Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Bezkomórkowa synteza białek z ekstraktów komórkowych z niedoborem egzonukleazy z wykorzystaniem liniowych matryc DNA

4.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64236

⸱

9 sierpnia 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1INRAe, AgroParisTech, Micalis Institute, Université Paris-Saclay, 2Helmholtz Institute for RNA-based Infection Research (HIRI), Helmholtz-Centre for Infection Research (HZI), 3Medical Faculty, University of Würzburg, 4Centre de Biochimie Structurale, INSERM U1054, CNRS UMR 5048, University of Montpellier

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Prezentowany tutaj jest protokół przygotowania i kalibracji buforu ekstraktów komórkowych z egzonukleazy V nokautujących szczepów Escherichia coli BL21 Rosetta2 (ΔrecBCD i ΔrecB). Jest to szybkie, łatwe i bezpośrednie podejście do ekspresji w bezkomórkowych systemach syntezy białek przy użyciu liniowych matryc DNA.

Streszczenie

Bezkomórkowa synteza białek (CFPS) stała się ostatnio bardzo popularna w dziedzinie biologii syntetycznej ze względu na swoje liczne zalety. Wykorzystanie liniowych matryc DNA dla CFPS pozwoli technologii osiągnąć pełny potencjał, skracając czas eksperymentu poprzez wyeliminowanie etapów klonowania, transformacji i ekstrakcji plazmidu. Liniowe DNA można szybko i łatwo amplifikować metodą PCR w celu uzyskania wysokich stężeń matrycy, unikając potencjalnej toksyczności ekspresji in vivo. Jednak liniowe matryce DNA są szybko degradowane przez egzonukleazy, które są naturalnie obecne w ekstraktach komórkowych. Istnieje kilka strategii, które zostały zaproponowane w celu rozwiązania tego problemu, takie jak dodawanie inhibitorów nukleaz lub chemiczna modyfikacja liniowych końców DNA w celu ochrony. Wszystkie te strategie kosztują dodatkowy czas i zasoby i nie pozwalają jeszcze uzyskać poziomów ekspresji białek bliskich plazmidowi. Szczegółowy protokół alternatywnej strategii przedstawiono tutaj dotyczący stosowania liniowych matryc DNA dla CFPS. Dzięki zastosowaniu ekstraktów komórkowych z komórek nokautujących z niedoborem egzonukleazy, liniowe matryce DNA pozostają nienaruszone bez konieczności jakichkolwiek modyfikacji końcowych. Przedstawiamy etapy przygotowania lizatu komórkowego ze szczepu Escherichia coli BL21 Rosetta2 ΔrecBCD metodą lizy sonikacyjnej i kalibracji buforu dla Mg-glutaminianu (Mg-glu) i K-glutaminianu (K-glu) specjalnie dla liniowego DNA. Metoda ta jest w stanie osiągnąć poziomy ekspresji białek porównywalne do tych z plazmidowego DNA w CFPS E. coli.

Wprowadzenie

Systemy bezkomórkowej syntezy białek (CFPS) są coraz częściej używane jako szybka, prosta i efektywna metoda inżynierii biosensorów, zdecentralizowanej produkcji i prototypowania obwodów genetycznych1. Ze względu na swój ogromny potencjał, systemy CFPS są regularnie stosowane w dziedzinie biologii syntetycznej. Jednak do tej pory systemy CFPS opierają się na kolistych plazmidach, które mogą ograniczać osiągnięcie pełnego potencjału technologii. Przygotowanie plazmidowego DNA zależy od wielu czasochłonnych etapów podczas klonowania i dużej ilości izolacji DNA. Z drugiej strony, amplifikacja PCR z plazmidu lub zsyntetyzowanej matrycy DNA może być wykorzystana do prostego przygotowania matryc CFPS w ciągu kilku godzin2,3. W związku z tym zastosowanie liniowego DNA stanowi obiecujące rozwiązanie dla CFPS. Jednak liniowe DNA jest szybko degradowane przez egzonukleazy naturalnie obecne w ekstraktach komórkowych4. Istnieją rozwiązania, które rozwiązują ten problem, takie jak użycie białka λ-faga GamS class5 lub DNA zawierającego miejsca Chi6 jako środków ochronnych, lub bezpośrednia ochrona liniowego DNA poprzez chemiczną modyfikację jego końców2,7,8,9. Wszystkie te metody wymagają suplementacji ekstraktu komórkowego, co jest kosztowne i czasochłonne. Od dawna wiadomo, że kompleks egzonukleazy V (RecBCD) degraduje liniowe DNA w lizatach komórkowych4. Ostatnio wykazaliśmy, że liniowe DNA może być znacznie lepiej chronione w lizatach z komórek znokautowanych przez geny egzonukleazy (recBCD)10.

W tym protokole, kroki przygotowania bezkomórkowych lizatów ze szczepu E. coli BL21 Rosetta2 ΔrecBCD metodą lizy sonikacyjnej są szczegółowo opisane. Liza sonikacji jest powszechną i niedrogą techniką stosowaną przez kilka laboratoriów11,12. Ekstrakty wyprodukowane z tego szczepu nie wymagają dodawania żadnego dodatkowego składnika ani modyfikacji matrycy DNA, aby wspomóc ekspresję z liniowych matryc DNA. Metoda opiera się na podstawowym etapie optymalizacji buforu dla ekstraktów komórkowych specjalnie pod kątem liniowej ekspresji DNA z natywnych promotorów E. coli. Wykazano, że ta specyficzna optymalizacja buforu dla liniowej ekspresji DNA jest kluczem dla natywnych promotorów σ70 do uzyskania wysokiej produkcji białka bez suplementacji białka GamS lub Chi DNA, unikając nawet oczyszczania produktów PCR10. Stwierdzono, że optymalne stężenie Mg-glu dla liniowej ekspresji DNA jest podobne do stężenia plazmidowego DNA. Jednak optymalne stężenie K-glu wykazało znaczną różnicę między liniowym a plazmidowym DNA, prawdopodobnie ze względu na mechanizm związany z transkrypcją10. Funkcjonalność białek eksprymowanych za pomocą tej metody została wykazana w kilku zastosowaniach, takich jak szybkie badania przesiewowe przełączników toehold i ocena aktywności wariantów enzymów10.

Ten protokół zapewnia proste, efektywne i opłacalne rozwiązanie do korzystania z liniowych matryc DNA w systemach bezkomórkowych E. coli, po prostu używając zmutowanych ekstraktów komórkowych ΔrecBCD i specyficznej kalibracji dla liniowego DNA jako szablonu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie podłoża i bufora

  1. Przygotowanie podłoża 2xYT+P (stałego i ciekłego)
    1. Przygotować płynne i stałe podłoża zgodnie z opisem w Tabeli 1, a następnie sterylizować w autoklawie.
      UWAGA: Ten protokół wymaga jednej płytki agarowej 2xYT+P zawierającej chloramfenikol (10 μg/ml). Objętość płynnych mediów jest proporcjonalna do wymaganej objętości lizatu. W tym przypadku stosuje się początkową objętość 5 l płynnego podłoża 2xYT+P. Jednak objętość można regulować w razie potrzeby, wiedząc, że 1 l hodowli komórkowej daje od 2 do 3 ml końcowego lizatu komórkowego.
  2. Przygotowanie chloramfenikolu (34 mg/ml)
    1. Odważyć 0,34 g chloramfenikolu, dodać etanol do 10 ml i rozpuść przez zmieszanie. Podamy po 1 ml do kilku probówek i przechowujemy w temperaturze -20 °C do późniejszego wykorzystania.
  3. Przygotowanie buforu S30A
    1. Przygotować bufor S30A zgodnie z tabelą 2, dążąc do uzyskania 2 l tego buforu.
      UWAGA: Po raz kolejny objętość tego buforu jest proporcjonalna do wymaganej objętości lizatu.
    2. Przed sterylizacją w autoklawie należy dostosować pH buforu do 7,7 za pomocą lodowatego kwasu octowego.
    3. Opróżnij bufor w autoklawie.
    4. Przechowywać ten bufor w temperaturze 4 °C po sterylizacji w autoklawie.
    5. Przed użyciem dodaj DTT (przefiltrowane przez filtr membranowy 0,22 μm) do buforu S30A, aby osiągnąć końcowe stężenie 2 mM (2 ml zapasu 1 M DTT na 1 l buforu S30A).
      UWAGA: Po raz kolejny objętość tego buforu jest proporcjonalna do wymaganej objętości lizatu.
  4. Przygotowanie roztworu energetycznego
    UWAGA: To rozwiązanie energetyczne jest oparte na papierze Sun et al. paper13 (14x stężenie zapasów). Tabela 3 zawiera podsumowanie składników potrzebnych do przygotowania zapasu roztworu energetycznego, wraz z numerami katalogowymi wszystkich substancji chemicznych użytych w niniejszym protokole.
    1. Przygotować roztwory podstawowe zgodnie z tabelą 3 i przechowywać je na lodzie.
    2. Skalibrować pH zgodnie z wymaganiami dla wskazanych składników, za pomocą buforu Tris 2 M (60,57 g zasady Tris w 250 ml objętości sterylnej wody) lub KOH 15% (15 g KOH w 100 ml objętości sterylnej wody), jak wskazano w Tabeli 3.
    3. W probówce o pojemności 15 ml dodać objętość każdego składnika w kolejności wskazanej w tabeli 3.
    4. Podwielokrotność roztworu energetycznego, 150 μl na probówkę.
    5. Błyskawiczne zamrożenie podwielokrotności na suchym lodzie i przechowywanie w temperaturze -80 °C.
  5. Przygotowanie roztworu aminokwasów (AA)
    UWAGA: Roztwór aminokwasów jest przygotowywany przez zestaw RTS Amino Acid Sampler. Każdy z 20 aminokwasów jest dostarczany w tym zestawie w postaci 1,5 ml objętości przy 168 mM, z wyjątkiem leucyny, która ma 140 mM. W tym przypadku przygotowany roztwór podstawowy jest 4-krotnie skoncentrowany, a nie wymagany roztwór roboczy. Końcowe stężenie roztworu aminokwasu wynosi 6 mM dla wszystkich aminokwasów, z wyjątkiem leucyny, która ma temperaturę 5 mM.
    1. Rozmrozić probówki z 20 aminokwasami przez wirowanie i inkubować w temperaturze 37 °C, aż do całkowitego rozpuszczenia.
      UWAGA: Cys może nie rozpuścić się całkowicie.
    2. Do probówki o pojemności 50 ml dodać 12 ml sterylnej wody i po 1,5 ml każdego z aminokwasów w kolejności wskazanej w tabeli 4.
    3. Wirować, aż roztwór będzie dość klarowny, inkubując w temperaturze 37 °C, jeśli to konieczne.
      UWAGA: Cys może nie rozpuścić się całkowicie.
    4. Podwielokrotność 500 μl roztworu aminokwasów w probówce na lodzie.
    5. Podwielokrotności należy błyskawicznie zamrozić na suchym lodzie i przechowywać w temperaturze -80 °C.
  6. Przygotowanie roztworów do kalibracji buforu
    1. Przygotować roztwór podstawowy dla Mg-glu (100 mM) i K-glu (3 M), jak wskazano w Tabeli 5. Wykonać seryjne rozcieńczenie (w objętości 1 ml) z tych zapasów dla Mg-glu (0 do 20 mM) i K-glu (20 do 300 mM), jak wskazano w pliku uzupełniającym 1 dla etapów kalibracji.
      UWAGA: Te stężenia podstawowe dotyczą etapu kalibracji i mogą wymagać zmiany podczas ustawiania końcowego eksperymentu. Najwyższe stężenia materiałów badanych pod kątem tego protokołu wynoszą odpowiednio 1 M i 4,5 M dla Mg-glu i K-glu.
  7. Przygotowanie PEG8000 zapasu roztworu
    1. Przygotuj 50 ml 40% roztworu PEG8000 (20 g PEG8000 w 50 ml objętości sterylnej wody).

2. Hodowla komórkowa i przygotowanie lizatu (4-dniowy eksperyment)

  1. Dzień 1
    1. Szczep smugowy BL21 Rosetta2 ΔrecBCD (Tabela 6) z bulionu glicerolu -80 °C na płytkę agarową 2xYT+P, która zawiera 10 μg/ml chloramfenikolu. Alternatywnie można również użyć BL21 Rosetta2 ΔrecB (Tabela 6) 10.
    2. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.
  2. Dzień 2
    1. Zaszczepić pojedynczą kolonię z powyższej płytki agarowej w 10 ml 2xYT+P uzupełnionego 10 μg/ml chloramfenikolu.
    2. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C, wytrząsając z prędkością 200 obr./min.
  3. Dzień 3
    1. Stwórz subkulturę, rozcieńczając nocną kulturę 100 razy w 4 litrach świeżej pożywki 2xYT+P zawierającej 10 μg/ml chloramfenikolu.
      UWAGA: Na przykład 40 ml nocnej kultury dodaje się do 3960 ml świeżej pożywki. Po rozcieńczeniu, 4 l pożywki dzieli się na 4 kolby (objętość 5 l) tak, aby każda kolba zawierała 1 l.
    2. Inkubować w temperaturze 37 °C, 200 obr./min przez około 3 do 4 godzin wzrostu, aby osiągnąć OD600 1,5-2,0. Rozcieńczyć kulturę 4x, jeśli mierzy się OD600 > 0,8,
      UWAGA: Dokładny czas inkubacji może się różnić w zależności od szczepu, początkowego inokulum, sprzętu laboratoryjnego i użytych instrumentów. Szczepy nokautujące ΔrecB/ΔrecBCD mają tempo wzrostu porównywalne z rodzicielskim BL21 Rosetta2 (>rysunek uzupełniający 1).
    3. Połóż kulturę na lodzie.
    4. Odwirować komórki w temperaturze 5 000 x g przez 12 minut w temperaturze 4 °C, a następnie odrzucić supernatant przez dekantację.
    5. Zawiesić granulki komórek w 800 ml schłodzonego S30A+DTT.
      UWAGA: Objętość S30A+DTT jest 5 razy mniejsza niż oryginalna objętość kultury komórkowej. Na przykład, aby uzyskać początkową objętość 1 l hodowli komórkowej, ponownie zawieś granulki komórkowe w 200 ml S30A+DTT. Zaleca się również wykonanie tego kroku w chłodni w temperaturze 4 °C, a także utrzymywanie wszystkich materiałów na lodzie.
    6. Odwirować komórki w temperaturze 5 000 x g przez 12 minut w temperaturze 4 °C, a następnie odrzucić supernatant przez dekantację.
    7. Powtórz kroki 2.3.5 i 2.3.6.
    8. Zawiesić granulki komórkowe w 160 ml schłodzonego S30A+DTT.
      UWAGA: Tym razem objętość S30A+DTT jest 25 razy mniejsza niż oryginalna objętość hodowli komórkowej. Na przykład, aby uzyskać początkową objętość 1 l hodowli komórkowej, ponownie zawieś granulki komórkowe w 40 ml S30A+DTT. Również w tym przypadku zaleca się wykonanie tego kroku w chłodni w temperaturze 4 °C, a także w celu utrzymania materiałów na lodzie.
    9. Przenieść komórki do schłodzonych i wstępnie zważonych probówek o pojemności 50 ml.
    10. Wirować komórki w temperaturze 2 000 x g przez 8 minut w temperaturze 4 °C, a następnie odrzucić supernatant przez dekantację.
    11. Wirować komórki w temperaturze 2 000 x g przez 4 minuty w temperaturze 4 °C, a następnie ostrożnie usunąć pozostały supernatant za pomocą pipety.
    12. Ponownie zmierz wagę probówki, aby obliczyć wagę osadu komórkowego.
    13. Przechowywać granulki komórkowe w temperaturze -80 °C.
  4. Dzień 4
    1. Weź granulki komórkowe z temperatury -80 °C i rozmrażaj je na lodzie przez 1-2 godziny.
    2. Ponownie zawiesić granulki komórkowe w 0,9 ml buforu S30A+DTT na gram masy granulek. Pipetuj powoli, aby ponownie zawiesić komórki, unikając w jak największym stopniu piany wierzchniej, jeśli taka istnieje.
    3. Umieścić 1 ml podwielokrotności zawieszonych komórek w mikroprobówkach o pojemności 1,5 ml i przechowywać je na lodzie lub wstępnie schłodzonym zimnym bloku w temperaturze 4 °C (zaleca się stosowanie bloczków metalowych).
      UWAGA: Jeśli ostatnia porcja jest znacznie mniejsza niż 1 ml, lepiej ją wyrzucić niż poddać sonizacji nieoptymalną objętość. Optymalna objętość (1 ml) do sonikacji została określona dla tego zestawu (probówka, sonikator i sonda) i może się różnić dla innego.
    4. Sonizuj każdą rurkę w sonikatorze (sonda 3 mm, częstotliwość 20 kHz), z ustawieniem amplitudy 20% na trzy cykle (30 s sonikacji, 1 min przerwy).
      UWAGA: Całkowita energia dostarczona w ciągu trzech cykli wyniosła ~266 dżuli (~80-110 dżuli na cykl). Na tym etapie trzymaj rurki na zimnym bloku otoczonym lodem. Przełączaj się między dwoma zimnymi blokami, aby uniknąć przegrzania sondy (zimny blok w trybie czuwania jest również utrzymywany w niskiej temperaturze na lodzie). Oba zimne bloki zostały wstępnie schłodzone w lodówce dzień przed sonikacją.
    5. Odwirowywać lizat w temperaturze 12 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
    6. Zebrać supernatant (lizat komórkowy) za pomocą pipety i przenieść do probówki o pojemności 50 ml.
    7. Inkubować lizat komórkowy w temperaturze 37 °C przy mieszaniu przy 200 obr./min, przez 80 min.
    8. Odwirowywać lizat w temperaturze 12 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
    9. Zebrać supernatant i podwielokrotność po 30 μl do wstępnie schłodzonych mikroprobówek o pojemności 1,5 ml, trzymając wszystkie probówki na lodzie.
    10. Porcje lizatu należy błyskawicznie zamrozić na suchym lodzie i przechowywać w temperaturze -80 °C.

3. Bezkomórkowa kalibracja bufora dla liniowego DNA

UWAGA: Bufor bezkomórkowy został skalibrowany dla optymalnych stężeń Mg-glu i K-glu, jak opisano w Sun et al.13. Plik uzupełniający 1 jest potrzebny do etapów kalibracji. Reakcje ustawiono na końcową objętość 10,5 μl każda. Ekstrakty kalibrowano przy użyciu 1 nM liniowego (patrz sekcja 4 poniżej) lub plazmidowego DNA. Doświadczenia można przeprowadzić w tym samym dniu, w którym przygotowywane są, lub przygotowane można zamrozić w temperaturze -80 °C w celu przeprowadzenia doświadczenia w innym dniu. Na wszystkich etapach kalibracji każdy składnik rozmrażano na lodzie przed zmieszaniem i pipetowaniem do płytki 384-dołkowej.

  1. Przygotować mieszankę wzorcową, zgodnie z zakładką "Przygotowanie buforu" w pliku Plik uzupełniający 1 pliku Excel, zawierającą: a) ekstrakt komórkowy (33% całkowitej objętości reakcji), b) DNA reporterowe (w postaci DNA liniowego i/lub plazmidowego) do końcowego stężenia 1 nM, c) bufor bezkomórkowy (PEG8000, roztwór AA i roztwór energetyczny) oraz d) K-glu do końcowego stężenia 80 mM.
  2. Aby uzyskać objętość reakcyjną 10,5 μl, należy pobrać 1,05 μl (10% całkowitej reakcji) różnych stężeń Mg-glu 10x skoncentrowane zapasy (końcowe zakresy stężeń: 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 i 20 mM) i dodać 9,45 μl (90% całkowitej reakcji) Master Mix. Delikatnie wymieszaj.
    UWAGA: Do przygotowania rozcieńczeń należy użyć ośmiopaskowych probówek do PCR i wymieszać za pomocą pipety wielokanałowej. W razie potrzeby można zastosować inny zakres stężeń Mg-glu.
  3. Odpipetować 10 μl powyższych reakcji do 384-dołkowej mikropłytki o kwadratowym dnie, przykryć ją za pomocą uszczelki z płytką samoprzylepną i zmierzyć ekspresję genu jako wynik fluorescencji. Rejestruj dane fluorescencji za pomocą czytnika płytek (np. 485 nm; Em: 528 nm) w regularnych odstępach czasu (np. 5 min) przez 8 godzin inkubacji w temperaturze 30 °C z ciągłym wytrząsaniem orbitalnym w temperaturze 307 cpm.
    UWAGA: W razie potrzeby odwiruj 384-dołkową mikropłytkę (<2,500 x g, 1 min, temperatura pokojowa) przed rozpoczęciem zbierania danych. Pomiary punktu końcowego wykorzystano do porównania ekspresji GFP w różnych składach. Wartości fluorescencji można przeliczyć na znormalizowane jednostki do kreślenia (patrz poniżej).
  4. Zidentyfikuj stężenie Mg-glu, które powoduje najwyższą wartość fluorescencji w punkcie końcowym.
    UWAGA: Jeśli nie masz pewności co do uzyskanego optymalnego stężenia Mg-glu, powtórz krok 3.2 z bardziej zróżnicowanymi zakresami stężeń.
  5. Przy zoptymalizowanym stężeniu Mg-glu przejdź do kalibracji K-glu dla zakresu stężeń (20, 40, 60, 80, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 220 i 240 mM), używając tych samych objętości wskazanych w kroku 3.2. Przeprowadź eksperyment i zidentyfikuj najwyższą wartość fluorescencji spośród badanych stężeń K-glu. Wskazuje to optymalny skład buforowy dla Mg-glu i K-glu dla tego lizatu.
    UWAGA: Jeśli nie masz pewności co do uzyskanego optymalnego stężenia K-glu, powtórz krok z bardziej zróżnicowanymi zakresami stężeń.
  6. Po ustaleniu wartości Mg-glu i K-glu należy przygotować probówki wyjściowe o zoptymalizowanym składzie buforowym zgodnie z uzyskaną objętością partii. Skorzystać z zakładki "Przygotowanie buforu" w pliku uzupełniającym 1, aby obliczyć liczbę potrzebnych probówek buforowych, porcja 38 μl na probówkę, i przechowywać w temperaturze -80 °C.

4. Liniowe przygotowanie DNA

UWAGA: Do kalibracji lizatu używany jest plazmid P70a-deGFP. Plazmid ten utrzymywano w E. coli KL740 cl857+ (Tabela 6) do miniprepu przy użyciu zestawu Plasmid Miniprep lub maxiprep przy użyciu zestawu Plasmid Maxiprep. Liniowe fragmenty DNA użyte jako matryce ekspresyjne w reakcjach bezkomórkowych amplifikowano metodą PCR przy użyciu starterów i matryc wymienionych w Tabeli 7 i Tabeli 8.

  1. Amplifikacja PCR z plazmidu P70a-deGFP przy użyciu polimerazy DNA ze starterami oligonukleotyetycznymi wymienionymi w Tabeli 7. Ustaw reakcje PCR w objętości 50 μl, zgodnie z protokołem producenta, korzystając z programu termocyklera: [98 °C przez 2 min; 40 cykli x (98 °C przez 30 s → 66 °C przez 30 s → 72 °C przez 60 s); 72 °C przez 10 min; 4 °C przez ∞].
  2. Trawić matrycowy DNA w reakcjach PCR, dodając 1 μl enzymu restrykcyjnego DpnI na 50 μl reakcji PCR i inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę. Następnie oczyść reakcję PCR za pomocą zestawu do czyszczenia PCR i DNA i eluuj w wodzie wolnej od nukleaz.
  3. Przed użyciem należy sprawdzić produkty PCR na 1% żelu agarozowym (1x TAE).
  4. Określ ilościowo oczyszczone produkty PCR (lub preparaty plazmidowe) za pomocą Nanodrop (ND-1,000).
    UWAGA: W przypadku stosowania polimerazy/buforu DNA, który jest bezpośrednio kompatybilny z dalszą reakcją bezkomórkową, etap oczyszczania (krok 2) można całkowicie pominąć, a stężenie nieoczyszczonego DNA zmierzyć za pomocą testu fluorometrycznego z barwnikiem wiążącym DNA (patrz Batista i wsp.10).

5. Wykonanie eksperymentalne

UWAGA: Oprócz korzystania z Pliku Uzupełniającego 1 do kalibracji zapasu buforowego dla każdej przygotowanej partii lizatu (powyżej), zaleca się skorzystanie z zakładki 'Przygotowanie Do Adaptacji' w pliku, aby ustawić kolejne reakcje bez komórek. Tak jak poprzednio, objętość reakcji jest ustawiona na 10,5 μl na reakcję, z czego tylko 10 μl jest ostatecznie pipetowane do płytki 384-dołkowej w celu uzyskania danych. W tym przypadku 5 nM każdego szablonu jest używane do wyrażania bez komórek. Ważne jest, aby zachować konsekwencję podczas pipetowania reakcji - używać tej samej pipety i rodzaju końcówek. Dozuj ostrożnie, aby uniknąć pęcherzyków w studzience lub przywierania płynu do ścianek studzienki. W razie potrzeby odwiruj płytkę (<2 500 x g, 1 min, temperatura pokojowa).

  1. Obliczyć objętości do pipetowania, wprowadzając opisy próbek i powtórzenia potrzebne dla każdej próbki do zakładki "Przygotowanie reakcji" w pliku uzupełniającym 1.
    UWAGA: Jeśli wymagana jest objętość reakcji inna niż 10,5 μl, można ją również wprowadzić do pliku uzupełniającego 1. Plik obliczy liczbę probówek z wcześniej zoptymalizowanymi zapasami buforowymi oraz probówek z ekstraktem komórkowym, które mają zostać rozmrożone na lodzie.
  2. Oznacz mikroprobówkę o pojemności 1,5 ml do przygotowania Optimal Master Mix (osobno dla liniowego i plazmidowego DNA), dodaj odpowiednie objętości buforu i lizatu i delikatnie wymieszaj.
    UWAGA: Ze względu na różnice w optymalnych stężeniach K-glu w ich, kopie zakładki "Przygotowanie do reakcji" powinny być wykonane do użycia oddzielnie dla liniowego i plazmidowego DNA.
  3. Najpierw należy pipetować próbki DNA, następnie wodę wolną od nukleaz, a na końcu optymalną mieszankę główną (MM) z kroku 5.2. Reakcję bezkomórkową należy delikatnie wymieszać pipetą tuż przed dodaniem do czytnika płytek i unikać pęcherzyków powietrza.
    UWAGA: Użyj probówki z ośmioma paskami do PCR, aby wymieszać objętość reakcji w celu uzyskania dodatkowej kontrpróby. Na przykład, jeśli planowane są techniczne triplikaty, należy przygotować mieszaninę do czterech reakcji i pozostawić martwą objętość w probówce, aby zmniejszyć błędy pipetowania podczas dodawania próbek do płytki.
  4. Ustawić reakcje w czytniku płytek (Ex 485 nm; Em 528 nm). Przebiegi kinetyczne rejestrowały dane fluorescencji w regularnych odstępach czasu (np. 5 minut) przez 8 godzin inkubacji w temperaturze 30 °C, z ciągłym wytrząsaniem orbitalnym w temperaturze 307 cpm.
    UWAGA: Pomiary punktu końcowego zostały podane jako punkt czasowy 8 godzin. Zebrane wartości fluorescencji są w dowolnych jednostkach (a.u.), ale można je przeliczyć na znormalizowane jednostki do kreślenia (patrz poniżej).

6. Względna kwantyfikacja FITC i GFP

UWAGA: Wyrażenie GFP jest eksportowane przez czytnik płytek w dowolnych jednostkach fluorescencji (a.u.). Zaleca się jednak stosowanie znormalizowanych jednostek miary w celu porównania wartości fluorescencji między różnymi ustawieniami (partiami, sprzętem, użytkownikami i laboratoriami). Poniżej przedstawiono szczegółowe kroki konwersji wartości fluorescencji (au) na równoważne wartości FITC i eGFP (μM), przy użyciu standardowych krzywych NIST-FITC i rekombinowanego eGFP. Roztwór podstawowy NIST-FITC należy przechowywać w temperaturze 4 °C, a rekombinowany eGFP w temperaturze -20 °C. Upewnić się, że roztwór podstawowy i seryjne rozcieńczenia są chronione przed światłem. Po dostarczeniu zaleca się podwielokrotnienie rekombinowanego eGFP na mniejsze objętości, aby uniknąć wielokrotnych cykli zamrażania i rozmrażania.

  1. Przygotować roztwór 100 mM boranu sodu o pH 9,5 i przechowywać w temperaturze pokojowej lub w temperaturze 4 °C.
  2. Przygotować 12 rozcieńczeń (po 70 μl każde) dla krzywej wzorcowej, 2x na krok (50, 25, 12,5, 6,25, 3,125, 1,562, 0,781, 0,390, 0,195, 0,097, 0,048 i 0 μM) wzorca FITC identyfikowalnego przez NIST z 50 μM podstawowego roztworu sodu. Przygotować serię rozcieńczeń w trzech egzemplarzach.
  3. Podobnie jak w kroku 6.2, przygotuj seryjne rozcieńczenia (po 70 μl każde) z rekombinowanego eGFP, używając roztworu boranu sodu (1.2, 0,3, 0,075, 0,0188, 0,0047, 0,0012, 0,0003, 0,00007 i 0 μM). Przy obliczaniu molowości należy wziąć pod uwagę pełną wielkość białka (28 kDa) i stężenie oczyszczonego eGFP (1 g/l). Przygotować serię rozcieńczeń w trzech egzemplarzach.
  4. Dodać 20 μl każdego rozcieńczenia (dziewięć dołków każda = seria trzech rozcieńczeń x trzy kontrpróby techniczne) do 384-dołkowej mikropłytki o kwadratowym dnie, pokrytej samoprzylepną uszczelką płytkową, i inkubować w czytniku płytek w celu pomiaru.
    UWAGA: Tutaj użyte ustawienia to Wzbudzenie: 485/20, Emisja: 528/20, z wzmocnieniem 50. Jednak dodatkowe kombinacje długości fali/wzmocnienia mogą być również używane do kalibracji dla innych cząsteczek fluorescencyjnych i/lub ustawień wzmocnienia. Aby obliczyć współczynnik konwersji, te same ustawienia długości fali i wzmocnienia są wymagane do uzyskania danych fluorescencji GFP z eksperymentów bezkomórkowych i danych krzywej standardowej.
  5. Użyj zakresu sygnału liniowego (tutaj na przykład [FITC] ≤ 0,781 μM), aby dopasować nachylenie [y = ax i R2] dla każdego warunku.
    UWAGA: Asortyment może się różnić w zależności od zastosowanych maszyn i standardowych rozwiązań.
  6. Zapisz dane do kalibracji FITC i eGFP, aby obliczyć względne pomiary dla laboratorium, postępując zgodnie z przykładem w tabeli 9. Podziel wartości uzyskane w dowolnych jednostkach fluorescencji (a.u.) przez wartość nachylenia krzywej "a" (y = oś), aby oszacować produkcję GFP pod względem FITC lub eGFP.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Przedstawione są tutaj reprezentatywne wyniki po kalibracji lizatu w celu uzyskania optymalnych poziomów glutaminianu Mg i glutaminianu K oddzielnie dla liniowego i plazmidowego DNA (Rysunek 1). Optymalne stężenie glutaminianu Mg jest podobne dla ekstraktów ΔrecB i ΔrecBCD i wynosi 8 mM (Rysunek 1B). Jednakże optymalne stężenie glutaminianu K dla plazmidowego DNA wynosi 140 mM, podczas gdy optymalne stężenie glutaminianu K dla liniowego DNA dla...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Tutaj pokazujemy, że lizat komórkowy przygotowany z E. coli BL21 Rosetta2 z nokautem genomowym dla operonu recB lub recBCD wspiera wysoką ekspresję białka z liniowych matryc DNA. Protokół ten opracowuje krok po kroku procedurę kalibracji lizatu specyficzną dla liniowych matryc DNA (ryc. 2), co jest krytycznym krokiem, który prowadzi do wysokiej ekspresji promotorów σ70 w liniowym DNA, osiągając poziomy bliskie plazmidowi dla równomolowych stężeń DNA. Protokół ten p...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Podziękowania

ACB i JLF potwierdzają wsparcie finansowe w postaci grantu ANR SINAPUV (ANR-17-CE07-0046). JLF i JB potwierdzają wsparcie finansowe w postaci grantu ANR SynBioDiag (ANR-18-CE33-0015). MSA i JLF potwierdzają wsparcie finansowe w ramach grantu ANR iCFree (ANR-20-BiopNSE). JB dziękuje za wsparcie ze strony ERBN, która rozpoczyna projekt "COMPUCELL" (grant numer 657579). Centre de Biochimie Structurale dziękuje za wsparcie ze strony Francuskiej Infrastruktury na rzecz Zintegrowanej Biologii Strukturalnej (FRISBI) (ANR-10-INSB-05-01). MK dziękuje za wsparcie finansowe ze strony departamentu MICA INRAe, Université Paris-Saclay, DIM-RFSI regionu Ile-de-France (IdF) oraz ANR DREAMY (ANR-21-CE48-003). Prace te zostały sfinansowane przez Europejską Radę ds. Badań Naukowych (European Research Council Consolidator Award, 865973 CLB).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
2-YT BulionInvitrogen22712020
1,5 ml probówki Safe-LockEppendorf301200861,5 ml mikroprobówka 1,5 ml
384-dołkowa mikropłytka z kwadratowym dnemThermo Scientific Nunc142761
3PGA (disodium kwasu D-(-)-3-fosfoglicerynowego)Sigma-AldrichP8877
uszczelka na płytkę samoprzylepnąThermo Scientific Nunc
AgarInvitrogen30391023
ATP (hydrat soli disodowej adenozyno-5'-trifosforanu)Sigma-AldrichA8937
BL21 Rosetta2Merck Millipore71402
BL21 Rosetta2 Δ recBAddgene176582
BL21 Rosetta2 i Delta; recBCDAddgene176583
cAMP (Adenozyno-3' 5'-cykliczny monofosforan)Sigma-Aldrich A9501
Chloramfenikol Sigma-AldrichC0378
CoA (hydrat koenzymu A)Sigma-AldrichC4282
Corning 15 ml probówki wirówkowe PP, stojak pakowany z nasadką CentriStar, sterylnaCorning43079015 ml
Corning 50 ml PP probówki wirówkowe, stożkowe dno z nasadką CentriStar, sterylnaCorning43082850 ml
CTP (cytydyna 5'-trifosforan, sól disodowa hydrat)Alfa Aesar  J62238
DpnINEBR0176S
DTT (DL-Dithiothreitol)Sigma-AldrichD0632
Kwas folinowy (stała sól wapniowa kwasu folinowego)Sigma-AldrichF7878
GTP (5?-trifosforan guanozyny,  Sól disodowa)Sigma-Aldrich371701
HEPESSigma-Aldrich  H3375
K fosforan dwuzasadowy (K2HPO4)Carl Roth231-834-5
K fosforan jednozasadowy (H2KO4P)Sigma-AldrichP5655
K-glutaminianAlfaAesar A17232
Mg-glutaminian Sigma-Aldrich49605
Millex-GP Filtr strzykawkowy, 0,22 i mikro; m, polieterosulfonMerck MilliporeSLGP033RBfiltr membranowy 0,22 i mikro; m
Monarch PCR & Zestaw do oczyszczania DNANEBT1030SPCR & Zestaw do oczyszczania DNA
Zestaw do miniprzygotowania plazmidu Monarch NEBT1010SZestaw do miniprzygotowania plazmidu
NAD (hydrat dinukleotydu B-nikotynamidoadeninowego) Sigma-Aldrich N6522
Zgodny z NIST standard FITCInvitrogenF36915Zestaw NIST-FITC
NucleoBond Xtra MaxiMacherey-Nagel740414.1Zestaw Plasmid Maxiprep
PEG 8000Sigma-Aldrich89510
Biotek Synergy HTX
Oczyszczone rekombinowane białko EGFPChromotekegfp-250Rekombinowany eGFP
Q5 High-Fidelity 2X Master MixNEBM0492SPolimeraza DNA
Q5 High-Fidelity 2X Master Mix NewEngland BiolabsM0492LZestaw
testowy Qubit dsDNA BRThermoQ32850z barwnikiem wiążącym DNA
RTS Amino Acid Samplerbiotechrabbit BR1401801
SpermidineSigma-Aldrich85558
Sterylna wodaOczyszczona woda z systemu Millipore RiOs 8, sterylizowana w autoklawie.
Tris baseProdukty Life Science Cytiva17-1321-01 
tRNARoche10109550001
Procesor ultradźwiękowy Komórka wibracyjna VC-505SONICSVC505sonikator
UTP Na3 (5'-trifosforan urydyny, hydrat soli trisodowej)Acros Organics 
Woda, bez nukleazThermoR0581woda bez nukleaz
232701 probówka probówka Czytnik płytek Test fluorometryczny 226310010

Bibliografia

  1. Silverman, A. D., Karim, A. S., Jewett, M. C. Cell-free gene expression: an expanded repertoire of applications. Nature Reviews Genetics. 21 (3), 151-170 (2020).
  2. McSweeney, M. A., Styczynski, M. P. Effective use of linear DNA in cell-free expression systems. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, 715328(2021).
  3. Schinn, S. -M. Protein synthesis directly from PCR: progress and applications of cell-free protein synthesis with linear DNA. New Biotechnology. 33 (4), 8(2016).
  4. Prell, A., Wackernagel, W. Degradation of linear and circular DNA with gaps by the recBC enzyme of Escherichia coli. Effects of gap length and the presence of cell-free extracts. European Journal of Biochemistry. 105 (1), 109-116 (1980).
  5. Sitaraman, K., et al. A novel cell-free protein synthesis system. Journal of Biotechnology. 110 (3), 257-263 (2004).
  6. Marshall, R., Maxwell, C. S., Collins, S. P., Beisel, C. L., Noireaux, V. Short DNA containing χ sites enhances DNA stability and gene expression in E. coli cell-free transcription-translation systems. Biotechnology and Bioengineering. 114 (9), 2137-2141 (2017).
  7. Yim, S. S., Johns, N. I., Noireaux, V., Wang, H. H. Protecting linear DNA templates in cell-free expression systems from diverse bacteria. ACS Synthetic Biology. 9 (10), 2851-2855 (2020).
  8. Norouzi, M., Panfilov, S., Pardee, K. High-efficiency protection of linear DNA in cell-free extracts from Escherichia coli and Vibrio natriegens. ACS Synthetic Biology. 10 (7), 1615-1624 (2021).
  9. Zhu, B., et al. Increasing cell-free gene expression yields from linear templates in Escherichia coli and Vibrio natriegens extracts by using DNA-binding proteins. Biotechnology and Bioengineering. 117 (12), 3849-3857 (2020).
  10. Batista, A. C., et al. Differentially optimized cell-free buffer enables robust expression from unprotected linear DNA in exonuclease-deficient extracts. ACS Synthetic Biology. 11 (2), 732-746 (2022).
  11. Levine, M. Z., Gregorio, N. E., Jewett, M. C., Watts, K. R., Oza, J. P. Escherichia coli-based cell-free protein synthesis: protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology. JoVE. (144), e58882(2019).
  12. Kwon, Y. -C., Jewett, M. C. High-throughput preparation methods of crude extract for robust cell-free protein synthesis. Scientific Reports. 5 (1), 8663(2015).
  13. Sun, Z. Z., et al. Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology. Journal of Visualized Experiments. (79), e50762(2013).
  14. Dopp, J. L., Jo, Y. R., Reuel, N. F. Methods to reduce variability in E. Coli-based cell-free protein expression experiments. Synthetic and Systems Biotechnology. 4 (4), 204-211 (2019).
  15. Cole, S. D., et al. Quantification of interlaboratory cell-free protein synthesis variability. ACS Synthetic Biology. 8 (9), 2080-2091 (2019).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Ekstrakty pozbawione egzonukleazbiologia syntetycznaliza sonikacyjnakalibracja buforuoptymalizacja poziomu glutaminianu magnezukalibracja poziomu glutaminianu potasuekspresja GFPekstrakty z Escherichia coli
Bezkomórkowa synteza białek z ekstraktów komórkowych z niedoborem egzonukleazy z wykorzystaniem liniowych matryc DNA
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.