe wciąż obecne i reaktywne na powierzchni.
    3. Przepłucz biochip, wstrzykując 40 mM OG z przepływem 50 µL/min przez 4 min.
      UWAGA: Po etapie pasywacji kąt roboczy jest dostosowywany (jako nowe wyznaczenie linii bazowej przed wstrzyknięciem próbki), aby uzyskać najwyższą czułość na plamach będących przedmiotem zainteresowania.
  4. Wstrzykiwanie próbki:
    1. Ponownie zdefiniuj krzywe plazmonowe po pasywacji i tym razem wybierz kąt roboczy zgodnie z ligandem.
    2. W monitorowaniu kinetycznym zmniejsz przepływ do 20 µL/min i poczekaj, aż linia bazowa stanie się stabilna.
    3. Wstrzyknij próbkę o wybranym stężeniu (od 1 x 108 EVs/mL do 1 x 1010 EVs/mL w zależności od powinowactwa między EV a wszczepionymi ligandami) i kliknij manual injection (wstrzykiwanie ręczne) lub automatic injection (wstrzykiwanie automatyczne). W przypadku wstrzykiwania ręcznego po wstrzyknięciu 200 µL próbki kliknij stop the injection (zatrzymaj wstrzykiwanie). Ponieważ czas trwania wstrzykiwania wynosi zazwyczaj 10 min, zacznij śledzić kinetykę oddziaływania i zmierz zmianę zwierciadła, obliczając różnicę w zwierciadle między początkiem a końcem wstrzykiwania obserwowaną podczas monitorowania kinetycznego (Rysunek 5).
      UWAGA: Różne wstrzyknięte próbki są opisane w sekcji wyników reprezentatywnych.
  5. Po wstrzyknięciu próbki zastosuj jedno z dwóch poniższych podejść, aby zakończyć eksperyment SPRi:
    1. W podejściu unfixed/in-liquid (bez utrwalania/w cieczy) wyjmij biochip z aparatu SPRi, nanieś na niego kroplę cieczy i przejdź do dalszej charakterystyki AFM powierzchni w cieczy.
    2. W podejściu fixed (utrwalanie) wstrzyknij glutaraldehyd (0,5%) rozcieńczony w wodzie z przepływem 20 µL/min przez 10 min, aby utrwalić cząsteczki uchwycone na biochipie. Wstrzyknij wodę, aby wypłukać powierzchnię, wyjmij biochip, bardzo delikatnie przemyj go wodą destylowaną i wysusz na powietrzu w celu dalszej analizy pod AFM.

Analiza wzorców w obrazach mikroskopowych; porównanie danych na schemacie; rozkład komórek zaznaczony kolorami.
Rysunek 4: Obraz CCD SPRi biochipu. (A,B) Multipleksowy biochip po pasywacji albuminą. (A) Chip bez defektów; (B) niektóre defekty, które pojawiły się na chipie: fuzja plamek (i), słabe szczepienie (ii) lub kurz bądź „zanieczyszczenia” (iii). ROI, zaznaczone kolorami w plamkach (jeden kolor na rodzinę ligandów), wybrano tak, aby uniknąć tych „zanieczyszczeń”. W przypadku zlania się plamek, odnotowano to i albo je zignorowano, albo nazwano jako „mieszaninę ligandów 1 i 2”. (C) Goły chip złoty bez mikromacierzy do eksperymentu badającego adsorpcję EV na złocie. Niebieska strzałka wskazuje kierunek przepływu. Chip ten nie posiadał plamek, a ROI wybrano w celu rejestracji sygnału odblasku od linii 1 (L1, czerwone okręgi) do linii 4 (L4, fioletowe okręgi) podczas wstrzykiwania próbki. Pasek skali = 1 mm dla wszystkich trzech obrazów. Skróty: SPRi = obrazowanie rezonansu plazmonów powierzchniowych; CCD = urządzenie z ładunkiem sprzężonym; ROI = obszary zainteresowania; EV = pęcherzyki zewnątrzkomórkowe. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wykres przedstawiający zmianę sygnału i absorbancję w analizie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych w czasie.
Rysunek 5: Eksperymenty SPRi z wstrzykiwaniem EV na biochip. (A) Eksperyment wychwytywania na biochipie multipleksowym przedstawiający sygnały odblaskowe różnych ligandów. W tym przypadku stosunek sygnału do szumu dla różnych ligandów był bardzo dobry (zwłaszcza w miejscach z antiCD41), ponieważ odpowiedź kontroli negatywnej była pomijalna. (B) Eksperyment adsorpcji EV na niezmodyfikowanym biochipie. Sensorgram przedstawiający kondycjonowanie chipa dwukrotnym przepłukaniem buforem i czyszczeniem OG (1), wstrzyknięcie próbki EV (2) oraz sygnał odblaskowy po interakcji EV (3). Na tym biochipie nie zastosowano kontroli negatywnej, jednak sygnał odblaskowy (jego kinetyka, stabilność po wstrzyknięciu) był wysoki, co oznacza, że pęcherzyki EV były w stanie adsorbować się i pozostać stabilne na złotym chipie. Skróty: EV = pęcherzyk zewnątrzkomórkowy; OG = octyloglukozyd. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

3. Mikroskopia sił atomowych

  1. Użyj tryb kontaktowy do skanowania biochipu w powietrzu oraz tryb obrazowania ilościowego do skanowania biochipu w warunkach ciekłych.
  2. Wyrównaj biochip z górną krawędzią maski na szkiełku przedmiotowym (opracowanym w laboratorium), aby zidentyfikować położenie poszczególnych mikroplamek na biochipie (Rycina 6A).
    UWAGA: Maska zawiera oznaczenia punktów, które odpowiadają położeniu punktów ligandów zgodnie z użyciem urządzenia do nanoszenia (spottera). Maska ta składa się z szkiełka przedmiotowego, na którym dwa prostopadłe kliny umożliwiają umieszczenie chipa. Ponadto szkiełko przedmiotowe jest oznaczone 16 filcowymi kropkami odpowiadającymi lokalizacji punktów na chipie, co pozwala dzięki przezroczystości na zlokalizowanie punktów i zeskanowanie pożądanego obszaru.
  3. Pozycjonowanie końcówki:
    1. Użyj kamery CCD zamontowanej nad AFM, aby zlokalizować wspornik w odpowiednim miejscu przeznaczonym do skanowania. Aby przeprowadzić tę procedurę, użyj trójkątne wsporniki z 200 µm długość, 28 µm szerokośćoraz a stała sprężystości z 0,08 N/m.
  4. Ustaw wiązkę lasera na górnej powierzchni wspornika w pozycji zapewniającej optymalną odpowiedź w mechanizmie sterowania sprzężonego.
  5. Skanowanie:
    1. Po zablokowaniu i nawiązaniu kontaktu z powierzchnią biochipa, rozpocznij akwizycję AFM w tryb kontaktowy lub w tryb obrazowania ilościowego z trzech do pięciu dużych obszarów (zazwyczaj 10 × 10 µm²) na małe obszary (1 x 1 µm²).
      UWAGA: Schemat przedstawiający różne obszary, które mogą zostać przeskanowane, znajduje się w Rycina 6DNależy upewnić się, że charakterystyka AFM jest reprezentatywna dla całego obszaru o powierzchni 1 mm² i że przy dobrej rozdzielczości zwizualizowano wystarczającą liczbę EV w celu przeprowadzenia wiarygodnej analizy (należy policzyć i przeanalizować minimum 300 EV dla każdego wariantu), a następnie przeprowadzić pomiary metrologiczne i morfologiczne.
  6. Obróbka obrazu AFM:
    1. Przetwarzaj obrazy AFM za pomocą oprogramowania do przetwarzania danych JPK, zaczynając od wybrania kanał wysokości.
    2. Wybierz a dopasowanie wielomianowe należy odjąć od każdej linii, aby uzyskać wyprostowane linie skanowania.
    3. Wybierz próg wysokości na ziarnach złota w celu wyeliminowania chropowatości powierzchni. W odniesionym oprogramowaniu (patrz w Tabela materiałów), w module ekstrakcji ziaren należy oznaczyć ziarna, stosując wartość progu wysokości wynoszącą 8,5 nm. Po tym, jak ziarna zostaną przefiltrowane, the liczba ziaren pojawia się.
      UWAGA: Zazwyczaj chropowaty podłoże złote (RMS z3 nm) oraz obecność warstw chemicznych i ligandów wymagają próg należy ustawić na 8,5 nm.
    4. Aby wyekstrahować kilka właściwości oznakowanych ziaren, takich jak wysokość, objętośći średnicaotwórz obraz w wskazanym oprogramowaniu i wybierz przetwarzanie danych | Ziarna | Oznaczanie według progu.
    5. Wybierz ziarna filtra w funkcja z właściwościPo pojawieniu się nowego okna wybierz następujące parametry: Wartość = maksymalne z-max, Powierzchnia = powierzchnia rzutowana A0. Następnie należy wybrać kryteria A I B.
    6. Otwórz rozkład wielkości ziaren; w oknie, które się pojawi, wybierz wartość (maksymalnie), objętość (podstawa: zero), i granica (długość). Należy zapoznać się z wyświetloną tabelą (w formacie .txt), która zawiera trzy kolumny z wysokość, objętośći średnica wartości dla wszystkich ziaren wykrytych na obrazie przy ustalonym progu.
    7. Z wysokości, horaz średnicy, Doblicz promień krzywizny, Rc, każdej EV za pomocą równania (1)8a następnie obliczyć objętość, V, korzystając z równania (2):
      Równanie równowagi statycznej \( R_c = (h^2 + D^2/4)/2h \), wzór do analizy strukturalnej.    (1)
      Wzór na obliczanie objętości kaloty kulistej; równanie: V=πh²(3R-h)/3; schemat edukacyjny.    (2)
    8. Z V, oblicz średnicę efektywną, d eff, każdego EV (średnica sfery o tej samej objętości) korzystając z równania (3):
      Równanie średnicy efektywnej; wzór do obliczania wielkości cząstek w badaniach opartych na objętości.    (3) 
    9. Narysuj wykresy przedstawiające rozmiary (zmierzona wysokość, zmierzona średnica i obliczona średnica efektywna) pęcherzyków EV, gdzie każda zliczona cząstka jest reprezentowana przez kropkę.
      UWAGA: W ten sposób, po zakończeniu charakterystyki, platforma NBA umożliwia korelację sygnału biodetekcji, a następnie fenotypowania, z liczbą i wielkością podgrup EV.

Układ mikrofluidyczny, obraz mikroskopowy, analiza wzoru kropel, skala 1 mm i 500 µm dla badań precyzyjnych.
Rysunek 6: Charakterystyka biochipa za pomocą AFM. Po eksperymencie SPRi chip został albo unieruchomiony i wysuszony, albo utrzymany w cieczy w celu charakterystyki metodą AFM. (A) Obrobiona szklana płytka (z dwoma prostopadłymi klinami pozycjonującymi, oznaczonymi na zdjęciu literą „w”) przedstawiająca maskę dopasowaną do lokalizacji 16 mikrotablic biochipa. Dzięki ekspozycji na światło i przejrzystości, po zainstalowaniu do charakterystyki AFM, szklana płytka umożliwia umieszczenie końcówki AFM w pożądanym punkcie w celu jego scharakteryzowania. (B) Biochip zainstalowany na płytce „maskującej” pod kroplą buforu do skanowania w warunkach ciekłych. (C) Obraz SPRi 16 mikrotablic. (D) Jedna mikrotablica obrazowana za pomocą mikroskopii optycznej po immunowychwyceniu biofunkcjonalizowanych nanocząstek kalibracyjnych o średnicy 920 nm. Białe kwadraty wskazują próbkowanie różnych obszarów skanowanych przez AFM w każdym interesującym punkcie, aby zapewnić rzetelność charakterystyki AFM. Paski skali = (C) 1 mm, (D) 500 µm. Skróty: AFM = mikroskopia sił atomowych; SPRi = obrazowanie powierzchniowego rezonansu plazmonowego. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

4. Spektroskopia Ramana

UWAGA: W przypadku spektroskopii Ramanowskiej należy zastąpić szkiełko przedmiotowe używane jako podłoże szkiełkiem z CaF2, które wykazuje pomijalny sygnał Ramanowski.

  1. Warunki optyczne akwizycji:
    1. Ustaw następujące parametry dla mikroskopu do obrazowania Ramanowskiego: obiektyw mikroskopu: 50x; długość fali lasera: 532 nm; moc lasera: 10 mW; czas ekspozycji: 500 ms; liczba akumulacji: 140; zakres widmowy: od 450 cm−1 do 3,200 cm−1.
      UWAGA: Zastosowanie zbyt dużej mocy i/lub zbyt długiego czasu akwizycji może doprowadzić do uszkodzenia próbki, co objawia się niestabilnością widm w czasie. Należy rozpocząć od niskiej dawki energii i zwiększać ją, jeśli sygnał jest zbyt słaby. W celu zredukowania fluorescencji szkodliwej dla pomiarów Ramanowskich można zastosować lasery o większych długościach fal (633 nm, 785 nm). Należy jednak pamiętać, że intensywność sygnału maleje z czwartą potęgą długości fali, a dodatkowo należy uwzględnić czułość widmową kamery.
  2. Obrazowanie Ramanowskie:
    1. W pierwszej kolejności obserwuj widma na żywo przy zredukowanej liczbie akumulacji (10), aby znaleźć obszar z najlepszym stosunkiem sygnału do szumu.
      UWAGA: Silny sygnał w obszarze wysokich częstotliwości (2,800-3,000 cm−1) może ułatwić detekcję EV na powierzchni przy krótkich czasach ekspozycji, co wykazano wcześniej10.
    2. Po wybraniu ROI (obszaru zainteresowania), dobierz rozdzielczość przestrzenną zgodnie z czasem dostępnym na akwizycję.
      ​UWAGA: Rozdzielczość przestrzenna jest ograniczona przez limit dyfrakcyjny (~500 nm).
    3. Rozpocznij akwizycję mapowania Ramanowskiego.
  3. Preprocessing danych:
    1. Używając zintegrowanego środowiska programistycznego (IDE) języka Python (np. Spyder), otwórz plik zawierający widma.
    2. Odejmij linię bazową widm, aby skorygować interferencje wynikające z ewentualnej fluorescencji. Na przykład użyj funkcji „arpls” z pakietu „irfpy”23. Przetestuj różne wartości parametru „lam”, aby znaleźć taką, która zapewni najlepszą korekcję linii bazowej (zazwyczaj między 103 a 107).
    3. Znormalizuj widma, na przykład dzieląc wszystkie intensywności widma przez jego intensywność przy 2,900 cm−1 lub odejmując średnią z widma, a następnie dzieląc wynik przez jego odchylenie standardowe (normalizacja metodą „standard normal variate”).
      UWAGA: Ten krok jest niezbędny do porównania względnego składu molekularnego EV.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Wyznaczenie optymalnych warunków pH dla szczepienia ligandów
Różne ligandy wykorzystywane do przygotowania biochipów są testowane w zależności od pH oraz ich zdolności do oddziaływania z chemiczną warstwą tiolanową (Rysunek 3). Ligandy są rozcieńczane w buforze octanowym o różnych wartościach pH, a następnie wstrzykiwane na biochip funkcjonalizowany chemicznie warstwą C11C16. Roztwory są wstrzykiwane na powierzchnię w sposób losowy, a po każdym wstrzyknięciu ligandu poda...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Najnowsze metody identyfikacji EV, które są najczęściej stosowane, to immunoblotting specyficzny dla białka w celu potwierdzenia pochodzenia EV, TEM w celu potwierdzenia ich struktury oraz NTA w celu ilościowego określenia ich liczby i rozkładu wielkości w objętości próbki3. Niemniej jednak duże zainteresowanie EV w badaniach (bio)medycznych oraz ograniczenia istniejących narzędzi analitycznych skłoniły społeczność naukową do opracowania nowych metod charakterystyki, dyskryminacji i kwantyfikacji ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Kelly Aubertin i Fabien Picot z głównego ośrodka IVETh (Paryż) są uznani za uczestników eksperymentów z obrazowaniem ramanowskim. Thierry Burnouf (Uniwersytet Medyczny w Tajpej, Tajwan) i Zuzana Krupova (z Helincourt, Francja) zostali uznani za dostarczycieli próbek EV pochodzących odpowiednio z próbek krwi płytkowej i mleka krowiego. Prace były wspierane przez region Bourgogne Franche-Comté oraz szkołę podyplomową EUR EIPHI (projekt NOWICJUSZ, 2021-2024). Część tych prac została wykonana przy użyciu platformy CLIPP oraz w pomieszczeniach czystych RENATECH w FEMTO-ENGINEERING, za co dziękujemy Rabah Zeggari.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Przeciwciało CD41aDiaclone SAS (Francja)447528
CP920Microparticles GmbH, Niemcy448303
DXR3xi Thermo Fisher ScientificT1502
EDCSigmaA6272
EtanoloaminaSigmaP5368-10PAK
Evs pochodzące z koncentratów płytek krwiWspółpraca : Pr T. Burnouf (TMU, Tajpej)S2889
Evs z mleka krowiegoWspółpraca : Dr Z. Krupova (Excilone, Helincourt - Francja)3450
Aldehyd glutarowySigma56845
Gwyddion 853.223.020
Napylanie magnetronowePLASSYSSAB5300165
kwas merkapto-1-heksadekanowySigmaG5882
Merkapto-1-undekanol SigmaO8001
Góry SPIP TeDigital Surf
NanoWizard 3 Bioscience Bruker-JPK 
Glukozyd oktylowy (OG) Przeciwciało przeciwko Sigmie
OvalbumineBufor fosforanowy Sigma
Sól fizjologiczna (PBS)Surowica
Rat (RSA)Sigma
Bufor octanu sodu Sigma
SPR-Biacore 3000GE Healthcare/ Cytiva life sciences
SPRi BiochipPlatformaBiochipy zostały wyprodukowane we własnym zakresie w pomieszczeniu czystym, Besancon
SPRi Plex IIHoriba Scientific 
Sulfo-NHSSigma
albuminy Sigma technologiczna MIMENTO

Bibliografia

  1. Silva, A. K. A., et al. Development of extracellular vesicle-based medicinal products: A position paper of the group "Extracellular Vesicle translatiOn to clinicaL perspectiVEs - EVOLVE France". Advanced Drug Delivery Reviews. 179, 114001(2021).
  2. Xunian, Z., Kalluri, R. Biology and therapeutic potential of mesenchymal stem cell-derived exosomes. Cancer Science. 111 (9), 3100-3110 (2020).
  3. Hartjes, T. A., et al. Extracellular vesicle quantification and characterization: Common methods and emerging approaches. Bioengineering. 6 (1), 7(2019).
  4. Xing, Y., et al. Analysis of extracellular vesicles as emerging theranostic nanoplatforms. Coordination Chemistry Reviews. 424, 213506(2020).
  5. Wang, T., Xing, Y., Cheng, Z., Yu, F. Analysis of single extracellular vesicles for biomedical applications with especial emphasis on cancer investigations. Trends in Analytical Chemistry. 152, 116604(2022).
  6. Boireau, W., Elie-Caille, C. Extracellular vesicles: Definition, isolation and characterization. Medecine Sciences: M/S. 37 (12), 1092-1100 (2021).
  7. Brisson, A. R., et al. Extracellular vesicles from activated platelets: A semiquantitative cryo-electron microscopy and immuno-gold labeling study. Platelets. 28 (3), 263-271 (2017).
  8. Yuana, Y., et al. Atomic force microscopy: A novel approach to the detection of nanosized blood microparticles. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 8 (2), 315-323 (2010).
  9. Sebaihi, N., de Boeck, B., Yuana, Y., Nieuwland, R., Pétry, J. Dimensional characterization of extracellular vesicles using atomic force microscopy. Measurement Science and Technology. 28 (3), 034006(2017).
  10. Beekman, P., et al. Immuno-capture of extracellular vesicles for individual multi-modal characterization using AFM, SEM and Raman spectroscopy. Lab on a Chip. 19 (15), 2526-2536 (2019).
  11. Malenica, M., et al. Perspectives of microscopy methods for morphology characterisation of extracellular vesicles from human biofluids. Biomedicines. 9 (6), 603(2021).
  12. Verweij, F. J., et al. The power of imaging to understand extracellular vesicle biology in vivo. Nature Methods. 18 (9), 1013-1026 (2021).
  13. Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): A position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).
  14. Obeid, S., et al. NanoBioAnalytical characterization of extracellular vesicles in 75-nm nanofiltered human plasma for transfusion: A tool to improve transfusion safety. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 20, 101977(2019).
  15. Obeid, S., et al. Development of a NanoBioAnalytical platform for «on-chip» qualification and quantification of platelet-derived microparticles. Biosensors and Bioelectronics. 93, 250-259 (2017).
  16. Ridolfi, A., et al. AFM-based high-throughput nanomechanical screening of single extracellular vesicles. Analytical Chemistry. 92 (15), 10274-10282 (2020).
  17. Vorselen, D., et al. The fluid membrane determines mechanics of erythrocyte extracellular vesicles and is softened in hereditary spherocytosis. Nature Communications. 9 (1), 4960(2018).
  18. Hardij, J., et al. Characterisation of tissue factor bearing extracellular vesicles with AFM: Comparison of air-tapping-mode AFM and liquid Peak Force AFM. Journal of Extracellular Vesicles. 2, 21045(2013).
  19. Jorgensen, M., et al. Extracellular Vesicle (EV) Array: Microarray capturing of exosomes and other extracellular vesicles for multiplexed phenotyping. Journal of Extracellular Vesicles. 2, 20920(2013).
  20. Remy-Martin, F., et al. Surface plasmon resonance imaging in arrays coupled with mass spectrometry (SUPRA-MS): Proof of concept of on-chip characterization of a potential breast cancer marker in human plasma. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 404 (2), 423-432 (2012).
  21. Czamara, K., et al. Raman spectroscopy of lipids: A review. Journal of Raman Spectroscopy. 46 (1), 4-20 (2015).
  22. Penders, J., et al. Single particle automated Raman trapping analysis of breast cancer cell-derived extracellular vesicles as cancer biomarkers. ACS Nano. 15 (11), 18192-18205 (2021).
  23. Baek, S. J., Park, A., Ahn, Y. J., Choo, J. Baseline correction using asymmetrically reweighted penalized least squares smoothing. Analyst. 140 (1), 250-257 (2015).
  24. Daaboul, G. G., et al. Digital detection of exosomes by interferometric imaging. Scientific Reports. 6, 37246(2016).
  25. Ertsgaard, C. T., et al. Integrated nanogap platform for sub-volt dielectrophoretic trapping and real-time Raman imaging of biological nanoparticles. Nano Letters. 18 (9), 5946-5953 (2018).
  26. Maas, S. L., et al. Possibilities and limitations of current technologies for quantification of biological extracellular vesicles and synthetic mimics. Journal of Controlled Release. 200, 87-96 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowemultipleksowy biochipmikroskopia sił atomowychspektroskopia Ramanaanaliza podzbiorów pęcherzykówwłaściwości nanomechaniczneprzygotowanie biochipuśledzenie nanocząstekWestern blotting
Multimodalna platforma analityczna na multipleksowanym chipie do obrazowania powierzchniowego rezonansu plazmonowego do analizy podzbiorów pęcherzyków zewnątrzkomórkowych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.