Method Article

Multimodalna platforma analityczna na multipleksowanym chipie do obrazowania powierzchniowego rezonansu plazmonowego do analizy podzbiorów pęcherzyków zewnątrzkomórkowych

DOI:

10.3791/64210

⸱

March 17th, 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Université de Franche-Comté, CNRS UMR-6174, FEMTO-ST Institute, 2Lille Neuroscience & Cognition research centre, 3Institut Galien Paris-Saclay, CNRS UMR-8612 , Université Paris-Saclay, 4Interdisciplinary Lab Carnot Bourgogne LICB, CNRS UMR-6303, Université de Bourgogne Franche-Comté

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten artykuł proponuje nową generację wieloparametrycznych platform analitycznych o zwiększonej przepustowości do charakterystyki podzbiorów pęcherzyków zewnątrzkomórkowych. Metoda opiera się na połączeniu multipleksowanych metod biodetekcji z analizami metrologicznymi i morfomechanicznymi za pomocą mikroskopii sił atomowych, w połączeniu ze spektroskopią Ramana, w celu kwalifikacji celów pęcherzykowych uwięzionych na biochipie mikromacierzy.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV) to pochodzące z błony, maleńkie pęcherzyki wytwarzane przez wszystkie komórki, o średnicy od 50 do kilkuset nanometrów i używane jako środek komunikacji międzykomórkowej. Stają się one obiecującymi narzędziami diagnostycznymi i terapeutycznymi dla różnych chorób. Istnieją dwa główne procesy biogenezy wykorzystywane przez komórki do produkcji EV różniących się wielkością, składem i zawartością. Ze względu na ich wysoką złożoność pod względem wielkości, składu i pochodzenia komórek, ich charakterystyka wymaga połączenia technik analitycznych. Projekt ten zakłada opracowanie nowej generacji wieloparametrycznych platform analitycznych o zwiększonej przepustowości do charakterystyki subpopulacji pojazdów elektrycznych. Aby osiągnąć ten cel, prace rozpoczynają się od stworzonej przez grupę platformy nanobioanalitycznej (NBA), która umożliwia oryginalne badanie pojazdów elektrycznych w oparciu o połączenie multipleksowanych metod biodetekcji z analizami metrologicznymi i morfomechanicznymi za pomocą mikroskopii sił atomowych (AFM) celów pęcherzykowych uwięzionych na biochipie mikromacierzy. Celem było zakończenie tego badania EV analizą fenotypową i molekularną za pomocą spektroskopii Ramana. Osiągnięcia te umożliwiają zaproponowanie multimodalnego i łatwego w użyciu rozwiązania analitycznego do dyskryminacji podzbiorów EV w płynach biologicznych o potencjale klinicznym

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rosnące zainteresowanie badaniami EV w diagnostyce i terapii1,2,3,4,5, w połączeniu z wyzwaniami, przed którymi stoi ta dziedzina, zaowocowało opracowaniem i wdrożeniem szerokiej gamy podejść i technik do ilościowego określania lub charakteryzowania tych pęcherzyków. Najczęściej stosowanymi metodami identyfikacji EV są immunoblotting specyficzny dla białek i proteomika w celu potwierdzenia pochodzenia EV, transmisyjna mikroskopia elektronowa (TEM) w celu potwierdzenia ich struktury oraz analiza śledzenia nanocząstek (NTA) w celu ilościowego określenia ich liczby i rozkładu wielkości w objętości próbki.

Żadna z tych technik sama w sobie nie dostarcza jednak wszystkich informacji wymaganych do scharakteryzowania podzbiorów EV. Nieodłączna heterogeniczność pojazdów elektrycznych wynikająca z różnorodności ich właściwości biochemicznych i fizycznych utrudnia przeprowadzanie globalnych analiz, które są wiarygodne i odtwarzalne, zwłaszcza w przypadku pojazdów elektrycznych zawartych w mieszaninie (próbce surowej). W związku z tym w przypadku EV potrzebne są metody wykrywania i charakteryzowania, zarówno indywidualnie, jak i ogólnie, w celu uzupełnienia innych metod, które są szybsze, ale nie selektywne6.

Obrazowanie w wysokiej rozdzielczości za pomocą TEM (lub cryoTEM) lub AFM pozwala na określenie morfologii i metrologii EV z rozdzielczością nanometryczną7,8,9,10,11,12. Jednak głównym ograniczeniem stosowania mikroskopii elektronowej w przypadku obiektów biologicznych, takich jak EV, jest potrzeba próżni do przeprowadzenia badania, co wymaga utrwalenia i odwodnienia próbki. Takie przygotowanie utrudnia translację ze struktur obserwowanych na morfologię EV w roztworze. Aby uniknąć takiego odwodnienia próbki, technika cryoTEM jest najbardziej odpowiednia do charakteryzacji EV13. Jest szeroko stosowany do określania ultrastruktury pojazdów elektrycznych. Znakowanie immunologiczne pęcherzyków przez biofunkcjonalizowane nanocząstki złota umożliwia również identyfikację określonych subpopulacji EV i odróżnienie ich od innych cząstek obecnych w złożonej próbce biologicznej. Jednak ze względu na niewielką liczbę EV analizowanych za pomocą mikroskopii elektronicznej często trudno jest wykonać charakterystykę, która jest reprezentatywna dla złożonej i niejednorodnej próbki.

Aby ujawnić tę niejednorodność rozmiarów, Międzynarodowe Towarzystwo Pęcherzyków Zewnątrzkomórkowych (ISEV) sugeruje analizę wystarczającej liczby obrazów szerokokątnych, którym towarzyszą mniejsze obrazy, aby ujawnić poszczególne EV o wysokiej rozdzielczości14. AFM jest alternatywą dla podejść optycznych i technik dyfrakcji elektronicznej do badania EV. Technika ta wykorzystuje ostrą końcówkę przytrzymywaną przez elastyczny wspornik, który skanuje próbkę osadzoną na jednym nośniku, linia po linii, i dostosowuje odległość między końcówką a obecnymi elementami za pomocą pętli sprzężenia zwrotnego. Dzięki temu możliwe jest scharakteryzowanie topografii próbki i zebranie informacji morfomechanicznych15,16,17,18. EV mogą być skanowane przez AFM albo po osadzeniu na atomowo płaskim podłożu, albo po uchwyceniu na określonym podłożu funkcjonalizowanym przez przeciwciała, peptydy lub aptamery w celu scharakteryzowania różnych subpopulacji18,19. Ze względu na swoją zdolność do ilościowego określania i jednoczesnego sondowania struktury, biomechaniki i błoniastej zawartości biomolekularnej EV w złożonych próbkach biologicznych bez potrzeby wstępnej obróbki, znakowania lub odwadniania, AFM jest obecnie coraz częściej stosowany do charakteryzowania EV w precyzyjny i wieloparametryczny sposób w fizjologicznych warunkach temperatury i pożywki.

Ten artykuł proponuje metodologię wykorzystującą rdzeń złotego biochipa, który może być (bio)chemicznie funkcjonalizowany w formacie multipleksowanym. Substrat ten jest kamieniem węgielnym potężnej platformy analitycznej łączącej biodetekcję podzbiorów EV za pomocą powierzchniowego rezonansu plazmonowego, a po adsorpcji/szczepieniu lub immunowychwyceniu EV na chipie, AFM umożliwia metrologiczną i morfomechaniczną charakterystykę EV. W połączeniu z sygnaturą Ramanowską podzbiorów EV uchwyconych na chipie, ta platforma analityczna umożliwia kwalifikację EV obecnych w próbkach biologicznych w sposób bezznacznikowy i bez konieczności przeprowadzania etapów przedanalitycznych. Niniejszy artykuł pokazuje, że połączenie potężnych technik, wspomaganych przez wysoce rygorystyczną metodologię w zakresie przygotowania podłoża i pozyskiwania danych, sprawia, że analiza EV jest głęboka, ostateczna i solidna.

Zasada proponowanego podejścia polega na przygotowaniu złotego podłoża, adsorpcji/szczepieniu lub wychwytywaniu podtypów EV, a następnie skanowaniu ich przez AFM w celu oszacowania wielkości i morfologii każdego podzbioru EV. Dodatkowo te zaadsorbowane EV są analizowane za pomocą spektroskopii Ramana. Substrat ten może rzeczywiście prezentować trzy typy interfejsów o rosnącej złożoności: nagie, chemicznie funkcjonalizowane lub mikromacierze ligandowe. Przed opisaniem różnych etapów protokołu, czytelnicy są odsyłani do schematycznej prezentacji podejścia platformy nanobioanalitycznej (NBA) w Rysunek 1, łączący obrazowanie powierzchniowego rezonansu plazmonowego (SPRi), AFM i spektroskopię.

figure-introduction-1
Rysunek 1: Platforma NanoBioAnalytics. Podejście to łączy (A) obrazowanie powierzchniowego rezonansu plazmonowego, (B) mikroskopię sił atomowych oraz (nano)spektroskopię w podczerwieni/Ramanowskiej, wszystkie zaangażowane na tym samym podłożu - multipleksowanym złotym chipie. Skróty: NBA = platforma NanoBioAnalytics; SPRi = obrazowanie powierzchniowego rezonansu plazmonowego; AFM = mikroskopia sił atomowych; EV = pęcherzyk zewnątrzkomórkowy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rdzeń złotego biochipa stanowi serce platformy, ponieważ wszystkie techniki charakterystyki bez etykiet są przeprowadzane na tym biochipie. Zgodnie z potrzebami charakterystyki EV (zarówno globalne/całkowite EV, jak i podzbiory EV) oraz ograniczeniami/wymaganiami zastosowanych metod, opracowano trzy rodzaje powierzchni biochipów złota: albo "nagie", chemicznie funkcjonalizowane "C11 / C16", albo biofunkcjonalizowane ligandem, zwane "ligandową" powierzchnią złota.

Nagi biochip, zwany "goły", umożliwia prostą adsorpcję EV na złocie. Możliwe jest wybranie zastosowanego buforu i realizacja tej adsorpcji w sposób pasywny (etapy inkubacji, a następnie płukania) lub w celu monitorowania go pod przepływem (w SPRi). Co więcej, ta pasywna adsorpcja może być realizowana zarówno na całym chipie (jako makromacierz), jak i zlokalizowana w mikromacierzach za pomocą skanera mikropipet. "Procedura podprzepływowa" pozwala badaczom śledzić kinetykę i poziom adsorpcji EV. Takie podejście do nagiego podłoża ze złota przyjmuje się, gdy granica faz warstwy chemicznej może zakłócać metodę analityczną (np. w przypadku spektroskopii Ramanowskiej).

Chemicznie funkcjonalizowany biochip, zwany "C11/C16", jest używany do tworzenia gęstego i wytrzymałego "dywanu" EV kowalencyjnie związanych na powierzchni złota poprzez tworzenie pierwotnych wiązań amidowych z tiolatenami, podczas gdy celem jest uzyskanie globalnego widoku próbki EV. Rzeczywiście, w tym przypadku złoto jest funkcjonalizowane przez mieszaninę tiolanów merkapto-1-undekanolu (11-MUOH: "C11") i kwasu merkapto-1-heksadekanowego (16-MHA: "C16"), a frakcja tiolanów jest aktywowana chemicznie w celu ustanowienia kowalencyjnego wiązania z celami. Ponownie, strategia ta może być realizowana albo pasywnie (etapy inkubacji, a następnie płukania, albo w "makroukładzie", albo w wielu mikromacierzach za pomocą obserwatora mikropipet), albo przy natężeniu przepływu (w SPRi), aby śledzić kinetykę i poziom szczepienia EV na powierzchni złota.

Biofunkcjonalizowany biochip, zwany "ligandami", jest chemicznie aktywowany do kowalencyjnego przeszczepiania różnych ligandów (np. przeciwciał, receptorów) w celu selektywnego wychwytywania (z powinowactwem) różnych podzbiorów EV, które współistnieją w próbce biologicznej.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie złotego podłoża

UWAGA: Na wiórach złota produkowane są trzy rodzaje powierzchni: 1) naga powierzchnia, 2) chemicznie funkcjonalizowana i 3) biofunkcjonalizowana (ligandy szczepione na warstwie C11C16). Od tego momentu będą one nazywane odpowiednio "nagimi", "C11C16" i "ligandami".

  1. Przygotowanie podłoża złotego:
    UWAGA: W przypadku tego protokołu złote biochipy zostały wyprodukowane we własnym zakresie w pomieszczeniu czystym. Domowe biochipy składały się ze szkiełek podstawowych (SF11) pokrytych powłoką z chromu (2 nm Cr) i złota (48 nm Au). Długość biochipa wynosiła 28 mm, szerokość 12,5 mm, a grubość 0,5 mm20.
    1. Użyj rozpylania magnetronowego prądu stałego15, aby pokryć szkiełka metodą fizycznego osadzania z fazy gazowej (PVD).
  2. Funkcjonalizacja chemiczna:
    1. Funkcjonalizuj nagie wióry, inkubując je przez noc w mieszaninie 90%/10% molowej merkapto-1-undekanolu (11-MUOH: C11) i kwasu merkapto-1-heksadekanowego (16-MHA: C16) w temperaturze 1 mM w absolutnym etanolu, pod mieszaniem i w temperaturze pokojowej><. UWAGA: Ten krok utworzy stabilną, samoorganizującą się monowarstwę (SAM), która jest przydatna w szczepieniu ligandów.
    2. Wyczyść biochip (delikatnie umyj) absolutnym etanolem i ultraczystą wodą, wysusz go w azocie i przechowuj w warunkach czystych.
    3. Aktywacja chemicznie funkcjonalizowanego biochipa:
      UWAGA: Począwszy od tego etapu, eksperymenty muszą być przeprowadzane w laboratorium analitycznym.
      1. Wyczyść biochip ultraczystą wodą, delikatnie go myjąc, a następnie wysusz chip pod delikatnym przepływem powietrza. Aby aktywować grupy karboksylowe C16, należy inkubować biochip w mieszaninie 200 mM etylowego (dimetyloaminopropylo)karbokodiimidu/N-hydroksysukcynimidu (EDC) i 50 mmol/l N-hydroksysukcynimidu (Sulfo-NHS) przez co najmniej 30 minut w ciemności w temperaturze pokojowej. Następnie spłucz wodą przed eksperymentami ze szczepieniem.
  3. Szczepienie ligandów na funkcjonalizowanym biochipie:
    UWAGA: Immobilizacja ligandów (lub EV w niektórych eksperymentach) na chipie może być wykonana pasywnie poza instrumentem SPRi (inkubacja kropli na aktywowanym chipie) lub dynamicznie pod przepływem do instrumentu SPRi. Są to chipy zmodyfikowane EV lub ligandem. Rysunek 2 przedstawia złoty biochip, skaner mikropipet i biochip po wykryciu z 16 kropelkami ligandu o mocy 300 nL każda.
    1. Do szczepienia ligandów należy użyć cząsteczek, takich jak przeciwciała (np. immunoglobuliny-antyCD41 [specyficzne dla EV pochodzących z natywnych płytek krwi, zwanych N-PEVs], antyCD61, antyCD62P, antyCD9 i antyOVA [przeciwciało kontrolne przeciwko albuminie jaja kurzego]) i Aneksyna V. Rozcieńczyć je w 200 μg/ml w kwaśnym roztworze (od pH 4,5 do 6 w zależności od optymalnego pH dla aktywności lub funkcji liganda).
      UWAGA: Optymalne pH dla szczepienia przeciwciał zostało wcześniej określone za pomocą eksperymentów z wstępnym zatężaniem przeprowadzonych na przyrządzie SPR w celu określenia optymalnego pH do szczepienia ligandów (patrz Rysunek 3). Ponieważ warunki szczepienia zmieniają się z klonami stosowanych przeciwciał, zaleca się określenie tych warunków przed przystąpieniem do eksperymentów SPRi.
    2. Do procedury szczepienia dodaj 300 nl roztworu EVs/ligand za pomocą spotter.
      UWAGA: Kawałek papieru zanurzony w wodzie należy przechowywać zarówno w lewej, jak i prawej studzience, aby uniknąć parowania kropel. Ten krok jest ważny, aby utrzymać EV/ligandy w optymalnym stanie pod względem stabilności i funkcjonalności.
    3. Po wykryciu należy umieścić biochip w kąpieli sonicznej (częstotliwość: 37 kHz, moc: 30%) przez 30 minut inkubacji. Umyj biochip od góry ultraczystą wodą i delikatnie umieść go na pryzmacie o tym samym współczynniku załamania światła (RI) co biochip. Regulując biochip na górze pryzmatu, dodaj kroplę (~ 2,3 μL) oleju o tym samym RI co pryzmat, aby utworzyć jednolitą, cienką warstwę między biochipem a pryzmatem.
      UWAGA: Ten krok zapewnia ciągły ośrodek o tym samym RI w torze optycznym. Ważne jest, aby na tym etapie unikać wprowadzania pęcherzyków powietrza do warstwy oleju, ponieważ zmieni to właściwości optyczne ścieżki i utrudni dalszą analizę.

figure-protocol-1
Rysunek 2: Biochip i ręczny spotter. Złoty biochip (po lewej), skaner mikropipet (w środku) i biochip po nakrapieniu kropelkami liganda o wielkości 300 nL każda (po prawej). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-protocol-2
Rysunek 3: Testy wstępnego stężenia w celu określenia optymalnego pH do szczepienia ligandów. Sensorgram przedstawia poziom oddziaływania w funkcji czasu dla jednego liganda wstrzykniętego losowo (przy różnych wartościach pH) w tym samym stężeniu przez 2 minuty na powierzchnię. OG to detergent, który pozwala na odzyskanie linii bazowej między każdym wstrzyknięciem. W tym przypadku sensorgram wskazuje, że pH 6 pozwoliło na najwięcej szczepień ligandów, z sygnałem SPRi 1091 RU. Skróty: OG = glukozyd oktylu; RU = jednostka odpowiedzi. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

2. Obrazowanie powierzchniowego rezonansu plazmonowego

  1. Zamontuj biochip w systemie SPRi. Utrzymuj natężenie przepływu bufora PBS (bufora bieżącego) na poziomie 50 μl/min.
    UWAGA: Jeśli są jakieś pęcherzyki, zwiększ natężenie przepływu do 500-1,000 μl/min i często wstrzykiwaj 40 mM glukozydu oktylu (OG), aby je usunąć tak szybko, jak to możliwe.
  2. Kondycjonowanie złotego biochipa w instrumencie SPRi: Wybór kątów pracy
    1. Kliknij menu rozwijane po lewej stronie oprogramowania i kliknij katalog roboczy, aby zdefiniować folder, w którym mają zostać zapisane dane eksperymentalne. Następnie kliknij Plasmon | Akwizycja obrazu.
    2. Znajdź obraz (jak pokazano w Rysunek 4A), na którym widoczne są różne miejsca, i kliknij, aby wybrać ten obraz. Aby zdefiniować obszar zainteresowania (ROI), zgodnie z Rysunek 4, kliknij automatyczne wykrywanie lub ręczną definicję wewnątrz punktów (Rysunek 4B) lub na chipie, aby odnieść się do określonej lokalizacji, nawet bez plam (Rysunek 4C),.
    3. Gdy używane są biochipy multipleksowane, wpisz nazwę rodzin ligandów, a następnie kliknij odpowiednie miejsca.
      UWAGA: Rodzina ligandów odpowiada kilku plamkom funkcjonalizowanym tym samym ligandem. Zazwyczaj chip przedstawia co najmniej duplikaty, a nawet często potrójne egzemplarze każdego liganda.
    4. Kliknij na zakończ definicję gatunku i poczekaj na przekierowanie do okna zawierającego uzyskane krzywe plazmonowe.
    5. Wybierz kąt roboczy. Przeciągnij czarną linię kursorem do optymalnego kąta roboczego i kliknij Przesuń lustro do kąta roboczego.
      UWAGA: Krzywa plazmonowa składa się z wartości współczynnika odbicia (%) w funkcji kąta, a oprogramowanie podaje inną krzywą z wartością nachylenia (%) w funkcji kąta. Aby wybrać dobry kąt roboczy, wybierz kąt o najwyższej wartości nachylenia.
      1. W przypadku etapu pasywacji (ze względu na albuminę) wykonywanego wewnątrz aparatu, należy wybrać kąt roboczy, aby uzyskać optymalną czułość w stosunku do powierzchni, ustanawiając w ten sposób kontrolę jakości reaktywności powierzchni.
        UWAGA: Ten etap pasywacji jest ważny, gdy chip jest przygotowany do biodetekcji powinowactwa/wychwytywania w celu zmniejszenia niespecyficznych interakcji między próbką a powierzchnią biochipa.
  3. Kliknij Kinetyka, aby rozpocząć monitorowanie kinetyczne w czasie rzeczywistym. Gdy oprogramowanie poprosi użytkownika o zdefiniowanie kontroli ujemnej, należy w tym momencie nie wybierać kontroli ujemnej (ponieważ pozwoli to na obserwację kinetyki na miejscach kontroli ujemnej).
    1. Wstrzyknąć albuminę surowicy szczura (RSA, 200 μg/ml, przygotowaną w buforze octanowym o pH 4,5) w dawce 50 μl/min przez 4 minuty, aby pasywować powierzchnię wokół plamek i ewentualnie wypełnić puste przestrzenie wewnątrz plamek liganda.
      UWAGA: RSA jest wstrzykiwany w celu pokrycia biochipa, który nie jest związany z żadnymi ligandami.
    2. Wstrzykiwać etanoloaminę (1 M) w ilości 20 μl/min przez 10 minut w celu dezaktywacji grup karboksylowych nadal obecnych i reaktywnych na powierzchni.
    3. Umyj biochip, wstrzykując 40 mM OG przy 50 μL/min przez 4 min.
      UWAGA: Po etapie pasywacji kąt roboczy jest dostosowywany (jako nowe wyznaczenie linii bazowej przed wstrzyknięciem próbki) tak, aby był najbardziej czuły w miejscach zainteresowania.
  4. Wstrzyknięcie próbki:
    1. Przedefiniuj krzywe plazmonu po pasywacji i tym razem wybierz kąt roboczy zgodnie z ligandem.
    2. W przypadku monitorowania kinetycznego należy zmniejszyć natężenie przepływu do 20 μl/min i poczekać, aż linia bazowa się ustabilizuje.
    3. Wstrzyknąć próbkę w wybranym stężeniu (od 1 x 108 EVs/ml do 1 x10 10 EVs/ml w zależności od powinowactwa między EVs a przeszczepionymi ligandami) i kliknąć na wstrzyknięcie ręczne lub automatyczne wstrzyknięcie. W przypadku iniekcji ręcznej, po wstrzyknięciu 200 μL próbki, należy kliknąć przycisk Zatrzymaj wstrzykiwanie. Ponieważ czas trwania wstrzyknięcia wynosi zwykle 10 minut, zacznij śledzić kinetykę interakcji i zmierz zmianę współczynnika odbicia, obliczając różnicę w współczynniku odbicia między początkiem a końcem iniekcji obserwowaną podczas monitorowania kinetycznego (Rysunek 5).
      UWAGA: Różne próbki, które zostały wstrzyknięte, są opisane w sekcji dotyczącej reprezentatywnych wyników.
  5. Po wstrzyknięciu próbki postępuj zgodnie z jednym z tych dwóch podejść, aby zakończyć eksperyment SPRi:
    1. W podejściu nieutrwalonym/w cieczy wyjmij biochip z aparatu SPRi, dodaj do niego kroplę cieczy i przystąp do dalszej charakterystyki AFM powierzchni w cieczy.
    2. W podejściu ustalonym wstrzyknąć aldehyd glutarowy (0,5%) rozcieńczony w wodzie o stężeniu 20 μl/min przez 10 minut, aby utrwalić cząsteczki wychwycone na biochipie. Wstrzyknąć wodę, aby spłukać powierzchnię, wyjąć biochip, bardzo delikatnie umyć go wodą destylowaną i wysuszyć na powietrzu w celu dalszej analizy w AFM.

figure-protocol-3
Rysunek 4: Obraz biochipa SPRi CCD. (A,B) Multipleksowany biochip po pasywacji albuminy. (A) Chip bez wartości domyślnej; (B) niektóre defekty, które pojawiły się na chipie: zrost plam (i), słabe szczepienie (ii) lub kurz lub "zanieczyszczenia" (iii). Zwroty akcji, w kolorze plam (jeden kolor na rodzinę ligandów), zostały wybrane, aby uniknąć tych "zanieczyszczeń". Kiedy plamy się łączyły, były one odnotowywane i albo ignorowane, albo nazywane "mieszaniną ligandów 1 i 2". (C) Nienaruszony złoty chip bez mikroukładów do eksperymentu badającego adsorpcję EV na złocie. Niebieska strzałka wskazuje kierunek przepływu. Chip ten nie prezentował plamek, a ROI zostały wybrane do rejestracji sygnału odbicia od linii 1 (L1, czerwone kółka) do linii 4 (L4, fioletowe kółka) podczas wstrzykiwania próbki. Podziałka liniowa = 1 mm dla wszystkich trzech obrazów. Skróty: SPRi = obrazowanie powierzchniowego rezonansu plazmonowego; CCD = urządzenie sprzężone z ładunkiem; ROI = regiony zainteresowania; EVs = pęcherzyki zewnątrzkomórkowe. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-protocol-4
Rysunek 5: Eksperymenty SPRi z wstrzykiwaniem EV do biochipa. (A) Eksperyment przechwytywania na multipleksowanym biochipie pokazujący sygnały odbicia różnych ligandów. W tym przypadku stosunek sygnału do szumu dla różnych ligandów był bardzo dobry (a zwłaszcza w miejscach antyCD41), ponieważ odpowiedź kontroli negatywnej była znikoma. (B) Eksperyment adsorpcyjny EV na nieosłoniętym biochipie. Sensorgram przedstawiający kondycjonowanie chipa za pomocą dwóch płukań bufora i czyszczenia OG (1), z wstrzyknięciem próbki EV (2) oraz sygnałem odbicia po interakcji EV (3). Na tym biochipie nie było kontroli negatywnej, ale sygnał odbicia (jego kinetyka, stabilność po wstrzyknięciu) był wysoki, co oznacza, że te EV były w stanie adsorbować się i pozostać stabilne na złotym chipie. Skróty: EV = pęcherzyk zewnątrzkomórkowy; OG = glukozyd oktylu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

3. Mikroskopia sił atomowych

  1. Użyj trybu kontaktowego, aby zeskanować biochip w powietrzu i trybu obrazowania ilościowego, aby zeskanować biochip w stanie ciekłym.
  2. Wyrównaj biochip na górze maski na szkiełku podstawowym (opracowanym w laboratorium), aby określić położenie odpowiednich mikroplamek na biochipie (Rysunek 6A).
    UWAGA: Maska zawiera oznaczenia plamek, które odpowiadają położeniu plamek ligandów w zależności od użytego obserwatora. Maska ta składa się ze szklanego szkiełka, na którym znajdują się dwa prostopadłe kliny umożliwiające umieszczenie chipa. Co więcej, szkiełko jest oznaczone 16 filcowymi kropkami odpowiadającymi lokalizacji plamki na chipie, co pozwala na przezroczystość zlokalizowania plamek i zeskanowanie żądanego obszaru.
  3. Umiejscowienie końcówki:
    1. Użyj kamery CCD na górze AFM, aby zlokalizować wspornik we właściwym miejscu, które należy zeskanować. Aby postępować zgodnie z tym protokołem, należy użyć trójkątnych wsporników o długości 200 μm, szerokości 28 μm i stałej sprężystości 0,08 N/m.
  4. Ustaw laser na górze wspornika w pozycji, która zapewnia optymalną reakcję w mechanizmie sterowania sprzężeniem zwrotnym.
  5. Skanowanie:
    1. Po załączeniu i kontakcie z powierzchnią biochipa rozpocznij akwizycję AFM w trybie kontaktowym lub w trybie obrazowania ilościowego od trzech do pięciu dużych obszarów (zwykle 10 × 10 μm²) do małych obszarów (1 x 1 μm²).
      UWAGA: Reprezentacja różnych obszarów, które można zeskanować, jest pokazana w Rysunek 6D. Upewnij się, że charakterystyka AFM jest reprezentatywna dla całej plamki mm² i że wystarczająca liczba EV jest wizualizowana w dobrej rozdzielczości dla solidnej analizy (co najmniej 300 EV policzonych i przeanalizowanych dla każdego stanu), a następnie wykonaj pomiary metrologiczne i morfologiczne.
  6. Leczenie obrazem AFM:
    1. Traktuj obrazy AFM za pomocą oprogramowania do przetwarzania danych JPK, wybierając najpierw kanał wysokości.
    2. Wybierz pasowanie wielomianowe, które ma zostać odjęte od każdej linii, aby uzyskać wyprostowane linie skanowania.
    3. Wybierz próg wysokości na ziarnach złota, aby wyeliminować chropowatość powierzchni. W przywołanym oprogramowaniu (patrz tabela materiałów) w module ekstrakcji ziarna oznaczyć ziarna za pomocą wartości progowej wysokości wynoszącej 8,5 nm. Po przefiltrowaniu ziaren pojawia się liczba ziaren.
      UWAGA: Zazwyczaj szorstkie złote podłoże (RMS ~3 nm) oraz obecność warstw chemicznych i ligandów wymagają ustawienia progu na 8,5 nm.
    4. Aby wyodrębnić kilka właściwości oznaczonych ziaren, takich jak wysokość, objętość i średnica, otwórz obraz w oprogramowaniu, do którego się odwołuje, i wybierz opcję Leczenie danych | Ziarna | Oznacz według progu.
    5. Wybierz ziarna filtru w funkcji właściwości. Gdy pojawi się nowe okno, wybierz następujące parametry: Wartość = maksimum z-max, Powierzchnia = rzutowana powierzchnia A0. Następnie wybierz kryteria A i B.
    6. Otwórz rozkład ziarna; w wyświetlonym oknie wybierz wartość (maksimum), objętość (podstawa: zero) i granicę (długość). Zwróć uwagę na wyświetloną tabelę (w formacie .txt), która przedstawia trzy kolumny z wartościami wysokości, objętości i średnicy dla wszystkich ziaren wykrytych przy ustawionym progu na obraz.
    7. Na podstawie wysokości, h i średnicy, D, oblicz promień krzywizny, Rc, każdego EV za pomocą równania (1)8, a następnie oblicz objętość, V, używając równania (2):
      figure-protocol-5 (1)
      figure-protocol-6 (2)
    8. Z V oblicz efektywną średnicę, d eff, każdego EV (średnicę kuli o tej samej objętości) za pomocą równania (3):
      figure-protocol-7 (3)
    9. Wykreśl wykresy przedstawiające rozmiary (zmierzona wysokość, zmierzona średnica i obliczona średnica efektywna) EV, przy czym każda zliczona cząstka jest reprezentowana przez kropkę.
      UWAGA: Tak więc, na końcu charakterystyki, platforma NBA umożliwia korelację sygnału biodetekcji, a następnie fenotypowania, z liczbami i rozmiarami podzbiorów EV.

figure-protocol-8
Rysunek 6: Charakterystyka biochipa przez AFM. Po eksperymencie SPRi chip został albo utrwalony i wysuszony, albo utrzymany w cieczy w celu scharakteryzowania AFM. (A) Szkiełko szkiełkowe obrabiane maszynowo (z dwoma prostopadłymi klinami pozycjonującymi, oznaczonymi literą "w" na rysunku) przedstawiające dopasowanie maski z lokalizacją 16 mikroukładów biochipów. Dzięki ekspozycji na światło i przezroczystości, po zainstalowaniu do charakteryzacji AFM, szklane szkiełko umożliwia umieszczenie końcówki AFM w żądanym miejscu w celu jej scharakteryzowania. (B) Biochip zainstalowany na szkiełku "maskującym" i pod kroplą buforu do skanowania w warunkach płynnych. (C) Obraz SPRi 16 mikromacierzy. (D) Jedna mikromatryca zobrazowana za pomocą mikroskopii optycznej po wychwyceniu immunologicznym biofunkcjonalizowanych nanocząstek kalibracyjnych o średnicy 920 nm. Białe kwadraty wskazują pobieranie próbek z różnych obszarów skanowanych przez AFM w każdym interesującym miejscu, aby charakterystyka AFM była solidna. Podziałka = (C) 1 mm, (D) 500 μm. Skróty: AFM = mikroskopia sił atomowych; SPRi = obrazowanie powierzchniowego rezonansu plazmonowego. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

4. Spektroskopia Ramana

UWAGA: Do spektroskopii Ramanowskiej, zastąp szkiełko używane jako podłoże szkiełkiem CaF2, które ma znikomą sygnaturę Ramana.

  1. Warunki optyczne akwizycji:
    1. Ustaw następujące warunki dla mikroskopu do obrazowania ramanowskiego: obiektyw mikroskopu: 50x; długość fali lasera: 532 nm; moc lasera: 10 mW; czas naświetlania: 500 ms; liczba akumulacji: 140; zakres spektralny: od 450 cm−1 do 3.200 cm−1,
      UWAGA: Użycie zbyt dużej mocy i/lub zbyt długi czas pobierania może prowadzić do uszkodzenia próbki, o czym z czasem świadczą niestabilne widma. Zacznij od małej ilości energii i zwiększaj ją, jeśli sygnał jest zbyt słaby. Można stosować wyższe długości fal laserowych (633 nm, 785 nm) w celu zmniejszenia fluorescencji szkodliwej dla pomiarów Ramana. Jednak intensywność zmniejsza się wraz z czwartą potęgą długości fali i należy wziąć pod uwagę czułość spektralną kamery.
  2. Obrazowanie ramanowskie:
    1. Najpierw obserwuj widma na żywo ze zmniejszoną liczbą akumulacji (10), aby znaleźć obszar o najlepszym stosunku sygnału do szumu.
      UWAGA: Silny sygnał w zakresie wysokich częstotliwości (2,800-3,000 cm−1) może ułatwić wykrywanie EV na powierzchni przy niskich czasach ekspozycji, jak pokazano wcześniej10.
    2. Po wybraniu ROI wybierz rozdzielczość przestrzenną zgodnie z czasem dostępnym na akwizycję.
      UWAGA: Rozdzielczość przestrzenna jest ograniczona limitem dyfrakcji (~500 nm).
    3. Rozpocznij pobieranie mapowania Ramana.
  3. Wstępne przetwarzanie danych:
    1. Korzystając ze zintegrowanego środowiska programistycznego (IDE) języka Python (np. Spyder), otwórz plik zawierający widma.
    2. Odejmij linię bazową widm, aby skorygować zakłócenia z możliwej fluorescencji. Na przykład użyj funkcji "arpls" z pakietu "irfpy"23. Przetestuj różne wartości parametru "lam", aby znaleźć tę, która daje najlepszą korektę linii bazowej (zwykle między 10,3 i 10,7).
    3. Normalizuj widma, na przykład, dzieląc wszystkie natężenia widma przez jego natężenie na 2900 cm−1 lub odejmując średnią widma, a następnie dzieląc je przez odchylenie standardowe (normalizacja "normalizacja normalnej normalności").
      UWAGA: Ten krok jest niezbędny do porównania względnego składu molekularnego pojazdów elektrycznych.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Określenie optymalnych warunków pH do szczepienia ligandów
Różne ligandy używane do przygotowania biochipów są testowane w funkcji pH i ich zdolności do interakcji z warstwą chemiczną tiolatu (Rysunek 3). Ligandy rozcieńcza się w buforze octanowym o różnych wartościach pH i wstrzykuje na biochip chemicznie funkcjonalizowany warstwą C11C16. Roztwory są wstrzykiwane losowo na powierzchnię, a detergent (OG o sile 40 mM) jest wstrzykiwany po każdym wstrzyknięciu liganda w celu odzyska...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Najnowsze metody identyfikacji EV, które są najczęściej stosowane, to immunoblotting specyficzny dla białka w celu potwierdzenia pochodzenia EV, TEM w celu potwierdzenia ich struktury oraz NTA w celu ilościowego określenia ich liczby i rozkładu wielkości w objętości próbki3. Niemniej jednak duże zainteresowanie EV w badaniach (bio)medycznych oraz ograniczenia istniejących narzędzi analitycznych skłoniły społeczność naukową do opracowania nowych metod charakterystyki, dyskryminacji i kwantyfikacji ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kelly Aubertin i Fabien Picot z głównego ośrodka IVETh (Paryż) są uznani za uczestników eksperymentów z obrazowaniem ramanowskim. Thierry Burnouf (Uniwersytet Medyczny w Tajpej, Tajwan) i Zuzana Krupova (z Helincourt, Francja) zostali uznani za dostarczycieli próbek EV pochodzących odpowiednio z próbek krwi płytkowej i mleka krowiego. Prace były wspierane przez region Bourgogne Franche-Comté oraz szkołę podyplomową EUR EIPHI (projekt NOWICJUSZ, 2021-2024). Część tych prac została wykonana przy użyciu platformy CLIPP oraz w pomieszczeniach czystych RENATECH w FEMTO-ENGINEERING, za co dziękujemy Rabah Zeggari.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Przeciwciało CD41aDiaclone SAS (Francja)447528
CP920Microparticles GmbH, Niemcy448303
DXR3xi Thermo Fisher ScientificT1502
EDCSigmaA6272
EtanoloaminaSigmaP5368-10PAK
Evs pochodzące z koncentratów płytek krwiWspółpraca : Pr T. Burnouf (TMU, Tajpej)S2889
Evs z mleka krowiegoWspółpraca : Dr Z. Krupova (Excilone, Helincourt - Francja)3450
Aldehyd glutarowySigma56845
Gwyddion 853.223.020
Napylanie magnetronowePLASSYSSAB5300165
kwas merkapto-1-heksadekanowySigmaG5882
Merkapto-1-undekanol SigmaO8001
Góry SPIP TeDigital Surf
NanoWizard 3 Bioscience Bruker-JPK 
Glukozyd oktylowy (OG) Przeciwciało przeciwko Sigmie
OvalbumineBufor fosforanowy Sigma
Sól fizjologiczna (PBS)Surowica
Rat (RSA)Sigma
Bufor octanu sodu Sigma
SPR-Biacore 3000GE Healthcare/ Cytiva life sciences
SPRi BiochipPlatformaBiochipy zostały wyprodukowane we własnym zakresie w pomieszczeniu czystym, Besancon
SPRi Plex IIHoriba Scientific 
Sulfo-NHSSigma
albuminy Sigma technologiczna MIMENTO

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Silva, A. K. A., et al. Development of extracellular vesicle-based medicinal products: A position paper of the group "Extracellular Vesicle translatiOn to clinicaL perspectiVEs - EVOLVE France". Advanced Drug Delivery Reviews. 179, 114001(2021).
  2. Xunian, Z., Kalluri, R. Biology and therapeutic potential of mesenchymal stem cell-derived exosomes. Cancer Science. 111 (9), 3100-3110 (2020).
  3. Hartjes, T. A., et al. Extracellular vesicle quantification and characterization: Common methods and emerging approaches. Bioengineering. 6 (1), 7(2019).
  4. Xing, Y., et al. Analysis of extracellular vesicles as emerging theranostic nanoplatforms. Coordination Chemistry Reviews. 424, 213506(2020).
  5. Wang, T., Xing, Y., Cheng, Z., Yu, F. Analysis of single extracellular vesicles for biomedical applications with especial emphasis on cancer investigations. Trends in Analytical Chemistry. 152, 116604(2022).
  6. Boireau, W., Elie-Caille, C. Extracellular vesicles: Definition, isolation and characterization. Medecine Sciences: M/S. 37 (12), 1092-1100 (2021).
  7. Brisson, A. R., et al. Extracellular vesicles from activated platelets: A semiquantitative cryo-electron microscopy and immuno-gold labeling study. Platelets. 28 (3), 263-271 (2017).
  8. Yuana, Y., et al. Atomic force microscopy: A novel approach to the detection of nanosized blood microparticles. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 8 (2), 315-323 (2010).
  9. Sebaihi, N., de Boeck, B., Yuana, Y., Nieuwland, R., Pétry, J. Dimensional characterization of extracellular vesicles using atomic force microscopy. Measurement Science and Technology. 28 (3), 034006(2017).
  10. Beekman, P., et al. Immuno-capture of extracellular vesicles for individual multi-modal characterization using AFM, SEM and Raman spectroscopy. Lab on a Chip. 19 (15), 2526-2536 (2019).
  11. Malenica, M., et al. Perspectives of microscopy methods for morphology characterisation of extracellular vesicles from human biofluids. Biomedicines. 9 (6), 603(2021).
  12. Verweij, F. J., et al. The power of imaging to understand extracellular vesicle biology in vivo. Nature Methods. 18 (9), 1013-1026 (2021).
  13. Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): A position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).
  14. Obeid, S., et al. NanoBioAnalytical characterization of extracellular vesicles in 75-nm nanofiltered human plasma for transfusion: A tool to improve transfusion safety. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 20, 101977(2019).
  15. Obeid, S., et al. Development of a NanoBioAnalytical platform for «on-chip» qualification and quantification of platelet-derived microparticles. Biosensors and Bioelectronics. 93, 250-259 (2017).
  16. Ridolfi, A., et al. AFM-based high-throughput nanomechanical screening of single extracellular vesicles. Analytical Chemistry. 92 (15), 10274-10282 (2020).
  17. Vorselen, D., et al. The fluid membrane determines mechanics of erythrocyte extracellular vesicles and is softened in hereditary spherocytosis. Nature Communications. 9 (1), 4960(2018).
  18. Hardij, J., et al. Characterisation of tissue factor bearing extracellular vesicles with AFM: Comparison of air-tapping-mode AFM and liquid Peak Force AFM. Journal of Extracellular Vesicles. 2, 21045(2013).
  19. Jorgensen, M., et al. Extracellular Vesicle (EV) Array: Microarray capturing of exosomes and other extracellular vesicles for multiplexed phenotyping. Journal of Extracellular Vesicles. 2, 20920(2013).
  20. Remy-Martin, F., et al. Surface plasmon resonance imaging in arrays coupled with mass spectrometry (SUPRA-MS): Proof of concept of on-chip characterization of a potential breast cancer marker in human plasma. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 404 (2), 423-432 (2012).
  21. Czamara, K., et al. Raman spectroscopy of lipids: A review. Journal of Raman Spectroscopy. 46 (1), 4-20 (2015).
  22. Penders, J., et al. Single particle automated Raman trapping analysis of breast cancer cell-derived extracellular vesicles as cancer biomarkers. ACS Nano. 15 (11), 18192-18205 (2021).
  23. Baek, S. J., Park, A., Ahn, Y. J., Choo, J. Baseline correction using asymmetrically reweighted penalized least squares smoothing. Analyst. 140 (1), 250-257 (2015).
  24. Daaboul, G. G., et al. Digital detection of exosomes by interferometric imaging. Scientific Reports. 6, 37246(2016).
  25. Ertsgaard, C. T., et al. Integrated nanogap platform for sub-volt dielectrophoretic trapping and real-time Raman imaging of biological nanoparticles. Nano Letters. 18 (9), 5946-5953 (2018).
  26. Maas, S. L., et al. Possibilities and limitations of current technologies for quantification of biological extracellular vesicles and synthetic mimics. Journal of Controlled Release. 200, 87-96 (2015).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Extracellular VesiclesSurface Plasmon ResonanceMultiplexed BiochipAtomic Force MicroscopyRaman SpectroscopyVesicle Subset AnalysisNanomechanical PropertiesBiochip PreparationNanoparticle TrackingWestern Blotting

Related Articles