Transfer mitochondrialny z mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej myszy do starzejących się oocytów myszy

Podsumowanie

Tutaj opisujemy izolację mitochondriów z mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z mysiej tkanki tłuszczowej, a następnie przenosimy mitochondria do starzejących się oocytów myszy, aby poprawić jakość oocytów.

Streszczenie

Ze względu na spadek ilości i jakości oocytów związany z wiekiem, płodność kobiet powyżej 35 roku życia gwałtownie spadła. Mechanizmy molekularne, które utrzymują jakość oocytów, pozostają niejasne, dlatego obecnie trudno jest zwiększyć przyrost naturalny kobiet w wieku powyżej 35 lat. Oocyty zawierają więcej mitochondriów niż jakikolwiek rodzaj komórek w organizmie, a każda dysfunkcja mitochondriów może prowadzić do obniżenia jakości oocytów. W latach dziewięćdziesiątych XX wieku transfer cytoplazmaty oocytów przyniósł wielki sukces w rozrodzie człowieka, ale towarzyszyły mu kontrowersje etyczne. Oczekuje się, że autologiczny przeszczep mitochondriów będzie przydatną techniką zwiększania jakości oocytów, które zmniejszyły się z powodu wieku. W niniejszym badaniu wykorzystaliśmy komórki macierzyste pochodzące z tkanki tłuszczowej od starszych myszy jako dawcę mitochondriów w celu poprawy jakości oocytów starszych myszy. Dalszy rozwój technologii autologicznego transferu mitochondrialnego zapewni nowe i skuteczne leczenie niepłodności u kobiet w podeszłym wieku.

Wprowadzenie

Jednym z ważnych czynników wpływających na płodność kobiet jest starzenie się oocytów; spadek jakości oocytów jest główną przyczyną niepłodności u starszych kobiet. Jednak główna przyczyna starzenia się oocytów i mechanizm molekularny, który reguluje jakość oocytów, są nadal niejasne. Wcześniejsze badania wykazały, że zarówno liczba, jak i jakość mitochondriów są zaangażowane w kontrolę jakości oocytów i rozwój embrionalny^1,2,3. Spadek ilości i jakości mitochondriów jest ściśle związany ze starzeniem się³.

Podjęto wiele prób poprawy funkcji mitochondriów w starzejących się oocytach, w tym suplement diety mitochondriów i transfer mitochondriów. Dobrze znane, skuteczne suplementy diety mitochondriów obejmują koenzym Q10 (CoQ10), kwas alfa-liponowy (α-LA) i resweratrol (RSV)⁴. Badania wykazały, że suplementacja CoQ10 może nie tylko poprawić związany z wiekiem spadek ilości i jakości oocytów, ale także promować prawidłowy rozwój i owulację oocytów⁵. α-LA spowalnia spadek jakości oocytów związany ze starzeniem się i fenotypem metabolicznym pacjentek z zespołem policystycznych jajników (PCOS)^6,7. Resweratrol może zmniejszać liczbę oocytów z nieprawidłowymi wrzecionami i nieprawidłowym dopasowaniem chromosomów zwiększonym u starzejących się myszy, jednocześnie wpływając na rozwój embrionalny w sposób zależny od dawki⁸. Ponieważ jednak efekt kliniczny suplementów diety mitochondriów nie osiągnął oczekiwanego poziomu, należy zbadać inne skuteczne metody leczenia.

Pierwsza próba transferu mitochondriów została przeprowadzona w 1997 roku. Przeniesienie cytoplazmy oocytów młodej dawczyni do starzejących się oocytów biorcy poprawiło jakość oocytów u starszych pacjentek, które z powodzeniem urodziły zdrowe niemowlęta⁹, co było uzasadnieniem zastosowania tej techniki. Jednak allogeniczny transfer cytoplazmatyczny oocytów nie może być stosowany w praktyce klinicznej z dwóch głównych powodów - problemu heterogeniczności genetycznej i problemów regulacyjnych spowodowanych przeszczepem mitochondriów dawcy. Poprzednie badanie wykazało, że autologiczny przeszczep mitochondriów komórek może poprawić jakość oocytów, rozwój zarodków i płodność starszych myszy¹⁰, które nie miały problemów etycznych ani problemów z heterogenicznością genetyczną i rozwiązały niektóre problemy spowodowane transferem cytoplazmy oocytów dawcy do oocytów biorcy^10,11.

Tymczasem, autologiczny transfer mitochondriów był lepszy niż wpływ poprzednich suplementów diety mitochondriów na poprawę jakości oocytów¹¹. Dlatego autologiczny przeszczep mitochondriów komórek jest odpowiednim wyborem do klinicznego zastosowania tej technologii¹². Komórki macierzyste pochodzące z tkanki tłuszczowej (ADSC) mogą być uzyskiwane za pomocą technologii minimalnie inwazyjnej, są łatwe do wyizolowania i hodowli oraz mogą być idealną komórką "nasienną" dla medycyny regeneracyjnej. Mitochondria są bogate w ADSC, a funkcja mitochondriów nie zmniejsza się wraz z wiekiem, co sugeruje, że ADSC są doskonałym źródłem mitochondriów^13,14. W tym protokole wprowadzamy metodę transferu mitochondriów mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej myszy do starzejących się oocytów myszy w celu poprawy jakości oocytów. Jest to użyteczny model dla technologii autologicznego transferu mitochondrialnego ADSC u ludzi.

Protokół

Wszystkie opisane eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komitet Etyki Badań na Zwierzętach Trzeciego Szpitala Stowarzyszonego Uniwersytetu Soochow. Wszystkie operacje są prowadzone zgodnie z odpowiednimi wytycznymi agencji ds. opieki nad zwierzętami i ich wykorzystania. Szczegółowe informacje na temat wszystkich materiałów, przyrządów i odczynników użytych w tym protokole można znaleźć w Tabeli materiałów.

1. Izolacja i charakterystyka starzejących się mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej myszy (ADSC)

1. Uśmierc starsze myszy (10 miesięcy, średnio trzy) przez zwichnięcie szyjki macicy w znieczuleniu pentobarbitalem sodowym i zanurz je w 75% alkoholu przez 5 minut przed izolacją tkanki tłuszczowej.
   UWAGA: Moczenie w 75% alkoholu przez 5 minut może skutecznie zmniejszyć zanieczyszczenie komórek pierwotnych.
2. Wykonaj 2 cm nacięcie w skórze na obustronnej pachwinowej, odsłoń podskórną tkankę tłuszczową i użyj pęsety, aby wyizolować podskórną tkankę tłuszczową. Zbierz obustronny tłuszcz pachwinowy od myszy za pomocą wysterylizowanych nożyczek okulistycznych (unikaj przecinania tkanki podskórnej). Umieść tkankę tłuszczową w sterylnej probówce wirówkowej o pojemności 15 ml na lodzie i natychmiast przetransportuj ją do laboratorium hodowli komórkowych.
3. Przenieś tkankę tłuszczową na płytkę 6-dołkową, przepłucz ją 3x solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) zawierającą 100 U/ml penicyliny i streptomycyny. Usuń naczynia krwionośne, powięź tłuszczową i tkankę łączną pod tkanką tłuszczową i pokrój je na kawałki o wymiarach ~0,5 cm x 0,5 cm x 0,5 cm.
   UWAGA: Podczas izolowania tłuszczowych komórek macierzystych często dochodzi do zanieczyszczenia komórek śródbłonka naczyń krwionośnych. Usunięcie naczyń krwionośnych z tkanki tłuszczowej może zmniejszyć zanieczyszczenie komórek śródbłonka naczyń krwionośnych.
4. Rozdrobnioną tkankę tłuszczową przenieść do tej samej objętości roztworu kolagenazy typu I (0,1% końcowego stężenia kolagenazy typu I) i trawić w temperaturze 37 °C przez 30 minut.
5. Dodać równą objętość kompletnej pożywki hodowlanej (pożywka DMEM F-12 zawierająca 10% płodowej surowicy bydlęcej) w celu zneutralizowania kolagenazy typu I, odwirować przy 600 × g przez 10 minut i odrzucić supernatant i tkankę tłuszczową.
6. Zawiesić osad komórkowy w kompletnej pożywce hodowlanej. Usunąć niestrawioną tkankę przez filtrację przez sitko o wielkości 40 μm, a następnie odwirować przy 600 × g przez 5 minut.
7. Zawiesić zawiesinę komórek za pomocą 5 ml kompletnej pożywki hodowlanej i za pomocą pipety o pojemności 1 ml delikatnie pipetować w górę i w dół, aby utworzyć zawiesinę jednokomórkową. Sprawdź zawiesinę komórek pod mikroskopem, umieszczając podwielokrotność na hemocytometrze, aby potwierdzić, że są tylko pojedyncze komórki, bez żadnych agregatów. Dodać zawiesinę jednokomórkową do kolby do hodowli komórkowych o średnicy 25 cm i umieścić w inkubatorze o stężeniu 5% CO_{2 w} temperaturze 37 °C.
8. Zmień pożywkę hodowlaną 48 godzin później. Kontynuuj zmianę pożywki co 2-3 dni.
9. Po 7-10 dniach odłącz komórki w celu pasażowania komórek, gdy ich zbieg osiągnie 80%-90%. Usunąć całą pożywkę hodowlaną i przemyć komórki 2 ml PBS. Następnie dodaj 2 ml 0,05% trypsyny/EDTA, aby przeprowadzić dysocjację komórek^15,16.
10. Dodaj pożywkę do indukcji adipogennej przez 14 dni, aby wywołać różnicowanie ADSC w adipoctyes. Dodaj osteogenną pożywkę indukcyjną przez 28 dni do ADSC podanych na 24-dołkowych płytkach pokrytych żelatyną, aby wywołać ich różnicowanie w osteoblasty. W celu różnicowania neuronalnego należy wyhodować ADSC za pomocą pożywki do indukcji neuronalnej, a następnie wykryć specyficzną dla neuronów enolazę i polipeptyd mediatora neurofilamentu za pomocą immunofluorescencji¹⁵.
    1. Utrwal komórki w 4% paraformaldehydzie przez 30 minut w temperaturze pokojowej, a następnie przepuszczaj 0,5% Triton X-100 w PBS przez 15 minut.
    2. Po zablokowaniu 3% BSA w PBS, inkubować komórki z przeciwciałami pierwszorzędowymi (patrz tabela materiałów) rozcieńczonymi w roztworze blokującym w temperaturze 4 °C przez noc.
    3. Inkubować komórki z przeciwciałami drugorzędowymi przez 45 minut, a następnie barwić je DAPI przez 10 minut. Następnie zbadaj komórki za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.
11. Zebrać jednokomórkową zawiesinę ADSC za pomocą 0,05% trypsyny/EDTA, odwirować przy 600 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i ponownie zawiesić w PBS, aby dostosować gęstość komórek do 1 ×^{10 6}/ml. Podwielokrotnić zawiesinę komórek do probówek mikrowirówek o pojemności 1,5 ml (100 μl/probówkę) i dodać znakowane FITC królicze przeciwciała monoklonalne przeciwko mysim CD29, CD90, CD34 i HLA-DR o stężeniu przeciwciał 0,5 μg/ml. Potraktuj grupę kontrolną tą samą objętością króliczego IgG FITC, inkubuj na lodzie przez 30 minut i spłucz PBS w celu usunięcia niesprzężonego przeciwciała. Wykrywanie markerów powierzchniowych ADSC za pomocą cytometrii przepływowej¹³.

2. Izolacja mitochondriów z tłuszczowych komórek macierzystych

UWAGA: Wszystkie operacje izolacji mitochondriów muszą być przeprowadzane na lodzie.

1. Gdy ADSC osiągną gęstość 90%, trawić komórki za pomocą 2 ml 0,05% trypsyny/EDTA, wirować przy 600 × g przez 5 minut, zebrać i policzyć komórki i pobrać 1 × 10⁷ komórek do każdej ekstrakcji.
2. Ponownie zawiesić komórki w 2 ml buforu do ekstrakcji mitochondriów (do przygotowania buforu: 10 ml 0,1 M Tris-MOPS, 1 ml 0,1 M EGTA/Tris i 20 ml 1 M sacharozy; doprowadzić objętość do 100 ml wodą destylowaną i dostosować pH do 7,4) za pomocą 1x koktajlu inhibitora proteazy po umyciu 2 ml sterylnego PBS, a następnie inkubować na lodzie przez 5 minut.
3. Homogenizować komórki 20x-30x za pomocą homogenizatora szklanego (2,0 ml) i sprawdzić stopień homogenizacji za pomocą barwienia błękitem trypanowym.
   UWAGA: Proporcja wybarwionych komórek powinna wynosić ~80%. Nadmierna homogenizacja uszkodzi strukturę mitochondriów.
4. Odwirować homogenat komórek o masie 600 × g przez 15 minut, przenieść supernatant do nowej, wstępnie schłodzonej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i powtórzyć operację raz.
5. Odwirować supernatant o stężeniu 7 500 × g przez 15 minut i odrzucić supernatant. Przemyć osad mitochondrialny i ponownie go zawiesić, dodając ~100 μL wstępnie schłodzonego mitochondrialnego buforu do wstrzykiwań (225 mM mannitol, 75 mM sacharozy, 10 mM KCl, 10 mM Tris-HCl i 5 mM KH₂PO₄, pH 7,2), w stężeniu 1-5 mg/ml (całkowite stężenie białka). Zawiesinę mitochondrialną należy transportować na lodzie.
6. Przeanalizuj funkcję i czystość izolowanych mitochondriów za pomocą analizy cytometrii przepływowej JC-1 i Western blot (VDAC1, β-aktyna i Lamin B)¹³.
   1. Podziel izolowane mitochondria na trzy grupy: dimetylosulfotlenek (DMSO), JC-1 barwiony i JC-1 barwiony 30-chlorofenylohydrazonem karbonylu (CCCP) przez 30 minut.
   2. Po odwirowaniu w stężeniu 7 500 × g, odrzucić supernatant i zawiesić bufor.
   3. Uchwyć intensywność fluorescencji monomerów JC-1 (kanał FITC) i agregatów (kanał PE), które zostały wychwycone za pomocą cytometrii przepływowej. Oceń izolowane potencjały błony mitochondrialnej, mierząc stosunek średniej intensywności fluorescencji kanału PE do kanału FITC.
      UWAGA: Wykonaj powyższe kroki w ciemności.

3. Superstymulacja jajników

1. Wstrzyknąć 10-miesięcznej samicom myszy C57BL/6 dootrzewnowo 10 j.m. gonadotropiny surowicy ciężarnej klaczy (PMSG) w celu przeprowadzenia owulacji. Po 48 godzinach wstrzyknąć dootrzewnowo 10 j.m. ludzkiej gonadotropiny kosmówkowej (hCG).
2. Po 13 godzinach od wstrzyknięcia hCG rozerwać obrzęknięty jajowód mikroskopijną pęsetą. Uwolnij kompleksy wzgórków z obrzękniętego jajowodu. Rozpuścić wzgórki w podłożu M2 za pomocą hialuronidazy (0,3 mg/ml) w temperaturze 37 °C.
   UWAGA: Czas rozpuszczania jest krótszy niż 5 minut. Zminimalizuj czas, w którym kompleks wzgórków jest narażony na hialuronidazę, ponieważ długotrwała ekspozycja może upośledzać potencjał rozwojowy oocytów.

4. Transfer mitochondrialny wraz z ICSI

1. Umieść plemniki bez ogona w płynie mitochondrialnym. Pozyskaj plemniki bez ogona, wycinając je za pomocą ultradźwięków¹⁷. Umieść plemniki bez ogona w płynie mitochondrialnym tak, aby w 50 μl płynu mitochondrialnego znajdowało się 100 plemników.
   UWAGA: Ponieważ zawiesina mitochondrialna jest lekko lepka i niestabilna in vitro, należy wykonać wstrzyknięcie w ciągu 30 minut i wymienić igłę do mikroiniekcji natychmiast po jej zatkaniu. Optymalna średnica wewnętrzna igły do mikroiniekcji wynosi 5 μm.
2. Wstrzyknąć ~2 pL mitochondrialnego buforu oddechowego lub zawiesiny mitochondrialnej z plemnikami do oocytów za pomocą mikroiniektora pod mikroskopem odwróconym (200x; patrz Tabela Materiałów) w ciągu 30 minut zgodnie z protokołem Hiramoto opisanym przez Mehlmanna i Kline^10,18.
   UWAGA: Wstrzyknięta zawiesina mitochondrialna stanowi 1%-3% całkowitej objętości oocytów. Kontroluj objętość (1%-3%) zawiesiny mitochondrialnej w cytoplazmie, aby zapewnić konsystencję wstrzyknięcia.
3. Po wstrzyknięciu umieść zapłodnione oocyty w pożywce M2 w celu zrównoważenia przez 15 minut i przenieś zapłodnione jaja, które przeżyły, na pożywkę hodowlaną M16.
4. Zbadaj ocalałe płodne jaja, obserwując gładką morfologię, tworzenie się projądrka i uwalnianie drugiego ciała polarnego ¹⁹. Obserwuj, fotografuj i licz zarodki o godzinie 09:00 i 18:00 codziennie przez 4 dni. Na koniec zbierz i zamroź blastocysty i przechowuj je w lodówce o temperaturze -80 °C w celu określenia liczby kopii ATP i mtDNA w celu oceny liczby i poprawy przeszczepu mitochondriów.
   1. Przygotuj standardowy plazmid (plazmid do bezwzględnej kwantyfikacji, jak opisano wcześniej¹³), do oznaczania liczby kopii mitochondrialnych zgodnie z liczbą kopii 1 ×^{10 7}, 1 × 10⁶, 1 × 10⁵, 1 × 10⁴, 1 × 10³, 1 × 10² i 1 × 10¹. Przenieś zarodki do probówki sterylizacyjnej i dodaj 20 μl buforu lizatu, aby uwolnić mitochondrialne DNA. Następnie dezaktywować proteazę w lizacie w temperaturze 55 °C przez 20 min i w temperaturze 95 °C przez 10 minut.
   2. Określ liczbę kopii mtDNA za pomocą fluorescencyjnego ilościowego PCR, stosując następujące ustawienia: 5 μl mieszanki PCR, 0,5 μl startera B6 do przodu, 0,5 μl startera B6 rev, 2 μl produktu pirolizy i 2 μL ddH₂O. Postępuj zgodnie z warunkami PCR: etap 1, 95 °C przez 3 min; etap 2, 95 °C przez 30 s, 58 °C przez 30 s i 72 °C przez 30 s; Powtórz cykl 40 razy.

Wyniki

W niniejszym protokole wyizolowano i scharakteryzowano ADSC z tłuszczu mysiego (Rysunek 1). Aby uzyskać wyizolowane mitochondria, należy zniszczyć błonę komórkową za pomocą homogenizatora szklanego (Rysunek 2A). Ważne jest uzyskanie jednorodnej frakcji mitochondrialnej bez dużych skupisk, aby nie zapchać igły do mikroiniekcji. Najpierw należy użyć końcówek do pipet o pojemności 200 µL, a następnie 10 µL, aby delikatnie resuspendować homogenaty; na koniec należy ...

Dyskusja

Oocyty zawierają więcej mitochondriów niż jakikolwiek rodzaj komórek w organizmie, z liczbą kopii ~1-5 ×^{10 5} mtDNA. Mitochondria są niezbędne do dojrzewania oocytów, zapłodnienia i rozwoju embrionalnego, dlatego każda dysfunkcja mitochondriów może prowadzić do obniżenia jakości oocytów. Zmniejszona ilość i jakość mitochondriów jest ściśle związana ze starzeniem fizjologicznym. W tym protokole wprowadzono prostą metodę izolowania mitochondriów od ADSC starzejących się myszy i przenoszenia do starzejących się oo...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
0,05% trypsyna/EDTA	Gibco	25300054	hodowla komórkowa
4% paraformaldehyd	beyotime	P0099	immunofluorescencja
40 μ m sitko komórkowe	Corning	352340	Izolacja ADSC
indukcja adipogeniczna	Cyagen	HUXXC-90031	Wielokierunkowe różnicowanie
Roztwór do barwienia czerwienią alizaryny	Sigma	A5533	Wielokierunkowe różnicowanie
Przeciwciało przeciwko CD29	Analiza przepływu	558741	Biosciences
Przeciwciało przeciwko CD34	BD Biosciences	Analiza przepływu	560942
Przeciwciało przeciwko CD90	BD Biosciences	553016	analiza przepływu
Przeciwciało przeciwko HLA-DR	BD Biosciences	555560	analiza przepływu
i beta;-aktyna	Abcam	ab-8226	Test funkcji mitochondriów
BSA	Sigma	V900933	immunofluorescencja
CCCP	Solarbio		Analiza przepływu mitochondriów C6700 JC-1
ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix	Vazyme	Q711	qPCR
kolagenaza typu I	Sigma	SCR103	Izolacja ADSC
DAPI	Invitrogen	D1306	immunofluorescencja
DMEM-F12	Gibco	11320033	Hodowla komórkowa
DMSO	Sigma	276855	mitochondria JC-1 analiza przepływu
EGTA	Sigma	324626	Izolacja mitochondriów
FBS	Gibco	10100147
Cytometria przepływowa	BD Biosciences	FACSCanto& handel; II	Charakterystyka mikroskopu
fluorescencyjnego	leica	DM2500	immunofluorescencyjna
żelatyna	Sigma	48722	Wielokierunkowa
rurka do homogenizacji szkła	różnicującego Sangon	F519062	Izolacja mitochondriów
hCG	Aibei	M2520
Hialuronidaza	Sigma	H1115000	Superstymulacja jajników
Mikroskop odwrócony	Olympus	IMT-2	Mikroiniekcja
izolowany zestaw do barwienia mitochondriów	Sigma	CS0760	analiza przepływu mitochondriów JC-1
JC-1	Sigma	T4069	Test funkcji mitochondriów
KCl	Sigma	P5405	Transfer mitochondriów
KH2PO4	Sigma	P5655	Transfer
mitochondriówLaminB	Abcam	ab-16048	Test funkcji mitochondriów
M16 Medium	Sigma	M7292	hodowla komórek zarodkowych
M2 Medium	Sigma	M7167	hodowla komórek zarodkowych
mannitol	Sigma	M9546	Transfer mitochondriów
Mikrowtryskiwacz	Olympus+ eppendorf	IX73	Transfer mitochondriów
MitoTracker czerwony	Invitrogen	M22425	Barwienie mitochondriów
MOPS	Sigma	M1442	Izolacja mitochondriów
polipeptyd mediatora neurofilamentu (NFM)	Santa Cruz Biotechnology	sc-16143	Wielokierunkowe różnicowanie
indukcja neurogenna	Gibco	A1647801	Różnicowanie wielokierunkowe
Enolaza specyficzna dla neuronu (NSE)	Santa Cruz Biotechnology	sc-292097	Wielokierunkowe różnicowanie
Olej Red O	Sangon	E607319	Adipogenic differentiation
oil red O roztwór	Sigma	O1516	Wielokierunkowe różnicowanie
indukcja osteogenna	Cyagen	HUXXC-90021	Wielokierunkowe różnicowanie
PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanem)	Hyklon	SH30256.LS	Hodowla komórkowa
penicylina i streptomycyna	SV30010		klonów
PMSG	Aibei	M2620	superstymulacji jajników
	Sigma	P8340	Izolacja mitochondriów
sacharoza	Sigma	V900116	Izolacja mitochondriów
Tris	Sigma	648314	Izolacja mitochondriów
Tris-HCl Sigma		108319	Transfer mitochondriów
Triton X-100	beyotime	P0096	immunofluorescencja
VDAC	Abcam	ab-14734	Test funkcji mitochondriów

BD hodowli komórkowych ADSC superstymulująca jajniki Izolacja komórkowych Inhibitor proteazy