Rekonstrukcja i charakterystyka kompozytów aktynowo-mikrotubulowych o regulowanej dynamice i mechanice napędzanej silnikiem

Mehrzad Sasanpour; Daisy H. Achiriloaie; Gloria Lee; Gregor Leech; Maya Hendija; K. Alice Lindsay; Jennifer L. Ross; Ryan J. McGorty; Rae M. Robertson-Anderson

doi:10.3791/64228

Artykuł metodologiczny

Rekonstrukcja i charakterystyka kompozytów aktynowo-mikrotubulowych o regulowanej dynamice i mechanice napędzanej silnikiem

DOI:

10.3791/64228

⸱

25 sierpnia 2022

Mehrzad Sasanpour¹ , Daisy H. Achiriloaie¹^,² , Gloria Lee¹ , Gregor Leech¹ , Maya Hendija¹ , K. Alice Lindsay³ , Jennifer L. Ross³ , Ryan J. McGorty¹ , Rae M. Robertson-Anderson¹

¹Department of Physics and Biophysics, University of San Diego, ²W. M. Keck Science Department, Scripps College, Pitzer College, and Claremont McKenna College, ³Department of Physics, Syracuse University

W tym artykule

Informacja o sprostowaniu

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten artykuł przedstawia protokoły do inżynierii i charakteryzowania przestrajalnych trójwymiarowych sieci kompozytowych współsplątanych filamentów aktynowych i mikrotubul. Kompozyty przechodzą aktywną restrukturyzację i ruch balistyczny, napędzany silnikami miozyny II i kinezyny, a także są dostrojone przez względne stężenia aktyny, mikrotubul, białek motorycznych i pasywnych środków sieciujących.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cytoszkielet kompozytowy, składający się z oddziałujących ze sobą sieci półelastycznych włókien aktynowych i sztywnych mikrotubul, restrukturyzuje się i generuje siły, wykorzystując białka motoryczne, takie jak miozyna II i kinezyna, do kierowania kluczowymi procesami, takimi jak migracja, cytokineza, adhezja i mechanosensing. Podczas gdy interakcje aktyna-mikrotubule są kluczem do wszechstronności i zdolności adaptacyjnych cytoszkieletu, zrozumienie ich wzajemnego oddziaływania z aktywnością miozyny i kinezyny jest wciąż w powijakach. W tej pracy opisano, jak zaprojektować przestrajalne trójwymiarowe sieci kompozytowe współsplątanych włókien aktynowych i mikrotubul, które przechodzą aktywną restrukturyzację i ruch balistyczny, napędzane silnikami miozyny II i kinezyny i są dostrojone przez względne stężenia aktyny, mikrotubul, białek motorycznych i pasywnych środków sieciujących. Szczegółowo opisano również protokoły znakowania fluorescencyjnego mikrotubul i filamentów aktynowych w celu jak najskuteczniejszej wizualizacji restrukturyzacji i ruchu kompozytu za pomocą wielospektralnego obrazowania konfokalnego. Na koniec przedstawiono wyniki metod analizy danych, które można wykorzystać do ilościowego scharakteryzowania struktury, dynamiki i mechaniki nierównowagowej. Odtworzenie i zbadanie tej przestrajalnej platformy biomimetycznej dostarcza cennych informacji na temat tego, w jaki sposób sprzężona aktywność motoryczna, mechanika kompozytowa i dynamika włókien mogą prowadzić do niezliczonych procesów komórkowych, od mitozy, przez polaryzację, po mechano-czucie.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cytoszkielet to dynamiczna sieć kompozytowa oddziałujących ze sobą biopolimerów, która zapewnia strukturalne i mechaniczne wsparcie komórkom. Powiązane silniki molekularne i białka wiążące restrukturyzują i dostosowują cytoszkielet, aby umożliwić komórkom wzrost, zmianę kształtu, sztywnienie, poruszanie się, a nawet samoleczenie, umożliwiając niezliczone procesy komórkowe, od migracji i podziału po mechanosensing¹^,². Poza znaczeniem w biofizyce komórkowej, cytoszkielet jest również kwintesencją materii aktywnej z potencjalnymi zastosowaniami materiałowymi, od gojenia ran i dostarczania leków po filtrację i miękką robotykę^1,³^,⁴^,5^,⁶^,⁷^,⁸^,⁹.

Dwie kluczowe cechy, które nadają cytoszkieletowi unikalną strukturalną i mechaniczną różnorodność oraz wielofunkcyjność, to: 1) jego kompozytowa natura, składająca się z wielu oddziałujących ze sobą filamentów białkowych, takich jak półelastyczne filamenty aktynowe i sztywne mikrotubule, a także związane z nimi białka wiążące i sieciujące³^,⁵^,¹⁰; oraz 2) jego zdolność do ciągłej restrukturyzacji, poruszania się, zgrubienia i wykonywania pracy za pomocą energochłonnych silników, takich jak miozyny i kinezyny, popychających i ciągnących białka nitkowate^1,⁷^,¹¹^,¹²^,¹³. Podczas gdy ta elegancka złożoność umożliwia cytoszkieletowi pośredniczenie w procesach tak różnorodnych, jak ruchliwość komórek, cytokineza i gojenie się ran³^,⁶^,7^,¹¹, utrudnia to badaczom odtworzenie charakterystycznych cech cytoszkieletu in vivo w odtworzonych systemach in vitro.

Obecne wysiłki związane z rekonstytucją granic koncentrują się na kompozytach splątanych i usieciowanych włókien aktynowych oraz mikrotubul³^,¹⁰^,¹⁴^,¹⁵^,¹⁶^,¹⁷, sieci aktomiozyny generujące siły2^,⁸^,¹⁸^,¹⁹^,²⁰^,²¹, oraz aktywne nematyki sterowane interakcjami kinezyna-mikrotubula²²^,²³^,²⁴^,²⁵^,²⁶. Wykazano, że kompozyty aktynowo-mikrotubule w stanie ustalonym wykazują powstańcze właściwości mechaniczne¹⁵^,¹⁶^,²⁷, takie jak zwiększona mobilność włókien i zwiększona sztywność w porównaniu z systemami jednoskładnikowymi²⁷. Badania nad układami aktomiozyny in vitro wykazały szeroki zakres właściwości strukturalnych i dynamicznych, które zależą od stężeń aktyny, miozyny i środków sieciujących²⁸^,²⁹^,³⁰^,³¹. Na przykład, przy wystarczającym usieciowaniu, sieci aktomiozyny ulegają dużemu skurczeniu i zgrubnieniu²^,²⁸^,³⁰^,³²^,³³^,³⁴^,³⁵^,³⁶, podczas gdy bez crosslinkerów sieci wyświetlają się szybko, destabilizujący przepływ i pękanie¹⁹^,²⁹. Doniesiono, że odtworzone aktywne nematyki oparte na mikrotubulach, które wykorzystują klastry silników kinezynowych do sieciowania i ciągnięcia wiązek mikrotubul, wykazują długotrwałe przepływy turbulentne, rozciąganie, wyboczenie, pękanie i gojenie¹²^,²²^,²³^,²⁴^,²⁵^,³⁷^,³⁸^,³⁹^,⁴⁰^,⁴¹^,⁴²^,⁴³^,⁴⁴^,⁴⁵^,⁴⁶^,⁴⁷.

Ostatnio wykazano, że kompozyty aktynowo-mikrotubulowe napędzane mini-włóknami miozyny II prowadzą do bardziej uporządkowanego skurczu i integralności sieci w porównaniu z nieuporządkowanym przepływem i pęknięciem sieci, które wykazują sieci aktomiozyny bez środków sieciujących¹⁷^,²⁶^,⁴⁸. Co więcej, połączenie wytrzymałości kompozytu i generowania siły jest zoptymalizowane, gdy aktyna i mikrotubule są obecne w porównywalnych stężeniach. Kluczowe cechy pojawiające się w tym obszarze przestrzeni formulacji obejmują zwiększoną wytrzymałość mechaniczną²⁶, skoordynowany ruch aktyny i mikrotubul²⁶, stały, utrzymujący się skurcz i restrukturyzację mezoskalową¹⁷.

Tutaj opisane są protokoły do inżynierii i dostrajania współsplątanych i usieciowanych kompozytów mikrotubul i włókien aktynowych, które są wypychane z równowagi przez mini-filamenty miozyny II i klastry kinezyny działające odpowiednio na filamenty aktynowe i mikrotubule (Rysunek 1). Dynamika, struktura i mechanika tej klasy kompozytów może być dostrojona przez względne stężenia włókien, silników i środków sieciujących, aby wykazać bogatą przestrzeń fazową przepływu adwekcyjnego i turbulentnego, skurczu izotropowego, przyspieszenia, opóźnienia, wymieszania, usztywnienia, relaksacji i pękania. Prace te koncentrują się na przygotowaniu i dostrojeniu tej klasy aktywnych kompozytów cytoszkieletu. Jednak, aby pomóc naukowcom w analizie porównawczej i charakterystyce opisywanych aktywnych kompozytów, szczegółowo opisano również skuteczne metody obrazowania wykorzystujące wielospektralną mikroskopię konfokalną. Na koniec przedstawiono wyniki kluczowych metod analizy obliczeniowej, które można wykorzystać do pomiaru dynamiki, struktury i mechaniki kompozytów. Zachęca się naukowców do stosowania tych metod - które obejmują różnicową mikroskopię dynamiczną (DDM), autokorelację obrazu przestrzennego (SIA) i prędkość obrazu cząstek (PIV) - ponieważ zostały one zoptymalizowane w celu scharakteryzowania złożonej dynamiki i różnorodności strukturalnej kompozytów¹⁷^,²⁶^,⁴⁹.

Kroki opisane poniżej skupiają się na przygotowaniu kompozytów i zobrazowaniu ich za pomocą mikroskopii konfokalnej. Protokoły opisujące analizę danych po akwizycji i pomiary pęsetą optyczną można znaleźć w poprzednich pracach ¹⁷^,²⁶^,⁴⁸^,⁵⁰, i dostarczane na życzenie. Wszystkie materiały są wymienione w dostarczonej tabeli materiałów.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotuj silanizowane szkiełka nakrywkowe i szkiełka mikroskopowe, aby zapobiec adsorpcji białek na powierzchniach komór

UWAGA: To jest proces trwający 2 dni. Szkiełka silanizowane można przygotować do 1 miesiąca przed użyciem.

Umieść szkiełka nakrywkowe nr 1 (24 mm x 24 mm) i szkiełka mikroskopowe (1 cal x 3 cale) w wyznaczonym stojaku, który zmieści się w czyszczarce plazmowej. Umieść stojak w myjce plazmowej i uruchom przez 20 minut.
Przenieś szkiełka nakrywkowe i szkiełka do nowego stojaka przeznaczonego wyłącznie do użytku z silanem i umieść stojak w szklanym pojemniku, aby wyczyścić okulary, jak opisano poniżej.
1. Zanurz szkiełka nakrywkowe i szkiełka w 100% acetonie na 1 godzinę. Zanurz szkiełka nakrywkowe i szkiełka w 100% etanolu na 10 min.
2. Zanurz szkiełka nakrywkowe i szkiełka podstawowe w wodzie dejonizowanej (DI) na 5 minut. Powtórz czynności czyszczenia jeszcze dwa razy.
3. Zanurz szkiełka nakrywkowe i szkiełka w świeżo przygotowanym 0,1 M KOH na 15 minut. Zanurz szkiełka nakrywkowe i szkiełka w świeżym DI na 5 minut. Powtórz ten krok jeszcze dwa razy.
Suszyć szkiełka nakrywkowe i szkiełka podstawowe na powietrzu przez 10 minut. Czyścione szkiełka nakrywkowe i szkiełka należy traktować silanem, aby uzyskać powierzchnie hydrofobowe, jak opisano poniżej.
UWAGA: Wykonaj następujące czynności w dygestorium.
1. Zanurz wysuszone szkiełka nakrywkowe i szkiełka w 2% silanie (rozpuszczonym w toluenie) na 5 minut. Użyj lejka, aby wlać silan z powrotem do przeznaczonej do tego butelki, aby użyć ponownie do pięciu razy.
2. Zanurz szkiełka nakrywkowe i szkiełka w 100% etanolu na 5 minut. Zastąp etanol świeżym etanolem. Zanurz szkiełka nakrywkowe i szkiełka na 5 minut.
3. Zanurz szkiełka nakrywkowe i szkiełka w świeżym DI na 5 minut. Powtórz etap mycia etanolem i DI jeszcze dwa razy, używając za każdym razem świeżego etanolu i DI. Suszyć na powietrzu szkiełka nakrywkowe i szkiełka podstawowe przez 10 min.

2. Przygotowanie aktywnego kompozytu aktynowo-mikrotubulowego napędzanego mini-filamentami miozyny

Usuń nieaktywną miozynę poprzez wiązanie filamentu aktynowego i wykonaj ściąganie za pomocą ultrawirowania, jak opisano poniżej.
1. Polimeryzuj aktynę we włókna. Za pomocą precyzyjnej mikropipety i sterylnych końcówek pipet wymieszaj w probówce do mikrowirówki: 1,87 μl DI, 1,3 μL 10x buforu G, 1,3 μL 10x buforu F, 1,63 μL 4 M KCl, 4,53 μL aktyny (47,6 μM) i 1,08 μL 100 μM falloidyny.
  UWAGA: Aby zapewnić wystarczającą polimeryzację, stężenie aktyny i stosunek molowy aktyny do falloidyny powinny wynosić odpowiednio 18,4 μM i 2:1.
2. Delikatnie pipetować roztwór w górę i w dół, aby wymieszać, a następnie umieścić na lodzie w ciemności przez ≥1 godzinę. Schłodzić ultrawirówkę do temperatury 4 °C. Usunąć porcję miozyny z -80 °C i umieścić na lodzie.
  UWAGA: Wykonaj krok 2.2 w tym momencie, gdy aktyna polimeryzuje.
3. Po ≥1 h polimeryzacji aktyny dodać 1,3 μl 10 mM ATP i 2 μL 19 μM miozyny do spolimeryzowanej aktyny.
  UWAGA: Stosunek molowy aktyny do miozyny powinien wynosić >5, aby zapewnić wystarczające usunięcie nieaktywnych silników miozyny (tj. martwych głów).
4. Delikatnie pipetować roztwór w górę i w dół, aby wymieszać. Przenieść do probówki klasy ultrawirówkowej.
  Wirować w temperaturze 4 °C i 121,968 x g przez 30 min.
Przygotować splątaną sieć kompozytową włókien aktynowych i mikrotubul zgodnie z opisem poniżej.
UWAGA: Rozpocznij 30 minut przed odwirowaniem miozyny (krok 2.1.4).
1. Ustaw blok grzewczy na 37 °C. Za pomocą precyzyjnej mikropipety i sterylnych końcówek pipet dodaj do probówki do mikrowirówki: 13,9 μl PEM, 3 μL 1% Tween20, 1,55 μL 47,6 μM aktyny, 0,36 μL 34,8 μM R-aktyny, 0,3 μL 250 mM ATP, 0,87 μl 100 μM falloidyny, 1,91 μl 5-488-tubuliny, 0,3 μl 100 mM GTP i 0,75 μL 200 μM taksolu, do całkowitej objętości 23 μL,
  UWAGA: Podane stężenia aktyny i tubuliny dotyczą kompozytu z 2,9 μM aktyną i 2,9 μM tubuliną. Całkowite stężenie białka wynosi c = c_A+ c_T = 5,8 μM, a molowa frakcja aktyny wynosi c_A/(c_A + c_T) = Φ_A= 0,5. Zobacz krok 2.5, aby dostosować te wartości.
2. Delikatnie pipetować roztwór w górę i w dół, aby wymieszać i umieścić na bloku grzewczym o temperaturze 37 °C, chronionym przed światłem na 1 godzinę.
Przygotuj komory na próbki do eksperymentów z obrazowaniem konfokalnym, jak opisano poniżej.
UWAGA: Kroki 2.1.4 i 2.2.2 należy wykonać w okresach oczekiwania.
1. Umieść dwa silanizowane szkiełka obok siebie na płycie grzejnej (wyłączonej), połóż dwa paski termoplastycznej folii uszczelniającej w poprzek szkiełek w odległości ~3 mm od siebie i umieść dwa silanizowane szkiełka nakrywkowe na termoplastycznej folii uszczelniającej, aby utworzyć komorę na próbkę.
2. Obróć płytę grzejną na niskie ustawienie, aż szkiełka nakrywkowe mocno zwiążą się ze szkiełkami ze stopioną termoplastyczną folią uszczelniającą (~1-2 min). Dociśnij z równomiernym naciskiem, aby zapewnić wiązanie przy zachowaniu odstępu ~100 μm między dwiema powierzchniami.
3. Wyjmij komory i wyłącz płytę grzejną. Oznacz komory symbolami (+) i (-). Komora (+) będzie przeznaczona dla próbki aktywnej (z miozyną), a komora (-) będzie kontrolna (bez miozyny). Upewnij się, że każda komora może pomieścić ≤10 μl płynu.
Przygotuj próbki do obrazowania zgodnie z poniższym opisem.
UWAGA: Ważne jest, aby wykonać ten krok natychmiast po wykonaniu kroków 2.1 i 2.2.
1. Ostrożnie usunąć próbkę miozyny-aktyny z ultrawirówki (krok 2.1.4) i natychmiast odpipetować górne 7,5 μl supernatantu i przenieść do nowej probówki do mikrowirówki.
2. Wyjmij próbkę mikrotubuli aktyny z bloku grzewczego i delikatnie wymieszaj z 1,5 μl 10x D-Glukozy, 1,5 μl 10x GOC i 1,5 μl 1 mM blebbisatyny. Podzielić roztwór na dwie podwielokrotności po 13,7 μl i oznaczyć jako (+) i (-).
3. Zmieszać z 1,28 μl supernatantu z kroku 2.4.1 do (+) podwielokrotności. Zmieszać 1,28 μl DI z podwielokrotnością (-). Powoli przelej każdy roztwór do odpowiedniej komory (krok 2.3) poprzez działanie kapilarne. Uważaj, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza do kanału.
4. Uszczelnij dwa otwarte końce każdego kanału szybkoschnącym klejem epoksydowym lub UV. Upewnij się, że klej jest całkowicie suchy przed umieszczeniem go w mikroskopie. Obraz natychmiast, zgodnie z opisem w kroku 3.
  UWAGA: Klej UV jest korzystny, ponieważ utwardza się niemal natychmiast po ekspozycji na promieniowanie UV. Ponieważ jednak blibstatyna jest wrażliwa na promieniowanie UV, ważne jest, aby tylko miejscowo oświetlać klej (na krawędziach komory próbki) za pomocą małej różdżki UV, aby uniknąć dezaktywacji bkubstatyny.
Opcjonalnie: zmieniaj stężenia białek, aby dostroić dynamikę i strukturę kompozytów.
UWAGA: Poniższe kroki są sugerowanymi zmianami w powyższych krokach w celu zmiany stężeń aktyny, mikrotubul i miozyny, jeśli jest to pożądane.
1. Postępuj zgodnie z krokami opisanymi powyżej, z wyjątkiem następujących modyfikacji w krokach 2.2.1 i 2.4.3.
2. Aby zmienić stężenia aktyny i mikrotubul, dostosowując w ten sposób c i Φ_A, zwiększ lub zmniejsz objętość aktyny, R-aktyny i 5-488-tubuliny użytych w kroku 2.2.1, zgodnie z potrzebami²⁶. Zmieniając stężenie aktyny, dostosuj proporcjonalnie stężenia molowe R-aktyny i falloidyny, aby utrzymać te same proporcje molowe z aktyną. Dostosuj objętość PEM tak, aby końcowa objętość mieszaniny pozostała 23 μl. Wszystkie inne objętości i stężenia składników pozostają takie same.
3. Aby zmienić stężenie miozyny, dostosuj objętość miozyny dodawanej do podwielokrotności (+) w kroku 2.4.3 zgodnie z potrzebami. Dostosuj odpowiednio objętość DI dodaną do podwielokrotności (-). Dostosuj objętość PEM w kroku 2.2.1, aby uwzględnić wzrost lub spadek objętości miozyny (+) i DI (-), upewniając się, że końcowa objętość każdej próbki ((+) i (-)) wynosi 14,98 μl.

3. Obrazowanie i charakterystyka aktywnych kompozytów za pomocą mikroskopii konfokalnej

Aby zobrazować kompozyty aktomiozyno-mikrotubule przygotowane w kroku 2, należy użyć laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego (LSCM) lub podobnego mikroskopu z obiektywem zanurzeniowym w oleju 60x 1,4 NA. Aby jednocześnie uwidocznić filamenty aktynowe i mikrotubule w oddzielnych kanałach fluorescencyjnych, należy użyć lasera 561 nm z filtrami wzbudzenia/emisji 565/591 nm oraz lasera 488 nm z filtrami wzbudzenia/emisji 488/525 nm.
Umieść komorę na próbkę w mikroskopie tak, aby kanał kontrolny znajdował się bezpośrednio nad obiektywem. Upewnij się, że między obiektywem a szkiełkiem nakrywkowym znajduje się interfejs olejowy.
Użyj elementów sterujących stołu montażowego, aby ustawić ostrość kompozycji kontrolnej, a następnie znajdź obie powierzchnie komory próbki. Przesuń pozycję z do środka komory na próbkę. Sprawdź, czy nie ma wyraźnych nitkowatych sieci, jak pokazano na Rysunek 2.
Kontynuując wizualizację komory kontrolnej, dostosuj intensywność każdego lasera, aby umożliwić jednoczesną wizualizację filamentów aktynowych i mikrotubul. Utrzymuj najniższą możliwą intensywność lasera, aby zapobiec fotowybielaniu (bardziej rozpowszechnionemu w kanale aktyny) i przedostawaniu się (zwykle z mikrotubul do kanału aktynowego).
Aby scharakteryzować nieaktywną próbkę kontrolną, zbierz trzy szeregi czasowe (filmy) obrazów o rozdzielczości 256 x 256 pikseli kwadratowych (213 μm x 213 μm) z prędkością 2,65 kl./s, co daje łącznie ≥1000 klatek. Zebrać każdy szereg czasowy w innym obszarze komory pobierania próbek, w odległości ≥500 μm. Upewnij się, że wykrywalny ruch jest minimalny i nie ma przepływu ani restrukturyzacji.
Wyłącz laser 488 nm i użyj elementów sterujących stage, aby przejść do komory (+).
Za pomocą lasera 568 nm zwizualizuj mikrotubule w kanale (+), aby zapewnić prawidłowe tworzenie sieci (Rysunek 2) i zidentyfikuj osiowy środek komory próbki (który może różnić się od środkowego położenia z komory kontrolnej).
Włącz laser 488 nm i powtórz krok 3.5 powyżej, wykonując następujące modyfikacje. Zbieraj szeregi czasowe przez maksymalnie 45 minut, zatrzymując akwizycję, gdy próbka wyjdzie poza pole widzenia, pęknie lub zostanie wybielona. Rejestruj 5–10 szeregów czasowych i śledź czas, w którym każdy szereg czasowy rozpoczyna się względem początku pierwszego szeregu czasowego.
Analizuj dane za pomocą DDM, SIA i PIV zgodnie z opisem w Rysunek 3, Rysunek 4, Rysunek 5 i wcześniej¹⁷^,⁴⁸^,⁵⁰^,⁵¹.
UWAGA: Laser o długości fali 488 nm lokalnie aktywuje aktywność ATPazy miozyny poprzez dezaktywację blibstatyny, dlatego powinien być włączony tylko na początku zbierania danych, tak aby t = 0 znajdowało się na początku szeregu czasowego. Te parametry akwizycji są zoptymalizowane pod kątem analizy mikroskopii dynamicznej różnicowej (DDM), jak to zrobiono wcześniej²⁶.

4. Przygotowanie aktywnych kompozytów aktynowo-mikrotubulowych napędzanych silnikami kinezynowymi

UWAGA: Poniższe kroki tworzą kompozyty aktynowo-mikrotubulowe, które są wytrącane z równowagi przez silniki kinezynowe lub kombinację kinezyny i miozyny⁵⁰.

Przygotuj silniki kinezyny i miozyny zgodnie z poniższym opisem.
1. Jeśli włącza miozynę, wykonaj krok 2.1.
2. Aby utworzyć klastry motoryczne kinezyny, które wiążą się i wywierają siły między parami mikrotubul, użyj mikropipety i sterylnych końcówek pipet, aby dodać następujące składniki do sterylnej probówki mikrowirówki o pojemności 1,5 ml: 1,16 μl PEM, 2,74 μl 8,87 μM dimery kinezyny, 7,29 μL 83,3 μM NeutrAvidin, 0,81 μL 2 mM DTT. Delikatnie wymieszać, pipetując roztwór w górę i w dół, i inkubować w osłonie przed światłem (użyć czarnej probówki do mikrowirówki lub zawinąć w folię) przez 30 minut w temperaturze 4 °C.
  UWAGA: Stosunek molowy dimerów kinezyny do NA wynosi 1:25.
Wykonaj krok 2.3, aby przygotować komory na próbki i zrobić trzy komory zamiast dwóch. Wykonaj ten krok podczas inkubacji kinezyny (krok 4.1.2) i ultrawirowania miozyny (krok 4.1.1).
Przygotuj współsplątaną sieć kompozytową filamentów aktynowych i mikrotubul.
1. Ustawić blok grzejny na 37 °C. Za pomocą mikropipety i sterylnych końcówek pipet dodać do sterylnej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml: 3,21 μl PEM, 4,5 μl 1% Tween20, 2,18 μL 47,6 μM aktyny, 3,46 μl 5-R-tubuliny, 4,5 μl 100 mM ATP, 4,5 μl 10 mM GTP, 1,13 μl 200 μM taksolu i 1,57 μl 20 μM 488-falloidyny. Upewnij się, że całkowita objętość wynosi 25 μl.
2. Delikatnie pipetować roztwór w górę i w dół, aby wymieszać i umieścić na bloku grzewczym o temperaturze 37 °C, chronionym przed światłem na 1 godzinę. Wyjmij probówkę z bloku grzewczego i za pomocą mikropipety delikatnie wymieszaj 0,84 μl 100 μM falloidyny. Inkubować przez 5-10 minut w temperaturze pokojowej, chronić przed światłem.
  UWAGA: Dodanie falloidyny na tym etapie, a nie w kroku 4.3.1, poprawia znakowanie fluorescencyjne włókien aktynowych, ponieważ 488-falloidyna nie musi konkurować z nieznakowaną falloidyną o miejsca wiązania aktyny.
Przygotowanie kompozytów aktywnych do obrazowania konfokalnego.
1. Dodać 1,13 μl 200 μM blebbistatyny, 1,35 μl 10x Glu i 1,35 μl 10x GOC do roztworu z kroku 4.3.2 i delikatnie wymieszać, pipetując w górę i w dół. Podzielić roztwór na trzy podwielokrotności po 10 μl i oznaczyć jako (K), (K+M) i (-).
2. Zmieszać 2,54 μl miozyny z kroku 2.1.4 do podwielokrotności (K+M). Zmieszać 2,54 μl PEM z podwielokrotnościami (K) i (-).
3. Za pomocą mikropipety i sterylnych końcówek do pipet dodać 2,5 μl klastrów kinezyny z kroku 4.1.2 do podwielokrotności (K) i (K+M). Pipetować w górę i w dół, aby wymieszać. Wymieszać 2,5 μl PEM z (-) przy użyciu tej samej techniki.
  UWAGA: Podane stężenia aktyny i tubuliny dotyczą kompozytu o zawartości 2,32 μM aktyny i 3,48 μM tubuliny. Całkowite stężenie białka wynosi c = c_A+ c_T = 5,8 μM, a molowa frakcja aktyny wynosi c_A/(c_A + c_T) = Φ_A= 0,4. Stężenia kinezyny i miozyny wynoszą odpowiednio 0,35 μM i 0,47 μM. Zobacz krok 2.5, aby uzyskać ogólne wskazówki dotyczące regulacji c_A, c_T, c i Φ_A.
4. Za pomocą mikropipety powoli przelej każdy roztwór do odpowiedniego kanału przygotowanych komór na próbki (krok 4.2) poprzez działanie kapilarne. Bardzo powoli i delikatnie docisnąć pipetę, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza do kanału.
5. Uszczelnij dwa otwarte końce każdego kanału szybkoschnącym klejem epoksydowym lub utwardzanym promieniami UV. Upewnij się, że klej jest całkowicie suchy przed umieszczeniem go w mikroskopie.
  UWAGA: Ważne jest, aby ten krok został wykonany szybko, aby zminimalizować czas, w którym kinezyna działa bez monitorowania. Z tego powodu zalecana jest żywica epoksydowa, która utwardza się w ciągu 1 minuty (zamiast 5 lub 10 minut). Klej utwardzany promieniami UV jest pod tym względem korzystny, ponieważ utwardza się niemal natychmiast po ekspozycji na promieniowanie UV.
Obrazy należy przygotować natychmiast po kroku 3, z wyjątkiem następujących ważnych modyfikacji. Ponieważ kinezyna nie jest kontrolowana przez aktywację światłem, zaczyna działać natychmiast po kroku 4.4.3, więc oznacz ten czas jako t = 0. Aby zobrazować kompozyt jak najbardziej zbliżony do początkowego stanu nieaktywnego (t = 0), należy najpierw zobrazować kanały (K) i (K+M) i zanotować czas, jaki upłynął między krokiem 4.4.3 a początkiem akwizycji danych (krok 3.8). W praktyce czas ten, który upłynął, wynosi ~5 min.

5. Włączanie pasywnych środków sieciujących do aktywnych kompozytów

UWAGA: Te kroki opisują, jak używać biotynylowanych podjednostek aktyny i tubuliny oraz NeutrAwidyny (NA) do pasywnego sieciowania aktyny z aktyną (A-A) lub mikrotubul z mikrotubulami (M-M) w aktywnych kompozytach opisanych w kroku 4.

Przygotować kompleksy sieciujące A-A lub M-M z biotynylowanymi białkami (biotyna-aktyna lub biotyna-tubulina), NA i biotyną w stosunku 2:2:1 biotyna-aktyna/tubulina:biotyna:NA. Rozpocznij ten proces przed krokiem 4 .
1. W przypadku środków sieciujących AA użyj mikropipety i sterylnych końcówek pipet, aby dodać 2 μl 11,6 μM biotyny-aktyny, 1,39 μl 8,33 μM NA, 2,27 μL 1,02 μM biotyny i 4,34 μl PEM do probówki mikrowirówkowej. Delikatnie mieszać, pipetując w górę i w dół.
2. W przypadku środków sieciujących M-M użyj mikropipety i sterylnych końcówek pipet, aby dodać 1,86 μl 4,55 μM biotyny-tubuliny, 1,11 μl 8,33 μM NA, 1,82 μl 1,02 μM biotyny i 5,21 μl PEM do probówki mikrowirówkowej. Delikatnie mieszać, pipetując w górę i w dół.
3. Owinąć rurkę (rurki) z kroku 5.1.1 i/lub 5.1.2 termoplastyczną folią uszczelniającą, aby uzyskać wodoszczelne uszczelnienie. Umieścić na tratwie flotacyjnej w kąpieli sonicyjnej o kontrolowanej temperaturze ustawionej na 4 °C.
4. Sonikować przez 90 minut w temperaturze 4 °C. W praktyce najlepiej jest umieścić sonikator w chłodnym pomieszczeniu i dodać okłady z lodu do kąpieli sonikacyjnej, aby utrzymać niską temperaturę.
Aby włączyć kompleksy sieciujące do próbek do obrazowania, wykonaj krok 4.3, modyfikując krok 4.3.1 zgodnie z poniższym opisem dla sieciowania A-A (krok 5.2.1) lub sieciowania M-M (krok 5.2.2).
1. W celu sieciowania A-A połącz w probówce mikrowirówkowej: 1,94 μl PEM, 4,50 μl 1% Tween20, 2,18 μl 47,6 μM aktyny, 3,46 μL 45,5 μM 5-R-tubuliny, 1,13 μl środków sieciujących AA (krok 5.1.1), 4,50 μL 100 mM ATP, 4,50 μL 10 mM GTP, 1,13 μl 200 μM taksolu i 1,57 μl 20 μM 488-falloidyny. Upewnij się, że całkowita objętość wynosi 25 μl.
2. W przypadku sieciowania M-M połącz w probówce mikrowirówkowej: 1,97 μl PEM, 4,50 μl 1% Tween20, 2,18 μL 47,6 μM aktyny, 3,76 μL 45,5 μM 5-R-tubuliny, 1,13 μL rozcieńczenia 1:4 środków sieciujących M-M (krok 5.1.2), 4,50 μL 100 mM ATP, 4,50 μl 10 mM GTP, 1,13 μL 200 μM taksolu i 1,57 μl 20 μM 488-falloidyny. Upewnij się, że całkowita objętość wynosi 25 μl.
Postępuj zgodnie z krokami 4.3.2-4.5 z określonymi stężeniami dla stosunku molowego środka sieciującego do aktyny wynoszącego R_A = 0,02 i stosunku molowego środka sieciującego do tubuliny wynoszącego R_T = 0,005. Te wartości_{R A} i_{R T} dają podobne długości między sieciownikami wzdłuż włókien aktynowych i mikrotubul (d_A 60 nm i d_MT 67 nm), oszacowane za pomocą d_A =_monomer I/2R_A, gdzie_monomer I jest długością monomeru aktyny, a d_MT =_{pierścień I}/26R_T, gdzie_pierścień I jest długością pierścienia 13 tubuliny¹⁵^,¹⁷.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby określić pomyślne przygotowanie aktywnych kompozytów (Rysunek 1), oraz scharakteryzować ich dynamikę i strukturę, laserowy skaningowy mikroskop fluorescencyjny z co najmniej dwoma kanałami fluorescencyjnymi jest używany do jednoczesnej wizualizacji filamentów aktynowych i mikrotubul (Rysunek 2 i Rysunek 6). Wszystkie filamenty aktynowe i mikrotubule w kompozytach są słabo znakowane, a nie domieszkowane w jasnych włóknach znacznikowych, jak to często ma miejsce w badaniach in vitro. Metoda ta zapewnia, że mierzona dynamika i struktura są reprezentatywne dla samego kompozytu, a nie dla znaczników, które powstają w innych warunkach niż kompozyty. Z tego powodu pojedyncze filamenty aktynowe i mikrotubule zazwyczaj nie mogą być rozdzielone, a obrazy przedstawiają mezoskalową strukturę sieci (Rysunek 2 i Rysunek 6).

To podejście do etykietowania zostało zoptymalizowane pod kątem autokorelacji obrazów przestrzennych (SIA) i analiz dynamicznej mikroskopii różnicowej (DDM), które badają dynamikę i strukturę w odwrotnej przestrzeni Fouriera (Rysunek 4, Rysunek 5, oraz Rysunek 8)⁵²^,⁵³^,⁵⁴^,⁵⁵. Prędkość obrazu cząstek (PIV) może być również używana do zobrazowania i scharakteryzowania dynamiki i pól przepływu (Rysunek 3 i Rysunek 7), ale wymaga łączenia pikseli (niższa rozdzielczość przestrzenna) i większych przyrostów czasu opóźnienia (niższa rozdzielczość czasowa) niż SIA i DDM, aby wyeliminować błędne wektory, które powstają w wyniku szumu w gęstych, niskosygnałowych obrazach. Niemniej jednak PIV jest zalecany do jakościowego badania pól przepływu i potwierdzania wyników DDM (Rysunek 4 i Rysunek 8)²⁶^,⁵⁰.

Przykładowa charakterystyka opisanych sieci za pomocą tych analiz (tj. DDM, SIA, PIV) jest dostarczana, aby pomóc badaczom w stosowaniu podobnych analiz do analizy porównawczej i charakteryzowania ich próbek. Szczegółowe opisy tych technik wykraczają jednak poza zakres niniejszej pracy. Szczegółowe opisy sposobu wykonywania DDM w tych i innych podobnych systemach, w tym przyjazny dla użytkownika kod Pythona, można znaleźć w poprzednich pracach¹⁷^,²⁶^,⁴⁹^,⁵⁰ i zawartych tam odniesieniach. Po szczegóły dotyczące sposobu wykonywania SIA i PIV na opisywanych tutaj systemach czytelnik jest kierowany do poprzednich prac¹⁷^,⁵⁰.

Kilka kontroli, opisanych poniżej, powinno być wykonanych, aby upewnić się, że kompozyty działają zgodnie z oczekiwaniami. Kompozyt bez miozyny lub kinezyny powinien wydawać się zasadniczo statyczny z minimalnymi wahaniami termicznymi lub dryftem. Filamenty aktynowe i mikrotubule powinny wydawać się współsplątane i jednorodnie rozmieszczone, z minimalnym wiązaniem, agregacją lub separacją faz aktyny i mikrotubul w polu widzenia ~200 μm x 200 μm (Rysunek 2, skrajnie po lewej)¹⁷. Podobnego wyniku należy oczekiwać w przypadku kompozytów, które zawierają miozynę, ale nie są wystawione na działanie światła o długości fali 488 nm (w celu dezaktywacji bibstatyny).

Po włączeniu miozyny i wystawieniu na działanie światła o długości 488 nm, kompozyty ulegają skurczowi, który jest w dużej mierze izotropowy i podobny dla aktyny i mikrotubul, co widać na obrazach mikroskopowych wykonanych przed i po aktywności miozyny (Rysunek 2), a także odpowiadających im polach przepływu PIV przez różne czasy aktywności (Rysunek 3). Aby określić, czy ruch jest balistyczny, dyfuzyjny, subdyfuzyjny itp., charakterystyczny czas dekoracji τ (q) wyznaczony z DDM jest obliczany jako funkcja wektora falowego (tj. przestrzeni odwrotnej). Zobacz jak opisano szczegółowo wcześniej¹⁷^,²⁶^,⁴⁹. Rysunek 4 pokazuje również, w jaki sposób można wykorzystać DDM do scharakteryzowania tych kompozytów. Skalowanie potęgowe τ (q) ~ 1 / vq^β, gdzie β = 1, wskazuje ruch balistyczny z prędkością v. Dla porównania, β = 2 reprezentuje dynamikę dyfuzyjną, gdzie v jest współczynnikiem dyfuzji. Wszystkie aktywne kompozyty wykazują skalowanie balistyczne ( Rysunek 4A) z prędkościami dostrojonymi przez stężenia aktyny i miozyny (Rysunek 4B) i które mogą zmieniać się w czasie podczas aktywności, przyspieszając lub zwalniając ( Rysunek 4C,D).

Restrukturyzacja i grupowanie sieci, widoczne w Rysunek 2 i bardziej widoczne dla wyższych stężeń aktyny i miozyny, można scharakteryzować za pomocą SIA, jak pokazano w Rysunek 5, i opisane wcześniej¹⁷^,⁴⁸^,⁵⁰. Krótko mówiąc, długość korelacji ξ, która jest miarą charakterystycznego rozmiaru cech na obrazie, można wyznaczyć, dopasowując każdą krzywą autokorelacji intensywności przestrzennej g(r) do funkcji wykładniczej odległości r między pikselami. Większe piki g(r), które utrzymują się na dłuższych odległościach, wskazują na większe cechy strukturalne (tj. wiązanie, grupowanie poszczególnych włókien). Jak pokazano na Rysunek 5, dla wyższych frakcji aktyny i stężeń miozyny, znaczna restrukturyzacja i agregacja znajduje odzwierciedlenie we wzroście ξ w czasie.

Właściwości lepkosprężyste i nieliniowa reakcja mechaniczna aktywnych kompozytów mogą być również mierzone za pomocą pęsety optycznej mikroreologii (OTM). Jednak protokoły i reprezentatywne wyniki tych eksperymentów wykraczają poza zakres tej pracy. Zainteresowanych czytelników odsyłamy do poprzednich prac⁴⁸^,⁵⁶, które dokładnie opisują sposób wykonywania pomiarów OTM i oczekiwane wyniki.

Korzystając z tego samego programu narzędzi eksperymentalnych i analitycznych, który opisano powyżej, poniższa sekcja opisuje, jak zmienia się dynamika i struktura, gdy silniki kinezynowe i środki sieciujące biotynę-NA są włączane do kompozytów (Rysunek 6, Rysunek 7, oraz Rysunek 8). Rysunek 6 pokazuje reprezentatywne obrazy konfokalne kompozytów napędzanych albo tylko kinezyną (K), albo kinezyną i miozyną (K+M), z i bez pasywnego sieciowania (XL) filamentów aktynowych lub mikrotubul.

Włączenie kinezyny do kompozytów początkowo powoduje podobną dynamikę i restrukturyzację jak kompozyty oparte na miozynie, co widać w górnym rzędzie Rysunek 7 (Klasa 1). Jednak dynamika zazwyczaj przechodzi w przepływ anizotropowy na dużą skalę (Rysunek 7 środkowy rząd, klasa 2), przyspieszanie i zwalnianie (Rysunek 7 dolny rząd, klasa 3). Cechy te łączą się z grupowaniem i agregacją mezoskalową po 5-30 minutach (Rysunek 6 i Rysunek 8B). Pola przepływu generowane przez PIV i czasowe mapy kolorów pokazane w Rysunek 7 przedstawia przykłady restrukturyzacji izotropowej (klasa 1, górny panel), ukierunkowanego przepływu (klasa 2, środkowe panele) i dwukierunkowego przyspieszenia (klasa 3, dolne panele).

Prędkości aktyny i mikrotubul w różnych punktach czasowych podczas aktywności, określone za pomocą dopasowań do krzywych τ(q), ilustrują przyspieszenie, po którym następuje spowolnienie (Rysunek 8), które zależy od sieciowania. Jak pokazano również w Rysunek 8, gdy oba białka motoryczne są połączone, dynamika jest w rzeczywistości wolniejsza niż w przypadku kompozytów zawierających tylko kinezynę, a przepływ mezoskalowy jest opóźniony. Miozyna wspiera również bardziej jednorodne wzajemne przenikanie się sieci aktyny i mikrotubul przez cały czas trwania aktywności, a także mniejszą agregację i restrukturyzację. Efekty te można zobaczyć na obrazach w Rysunek 6 i są określone ilościowo przez zmienne w czasie długości korelacji obliczone za pomocą SIA, które są na ogół mniejsze w obecności miozyny (Rysunek 8B).

figure-results-1
Rysunek 1. Projektowanie i charakterystyka aktywnych kompozytów aktyna-mikrotubule z wieloma silnikami generującymi siłę i pasywnymi sieciownikami. (A) Monomery aktyny i dimery tubuliny są kopolimeryzowane przy stężeniach molowych c_A i c_T 0,73-11,6 μM i frakcjach molowych aktyny Φ_A = c_A / (c_A + c_T) = 0, 0,25, 0,5, 0,75 i 1, tworząc splątane sieci włókien aktynowych (zielony) i mikrotubul (czerwony). Pasywne sieciowanie uzyskuje się za pomocą NA do łączenia biotynylowanych filamentów aktyny (Actin XL) lub mikrotubul (MT XL) w stosunku molowym środek sieciujący:białko wynoszącym R_A = 0,01-0,08 i R_MT = 0,001-0,01 odpowiednio dla aktyny i mikrotubul. Minifilamenty miozyny-II (fioletowe) i klastry kinezyny (pomarańczowe), w stężeniach c_M = 0,12 - 0,48 μM i c_K = 0,2 - 0,7 μM, popychają i ciągną włókna, aby wyprowadzić kompozyty ze stanu ustalonego. (B) Schemat przestrzeni recepturowej. Minifilamenty miozyny II (M), klastry kinezyny (K) lub oba silniki (K+M) są wbudowane w kompozyty bez pasywnych środków sieciujących (No XL), usieciowań aktynowo-aktynowych (Actin XL) i mikrotubul-mikrotubul (MT XL). Nie wszystkie kreskówki są rysowane w skali. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2. Dwukolorowe obrazowanie konfokalne kompozytów cytoszkieletowych sterowanych miozyną o różnych stężeniach miozyny c_M i molowych frakcjach aktyny Φ_A. (A) Dwukolorowe obrazy z mikroskopii konfokalnej o wymiarach 256 x 128 pikseli kwadratowych (212 x 106^μm2) pokazują, w jaki sposób kompozyty filamentów aktynowych (zielony) i mikrotubul (czerwony) są przegrupowywane przez aktywność motoryczną miozyny. Nie ma silników kinezynowych ani pasywnych środków sieciujących. W każdym panelu pokazane są obrazy wykonane na początku (po lewej, przed) i na końcu (po prawej, po) 45-minutowej aktywacji miozyny (poprzez oświetlenie światłem o długości fali 488 nm w celu dezaktywacji bibistatyny). Panele są uporządkowane przez zwiększanie stężenia molowego miozyny (c_M), idąc od lewej do prawej, i zwiększając frakcję molową aktyny (Φ_A), idąc od góry do dołu. Kolory otaczające każdy panel są zgodne z kodowaniem kolorów używanym w Rysunek 4 i Rysunek 5. Podziałka wynosi 50 μM. Aby jak najlepiej uchwycić dynamikę i strukturę do analizy, używamy szybkości klatek na sekundę 1-5 kl./s, ROI z bokami 50-250 μm i czasu trwania szeregów czasowych od 5 do 45 minut, w zależności od szybkości skurczu i przegrupowania. Panele, w których obrazy przed i po wyglądają podobnie, wskazują na minimalną restrukturyzację, co widać w panelach w kolorze różowym, karmazynowym i cyjanowym. Grupowanie na małą skalę, o czym świadczy zwiększona niejednorodność i obecność jasnych cech punktowych, można zobaczyć na pomarańczowym, zielonym i czerwonym panelu. Kurczenie się na dużą skalę, postrzegane jako jednolicie kurcząca się sieć, jest widoczne na niebieskich i fioletowych panelach. Ten rysunek został zmodyfikowany z reference¹⁷. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3. Prędkość obrazowania cząstek (PIV) pokazuje, że aktywność aktomiozyny wyzwala skoordynowaną dynamikę kurczliwości aktyny i mikrotubul w splątanych kompozytach. Pola przepływu PIV dla aktyny (górny rząd) i mikrotubul (dolny rząd) w kompozycie napędzanym miozyną o (Φ_A, c_M) = (0,5, 0,24) w rosnących czasach w ciągu 6-minutowego szeregu czasowego. Pola przepływu zostały wygenerowane za pomocą wtyczki Fiji/ImageJ PIV z czasem opóźnienia 20 s i binningiem 2 piksele x 2 piksele. Zarówno aktyna, jak i mikrotubule wykazują stały ruch skierowany w stronę środkowego obszaru pola widzenia przez cały czas trwania filmu. Podziałka skali na wszystkich obrazach wynosi 50 μm. Różne kolory strzałek odpowiadają różnym prędkościom, jak wskazano na skali kolorów po prawej stronie pól wektorowych. Ten rysunek został zmodyfikowany z reference²⁶. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4. Czasowo-rozdzielcza różnicowa mikroskopia dynamiczna (DDM) mierzy szybkość i rodzaj ruchu aktyny i mikrotubul w aktywnych kompozytach. (A) DDM jest wykonywany na kanałach mikrotubul (góra, symbole otwarte) i aktyny (dół, symbole wypełnione) szeregów czasowych w celu wyznaczenia charakterystycznych czasów zaniku τ w funkcji liczby falowej q zarówno dla aktyny (symbole wypełnione), jak i mikrotubul (symbole otwarte), jak opisano wcześniej¹⁷^,²⁶. Wszystkie krzywe są zgodne ze skalą τ ~ ^q-1, wskazującą ruch balistyczny, z prędkościami v, które są określane przez dopasowania do τ(q) = (vq)^-1. Większe prędkości odpowiadają mniejszym wartościom τ(q) dla dowolnego q. Kolory i kształty symboli odpowiadają kombinacjom (Φ_A, c_M) pokazanym w B. (B) Prędkości skurczu v są wyznaczane za pomocą dopasowań do krzywych τ(q) pokazanych w A, które są uśredniane dla wszystkich czasów opóźnienia dla czasu trwania każdego 45-minutowego szeregu czasowego. (C) DDM z rozdzielczością czasową (trDDM) określa ilościowo, w jaki sposób dynamika zmienia się w czasie, oceniając τ(q) dla aktyny (symbole wypełnione, po lewej) i mikrotubul (symbole otwarte, po prawej) dla kolejnych 6-minutowych interwałów (oznaczonych różnymi odcieniami tego samego koloru) w ciągu 45-minutowego czasu aktywacji. trDDM jest wykonywany dla każdej kombinacji (Φ_A, c_M) (oznaczonej różnymi symbolami i kolorami), zgodnie z opisem w legendzie w prawym dolnym rogu. Krzywe τ(q) pokazane w C mają podobne skalowanie i trendy jak te w A, ale wykazują również zależność od czasu dla niektórych kompozycji (Φ_A, c_M), w szczególności dla Φ_A = 0,75. (D) Prędkości skurczu dla filamentów aktynowych (symbole zamknięte) i mikrotubul (symbole otwarte) są wyznaczane na podstawie dopasowań do odpowiednich krzywych τ(q). Słupki błędów na wszystkich wykresach reprezentują błąd standardowy wartości w trzech do pięciu powtórzeniach. Ten rysunek został zmodyfikowany z reference¹⁷. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 5. Analiza autokorelacji obrazu przestrzennego (SIA) określa ilościowo restrukturyzację aktywnych kompozytów cytoszkieletu sterowaną silnikiem. (A) Autokorelacja g(r) dla mikrotubul na początku (po lewej, t = 0 min, ciemne odcienie) i na końcu (po prawej, t = 42 min, jasne odcienie) doświadczenia dla preparatów (Φ_A, c_M) wymienionych w legendzie. Wstawka: przykładowe dopasowanie danych do w początkowym i końcowym czasie dla (Φ_A, c_M) = (0,75, 0,12). (B) Średnie długości korelacji ξ dla aktyny (symbole zamknięte) i mikrotubul (symbole otwarte) dla każdego (Φ_A, c_M) wyznaczone za pomocą wykładniczych dopasowań każdej krzywej g(r), jak pokazano we wstawce w A. Dane są podzielone na te, które wykazują minimalną (po lewej) i znaczną (po prawej) restrukturyzację. Słupki błędów w punktach A i B reprezentują błąd standardowy w trzech do pięciu powtórzeniach. Ten rysunek został zmodyfikowany z reference¹⁷. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-7
Rysunek 6. Włączenie silników kinezynowych i pasywnych środków sieciujących do aktywnych kompozytów w celu zwiększenia programowalności i rozszerzenia przestrzeni fazowej dynamiki i struktury. (A) Dwukolorowe obrazy konfokalne aktyny (zielony) i mikrotubul (czerwony) w aktywnych kompozytach wykazują złożoną, zależną od preparatu restrukturyzację w czasie (wymienioną w min). Pięć obrazów w każdym wierszu odpowiada pięciu klatkom szeregu czasowego z 2000 klatek uzyskanych dla kompozytu napędzanego kinezyną (K, rzędy 1, 3, 5) lub kinezyną i miozyną (K+M, wiersze 2, 4, 6) i bez pasywnych środków sieciujących (nr XL, wiersze 1, 2), wiązanie krzyżowe aktyna-aktyna (Actin XL, wiersze 3, 4) lub sieciowanie krzyżowe mikrotubula-mikrotubula (MT XL, wiersze 5, 6). Wszystkie pręty skali mają rozmiar 50 μm. Kolory konturów są zgodne ze schematem kolorów w Rysunek 8. (B) Oddzielne kanały fluorescencji aktyny i mikrotubul dla kompozytów zawierających tylko kinezynę wykazują zróżnicowane struktury zarówno z kolokalizacją aktyny-MT, jak i separacją mikrofaz. Przedstawione obrazy dotyczą kompozytów o c_A = 2,32 μM, c_T = 3,48 μM, c_K = 0,35 μM, c_M = 0,47 μM (rzędy 2, 4, 6), R_A = 0,02 (rzędy 3, 4) i R_MT = 0,005 (rzędy 5, 6). Wszystkie kompozyty rozpoczynają się od równomiernie rozmieszczonych przenikających się sieci aktyny i mikrotubul (kolumna 1). Kompozyty napędzane kinezyną bez środków sieciujących (rząd 1) tworzą luźno połączone amorficzne klastry, które są bogate w MT. Aktyna początkowo kolokalizuje się w centrach tych agregatów, ale potem jest wyciskana z regionów bogatych w MT, które nadal kurczą się i odłączają od siebie. Sieciowanie aktyny-aktyny (rząd 3) utrudnia tę mikroskalową separację aktyny-MT, a zamiast tego agregaty bogate w MT są połączone długimi pasmami aktyny. Sieciowanie aktyny umożliwia również powolne wchłanianie aktyny do regionów bogatych w MT, tak że kompozyt staje się połączoną siecią kolokalizowanych klastrów aktyny i MT. Sieciowanie mikrotubul (rząd 5) prowadzi do amorficznego grupowania MT, które łączą się z czasem, co skutkuje separacją fazową aktyny i MT na większą skalę. Dodanie miozyny (rzędy 2, 4, 6) zmniejsza wymieszanie i restrukturyzację napędzaną kinezyną. Bez środków sieciujących (wiersz 2) kompozyty wykazują niewielkie przegrupowanie w ciągu kilku godzin. Sieciowanie zwiększa restrukturyzację i kolokalizację aktyny i mikrotubul (rzędy 4, 6). W szczególności, gdy mikrotubule są usieciowane (rząd 6), następuje znaczne przenikanie i reorganizacja w przypominające sieć sieci włókien. Ten rysunek został zmodyfikowany z reference⁵⁰. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-8
Rysunek 7. PIV pokazuje, że aktywne kompozyty wykazują trzy klasy przestrzennie odrębnych pól przepływu. (A) Pola przepływu PIV dla pierwszej (_{t i}) i ostatniej (t_f) klatki trzech reprezentatywnych szeregów czasowych, pokazujące różne klasy dynamiczne, które wykazują kompozyty pokazane na Rysunek 6. Pola przepływu PIV dla mikrotubul (na górze) i aktyny (na dole) dla klasy 1 (na górze, fioletowy), klasy 2 (środek, pomarańczowy) i klasy 3 (na dole, magenta) przykładowe filmy, z kolorami strzałek odpowiadającymi uniwersalnej skali prędkości na dole oraz mapą kolorów w skali szarości przedstawiającą przestrzenny rozkład prędkości, znormalizowaną oddzielnie dla każdego pola przepływu zgodnie ze skalą pokazaną na dole. Podziałka liniowa wynosi 50 μM. (B) Rozkłady kątowe wektorów prędkości od A (w jednostkach radianów) z podanymi początkowymi i końcowymi odchyleniami standardowymi σ_i i_{σ f}. (C) Czasowe mapy kolorów dla filmów analizowanych w punktach A i B pokazują położenie każdego piksela między klatkami względem jego punktu początkowego. Mapy klasy 1 pokazują losowy ruch w małej skali; Mapy klasy 2 przedstawiają szybki ruch jednokierunkowy z minimalną zmiennością przestrzenną lub czasową; Mapy klasy 3 wykazują cechy zarówno klasy 1, jak i 2. Ten rysunek został zmodyfikowany z reference⁵⁰. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-9
Rysunek 8. DDM i SIA mierzą zmienną w czasie dynamikę i strukturę dwusilnikowych kompozytów aktynowo-mikrotubulowych. (A) Prędkości dla kompozytów opisane w Rysunek 6 i Rysunek 7, mierzone za pomocą DDM, pokazują przyspieszanie i zwalnianie kompozytów, zaprogramowane przez sieciowanie i aktywność miozyny. Prędkości mikrotubul (MT, zamknięte okręgi) i aktyny (A, otwarte okręgi) są wykreślane jako funkcja czasu aktywności w kompozytach bez sieciowania (góra, niebieski), sieciowanie aktyny (środek, zielony), sieciowanie mikrotubul (dół, czerwony), bez miozyny (K, ciemniejsze odcienie) i z miozyną (K+M, jaśniejsze odcienie). W przypadku przypadków klasy 3, które mają dwie prędkości, mniejsza prędkość jest oznaczona gwiazdką. Punkty danych ujęte w przerywane czarne kółka odpowiadają maksymalnej prędkości v_max dla każdej postaci użytkowej. Słupki błędów (większość z nich jest zbyt mała, aby je zobaczyć) są błędem standardowym w stosunku do pasowań potęgowych odpowiadającego im τ(q). (B) Strukturalne długości korelacji ξ, wyznaczone za pomocą SIA, w funkcji czasu aktywności, dla tego samego zestawu szeregów czasowych ocenianych w A. Każdy punkt danych jest średnią długości korelacji wyznaczonych dla pierwszej i ostatniej klatki odpowiedniego szeregu czasowego. Ogólnie rzecz biorąc, ξ wydłuża się w czasie zarówno dla aktyny, jak i mikrotubul we wszystkich układach kompozytowych, a kompozyty napędzane wyłącznie kinezyną mają większe długości korelacji niż te, w których występuje również miozyna. Punkty danych w A i B, które odpowiadają trzem szeregom czasowym analizowanym w Rysunek 7 są zakreślone w odpowiednim kolorze klasy (1 = fioletowy, 2 = pomarańczowy, 3 = magenta). Ten rysunek został zmodyfikowany z reference⁵⁰. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kluczowym osiągnięciem opisanego powyżej zrekonstruowanego systemu jest jego modułowość i możliwość dostrajania, dlatego użytkownicy są zachęcani do modyfikowania stężeń białek, silników, środków sieciujących itp., aby dopasować je do pożądanych wyników, niezależnie od tego, czy chodzi o emulację określonego procesu komórkowego, czy też zaprojektowanie materiału o określonej funkcjonalności lub właściwościach mechanicznych. Ograniczenia zakresu stężeń aktyny i tubuliny ustala się na dolnej granicy przez stężenie krytyczne potrzebne do polimeryzacji aktyny (~0,2 μM)57,58,59 i tubuliny (~3 - 4 μM)⁶⁰, a na górnej granicy przez przejście do wyrównania nematycznego włókien aktyny (~90 μM)^61,62 lub mikrotubul (~35 μM)⁶³. Monomery aktyny i dimery tubuliny powinny być polimeryzowane razem we włókna, a nie mieszane ze sobą po polimeryzacji, aby zapewnić, że tworzą jednorodnie przenikające się sieci perkolowane, które synergistycznie się wspierają. Nowa dynamika, którą wykazują kompozyty, opiera się na tej interakcji. Chociaż ogólnie ważne jest, aby wykonać wszystkie kroki opisane w protokole, aby pomyślnie odtworzyć pokazane wyniki, niektóre kroki są bardziej wymagające, podczas gdy inne mają miejsce na modyfikację i dostosowanie do konkretnych potrzeb i dostępnych zasobów.

Na przykład jednym z ważnych kroków w celu zapewnienia powtarzalnych wyników jest prawidłowe przygotowanie i przechowywanie odczynników zgodnie z wytycznymi zawartymi w Tabeli Materiałów. Białka cytoszkieletu (aktyna, tubulina, miozyna, kinezyna) są labilne i powinny być porcjowane, zamrażane w płomieniach ciekłym azotem i przechowywane w temperaturze -80 °C w podwielokrotnościach jednorazowego użytku. Po usunięciu z temperatury -80 °C podwielokrotności należy przechowywać na lodzie. Białka cytoszkieletu nie zachowują niezawodnie funkcji po dodatkowych cyklach zamrażania i rozmrażania.

Mikrotubule są bardziej wrażliwe na depolimeryzację i denaturację niż aktyna. Po usunięciu z temperatury -80 °C tubulina powinna być przechowywana na lodzie przed polimeryzacją i zużyta w ciągu 12 godzin. Po polimeryzacji mikrotubule należy przechowywać w temperaturze pokojowej. Bardzo ważne jest również ustabilizowanie mikrotubul za pomocą taksolu, aby zapobiec depolimeryzacji. Stabilizacja faloidyny włókien aktyny jest również ważna dla stłumienia zużywającego ATP kieratu aktyny, który konkuruje z aktywnością miozyny i kinezyny.

Ultrawirowanie silników miozyny jest kolejnym krytycznym krokiem, ponieważ usuwa nieaktywne martwe głowice miozyny. Nieusunięcie enzymatycznie nieaktywnych monomerów powoduje bierne sieciowanie sieci aktynowej i utratę aktywności. Aby przedłużyć aktywność ATPazy silników, można włączyć system regeneracji ATP, taki jak fosforan kreatyny i fosfokinaza^{kreatyny 64} .

Wreszcie, utrzymanie aktywności kompozytu wymaga zahamowania adsorpcji włókien i silników do ścianek komory próbki, co można osiągnąć poprzez pasywację szkiełek nakrywkowych i szkiełek mikroskopowych. Białka motoryczne są szczególnie podatne na adsorpcję, co powoduje, że kompozyt jest przyciągany do powierzchni komory próbki, przemieszcza się poza pole widzenia, zapada się do 2D i nie jest już poddawany aktywności. Silanizacja szkiełek nakrywkowych i szkiełek jest skutecznym sposobem pasywacji powierzchni i zapobiegania adsorpcji (patrz krok 1). Alternatywną metodą pasywacji stosowaną skutecznie w eksperymentach z cytoszkieletami in vitro jest pokrycie powierzchni dwuwarstwą lipidową, podobną do błony komórkowej¹⁸. Ta metoda jest korzystna, jeśli chce się przywiązać białka do powierzchni lub wprowadzić inne specyficzne interakcje białko-powierzchnia, ponieważ dwuwarstwa może być funkcjonalizowana. W przypadku eksperymentów z pęsetami optycznymi pasywacja mikrosfer jest również krytyczna i można ją osiągnąć poprzez pokrycie karboksylowanych mikrosfer BSA lub PEG za pomocą chemii sieciującej karbodimid⁴⁸.

Istnieje kilka aspektów prezentowanych protokołów, które badacze mogą rozważyć zmianę w celu dostosowania do swoich potrzeb. Po pierwsze, naukowcy mogą zdecydować się na zastąpienie nienatywnych środków sieciujących biotynę-NA biologicznymi środkami sieciującymi, takimi jak alfa-aktynina lub MAP65, które sieciują odpowiednio aktynę i mikrotubule 28,65,66. Zastosowanie nienatywnych środków sieciujących w opisanych tutaj kompozytach jest motywowane ich zwiększoną odtwarzalnością, stabilnością i możliwością przestrajania w porównaniu z natywnymi sieciownikami. Ze względu na silne wiązanie biotyna-NA, można założyć, że środki sieciujące są trwałe, a nie większość natywnych środków sieciujących, które przejściowo wiążą się z szerokim zakresem rotacji. Dynamika przejściowego sieciowania komplikuje analizowanie wkładu środków sieciujących i silników w dynamikę. Co więcej, łączniki biotyna-NA mogą być wszechstronnie stosowane do sieciowania zarówno aktyny, jak i mikrotubul, a także sieciowania aktyny do mikrotubul. W ten sposób można dokonać jednoznacznego porównania między motywami sieciowania, zachowując wszystkie inne zmienne (np. rozmiar środka sieciującego, powinowactwo wiązania, stechiometrię itp.). Wreszcie, odczynniki potrzebne do włączenia łączników biotyna-NA są powszechnie dostępne na rynku, dobrze scharakteryzowane i powszechnie stosowane w wielu laboratoriach biofizycznych. Jednak jedną z kluczowych zalet opisanej tutaj platformy in vitro jest jej modułowość, więc naukowcy powinni być w stanie bezproblemowo zastąpić łączniki biotyna-NA natywnymi łącznikami, jeśli zechcą.

Po drugie, w obecnym protokole monomery aktyny i dimery tubuliny są polimeryzowane we włókna razem w probówce wirówkowej przed dodaniem do komory próbki. Przepuszczenie roztworu splątanych białek nitkowatych do komory próbki może spowodować wyrównanie przepływu, zwłaszcza mikrotubul, co powoduje zaburzenie pożądanej izotropii i jednorodności kompozytów. Rzeczywiście, dużym postępem we wcześniejszych pracach nad kompozytami aktynowo-mikrotubulowymi w stanie ustalonym była zdolność do kopolimeryzacji aktyny i mikrotubul in situ (w komorze próbki) w celu zapewnienia tworzenia izotropowych przenikających się sieci aktyny i mikrotubul 15,16,27. Jednak rozszerzenie tego podejścia na kompozyty aktywne wymagałoby dodania silników do próbki przed polimeryzacją aktyny i tubuliny oraz inkubacji całej próbki w temperaturze 37 °C przed eksperymentami. Testy tej odmiany protokołu wykazały zmniejszoną polimeryzację aktyny i brak dostrzegalnej aktywności motorycznej, prawdopodobnie z powodu konkurencyjnej aktywności ATPazy i przedłużonej inkubacji silników w temperaturze 37 °C. Na szczęście nie ma zauważalnego wyrównania przepływu kompozytów przy przestrzeganiu obecnych protokołów, co można zobaczyć na rysunku 2, rysunku 3 i rysunku 6. Niemniej jednak zachęca się naukowców do projektowania protokołów, które pozwalają na tworzenie aktywnych kompozytów in situ.

Kolejną kwestią do rozważenia jest schemat znakowania fluorescencji, który pociąga za sobą rzadkie znakowanie wszystkich filamentów aktynowych i mikrotubul w sieci. To podejście do etykietowania zostało zoptymalizowane pod kątem bezpośredniej wizualizacji struktury sieci, a nie wnioskowania o strukturze i dynamice za pomocą włókien znacznikowych lub mikrosfer. Jednak kompromis polega na tym, że poszczególne filamenty nie są jasno oznaczone i rozdzielcze. Jednym z podejść, które naukowcy mogą zastosować, aby zarówno rozdzielić pojedyncze włókna, jak i zobrazować strukturę sieci, jest domieszkowanie wstępnie uformowanych włókien znakowanych innym fluoroforem, dzięki czemu zarówno otaczająca sieć, jak i poszczególne włókna mogą być obrazowane jednocześnie. Jednak w przypadku stosowania więcej niż dwóch fluoroforów i kanałów wzbudzenia/emisji, przebijanie między kanałami jest często trudne do wyeliminowania, dlatego należy zachować ostrożność przy wyborze fluoroforów, filtrów i intensywności lasera.

Powiązanym ograniczeniem jest brak możliwości wizualizacji silników miozyny lub kinezyny w kompozytach. Zastosowane znakowane fluorescencyjnie monomery aktyny i dimery tubuliny są dostępne na rynku, podczas gdy wizualizacja miozyny lub kinezyny w kompozytach wymaga wewnętrznego znakowania. Zachęca się naukowców do podjęcia kolejnego kroku w celu oznaczenia silników, tak jak to zrobiono wcześniej^18,67, aby móc jednoznacznie powiązać aktywność motoryczną i wiązanie z dynamiką i strukturami, które wykazują nasze kompozyty.

Na koniec należy zauważyć, że w obecnym protokole początek i czas trwania aktywności kinezyny nie jest kontrolowany. Ponieważ aktywność miozyny jest kontrolowana za pomocą fotodezaktywacji bróbstatyny, jak opisano powyżej, w celu wbudowania podobnej aktywacji świetlnej kinezyny, można włączyć aktywowane światłem ATP.

Aby zwiększyć złożoność opisanych tutaj projektów, aby lepiej naśladować warunki komórkowe i poszerzyć przestrzeń parametrów dynamiczno-struktura-funkcja, przyszłe prace skupią się na włączeniu włókien pośrednich, takich jak wimentyna^68,69, a także innych silników, takich jak dyneina^13,70. Żelsolina zostanie również włączona w różnych stężeniach w celu kontrolowania długości aktyny¹⁴, a także białka tau w celu kontrolowania sztywności mikrotubul.

Podsumowując, przedstawione protokoły opisują, w jaki sposób projektować, tworzyć i charakteryzować dynamikę, strukturę i mechanikę systemów materii aktywnej inspirowanych cytoszkieletem, które zawierają dwa oddzielne składniki generujące siłę czynną, które działają na różne podłoża w jednym systemie. Ta przestrajalna i modułowa platforma przybliża wysiłki związane z rekonstytucją o jeden ważny krok do naśladowania cytoszkieletu komórkowego i oferuje unikalną możliwość programowania jego właściwości w szerokiej przestrzeni fazowej poprzez niezależne włączanie, usuwanie i dostrajanie różnych komponentów. Co więcej, wszystkie komponenty tego wszechstronnego systemu są dostępne na rynku (patrz tabela materiałów), z wyjątkiem dimerów kinezynowych, które są oczyszczane w Ross Lab, jak opisano wcześniej⁵⁰, i dostępne na życzenie. Wreszcie, cały kod analizy jest dostępny bezpłatnie za pośrednictwem GitHub⁴⁹ i jest oparty na wolnych językach programowania i oprogramowaniu (Python i Fidżi). Miejmy nadzieję, że przejrzyste rozpowszechnianie protokołów do projektowania tych systemów sprawi, że platforma ta będzie bardziej dostępna dla zróżnicowanej grupy użytkowników o różnej wiedzy specjalistycznej, pochodzeniu, przynależności instytucjonalnej i celach badawczych.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Mayi Hendija i Dr. Jonathanowi Michelowi za pomoc w analizie danych, a także Dr. Janet Sheung, Dr. Moumita Das i Dr. Michael Rust za pomocne dyskusje i wskazówki. Badania te były wspierane przez grant badawczy Fundacji Williama M. Kecka i nagrodę NSF DMREF Award (DMR 2119663) przyznaną RMRA i JLR oraz granty National Institutes of Health R15 (R15GM123420, 2R15GM123420-02) przyznane RMR-A i RJM.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
(-)-Blebbistatin Skrót używany w papierze: blebbistatin	Sigma Aldrich	B0560	Stężenie w magazynie: 200 μ M w DMSO Storage: wysuszony, w DMSO, -20º C Receptury magazynowe i eksperymentalne: rozpuścić 1 mg proszku do 200 μ M w DMSO Storage, handling, troubleshooting Uwagi: ograniczony okres przydatności do spożycia, zwykle przestaje działać niezawodnie po 3-4 miesiącach. Kupuj i przygotowuj nowe rozwiązanie co 3 miesiące.
1:20 488-tubulina: mieszanina tubuliny Skrót używany w papierze: 5-488-tubulina	NA	NA	strong>Stężenie magazynowe: 5 mg / ml w PEM Przechowywanie: jednorazowe podwielokrotności, -80º C, unikaj cykli zamrażania i rozmrażania Przepisy na zapasy i eksperymenty: mieszaj tubulinę i tubulinę 488 w stosunku 20:1, błyskawiczne zamrażanie z LN2 Przechowywanie, obsługa, rozwiązywanie problemów Uwagi: każda porcja może być używana do 12 godzin przechowywana na lodzie w temperaturze 4º C, chronić przed światłem
1:20 R-tubulina: mieszanina tubuliny Skrót używany w papierze: 5-R-tubulina	NA	NA	strong>Stężenie magazynowe: 5 mg / ml w PEM Przechowywanie: podwielokrotności jednorazowego użytku, -80º C, unikaj cykli zamrażania i rozmrażania < silny> Przepisy na zapasy i eksperymenty: < / silny> mieszaj tubulinę i tubulinę rodaminy w stosunku 20: 1, błyskawiczne zamrażanie z LN2 Przechowywanie, obsługa, rozwiązywanie problemów Uwagi: każda porcja może być używana do 12 godzin przechowywana na lodzie w temperaturze 4º C, chronić przed lekką
aktyną (biotyną): mięśnie szkieletowe Skrót używany w papierze: cytoszkielet biotynowo-aktynowy		AB07	Stężenie zapasów: 1 mg / ml w buforze G Przechowywanie: podwielokrotności jednorazowego użytku, -80º C, unikaj cykli zamrażania i rozmrażania < strong> Stock i eksperymentuj Przepisy: < / strong> rozpuść do 1 mg / ml w buforze G, błyskawiczne zamrażanie za pomocą LN2 Przechowywanie, obsługa, rozwiązywanie problemów Uwagi: (1) bezpośrednio przed użyciem rozcieńczyć do 0,5 mg / ml w PEM, (2) po usunięciu z -80º C, sklep podwielokrotność na lodzie w 4&ORDM; C przez okres do 1 tygodnia
aktyna (rodamina): mięśnie szkieletowe królika Skrót używany w papierze: < / silny>	Cytoszkielet	AR05	Stężenie magazynowe: < / silny> 1,5 mg / ml w buforze G Przechowywanie: < / silny> podwielokrotności jednorazowego użytku, -80º C, unikaj cykli zamrażania i rozmrażania < strong > Przepisy na zapasy i eksperymenty: < / strong> rozpuść do 1,5 mg / ml w buforze G, błyskawiczne zamrażanie za pomocą LN2 Przechowywanie, obsługa, rozwiązywanie problemów Uwagi: po wyjęciu z -80º C, sklep podwielokrotność na lodzie w 4&ORDM; C, może być stosowany przez okres do 1 tygodnia
adenozynotrifosforanu Skrót używany w papierze: ATP	Thermo Fisher Scientific	A1048	Stężenie zapasów: 100 mM Przechowywanie: w roztworze (pH 7), -20º Przepisy na < / > < strong> i eksperymentalne: < / strong> rozpamiętywać w DI H < sub>2< / sub>0, doprowadzić pH do 7 za pomocą NaOH Przechowywanie, obsługa, rozwiązywanie problemów Uwagi: rutynowo sprawdzaj pH i dostosuj w razie potrzeby, hydrolizuje z czasem, wymieniaj co ~ 6-12 miesięcy
AlexaFluor488 Phalloidin Skrót używany w papierze: 488-falloidin	Thermo Fisher Scientific	A12379	Stężenie magazynu: 100 μ M DMSO < mocny> Przechowywanie: < / mocny> chroniony przed światłem, wysuszony, -20º C Receptury magazynowe i eksperymentalne: rozpuszczone do 100 μ M z DMSO Przechowywanie, obsługa, rozwiązywanie problemów Uwagi: bezpośrednio przed użyciem rozcieńczyć do 20 μ M w PEM (1 μ L w 4 i mu; L PEM)
AlexaFluor488– Oznaczone aktyną Skrót używany w papierze: 488-aktyna	Thermo Fisher	Scientific A12373	Stężenie zapasów: 1,5 mg / ml w buforze G Przechowywanie: podwielokrotności jednorazowego użytku, -80º C, unikaj cykli zamrażania i rozmrażania < strong > Stock i eksperymentuj Przepisy: < / silny> rozpuść do 1,5 mg / ml w buforze G, błyskawiczne zamrażanie za pomocą LN2 Przechowywanie, obsługa, rozwiązywanie problemów Uwagi: ten produkt został wycofany
Podstawowy środek do czyszczenia plazmowego Skrót używany w papierze: środek do czyszczenia plazmowego	Harrick Plasma	PDC-32G
Bemis Laboratoryjna folia do owijania Parafilm M Skrót używany w papierze: przezroczysta folia	Thermo Fisher Scientific	13-374-5
D-(+)-Glukoza Skrót używany w papierze:	Thermo Fisher Scientific	A1682836	Stężenie zapasów: < / silny> 100x Przechowywanie: < / silny> przechowywać w stężeniu magazynowym (100x) lub 10x, wysuszony, w temperaturze -20º C < strong> Stock and Experiment Recipes: < / strong> rozpuść proszek do 4,5 mg / ml w DI H_{2< / sub>0 < strong> Przechowywanie, obsługa, rozwiązywanie problemów Uwagi: końcowe stężenie w roztworze powinno 45 μ g/mL}
D-Biotyna < silny> Skrót używany w papierze: < / mocny> biotyna	Fisher Scientific	BP232-1	Stężenie zapasów: < / silny> 1,02 mM w PEM < silny> Przechowywanie: suszony, 4º C
dejonizowana woda nanoczysta Skrót używany w papierze: DI
Dimethyldichlorosilane Skrót używany w papierze: silan	Thermo Fisher Scientific	D/3820/PB05	Stężenie zapasów: 2% rozpuszczone w Toulene
Dithiothreitol Skrót używany w papierze: DTT	Thermo Fisher Scientific	R0861	Stock Stężenie: 1 M w DMSO Storage: wysuszony, -20º C Receptury magazynowe i eksperymentalne: rozcieńczyć do 2 mM w PEM bezpośrednio przed każdym eksperymentem
DMSO Bezwodny Skrót używany w papierze: DMSO	Thermo Fisher Scientific	D12345
F-Buffer Skrót używany w papierze: F-buffer	NA	NA	Stock Concentration: 10x Storage: wysuszony, -20º C Receptury magazynowe i eksperymentalne: 10 mM Imidazol (pH 7,0), 50 mM KCl, 1 mM MgCl₂, 1 mM EGTA, 0,2 mM ATP
G-Buffer Skrót używany w papierze: G-buffer	NA	NA	Stock Concentration: 10x Storage: wysuszony, -20º C Receptury magazynowe i eksperymentalne: 2,0 mM Tris (pH 8), 0,2 mM ATP, 0,5 mM DTT, 0,1 mM CaCl₂. Przechowywać w temperaturze -20&st;C.
Szkiełko mikroskopowe szklane &NBSP; Skrót używany w papierze: slajd	Thermo Fisher Scientific	22-310397
Oksydaza glukozowa + katalaza + β-merkaptoetanol Skrót używany w papierze: GOC	Sigma Aldrich	G2133-250KU, C1345, 63689	Stężenie zapasów: < / silny> 100x Przechowywanie: < / silny> przechowywać w stężeniu zapasowym (100x) lub 10x, wysuszony, w temperaturze -20º C Receptury magazynowe i eksperymentalne: Dla 100x: 4,3 mg/ml oksydazy glukozowej, 0,7 mg/ml katalazy, 0,5% v/v β-merkaptoetanol w DI H₂0 Przechowywanie, obsługa, rozwiązywanie problemów Uwagi: końcowe stężenie w roztworze powinno wynosić: 0,005% β-merkaptoetanol, 43 μ g/ml oksydazy glukozowej, 7 μ g/ml katalazy
glu-GOC system oczyszczania tlenu < silny> Skrót używany w papierze: < / silny> glu-GOC	NA	NA	silny> Stężenie zapasów: < / mocny> 100x Przechowywanie: < / mocny> za każdym razem przygotuj świeży < silny> Przepisy na zapasy i eksperymenty: < / mocny> wymieszaj równe części Glu i GOC i dodaj w 1/100 końcowej objętości próbki bezpośrednio przed obrazowaniem Storage, Obsługa, uwagi dotyczące rozwiązywania problemów: przygotować z Glu i GOC bezpośrednio przed obrazowaniem
trifosforanu guanozyny < silny>Skrót używany w papierze: < / silny> GTP	Thermo Fisher Scientific	R0461	Stężenie magazynu: < / silny> 100 mM Przechowywanie: < / silny> 100 μ L podwielokrotności przy -20º C
Instant Mix 1-minutowa żywica epoksydowa Skrót używany w papierze: epoksydowa	Loctite	1366072
Kinesin-1 401 BIO 6x HIS Skrót używany w papierze: kinezyna	Przygotowane w JL Ross Lab na Uniwersytecie w Syracuse	NA	strong>Stężenie zapasów: 8,87 μ M w PEM Storage: jednorazowe podwielokrotności, -80º C, unikaj cykli zamrażania i rozmrażania < strong> Przechowywanie, obsługa, rozwiązywanie problemów Uwagi: biotynylowane dimery tworzą klastry kinezyny, każda podwielokrotność może być używana do 12 godzin przechowywana na lodzie w temperaturze 4º C
NeutrAvidin Skrót używany w papierze: NA	Thermo Fisher Scientific	31000	Stężenie magazynowe: 5 mg / ml w PEM Przechowywanie: wysuszony, -20º C Receptury magazynowe i eksperymentalne: rozpuścić proszek do 5 mg/ml w PEM
nr 1. Szkiełka nakrywkowe szklane (24 mm x 24 mm) Skrót używany w papierze: szkiełko nakrywkowe	Thermo Fisher Scientific	12-548-CP
Paklitaksel Skrót używany w papierze: Taxol	Thermo Fisher Scientific	P3456	Stock Stężenie: 2 mM w DMSO Przechowywanie: chroniony przed światłem, wysuszony, -20º C < strong> Receptury magazynowe i eksperymentalne: rozpuścić do 2 mM za pomocą DMSO Przechowywanie, obsługa, rozwiązywanie problemów Uwagi: bezpośrednio przed użyciem rozcieńczyć do 200 μ M w DMSO (0,4 μ L w 3,6 i mu; L DMSO)
PEM-100 Skrót używany w papierze: PEM	NA	NA	Stock Stężenie:< / mocny> 1x Przechowywanie: temperatura pokojowa (RT) Receptury magazynowe i eksperymentalne: 100 mM K-RURY (pH 6,8), 2 mM EGTA, 2 mM MgCl₂ Przechowywanie, obsługa, rozwiązywanie problemów Uwagi: użyj KOH, aby dostosować pH do 6,8, często sprawdzaj pH i odpowiednio dostosuj
falloidynę Skrót używany w papierze: falloidyna	Thermo Fisher Scientific	P3457	Stock Stężenie: 100 μ M w DMSO < strong> Przechowywanie: chronione przed światłem, wysuszone, -20º C, ściśle przestrzegaj warunków przechowywania / obchodzenia się < silny> Receptury magazynowe i eksperymentalne: < / silny> rozpuszczony do 100 μ M z DMSO Przechowywanie, obsługa, rozwiązywanie problemów Uwagi: podatny na zanieczyszczenia podczas jego przygotowania i denaturacji, identyfikowalny jako duże amorficzne agregaty aktyny w próbkach
tubulina mózgu świni Skrót używany w papierze: < / silny> tubulinowy	cytoszkielet	T240	Stężenie magazynowe: < / silny> 5 mg / ml w PEM Przechowywanie: jednorazowe podwielokrotności, -80º C, unikaj cykli zamrażania i rozmrażania < strong> Stock i eksperymentuj Przepisy: < / strong> rozpuść proszek do 5 mg / ml w PEM, błyskawiczne zamrażanie za pomocą LN2 Przechowywanie, obsługa, rozwiązywanie problemów Uwagi: każda porcja może być używana do 12 godzin przechowywana na lodzie w temperaturze 4&ORDM; C
Chlorek potasu Skrót używany w papierze: KCl	Thermo Fisher Scientific	AM9640G	Stock Stężenie: 4 M Przechowywanie: RT
Aktyna szkieletowa królika Skrót używany w papierze: < / silny> aktynowy	cytoszkielet	AKL99	Stężenie magazynowe: < / silny> 2 mg / ml w buforze G Przechowywanie: < / silny> podwielokrotności jednorazowego użytku, -80º C, unikaj cykli zamrażania i rozmrażania < strong > Stock i eksperymentuj Przepisy: < / strong> rozpuść do 2 mg / ml w buforze G, błyskawiczne zamrażanie za pomocą LN2 Storage, handling, troubleshooting Uwagi: po wyjęciu z -80º C, sklep podwielokrotność na lodzie w 4&ORDM; C, może być stosowany przez okres do 1 tygodnia
Miozyna szkieletowa królika II Skrót używany w papierze: cytoszkielet miozyny		MY02	Stężenie zapasów: < / silny> 10 mg / ml w PEM Przechowywanie: podwielokrotności jednorazowego użytku, -80º C, unikaj cykli zamrażania i rozmrażania < strong> Stock i eksperymentuj Przepisy: < / mocny> rozpuść proszek do 10 mg / ml w PEM, błyskawiczne zamrażanie za pomocą LN2 Przechowywanie, obsługa, rozwiązywanie problemów Uwagi: monomery tworzą minifilamenty o niskim KCl, każda porcja może być używana do 12 godzin przechowywana na lodzie w temperaturze 4º C
Tubulina (biotyna): mózg świni < silny>Skrót używany w papierze: < / silny> biotynowo-tubulinowy	cytoszkielet	T333P	Stężenie zapasów: < / silny> 5 mg / ml w PEM Przechowywanie: jednorazowe podwielokrotności, -80º C, unikaj cykli zamrażania i rozmrażania < strong> Stock i eksperymentuj Przepisy: < / strong> rozpuść proszek do 5 mg / ml w PEM, błyskawiczne zamrażanie za pomocą LN2 Przechowywanie, obsługa, rozwiązywanie problemów Uwagi: bezpośrednio przed użyciem rozcieńczyć do 0,5 mg / ml w tubulinie PEM
(fluorescencyjna HiLyte 488): Mózg świni Skrót używany w papierze: < / silny> cytoszkielet 488-tubulinowy		TL488M	Stężenie magazynowe: < / silny> 5 mg / ml w PEM Przechowywanie: < / silny> jednorazowe porcje, -80º C, unikaj cykli zamrażania i rozmrażania < strong> Stock i eksperymentuj Przepisy: < / strong> rozpuść proszek do 5 mg / ml w PEM, błyskawiczne zamrażanie za pomocą LN2 Przechowywanie, obsługa, rozwiązywanie problemów Uwagi: każda porcja może być używana do 12 godzin przechowywana na lodzie w temperaturze 4&ORDM; C, chronić przed lekką
tubuliną (rodaminą): mózg świni Skrót używany w papierze: < / silny>	Cytoszkielet	TL590M	Stężenie magazynowe: < / silny> 5 mg / ml w PEM Przechowywanie: < / silny> podwielokrotności jednorazowego użytku, -80º C, unikaj cykli zamrażania i rozmrażania < strong> Stock i eksperymentuj Przepisy: < / strong> rozpuść proszek do 5 mg / ml w PEM, błyskawiczne zamrażanie za pomocą LN2 Przechowywanie, obsługa, rozwiązywanie problemów Uwagi: każda porcja może być używana do 12 godzin przechowywana na lodzie w temperaturze 4&ORDM; C, chronić przed światłem
Tween 20 Skrót używany w papierze: Tween20	Thermo Fisher Scientific	J20605. AP	strong>Stężenie zapasów: < / silny> 1% v / v w DI H_{2< / sub>0 Przechowywanie: < / mocny>}
Mikrorurki ultrawirówki RT Skrót używany w papierze: Beckman-Coulter Optima Max XP	Beckman Coultier	343776	Przechowywanie, obsługa, rozwiązywanie problemów Uwagi: 8x34 mm PC
Klej utwardzany światłem UV Skrót używany w papierze: Klej UV	Pharda	SKG-2869

<< R-aktyny << R-tubulinowy <

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Sprostowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: Reconstituting and Characterizing Actin-Microtubule Composites with Tunable Motor-Driven Dynamics and Mechanics
Posted by JoVE Editors on 10/11/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: Reconstituting and Characterizing Actin-Microtubule Composites with Tunable Motor-Driven Dynamics and Mechanics. The Authors section was updated.

Mehrzad Sasanpour1
Daisy H. Achiriloaie1,2
Gloria Lee1
Gregor Leech1
Christopher Currie1
K. Alice Lindsay3
Jennifer L. Ross3
Ryan J. McGorty1
Rae M. Robertson-Anderson1
1Department of Physics and Biophysics, University of San Diego
2W. M. Keck Science Department, Scripps College, Pitzer College, and Claremont McKenna College
3Department of Physics, Syracuse University

to:

Mehrzad Sasanpour1
Daisy H. Achiriloaie1,2
Gloria Lee1
Gregor Leech1
Maya Hendija1
K. Alice Lindsay3
Jennifer L. Ross3
Ryan J. McGorty1
Rae M. Robertson-Anderson1
1Department of Physics and Biophysics, University of San Diego
2W. M. Keck Science Department, Scripps College, Pitzer College, and Claremont McKenna College
3Department of Physics, Syracuse University

Tagi

Rekonstrukcja cytooszkieletu miozyna II motory kinezynowe obrazowanie konfokalne pasywne sieciowania r nicowa mikroskopia dynamiczna welocymetria obrazu cz stek p sety optyczne

Rekonstrukcja i charakterystyka kompozytów aktynowo-mikrotubulowych o regulowanej dynamice i mechanice napędzanej silnikiem

W tym artykule

Informacja o sprostowaniu

Podsumowanie

Streszczenie

Wprowadzenie

Protokół

Wyniki

Dyskusja

Oświadczenia

Podziękowania

Materiały

Przedruki i uprawnienia

Sprostowanie

Tagi

Powiązane artykuły