Artykuł metodologiczny

Transfer mitochondrialny z mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej myszy do starzejących się oocytów myszy

DOI:

10.3791/64217

⸱

6 stycznia 2023

 ,  , 
1Department of Obstetrics and Gynecology, the Third Affiliated Hospital, Soochow University, 2Department of Obstetrics and Gynecology, Nanjing First Hospital, Nanjing Medical University, 3Center for Reproductive Medicine and Obstetrics and Gynecology, Nanjing Drum Tower Hospital, Nanjing University Medical School

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj opisujemy izolację mitochondriów z mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z mysiej tkanki tłuszczowej, a następnie przenosimy mitochondria do starzejących się oocytów myszy, aby poprawić jakość oocytów.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ze względu na spadek ilości i jakości oocytów związany z wiekiem, płodność kobiet powyżej 35 roku życia gwałtownie spadła. Mechanizmy molekularne, które utrzymują jakość oocytów, pozostają niejasne, dlatego obecnie trudno jest zwiększyć przyrost naturalny kobiet w wieku powyżej 35 lat. Oocyty zawierają więcej mitochondriów niż jakikolwiek rodzaj komórek w organizmie, a każda dysfunkcja mitochondriów może prowadzić do obniżenia jakości oocytów. W latach dziewięćdziesiątych XX wieku transfer cytoplazmaty oocytów przyniósł wielki sukces w rozrodzie człowieka, ale towarzyszyły mu kontrowersje etyczne. Oczekuje się, że autologiczny przeszczep mitochondriów będzie przydatną techniką zwiększania jakości oocytów, które zmniejszyły się z powodu wieku. W niniejszym badaniu wykorzystaliśmy komórki macierzyste pochodzące z tkanki tłuszczowej od starszych myszy jako dawcę mitochondriów w celu poprawy jakości oocytów starszych myszy. Dalszy rozwój technologii autologicznego transferu mitochondrialnego zapewni nowe i skuteczne leczenie niepłodności u kobiet w podeszłym wieku.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jednym z ważnych czynników wpływających na płodność kobiet jest starzenie się oocytów; spadek jakości oocytów jest główną przyczyną niepłodności u starszych kobiet. Jednak główna przyczyna starzenia się oocytów i mechanizm molekularny, który reguluje jakość oocytów, są nadal niejasne. Wcześniejsze badania wykazały, że zarówno liczba, jak i jakość mitochondriów są zaangażowane w kontrolę jakości oocytów i rozwój embrionalny1,2,3. Spadek ilości i jakości mitochondriów jest ściśle związany ze starzeniem się3.

Podjęto wiele prób poprawy funkcji mitochondriów w starzejących się oocytach, w tym suplement diety mitochondriów i transfer mitochondriów. Dobrze znane, skuteczne suplementy diety mitochondriów obejmują koenzym Q10 (CoQ10), kwas alfa-liponowy (α-LA) i resweratrol (RSV)4. Badania wykazały, że suplementacja CoQ10 może nie tylko poprawić związany z wiekiem spadek ilości i jakości oocytów, ale także promować prawidłowy rozwój i owulację oocytów5. α-LA spowalnia spadek jakości oocytów związany ze starzeniem się i fenotypem metabolicznym pacjentek z zespołem policystycznych jajników (PCOS)6,7. Resweratrol może zmniejszać liczbę oocytów z nieprawidłowymi wrzecionami i nieprawidłowym dopasowaniem chromosomów zwiększonym u starzejących się myszy, jednocześnie wpływając na rozwój embrionalny w sposób zależny od dawki8. Ponieważ jednak efekt kliniczny suplementów diety mitochondriów nie osiągnął oczekiwanego poziomu, należy zbadać inne skuteczne metody leczenia.

Pierwsza próba transferu mitochondriów została przeprowadzona w 1997 roku. Przeniesienie cytoplazmy oocytów młodej dawczyni do starzejących się oocytów biorcy poprawiło jakość oocytów u starszych pacjentek, które z powodzeniem urodziły zdrowe niemowlęta9, co było uzasadnieniem zastosowania tej techniki. Jednak allogeniczny transfer cytoplazmatyczny oocytów nie może być stosowany w praktyce klinicznej z dwóch głównych powodów - problemu heterogeniczności genetycznej i problemów regulacyjnych spowodowanych przeszczepem mitochondriów dawcy. Poprzednie badanie wykazało, że autologiczny przeszczep mitochondriów komórek może poprawić jakość oocytów, rozwój zarodków i płodność starszych myszy10, które nie miały problemów etycznych ani problemów z heterogenicznością genetyczną i rozwiązały niektóre problemy spowodowane transferem cytoplazmy oocytów dawcy do oocytów biorcy10,11.

Tymczasem, autologiczny transfer mitochondriów był lepszy niż wpływ poprzednich suplementów diety mitochondriów na poprawę jakości oocytów11. Dlatego autologiczny przeszczep mitochondriów komórek jest odpowiednim wyborem do klinicznego zastosowania tej technologii12. Komórki macierzyste pochodzące z tkanki tłuszczowej (ADSC) mogą być uzyskiwane za pomocą technologii minimalnie inwazyjnej, są łatwe do wyizolowania i hodowli oraz mogą być idealną komórką "nasienną" dla medycyny regeneracyjnej. Mitochondria są bogate w ADSC, a funkcja mitochondriów nie zmniejsza się wraz z wiekiem, co sugeruje, że ADSC są doskonałym źródłem mitochondriów13,14. W tym protokole wprowadzamy metodę transferu mitochondriów mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej myszy do starzejących się oocytów myszy w celu poprawy jakości oocytów. Jest to użyteczny model dla technologii autologicznego transferu mitochondrialnego ADSC u ludzi.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie opisane eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komitet Etyki Badań na Zwierzętach Trzeciego Szpitala Stowarzyszonego Uniwersytetu Soochow. Wszystkie operacje są prowadzone zgodnie z odpowiednimi wytycznymi agencji ds. opieki nad zwierzętami i ich wykorzystania. Szczegółowe informacje na temat wszystkich materiałów, przyrządów i odczynników użytych w tym protokole można znaleźć w Tabeli materiałów.

1. Izolacja i charakterystyka starzejących się mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej myszy (ADSC)

  1. Uśmierc starsze myszy (10 miesięcy, średnio trzy) przez zwichnięcie szyjki macicy w znieczuleniu pentobarbitalem sodowym i zanurz je w 75% alkoholu przez 5 minut przed izolacją tkanki tłuszczowej.
    UWAGA: Moczenie w 75% alkoholu przez 5 minut może skutecznie zmniejszyć zanieczyszczenie komórek pierwotnych.
  2. Wykonaj 2 cm nacięcie w skórze na obustronnej pachwinowej, odsłoń podskórną tkankę tłuszczową i użyj pęsety, aby wyizolować podskórną tkankę tłuszczową. Zbierz obustronny tłuszcz pachwinowy od myszy za pomocą wysterylizowanych nożyczek okulistycznych (unikaj przecinania tkanki podskórnej). Umieść tkankę tłuszczową w sterylnej probówce wirówkowej o pojemności 15 ml na lodzie i natychmiast przetransportuj ją do laboratorium hodowli komórkowych.
  3. Przenieś tkankę tłuszczową na płytkę 6-dołkową, przepłucz ją 3x solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) zawierającą 100 U/ml penicyliny i streptomycyny. Usuń naczynia krwionośne, powięź tłuszczową i tkankę łączną pod tkanką tłuszczową i pokrój je na kawałki o wymiarach ~0,5 cm x 0,5 cm x 0,5 cm.
    UWAGA: Podczas izolowania tłuszczowych komórek macierzystych często dochodzi do zanieczyszczenia komórek śródbłonka naczyń krwionośnych. Usunięcie naczyń krwionośnych z tkanki tłuszczowej może zmniejszyć zanieczyszczenie komórek śródbłonka naczyń krwionośnych.
  4. Rozdrobnioną tkankę tłuszczową przenieść do tej samej objętości roztworu kolagenazy typu I (0,1% końcowego stężenia kolagenazy typu I) i trawić w temperaturze 37 °C przez 30 minut.
  5. Dodać równą objętość kompletnej pożywki hodowlanej (pożywka DMEM F-12 zawierająca 10% płodowej surowicy bydlęcej) w celu zneutralizowania kolagenazy typu I, odwirować przy 600 × g przez 10 minut i odrzucić supernatant i tkankę tłuszczową.
  6. Zawiesić osad komórkowy w kompletnej pożywce hodowlanej. Usunąć niestrawioną tkankę przez filtrację przez sitko o wielkości 40 μm, a następnie odwirować przy 600 × g przez 5 minut.
  7. Zawiesić zawiesinę komórek za pomocą 5 ml kompletnej pożywki hodowlanej i za pomocą pipety o pojemności 1 ml delikatnie pipetować w górę i w dół, aby utworzyć zawiesinę jednokomórkową. Sprawdź zawiesinę komórek pod mikroskopem, umieszczając podwielokrotność na hemocytometrze, aby potwierdzić, że są tylko pojedyncze komórki, bez żadnych agregatów. Dodać zawiesinę jednokomórkową do kolby do hodowli komórkowych o średnicy 25 cm i umieścić w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 w temperaturze 37 °C.
  8. Zmień pożywkę hodowlaną 48 godzin później. Kontynuuj zmianę pożywki co 2-3 dni.
  9. Po 7-10 dniach odłącz komórki w celu pasażowania komórek, gdy ich zbieg osiągnie 80%-90%. Usunąć całą pożywkę hodowlaną i przemyć komórki 2 ml PBS. Następnie dodaj 2 ml 0,05% trypsyny/EDTA, aby przeprowadzić dysocjację komórek15,16.
  10. Dodaj pożywkę do indukcji adipogennej przez 14 dni, aby wywołać różnicowanie ADSC w adipoctyes. Dodaj osteogenną pożywkę indukcyjną przez 28 dni do ADSC podanych na 24-dołkowych płytkach pokrytych żelatyną, aby wywołać ich różnicowanie w osteoblasty. W celu różnicowania neuronalnego należy wyhodować ADSC za pomocą pożywki do indukcji neuronalnej, a następnie wykryć specyficzną dla neuronów enolazę i polipeptyd mediatora neurofilamentu za pomocą immunofluorescencji15.
    1. Utrwal komórki w 4% paraformaldehydzie przez 30 minut w temperaturze pokojowej, a następnie przepuszczaj 0,5% Triton X-100 w PBS przez 15 minut.
    2. Po zablokowaniu 3% BSA w PBS, inkubować komórki z przeciwciałami pierwszorzędowymi (patrz tabela materiałów) rozcieńczonymi w roztworze blokującym w temperaturze 4 °C przez noc.
    3. Inkubować komórki z przeciwciałami drugorzędowymi przez 45 minut, a następnie barwić je DAPI przez 10 minut. Następnie zbadaj komórki za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.
  11. Zebrać jednokomórkową zawiesinę ADSC za pomocą 0,05% trypsyny/EDTA, odwirować przy 600 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i ponownie zawiesić w PBS, aby dostosować gęstość komórek do 1 ×10 6/ml. Podwielokrotnić zawiesinę komórek do probówek mikrowirówek o pojemności 1,5 ml (100 μl/probówkę) i dodać znakowane FITC królicze przeciwciała monoklonalne przeciwko mysim CD29, CD90, CD34 i HLA-DR o stężeniu przeciwciał 0,5 μg/ml. Potraktuj grupę kontrolną tą samą objętością króliczego IgG FITC, inkubuj na lodzie przez 30 minut i spłucz PBS w celu usunięcia niesprzężonego przeciwciała. Wykrywanie markerów powierzchniowych ADSC za pomocą cytometrii przepływowej13.

2. Izolacja mitochondriów z tłuszczowych komórek macierzystych

UWAGA: Wszystkie operacje izolacji mitochondriów muszą być przeprowadzane na lodzie.

  1. Gdy ADSC osiągną gęstość 90%, trawić komórki za pomocą 2 ml 0,05% trypsyny/EDTA, wirować przy 600 × g przez 5 minut, zebrać i policzyć komórki i pobrać 1 × 107 komórek do każdej ekstrakcji.
  2. Ponownie zawiesić komórki w 2 ml buforu do ekstrakcji mitochondriów (do przygotowania buforu: 10 ml 0,1 M Tris-MOPS, 1 ml 0,1 M EGTA/Tris i 20 ml 1 M sacharozy; doprowadzić objętość do 100 ml wodą destylowaną i dostosować pH do 7,4) za pomocą 1x koktajlu inhibitora proteazy po umyciu 2 ml sterylnego PBS, a następnie inkubować na lodzie przez 5 minut.
  3. Homogenizować komórki 20x-30x za pomocą homogenizatora szklanego (2,0 ml) i sprawdzić stopień homogenizacji za pomocą barwienia błękitem trypanowym.
    UWAGA: Proporcja wybarwionych komórek powinna wynosić ~80%. Nadmierna homogenizacja uszkodzi strukturę mitochondriów.
  4. Odwirować homogenat komórek o masie 600 × g przez 15 minut, przenieść supernatant do nowej, wstępnie schłodzonej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i powtórzyć operację raz.
  5. Odwirować supernatant o stężeniu 7 500 × g przez 15 minut i odrzucić supernatant. Przemyć osad mitochondrialny i ponownie go zawiesić, dodając ~100 μL wstępnie schłodzonego mitochondrialnego buforu do wstrzykiwań (225 mM mannitol, 75 mM sacharozy, 10 mM KCl, 10 mM Tris-HCl i 5 mM KH2PO4, pH 7,2), w stężeniu 1-5 mg/ml (całkowite stężenie białka). Zawiesinę mitochondrialną należy transportować na lodzie.
  6. Przeanalizuj funkcję i czystość izolowanych mitochondriów za pomocą analizy cytometrii przepływowej JC-1 i Western blot (VDAC1, β-aktyna i Lamin B)13.
    1. Podziel izolowane mitochondria na trzy grupy: dimetylosulfotlenek (DMSO), JC-1 barwiony i JC-1 barwiony 30-chlorofenylohydrazonem karbonylu (CCCP) przez 30 minut.
    2. Po odwirowaniu w stężeniu 7 500 × g, odrzucić supernatant i zawiesić bufor.
    3. Uchwyć intensywność fluorescencji monomerów JC-1 (kanał FITC) i agregatów (kanał PE), które zostały wychwycone za pomocą cytometrii przepływowej. Oceń izolowane potencjały błony mitochondrialnej, mierząc stosunek średniej intensywności fluorescencji kanału PE do kanału FITC.
      UWAGA: Wykonaj powyższe kroki w ciemności.

3. Superstymulacja jajników

  1. Wstrzyknąć 10-miesięcznej samicom myszy C57BL/6 dootrzewnowo 10 j.m. gonadotropiny surowicy ciężarnej klaczy (PMSG) w celu przeprowadzenia owulacji. Po 48 godzinach wstrzyknąć dootrzewnowo 10 j.m. ludzkiej gonadotropiny kosmówkowej (hCG).
  2. Po 13 godzinach od wstrzyknięcia hCG rozerwać obrzęknięty jajowód mikroskopijną pęsetą. Uwolnij kompleksy wzgórków z obrzękniętego jajowodu. Rozpuścić wzgórki w podłożu M2 za pomocą hialuronidazy (0,3 mg/ml) w temperaturze 37 °C.
    UWAGA: Czas rozpuszczania jest krótszy niż 5 minut. Zminimalizuj czas, w którym kompleks wzgórków jest narażony na hialuronidazę, ponieważ długotrwała ekspozycja może upośledzać potencjał rozwojowy oocytów.

4. Transfer mitochondrialny wraz z ICSI

  1. Umieść plemniki bez ogona w płynie mitochondrialnym. Pozyskaj plemniki bez ogona, wycinając je za pomocą ultradźwięków17. Umieść plemniki bez ogona w płynie mitochondrialnym tak, aby w 50 μl płynu mitochondrialnego znajdowało się 100 plemników.
    UWAGA: Ponieważ zawiesina mitochondrialna jest lekko lepka i niestabilna in vitro, należy wykonać wstrzyknięcie w ciągu 30 minut i wymienić igłę do mikroiniekcji natychmiast po jej zatkaniu. Optymalna średnica wewnętrzna igły do mikroiniekcji wynosi 5 μm.
  2. Wstrzyknąć ~2 pL mitochondrialnego buforu oddechowego lub zawiesiny mitochondrialnej z plemnikami do oocytów za pomocą mikroiniektora pod mikroskopem odwróconym (200x; patrz Tabela Materiałów) w ciągu 30 minut zgodnie z protokołem Hiramoto opisanym przez Mehlmanna i Kline10,18.
    UWAGA: Wstrzyknięta zawiesina mitochondrialna stanowi 1%-3% całkowitej objętości oocytów. Kontroluj objętość (1%-3%) zawiesiny mitochondrialnej w cytoplazmie, aby zapewnić konsystencję wstrzyknięcia.
  3. Po wstrzyknięciu umieść zapłodnione oocyty w pożywce M2 w celu zrównoważenia przez 15 minut i przenieś zapłodnione jaja, które przeżyły, na pożywkę hodowlaną M16.
  4. Zbadaj ocalałe płodne jaja, obserwując gładką morfologię, tworzenie się projądrka i uwalnianie drugiego ciała polarnego 19. Obserwuj, fotografuj i licz zarodki o godzinie 09:00 i 18:00 codziennie przez 4 dni. Na koniec zbierz i zamroź blastocysty i przechowuj je w lodówce o temperaturze -80 °C w celu określenia liczby kopii ATP i mtDNA w celu oceny liczby i poprawy przeszczepu mitochondriów.
    1. Przygotuj standardowy plazmid (plazmid do bezwzględnej kwantyfikacji, jak opisano wcześniej13), do oznaczania liczby kopii mitochondrialnych zgodnie z liczbą kopii 1 ×10 7, 1 × 106, 1 × 105, 1 × 104, 1 × 103, 1 × 102 i 1 × 101. Przenieś zarodki do probówki sterylizacyjnej i dodaj 20 μl buforu lizatu, aby uwolnić mitochondrialne DNA. Następnie dezaktywować proteazę w lizacie w temperaturze 55 °C przez 20 min i w temperaturze 95 °C przez 10 minut.
    2. Określ liczbę kopii mtDNA za pomocą fluorescencyjnego ilościowego PCR, stosując następujące ustawienia: 5 μl mieszanki PCR, 0,5 μl startera B6 do przodu, 0,5 μl startera B6 rev, 2 μl produktu pirolizy i 2 μL ddH2O. Postępuj zgodnie z warunkami PCR: etap 1, 95 °C przez 3 min; etap 2, 95 °C przez 30 s, 58 °C przez 30 s i 72 °C przez 30 s; Powtórz cykl 40 razy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym protokole wyizolowaliśmy i scharakteryzowaliśmy ADSC z tłuszczu myszy (Rysunek 1). Aby uzyskać izolowane mitochondria, błona komórkowa musi zostać rozerwana za pomocą szklanego homogenizatora. (Rysunek 2A). Ważne jest, aby uzyskać jednolitą frakcję mitochondrialną bez dużych grudek, aby rurka do mikroiniekcji nie była zablokowana. Najpierw należy użyć końcówek do pipet o pojemności 200 μl, a następnie 10 μl, aby delikatnie zawiesić homogenaty; na koniec należy użyć ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Oocyty zawierają więcej mitochondriów niż jakikolwiek rodzaj komórek w organizmie, z liczbą kopii ~1-5 ×10 5 mtDNA. Mitochondria są niezbędne do dojrzewania oocytów, zapłodnienia i rozwoju embrionalnego, dlatego każda dysfunkcja mitochondriów może prowadzić do obniżenia jakości oocytów. Zmniejszona ilość i jakość mitochondriów jest ściśle związana ze starzeniem fizjologicznym. W tym protokole wprowadzono prostą metodę izolowania mitochondriów od ADSC starzejących się myszy i przenoszenia do starzejących się oo...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy pragną podziękować za wsparcie ze strony Narodowej Fundacji Nauk o Przyrodzie Chin (82001629 do X.Q.S.), Podstawowego Projektu Badawczego Biura Nauki i Technologii w Changzhou w ramach grantu numer CJ20200110 (dla Y.J.Y.), Młodzieżowego Programu Fundacji Nauk Przyrodniczych Prowincji Jiangsu (BK20200116 do X.Q.S.) oraz Finansowania Badań Podoktoranckich w Prowincji Jiangsu (2021K277B do X, Q.S.).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,05% trypsyna/EDTAGibco25300054hodowla komórkowa
  4% paraformaldehydbeyotimeP0099immunofluorescencja
40 μ m sitko komórkoweCorning352340Izolacja ADSC
indukcja adipogenicznaCyagenHUXXC-90031Wielokierunkowe różnicowanie
Roztwór do barwienia czerwienią alizarynySigmaA5533Wielokierunkowe różnicowanie
Przeciwciało przeciwko CD29Analiza przepływu558741Biosciences
Przeciwciało przeciwko CD34BD BiosciencesAnaliza przepływu560942
Przeciwciało przeciwko CD90BD Biosciences553016analiza przepływu
Przeciwciało przeciwko HLA-DRBD Biosciences555560analiza przepływu
i beta;-aktynaAbcamab-8226Test funkcji mitochondriów
BSASigmaV900933immunofluorescencja
CCCPSolarbioAnaliza przepływu mitochondriów C6700 JC-1
ChamQ Universal SYBR qPCR Master MixVazymeQ711qPCR
kolagenaza typu ISigmaSCR103Izolacja ADSC
DAPI InvitrogenD1306immunofluorescencja
DMEM-F12Gibco11320033Hodowla komórkowa
DMSOSigma276855mitochondria JC-1 analiza przepływu
EGTASigma324626Izolacja mitochondriów
FBSGibco10100147
Cytometria przepływowaBD BiosciencesFACSCanto& handel; IICharakterystyka mikroskopu
fluorescencyjnegoleicaDM2500immunofluorescencyjna
żelatynaSigma48722Wielokierunkowa
rurka do homogenizacji szkłaróżnicującego SangonF519062Izolacja mitochondriów
hCGAibeiM2520
HialuronidazaSigmaH1115000Superstymulacja jajników
  Mikroskop odwróconyOlympusIMT-2Mikroiniekcja
izolowany zestaw do barwienia mitochondriówSigmaCS0760analiza przepływu mitochondriów JC-1
JC-1SigmaT4069Test funkcji mitochondriów
KClSigmaP5405Transfer mitochondriów
KH2PO4SigmaP5655Transfer
mitochondriówLaminBAbcamab-16048Test funkcji mitochondriów
M16 MediumSigmaM7292hodowla komórek zarodkowych
M2 MediumSigmaM7167hodowla komórek zarodkowych
mannitolSigmaM9546Transfer mitochondriów
MikrowtryskiwaczOlympus+ eppendorfIX73Transfer mitochondriów
MitoTracker czerwonyInvitrogenM22425Barwienie mitochondriów
MOPSSigmaM1442Izolacja mitochondriów
polipeptyd mediatora neurofilamentu (NFM)Santa Cruz Biotechnologysc-16143Wielokierunkowe różnicowanie
indukcja neurogennaGibcoA1647801Różnicowanie wielokierunkowe
Enolaza specyficzna dla neuronu (NSE)Santa Cruz Biotechnologysc-292097Wielokierunkowe różnicowanie
Olej Red OSangonE607319Adipogenic differentiation
oil red O roztwórSigmaO1516Wielokierunkowe różnicowanie
indukcja osteogennaCyagenHUXXC-90021Wielokierunkowe różnicowanie
PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanem)HyklonSH30256.LSHodowla komórkowa
penicylina i streptomycynaSV30010klonów
PMSGAibeiM2620superstymulacji jajników
SigmaP8340Izolacja mitochondriów
sacharozaSigmaV900116Izolacja mitochondriów
TrisSigma648314Izolacja mitochondriów
Tris-HCl Sigma108319Transfer mitochondriów
Triton X-100beyotimeP0096immunofluorescencja
VDACAbcamab-14734Test funkcji mitochondriów
BD hodowli komórkowych ADSC superstymulująca jajniki Izolacja komórkowych Inhibitor proteazy

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sheng, X., et al. The mitochondrial protease LONP1 maintains oocyte development and survival by suppressing nuclear translocation of AIFM1 in mammals. eBioMedicine. 75, 103790(2022).
  2. Qi, L., et al. Mitochondria: the panacea to improve oocyte quality. Annals of Translational Medicine. 7 (23), 789(2019).
  3. Babayev, E., Seli, E. Oocyte mitochondrial function and reproduction. Current Opinion in Obstettrics & Gynecology. 27 (3), 175-181 (2015).
  4. Bentov, Y., Esfandiari, N., Burstein, E., Casper, R. F. The use of mitochondrial nutrients to improve the outcome of infertility treatment in older patients. Fertility and Sterility. 93 (1), 272-275 (2010).
  5. Ben-Meir, A., et al. Coenzyme Q10 restores oocyte mitochondrial function and fertility during reproductive aging. Aging Cell. 14 (5), 887-895 (2015).
  6. He, Y., Wang, Y., Zhang, H., Zhang, Y., Quan, F. Alpha-lipoic acid improves the maturation and the developmental potential of goat oocytes in vitro. Reproduction in Domestic Animals. 56 (4), 545-554 (2021).
  7. Gunalan, E., Yaba, A., Yilmaz, B. The effect of nutrient supplementation in the management of polycystic ovary syndrome-associated metabolic dysfunctions: A critical review. Journal of the Turkish German Gynecological Association. 19 (4), 220-232 (2018).
  8. Liu, M., et al. Resveratrol protects against age-associated infertility in mice. Human Reproduction. 28 (3), 707-717 (2013).
  9. Cohen, J., Scott, R., Schimmel, T., Levron, J., Willadsen, S. Birth of infant after transfer of anucleate donor oocyte cytoplasm into recipient eggs. Lancet. 350 (9072), 186-187 (1997).
  10. Wang, Z. B., et al. Transfer of autologous mitochondria from adipose tissue-derived stem cells rescues oocyte quality and infertility in aged mice. Aging. 9 (12), 2480-2488 (2017).
  11. Mobarak, H., et al. Autologous mitochondrial microinjection; a strategy to improve the oocyte quality and subsequent reproductive outcome during aging. Cell & Bioscience. 9, 95(2019).
  12. Bagheri, H. S., et al. Mitochondrial donation in translational medicine; from imagination to reality. Journal of Translational Medicine. 18 (1), 367(2020).
  13. Sheng, X., et al. Mitochondrial transfer from aged adipose-derived stem cells does not improve the quality of aged oocytes in C57BL/6 mice. Molecular Reproduction & Development. 86 (5), 516-529 (2019).
  14. Arana, M., Mazo, M., Aranda, P., Pelacho, B., Prosper, F. Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells: isolation, expansion, and characterization. Methods in Molecular Biology. 1036, 47-61 (2013).
  15. Yang, Y., Zhang, C., Sheng, X. Isolation and culture of three kinds of umbilical cord mesenchymal stem cells. Journal of Visualized Experiments. (186), e64065(2022).
  16. Yang, Y., et al. Transplantation of umbilical cord-derived mesenchymal stem cells on a collagen scaffold improves ovarian function in a premature ovarian failure model of mice. In Vitro Cellular & Developmental Biology Animal. 55 (4), 302-311 (2019).
  17. Ward, M. A., Yanagimachi, R. Intracytoplasmic sperm injection in mice. Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (1), (2018).
  18. Rinaudo, P., et al. Microinjection of mitochondria into zygotes creates a model for studying the inheritance of mitochondrial DNA during preimplantation development. Fertility and Sterility. 71 (5), 912-918 (1999).
  19. Arroyo, G., et al. Pronuclear morphology, embryo development and chromosome constitution. Reproductive Biomedicine Online. 20 (5), 649-655 (2010).
  20. Gosden, R. G., Johnson, M. H. Can oocyte quality be augmented. Reproductive Biomedicine Online. 32 (6), 551-555 (2016).
  21. Su, J., et al. Transplantation of adipose-derived stem cells combined with collagen scaffolds restores ovarian function in a rat model of premature ovarian insufficiency. Human Reproduction. 31 (5), 1075-1086 (2016).
  22. Beane, O. S., Fonseca, V. C., Cooper, L. L., Koren, G., Darling, E. M. Impact of aging on the regenerative properties of bone marrow-, muscle-, and adipose-derived mesenchymal stem/stromal cells. PLoS One. 9 (12), 115963(2014).
  23. Hartwig, S., et al. A critical comparison between two classical and a kit-based method for mitochondria isolation. Proteomics. 9 (11), 3209-3214 (2009).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

mezenchymalne kom rki macierzyste pochodzenia t uszczowegojako oocyt wdysfunkcja mitochondri wautologiczny przeszczep mitochondri wtransfer cytoplazmatyczny oocyt wniep odno u kobietstarzenie si oocyt w
Film wkrótce dostępny

Powiązane artykuły