Artykuł metodologiczny

Platforma szczepionkowa nanocząsteczkowa typu "plug-and-display" oparta na pęcherzykach błony zewnętrznej wykazujących domenę wiążącą receptor SARS-CoV-2

DOI:

10.3791/64213

⸱

25 lipca 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1National Engineering Research Center of Immunological Products, Department of Microbiology and Biochemical Pharmacy, College of Pharmacy, Third Military Medical University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obecny protokół opisuje bioinżynierię pęcherzyków błony zewnętrznej jako platformę szczepionki typu "Plug-and-Display", obejmującą produkcję, oczyszczanie, biokoniugację i charakterystykę.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biomimetyczne nanocząstki uzyskane z bakterii lub wirusów wzbudziły duże zainteresowanie badaniami i rozwojem szczepionek. Pęcherzyki błony zewnętrznej (OMV) są wydzielane głównie przez bakterie Gram-ujemne podczas średniego wzrostu, o średnicy nano i aktywności samoadiuwantowej, które mogą być idealne do podawania szczepionek. OMV funkcjonują jako wieloaspektowy system dostarczania białek, kwasów nukleinowych i małych cząsteczek. Aby w pełni wykorzystać biologiczne cechy OMV, bioinżynieryjne OMV pochodzące z Escherichia coli wykorzystano jako nośnik i domenę wiążącą receptor SARS-CoV-2 (RBD) jako antygen w celu skonstruowania platformy szczepionkowej "Plug-and-Display". Domeny SpyCatcher (SC) i SpyTag (ST) w Streptococcus pyogenes zastosowano do sprzężonych OMV i RBD. Gen cytolizyny A (ClyA) uległ translacji z genem SC jako białko fuzyjne po transfekcji plazmidu, pozostawiając reaktywne miejsce na powierzchni OMV. Po zmieszaniu RBD-ST w konwencjonalnym systemie buforowym przez noc, powstało kowalencyjne wiązanie między OMV a RBD. W ten sposób uzyskano szczepionkę OMV z wielowalentnym wyświetlaczem. Zastępując je różnymi antygenami, platforma szczepionek OMV może skutecznie wyświetlać różnorodne heterogeniczne antygeny, co potencjalnie szybko zapobiega epidemiom chorób zakaźnych. Protokół ten opisuje precyzyjną metodę konstruowania platformy szczepionki OMV, w tym produkcję, oczyszczanie, biokoniugację i charakterystykę.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jako potencjalna platforma szczepionkowa, pęcherzyki błony zewnętrznej (OMV) przyciągają coraz więcej uwagi w ostatnich latach1,2. OMV, wydzielane głównie naturalnie przez bakterie Gram-ujemne3, to sferyczne nanocząsteczki zbudowane z dwuwarstwy lipidowej, zwykle o wielkości 20-300 nm4. OMV zawierają różne rodzicielskie składniki bakteryjne, w tym antygeny bakteryjne i wzorce molekularne związane z patogenami (PAMP), które służą jako stałe wzmacniacze odporności5. Korzystając z ich unikalnych składników, naturalnej struktury pęcherzyków i doskonałych miejsc modyfikacji inżynierii genetycznej, OMV zostały opracowane do użytku w wielu dziedzinach biomedycznych, w tym w szczepionkach bakteryjnych6, adiuwantach7, lekach do immunoterapii nowotworów8, wektorach dostarczania leków9 i klejach antybakteryjnych10.

Pandemia SARS-CoV-2, która rozprzestrzenia się na całym świecie od 2020 roku, zebrała ogromne żniwo w globalnym społeczeństwie. Domena wiążąca receptor (RBD) w białku kolca (białko S) może wiązać się z ludzkim enzymem konwertującym angiotensynę 2 (ACE2), który następnie pośredniczy w wejściu wirusa do komórki11,12,13. W związku z tym RBD wydaje się być głównym celem dla odkrycia szczepionki14,15,16. Jednak monomeryczny RBD jest słabo immunogenny, a jego mała masa cząsteczkowa utrudnia rozpoznanie go układowi odpornościowemu, dlatego często wymagane są adiuwanty17.

W celu zwiększenia immunogenności RBD, skonstruowano OMV wykazujące wielowartościowe RBD. Istniejące badania wykorzystujące OMV do wyświetlania RBD zwykle łączą RBD z OMV w celu uzyskania ekspresji w bakteriach18. Jednak RBD jest białkiem pochodzącym z wirusa, a ekspresja prokariotyczna prawdopodobnie wpływa na jego aktywność. Aby rozwiązać ten problem, system SpyTag (ST)/SpyCatcher (SC), pochodzący od Streptococcus pyogenes, został użyty do utworzenia kowalencyjnego izopeptydu z OMV i RBD w konwencjonalnym systemie buforowym19. Domena SC była wyrażana przez cytolizynę A (ClyA) jako białko fuzyjne przez bioinżynieryjną Escherichia coli, a ST była wyrażana przez RBD za pośrednictwem HEK293F komórkowego systemu ekspresji. OMV-SC i RBD-ST mieszano i inkubowano przez noc. Po oczyszczeniu za pomocą ultrawirowania lub chromatografii wykluczającej (SEC) OMV-RBD otrzymano.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Budowa plazmidu

  1. Wstaw sekwencję SpyCatcher kodującą DNA (plik uzupełniający 1) do opornego na ampicylinę plazmidu pThioHisA-ClyA (patrz tabela materiałów) między miejscami BamH I i Sal I, aby skonstruować plazmid pThioHisA ClyA-SC zgodnie z wcześniej opublikowanym raportem20.
  2. Zmonopolizuj zsyntetyzowany gen fuzyjny SpyTag-RBD-Histag (plik uzupełniający 1) do plazmidu pcDNA3.1 (patrz tabela materiałów) między miejscami BamH I i EcoR I, aby skonstruować plazmid pcDNA3.1 RBD-ST zgodnie z wcześniej opublikowanym raportem19.

2. Przygotowanie OMV-SC

  1. Wykonaj transformację ClyA-SC, wykonując poniższe czynności.
    1. Dodać 5 μl roztworu plazmidu pThioHisA ClyA-SC (50 ng/μL) do 50 μl kompetentnego szczepu BL21, delikatnie przedmuchać i ostudzić na lodzie przez 30 minut.
    2. Umieścić roztwór na 90 s w łaźni wodnej o temperaturze 42 °C, a następnie natychmiast umieścić zmieszany roztwór na lodzie na 3 minuty.
    3. Dodać 500 μl pożywki LB do zawiesiny bakteryjnej i po wymieszaniu hodować przy 220 obr./min w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
    4. Całą przemianę należy umieścić na płytce agarowej LB zawierającej ampicylinę (100 μg/ml, patrz tabela materiałów) i hodować przez noc w temperaturze 37 °C.
      UWAGA: W kolejnych eksperymentach ampicylina była utrzymywana w tym samym stężeniu w pożywce. Jeśli nie, może to spowodować utratę plazmidów w bakteriach.
  2. W przypadku produkcji OMV-SC wykonaj poniższe czynności.
    1. Wyizolować pojedynczą kolonię z płytki (etap 2.1.4) do 20 ml pożywki LB (odpornej na ampicylinę) i hodować przez noc przy prędkości 220 obr./min w temperaturze 37 °C.
    2. Zaszczepić roztwór bakteryjny (od kroku 2.2.1.) do 2 litrów pożywki, hodować przy 220 obr./min, 37 °C przez 5 godzin, aż do logarytmicznego etapu wzrostu (OD600 nm wynosi od 0,6 do 0,8).
    3. Gdy OD przy 600 nm roztworu bakteryjnego osiągnie 0,6-0,8, dodać beta-D-tiogalaktopiranozyd izopropylu (IPTG, patrz tabela materiałów), aby końcowe stężenie roztworu bakteryjnego wynosiło 0,5 mM, a następnie hodować przez noc przy 220 obr./min w temperaturze 25 °C.
  3. Wykonaj oczyszczanie OMV-SC.
    1. Odwirować roztwór bakteryjny o sile 7 000 x g w temperaturze 4 °C przez 30 minut.
    2. Przefiltrować supernatant za pomocą filtra membranowego 0,22 μm, a następnie zagęścić go za pomocą membrany ultrafiltracyjnej 100 kD lub kolumny z pustych włókien (patrz tabela materiałów).
    3. Przefiltrować koncentrat przez filtr membranowy 0,22 μm, następnie odwirować go przy 150 000 x g w temperaturze 4 °C przez 2 godziny za pomocą ultrawirówki (patrz tabela materiałów) i wyrzucić supernatant za pomocą pipety.
    4. Zawiesić wytrącanie za pomocą PBS i przechowywać je w temperaturze -80 °C. Roztwór może utrzymać długotrwałą stabilność w temperaturze -80 °C.

3. Przygotowanie RBD-ST

  1. Wykonaj transfekcję RBD-ST, wykonując poniższe czynności.
    1. Wybierz odpowiedni eukariotyczny system ekspresji (np. HEK293F) i hoduj komórki przez noc w temperaturze 130 obr./min w temperaturze 37 °C po wyzdrowieniu.
    2. Dodać 20 μl roztworu komórek HEK293F do automatycznego licznika komórek (patrz tabela materiałów), zarejestrować liczbę komórek, dostosować stężenie do 1 x 106 komórek/ml, a następnie hodować komórki przy 130 obr./min w temperaturze 37 °C przez 4 godziny.
    3. Przefiltrować plazmid RBD-ST przez filtr membranowy 0,22 μm i dodać 300 μg plazmidów do pożywki do hodowli komórkowej (patrz tabela materiałów), aż ostateczna objętość wyniesie 10 ml; wstrząsać przez 10 s.
    4. Podgrzać PEI (1 mg/ml, patrz tabela materiałów) do 65 °C w łaźni wodnej, zmieszać 0,7 ml PEI z 9,3 ml pożywki do hodowli komórkowych i wstrząsać z przerwami przez 10 s.
      UWAGA: Nie potrząsaj energicznie roztworem. W przeciwnym razie powstałe pęcherzyki mogą wpłynąć na wydajność transfekcji.
    5. Dodać roztwór plazmidu do roztworu PEI, wstrząsać mieszaniną z przerwami przez 10 s i inkubować ją w temperaturze 37 °C przez 15 minut.
    6. Dodać mieszaninę do 280 ml pożywki do hodowli komórkowych i hodować ją z prędkością 130 obr./min w temperaturze 37 °C przez 5 dni.
  2. Wykonaj oczyszczanie RBD-ST.
    1. Odwirować komórki w temperaturze 6 000 x g w temperaturze 25 °C przez 20 minut i użyć pipety do zebrania supernatantu.
    2. Napełnij kolumnę 2 ml agarozy Ni-NTA (patrz Tabela Materiałów) i przemyj ją 3x 3x PBS.
    3. Dodać imidazol (patrz tabela materiałów) do supernatantu komórkowego, aby uzyskać końcowe stężenie 20 mM, i załadować supernatant komórki 2x.
    4. Dodać 3 objętości kolumn (CV) PBS zawierających 20 mM imidazolu do przemywania i zebrać frakcję płuczącą.
    5. Elucja gradientowa z 3 CV PBS zawierającego niskie do wysokich stężeń (np. 0,3 M, 0,4 M, 0,5 M) imidazolu; eluować 2x dla każdego stężenia.
    6. Użyj SDS-PAGE21, aby zidentyfikować RBD-ST w różnych gradientach stężeń.

4. Biokoniugacja i oczyszczanie OMV-RBD

  1. Oznaczyć stężenie białka metodą BCA (patrz tabela materiałów).
    1. Seryjnie rozcieńczyć wzorcowy roztwór białka BSA od 2 mg/ml do 0,0625 mg/ml, rozcieńczyć oczyszczone OMV-SC i RBD-ST 10x, a następnie wymieszać roztwory robocze BCA A i B (dostarczone w zestawie do oznaczania) w stosunku 50:1 (v/v).
    2. Dodać rozcieńczony roztwór białka (25 μl/basenik) i wymieszać z roztworem roboczym BCA (200 μl/basenik); inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut.
    3. Zmierz absorbancję (OD) przy 562 nm każdego dołka i oblicz stężenie białka z krzywej wzorcowej22.
  2. Wykonaj biokoniugację OMV-SC i RBD-ST, wykonując poniższe czynności.
    1. Wymieszaj OMV-SC i RBD-ST w PBS w proporcji 40:1 (w/w).
    2. Obrócić w pionie, aby zmiksować mieszaninę przez noc z prędkością 15 obr./min w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Różne antygeny mogą reagować w różnych proporcjach. Można próbować różnych proporcji reakcji w zależności od charakterystyki antygenu.
  3. Sprawdź skuteczność reakcji.
    1. Przygotować 10 μl OMV-SC, RBD-ST i produkt reakcji (krok 4.2.). Dodać 2,5 μl 5-krotnego buforu ładującego (patrz tabela materiałów) i podgrzewać próbki w temperaturze 100 °C przez 5 minut. Załadować próbki do żelu (10 μl/basenik). Wykonuj elektroforezę przy napięciu 60 V przez 20 min i zmień stan na 120 V na 1 godzinę.
    2. Przenieść białko z żelu do membran Western Blot PVDF (patrz tabela materiałów) pod napięciem 100 V przez 70 minut.
    3. Włożyć membranę do 5% odtłuszczonego mleka w proszku/TBST i wstrząsać przez 1 godzinę. Następnie umyć 3x TBST przez 5 minut na każde mycie z potrząsaniem.
    4. Umieścić membranę w 0,1% przeciwciałie His-Tag/TBST (patrz Tabela Materiałów) i wstrząsać przez 1 godzinę, następnie przemywać 3x TBST przez 5 minut na pranie z potrząsaniem.
    5. Umieścić membranę w 0,02% przeciwciałie anty-mysim IgG1 (HRP)/TBST (patrz Tabela Materiałów) i wstrząsać przez 40 min, a następnie przemywać 3x TBST przez 5 minut na pranie z potrząsaniem.
    6. Dodać ulepszony roztwór chemiluminescencji (patrz tabela materiałów) i odsłonić membranę.
  4. Przeprowadzić oczyszczanie OMV-RBD.
    1. Rozcieńczyć 1 ml przereagowanego roztworu OMV-RBD do objętości 10 ml i odwirować rozcieńczenie przy 150 000 x g w temperaturze 4 °C przez 2 godziny.
    2. Za pomocą pipety usunąć supernatant i zawiesić pozostałość w 10 ml PBS. Odwirować zawiesinę o sile 150 000 x g w temperaturze 4 °C przez 2 godziny.
    3. Odrzucić supernatant i zawiesić pozostałość w 1 ml PBS.
      UWAGA: Jeśli rozpuszczalność antygenu jest znacznie niższa, ten sam efekt separacji można osiągnąć za pomocą chromatografii wykluczającej według wielkości19.

5. Charakterystyka

  1. Wykonaj dynamiczne rozpraszanie światła (DLS).
    1. Rozcieńczyć próbki do stężenia 100 μg/ml i dodać 1 ml próbki do celi próbki.
    2. Wybierz "Rozmiar" dla "Typu pomiaru", "Białko" dla "Materiału próbki", "Woda" dla "Dyspergatora", "25 °C" dla "Temperatury", a następnie załaduj próbki i zmierz automatycznie23.
  2. Rejestruj obrazy za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM).
    1. Rozcieńczyć próbki do 100 μg/ml. Weź miedzianą siatkę o oczkach 200, dodaj do niej 20 μl próbki i pozostaw do wchłonięcia przez 10 minut.
    2. Użyj bibuły filtracyjnej, aby odsączyć roztwór, dodaj 20 μl 3% octanu uranylu do folii nośnej i barwij przez 30 s.
    3. Odsiądź octan uranylu i wysusz film w sposób naturalny w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
    4. Załadować próbki do systemu TEM (patrz tabela materiałów) i wykonać obrazy przy napięciu 80 kV.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Schemat blokowy dla tego protokołu jest pokazany w Rysunek 1. Protokół ten może być ogólnym podejściem do wykorzystania OMV jako platformy szczepionkowej; Wystarczy dobrać odpowiednie systemy ekspresji w zależności od rodzaju antygenów.

Rysunek 2 przedstawia możliwy do zrealizowania schemat projektowania plazmidu. Gen SC jest połączony z genem ClyA za pomocą elastycznego łącznika, podczas gdy ST łączy się z końcem 5' genu RBD za pomoc...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby stworzyć platformę szczepionkową nanocząsteczkową typu "Plug-and-Display", ClyA z fuzją SC poddano ekspresji w szczepach BL21(DE3), które są jednym z najczęściej stosowanych modeli produkcji białek rekombinowanych ze względu na jego zalety w ekspresji białek24, tak aby podczas procesu namnażania się bakterii na powierzchni OMV wyświetlała się wystarczająca ilość fragmentu SC. W tym samym czasie przygotowano antygen docelowy z fuzją ST do chemicznego sprzężenia między antygenami a OMV. Zalety t...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Kluczowy Program Fundacji Nauk Przyrodniczych Chongqing (nr cstc2020jcyj-zdxmX0027) oraz Projekt Chińskiej Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych (nr 31670936, 82041045).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Ampicylina sodowaSangon Biotech A610028
Automatyczny licznik komórekZestaw do
cwbiocw0014s
ChemiDoc Dotykowy system obrazowaniaBio-rad
Danamic Rozpraszanie światłaMalvernZetasizer Nano S90
Aparatura do elektroforezyCavoyPower BV
EZ-Buffers H 10X TBST BuforSangon BiotechC520009
Kozia pAb do myszy IgG1Abcamab97240
Wirówka do zamrażania o dużej prędkościBioridgeH2500R
Mysz His-Tag mAbTechnologia sygnalizacji komórkowej2366s
ImidazolSangon Biotech
Beta-D-tiogalaktopiranozyd izopropyluSangon Biotech A600118
Ni-NTA His-Bind SuperflowQiagen70691
Beztłuszczowe mleko w proszkuSangon Biotech
OPM-293Opm biosciences81075-001
pcDNA3.1 Plazmid RBD-STGenekreat z Wuhan technologia
Bufor fosforanowy sólfizjologiczna ZSGB-bioZLI-9061
Polietylenina LinearPolysciences23966-1
Wstępnie barwiona drabinka białkowaThermo26616
pThioHisA ClyA-SC plazmidgenecreat Wuhan
PVDF Western Blotting MembranesRoche
Systemy stołowe Quixstand (kolumna z pustych włókien 100 kD)
(5x)BeyotimeP0015
Chlorek soduSangon BiotechA100241
Supersignal west pico PLUS (ulepszony roztwór chemiluminescencyjny)Thermo34577
Przyrząd do zawieszaniaLife TechnologyMikser
Transmisyjny mikroskop elektronowyHitachiHT7800
TryptoneOxoidLP0042B
UltrawirówkaBeckman CoulterXPN-100
Spektrofotometr ultrafioletowyHitachiU-3900
Ekstrakt z drożdżySangon BiotechA610961
oznaczania ilościowego białek BCA Countstar BioTech A600277 Pożywka do hodowli komórkowych A600669 biologicznatechnologia biologiczna03010040001Bufor ładowania SDS-PAGE GE healthcare Hula

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Li, M., et al. Bacterial outer membrane vesicles as a platform for biomedical applications: An update. Journal of Controlled Release. 323, 253-268 (2020).
  2. Micoli, F., MacLennan, C. A. Outer membrane vesicle vaccines. Seminars in Immunology. 50, 101433(2020).
  3. Toyofuku, M., Nomura, N., Eberl, L. Types and origins of bacterial membrane vesicles. Nature Reviews Microbiology. 17 (1), 13-24 (2019).
  4. Sartorio, M. G., Pardue, E. J., Feldman, M. F., Haurat, M. F. Bacterial outer membrane vesicles: From discovery to applications. Annual Review of Microbiology. 75, 609-630 (2021).
  5. Kaparakis-Liaskos, M., Ferrero, R. L. Immune modulation by bacterial outer membrane vesicles. Nature Reviews Immunology. 15 (6), 375-387 (2015).
  6. Petousis-Harris, H., Radcliff, F. J. Exploitation of Neisseria meningitidis group B OMV vaccines against N-gonorrhoeae to inform the development and deployment of effective gonorrhea vaccines. Frontiers in Immunology. 10, 683(2019).
  7. Gnopo, Y. M. D., Watkins, H. C., Stevenson, T. C., DeLisa, M. P., Putnam, D. Designer outer membrane vesicles as immunomodulatory systems - Reprogramming bacteria for vaccine delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 114, 132-142 (2017).
  8. Zhang, Y. X., Fang, Z. Y., Li, R. Z., Huang, X. T., Liu, Q. Design of outer membrane vesicles as cancer vaccines: A new toolkit for cancer therapy. Cancers. 11 (9), 1314(2019).
  9. Berleman, J., Auer, M. The role of bacterial outer membrane vesicles for intra- and interspecies delivery. Environmental Microbiology. 15 (2), 347-354 (2013).
  10. Huang, W. L., Meng, L. X., Chen, Y., Dong, Z. Q., Peng, Q. Bacterial outer membrane vesicles as potential biological nanomaterials for antibacterial therapy. Acta Biomaterialia. 140, 102-115 (2022).
  11. Hoffmann, M., et al. SARS-CoV-2 cell entry depends on ACE2 and TMPRSS2 and is blocked by a clinically proven protease inhibitor. Cell. 181 (2), 271-280 (2020).
  12. Robbiani, D. F., et al. Convergent antibody responses to SARS-CoV-2 in convalescent individuals. Nature. 584 (7821), 437-442 (2020).
  13. Wang, M. Y., et al. SARS-CoV-2: Structure, Biology, and Structure-Based Therapeutics Development. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 587269(2020).
  14. Yang, S., et al. Safety and immunogenicity of a recombinant tandem-repeat dimeric RBD-based protein subunit vaccine (ZF2001) against COVID-19 in adults: Two randomised, double-blind, placebo-controlled, phase 1 and 2 trials. The Lancet Infectious Disease. 21 (8), 1107-1119 (2021).
  15. Wang, Z., et al. mRNA vaccine-elicited antibodies to SARS-CoV-2 and circulating variants. Nature. 592 (7855), 616-622 (2021).
  16. Amanat, F., et al. SARS-CoV-2 mRNA vaccination induces functionally diverse antibodies to NTD, RBD, and S2. Cell. 184 (15), 3936-3948 (2021).
  17. Tan, H. X., et al. Immunogenicity of prime-boost protein subunit vaccine strategies against SARS-CoV-2 in mice and macaques. Nature Communication. 12 (1), 1403(2021).
  18. Thapa, H. B., Mueller, A. M., Camilli, A., Schild, S. An intranasal vaccine based on outer membrane vesicles against SARS-CoV-2. Frontiers in Microbiology. 12, 752739(2021).
  19. Ma, X., et al. Nanoparticle vaccines based on the receptor binding domain (RBD) and heptad repeat (HR) of SARS-CoV-2 elicit robust protective immune responses. Immunity. 53 (6), 1315-1330 (2020).
  20. Yang, Z., et al. RBD-modified bacterial vesicles elicited potential protective immunity against SARS-CoV-2. Nano Letters. 21 (14), 5920-5930 (2021).
  21. Rhinesmith, T., Killinger, B. A., Sharma, A., Moszczynska, A. Multimer-PAGE: A method for capturing and resolving protein complexes in biological samples. Journal of Visualized Experiments. (123), e55341(2017).
  22. Arslan, A., et al. Determining total protein and bioactive protein concentrations in bovine colostrum. Journal of Visualized Experiments. (178), e63001(2021).
  23. Alves, N. J., Turner, K. B., Walper, S. A. Directed protein packaging within outer membrane vesicles from Escherichia coli: Design, production and purification. Journal of Visualized Experiments. (117), e54458(2016).
  24. Kim, S., et al. Genomic and transcriptomic landscape of Escherichia coli BL21(DE3). Nucleic Acids Research. 45 (9), 5285-5293 (2017).
  25. Daleke-Schermerhorn, M. H., et al. Decoration of outer membrane vesicles with multiple antigens by using an autotransporter approach. Applied and Environmental Microbiology. 80 (18), 5854-5865 (2014).
  26. Kuipers, K., et al. Salmonella outer membrane vesicles displaying high densities of pneumococcal antigen at the surface offer protection against colonization. Vaccine. 33 (17), 2022-2029 (2015).
  27. Veggiani, G., et al. Programmable polyproteams built using twin peptide superglues. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (5), 1202-1207 (2016).
  28. Saunders, K. O., et al. Neutralizing antibody vaccine for pandemic and pre-emergent coronaviruses. Nature. 594, 553-559 (2021).
  29. van Saparoea, H. B. V., Houben, D., Kuijl, C., Luirink, J., Jong, W. S. P. Combining protein ligation systems to expand the functionality of semi-synthetic outer membrane vesicle nanoparticles. Frontiers in Microbiology. 11, 890(2020).
  30. Needham, B. D., et al. Modulating the innate immune response by combinatorial engineering of endotoxin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (4), 1464-1469 (2013).
  31. Zanella, I., et al. Proteome-minimized outer membrane vesicles from Escherichia coli as a generalized vaccine platform. Journal of Extracellular Vesicles. 10 (4), 12066(2021).
  32. Wang, J. L., et al. Truncating the structure of lipopolysaccharide in Escherichia coli can effectively improve poly-3-hydroxybutyrate production. ACS Synthetic Biology. 9 (5), 1201-1215 (2020).
  33. Liu, Q., et al. Outer membrane vesicles from flagellin-deficient Salmonella enterica serovar Typhimurium induce cross-reactive immunity and provide cross-protection against heterologous Salmonella challenge. Scientific Reports. 6, 34776(2016).
  34. Balhuizen, M. D., Veldhuizen, E. J. A., Haagsman, H. P. Outer membrane vesicle induction and isolation for vaccine development. Frontiers in Microbiology. 12, 629090(2021).
  35. Hua, L., et al. A novel immunomodulator delivery platform based on bacterial biomimetic vesicles for enhanced antitumor immunity. Advanced Materials. 33 (43), 2103923(2021).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

SARS CoV 2 RBDPlug And Display PlatformOMV BioconjugationSpyCatcher SpyTagProtein PurificationUltracentrifugationTransmission Electron MicroscopyDynamic Light Scattering

Powiązane artykuły