Artykuł metodologiczny

Mikroskopia przyżyciowa do badania interakcji płytkowych-leukocytów-śródbłonka w wątrobie myszy

927 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64239

⸱

6 października 2022

 ,  , 
1Center for Translational Research on Inflammatory Diseases, Michael E. DeBakey Veterans Affairs Medical Center, 2Department of Medicine, Baylor College of Medicine, 3Department of Pediatrics, Baylor College of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Mikroskopia przyżyciowy to potężne narzędzie, które zapewnia wgląd zarówno w czasowe, jak i przestrzenne relacje szybkich i/lub sekwencyjnych procesów. W niniejszym artykule opisano protokół oceny zarówno interakcji białko-białko, jak i interakcji płytk-neutrofile-śródbłonek w sinusoidach wątroby w mysim modelu eksperymentalnej sepsy (endotoksemii).

Streszczenie

Zapalenie i zakrzepica to złożone procesy, które zachodzą głównie w mikrokrążeniu. Chociaż standardowa histologia może zapewnić wgląd w końcowy szlak zarówno zapalenia, jak i zakrzepicy, nie jest w stanie pokazać zmian czasowych, które zachodzą w czasie trwania tych procesów. Mikroskopia przyżyciowa (IVM) to wykorzystanie obrazowania żywych zwierząt w celu uzyskania czasowego wglądu w procesy fizjologiczne in vivo. Metoda ta jest szczególnie skuteczna przy ocenie interakcji komórkowych i białkowych w krążeniu ze względu na szybkie i sekwencyjne zdarzenia, które często są niezbędne do wystąpienia tych interakcji. Chociaż IVM jest niezwykle potężną metodologią obrazowania, która umożliwia przeglądanie złożonych procesów in vivo, istnieje wiele czynników metodologicznych, które należy wziąć pod uwagę podczas planowania badania IVM. W artykule przedstawiono proces przeprowadzania obrazowania przyżyciowego wątroby, identyfikując ważne kwestie i potencjalne pułapki, które mogą się pojawić. W związku z tym w niniejszej pracy opisano zastosowanie IVM do badania interakcji płytkowość-leukocyty-śródbłonek w sinusoidach wątroby w celu zbadania względnego udziału każdej z nich w różnych modelach ostrego uszkodzenia wątroby.

Wprowadzenie

Zapalenie i zakrzepica to złożone procesy, które zachodzą przede wszystkim w mikrokrążeniu. Protokół ten określa przygotowanie chirurgiczne, które pozwala na obrazowanie mikrokrążenia wątroby in vivo. Chociaż standardowa histologia może zapewnić wgląd w końcowe szlaki zarówno zapalenia, jak i zakrzepicy, nie może pokazać zmian czasowych, które zachodzą w całym procesie. Co więcej, metoda ta jest szczególnie skuteczna w ocenie przejściowych interakcji komórkowych i białkowych, które zachodzą w krążeniu mikronaczyniowym, ze względu na jej zdolność do uchwycenia, za pomocą wideomikroskopii, często szybkich i sekwencyjnych interakcji zachodzących w systemach biologicznych. W artykule opisano zastosowanie mikroskopii przyżyciowej do badania interakcji płytki-leukocyty-śródbłonek w sinusoidach wątroby w celu zbadania względnego udziału każdej z nich w różnych modelach ostrego uszkodzenia wątroby.

Chociaż ta metoda chirurgicznego przygotowania i obrazowania może być potencjalnie dostosowana do wielu modeli zapalnych i patologicznych, tutaj przedstawiono dwa modele zapalenia naczyń krwionośnych: model endotoksemii mysiej sepsy i uszkodzenia wątroby wywołanego paracetamolem (APAP). Wstrzyknięcie endotoksyny (lipopolisacharyd; LPS) w celu wywołania eksperymentalnego modelu mysiej sepsy rozpoczęto już w latach 30. XX wieku od jej izolacji, a następnie eksploracji jako kluczowej cząsteczki w progresji sepsy1. Chociaż model ten jest ograniczony, ponieważ LPS jest tylko pojedynczym składnikiem bakterii Gram-ujemnych, jest to powszechnie akceptowana i stosowana metoda, która jest stosunkowo prosta i szybka do wykonania. Co więcej, szybko i dokładnie odtwarza fizjologiczne objawy sepsy1. Biorąc pod uwagę rolę, jaką wchłanianie endotoksyn jelitowych odgrywa w rozwoju chorób wątroby i stanów zapalnych2, jest to doskonały model do badania interakcji płytki-leukocyty-śródbłonek w wątrobie myszy.

Oprócz modelu LPS sepsy, przedawkowanie APAP stanowi doskonały model do badania patologicznych interakcji komórka-komórka w wątrobie. Przedawkowanie APAP może prowadzić do ostrej niewydolności wątroby, charakteryzującej się małopłytkowością i akumulacją płytek krwi w wątrobie, co w konsekwencji blokuje regenerację wątroby za pośrednictwem leukocytów3. Podczas gdy metodologia przygotowania chirurgicznego i obrazowania dla tego modelu może być dostosowana do wielu zagadnień biologicznych i do badania różnych procesów patologicznych, zarówno model LPS sepsy, jak i uszkodzenia wątroby wywołanego APAP są doskonałymi modelami do badania interakcji płytkowość-leukocyty-śródbłonek in vivo.

IVM ma pewne nieodłączne zalety w porównaniu ze standardowymi technikami histologicznymi. Podczas gdy standardowe metody histologiczne pozwalają na badanie całych lub wycinków próbek tkanek oraz ocenę białek i architektury tkanek, metodologie te mają ograniczenia. Z założenia procesy te wymagają przetwarzania tkanek, które mogą zniekształcić lub zamaskować to, co znajduje się w żywym systemie. Tkanka musi zostać utrwalona podczas przygotowania histologicznego, co może spowodować powstanie artefaktów utrwalania lub wzmocnionej autofluorescencji. Utrwalenie może również prowadzić do zmian wewnątrzkomórkowych w tkance, a potencjalne niewłaściwe utrwalenie może prowadzić do degradacji tkanki. Co więcej, metody histologiczne nie mają potencjału do bezpośredniego badania czasowych aspektów interakcji białkowych lub komórkowych i mogą potencjalnie pomijać efemeryczne lub rzadkie interakcje.

Odwrotnie, fluorescencyjna mikroskopia przyżyciowa pozwala uniknąć wielu komplikacji i ograniczeń związanych ze standardową histologią. IVM pozwala uniknąć utrwalenia, a tym samym artefaktów lub degradacji tkanek, które mogą wystąpić podczas przygotowania histologicznego. Z założenia pozwala również na obrazowanie tkanek w żywym systemie biologicznym, w związku z czym izolacja i cięcie tkanek nie są wymagane. Ponadto pozwala na obrazowanie i badanie przejściowych lub rzadkich procesów, które mogą być trudne lub niemożliwe do uchwycenia za pomocą histologii. Ta metoda IVM może być również stosowana do uchwycenia i identyfikacji procesów sekwencyjnych (np. interakcji inicjowanych przez płytki krwi lub leukocyty, w wyniku których dochodzi do wiązania agregatów płytkowo-leukocytowych ze śródbłonkiem naczyniowym). Wreszcie, metoda ta może być dostosowana do wielu systemów obrazowania. W zależności od potrzeb badania i pożądanego zestawu danych, po przygotowaniu chirurgicznym, uzewnętrznioną wątrobę można umieścić w prawie każdym pożądanym systemie obrazowania. Z powodzeniem zastosowaliśmy ten protokół do obrazowania za pomocą szerokokątnej mikroskopii fluorescencyjnej, mikroskopii wirującego dysku, laserowej skaningowej mikroskopii konfokalnej z użyciem skanera głowicy rezonansowej, a także mikroskopii dwufotonowej. Nie ma jednak powodu, aby sądzić, że metoda ta powinna ograniczać się do wyżej wymienionych systemów mikroskopowych.

Ten artykuł o metodach przedstawia protokół IVM, który był wcześniej używany do badania interakcji płytkowość-leukocyty-śródbłonek w wątrobie myszy. Protokół ten został wykorzystany do porównania skroniowej adhezji płytek krwi, znakowanych fluorescencyjnie sprzężonymi przeciwciałami lub genetycznie zmodyfikowanych pod kątem endogennej fluorescencji4. Protokół ten został wykorzystany do oceny przejściowych interakcji płytk-leukocytów-śródbłonka w sinusoidach wątroby w endotoksemicznym modelu zapalenia wątroby oraz do kolokalizacji selektyny P i rekombinowanego białka. Ponadto protokół ten umożliwił określenie, czy różnice obserwowane w gęstości neutrofili przy użyciu standardowej histologii były wynikiem różnic w prędkościach krwinek czerwonych (jako substytut objętościowego natężenia przepływu)5. Wreszcie, metoda ta została wykorzystana do oceny rekrutacji płytek krwi przez komórki Kupffera w sinusoidach wątroby w ostrym modelu uszkodzenia wątroby wywołanego przez APAP6. Taki dorobek nie byłby możliwy przy użyciu standardowych metod histologicznych. Jak wspomniano, protokół ten można dostosować do różnych systemów obrazowania, a przy odpowiednim przygotowaniu chirurgicznym, doborze przeciwciał fluorescencyjnych i ustawieniach obrazowania, protokół ten jest wysoce niezawodny i powtarzalny w badaniu patologii wątroby.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie protokoły dla zwierząt zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Baylor College of Medicine oraz Komitet ds. Badań i Rozwoju Centrum Medycznego Michael E. DeBakey Veterans Affairs. Wszystkie eksperymenty są śmiertelne, a eutanazja jest przeprowadzana na końcu w chirurgicznym znieczuleniu. Szczegółowe informacje na temat wszystkich materiałów, odczynników i sprzętu użytego w tym protokole można znaleźć w Tabeli Materiałów.

1. Przygotowanie przeciwciał i barwników

  1. Wybór przeciwciał i barwników
    UWAGA: Liczba obserwowanych jednoczesnych kolorów będzie zależała od konkretnej konfiguracji mikroskopu. W zastosowanym tutaj systemie można jednocześnie wizualizować cztery różne długości fal.
    1. Wizualizacja naczyń pływających:
      1. Opierając się na projekcie eksperymentalnym, oznacz naczynia krwionośne przeciwciałem specyficznym dla śródbłonka (np. CD31) i/lub cząsteczką, która jest równomiernie rozmieszczona w osoczu (np. dekstran lub albumina).
        UWAGA: W tym artykule opisano zastosowanie dekstranu znakowanego na czerwono w Teksasie (150 kDa; 250 μg/mysz). Zaletą tego białka o dużej masie cząsteczkowej jest jego zdolność do pozostawania w układzie naczyniowym podczas ostrego stanu zapalnego. Należy zachować ostrożność podczas stosowania znakowania przeciwciałami, aby uniknąć przeciwciał, które mogą zakłócać funkcję śródbłonka.
    2. Wizualizacja płytek krwi:
      1. Aby zidentyfikować płytki krwi, należy użyć genetycznie zmodyfikowanych myszy (np. R26R-EYFPf/f/PF4-Cre) lub przeciwciał specyficznych dla płytek krwi (np. anty-GPIbβ) dla IVM. Szczegółowe informacje na temat stosowania znakowania fluorescencyjnego płytek krwi można znaleźć w poprzedniej publikacji4.
        UWAGA: W tym przypadku stosuje się przeciwciała anty-GPIbβ znakowane DyLight488 (X488; 6 μg/mysz). Należy zachować ostrożność podczas stosowania znakowania przeciwciałami, aby uniknąć zakłóceń w funkcji płytek krwi lub adhezji.
    3. Wizualizacja leukocytów:
      1. Podobnie jak w przypadku obrazowania płytek krwi, wizualizuj interesujące leukocyty za pomocą genetycznie zmodyfikowanych myszy (np. LysM-EGFP dla granulocytów) lub przeciwciał specyficznych dla leukocytów (np. Ly6G dla mysich neutrofili). Aby postępować zgodnie z tym protokołem, użyj przeciwciał anty-Ly6G znakowanych Brilliant Violet 421 (BV421) (3 μg / mysz). W ostrych (<6 h) doświadczeniach znakować neutrofile 3 μg anty-Ly6G (klon 1A8) na zwierzę.
        UWAGA: W przypadku stosowania przeciwciała anty-Ly6G (klon 1A8) należy zauważyć, że przeciwciało to zostało użyte do wyczerpania neutrofili (0,05-1 mg przeciwciała/mysz)7-9 po co najmniej 24 godzinach i/lub wielokrotnych wstrzyknięciach. Doniesiono również, że przeciwciała anty-Ly6G (1A8) wpływają na adhezję i transmigrację neutrofili przy wysokim (ale nie niskim) naprężeniu ścinającym w niektórych, ale nie wszystkich sytuacjach 9,10. Dlatego dawka przeciwciał powinna być starannie dobrana do każdego przypadku.
    4. Dodatkowe białka:
      1. W zależności od liczby laserów i zestawów filtrów/detektorów dostępnych w danym systemie obrazowania, dodaj więcej długości fal, aby zidentyfikować więcej obiektów jednocześnie, zwracając uwagę na unikanie nakładania się widma.
        UWAGA: Protokół ten opisuje obrazowanie czwartego obiektu, selektyny P (klon Psel.KO2.3), przy użyciu przeciwciała anty-selektynowego P znakowanego PerCP-eFluor 710 (4 μg/mysz). Chociaż większość opisów i zdjęć w tym artykule dotyczy ostrego uszkodzenia wątroby wywołanego LPS, inne modele urazów mogą być interesujące i mogą wymagać alternatywnych etykiet. Zobacz dyskusję, aby zapoznać się z opisem przeciwciał stosowanych w przypadku urazów wywołanych przez APAP6.
  2. Usuwanie konserwantów i sterylizacja
    UWAGA: Chociaż na rynku dostępne są przeciwciała i barwniki gotowe do wstrzykiwań zwierzętom, większość z nich będzie zawierała nośniki lub konserwanty (np. Azydek sodu), które mogą być szkodliwe dla zwierząt lub dodawać zmienne zakłócające. Przeciwciała i barwniki zawierające nośniki lub konserwanty należy dializować z roztworem soli fizjologicznej bez wapnia i magnezu buforowanym fosforanami Dulbecco (DPBS-/-; lub innymi fizjologicznymi).
    1. Wlać 500 ml DPBS-/- (~1,000-krotna objętość przeciwciała/barwnika do dializyzacji) do zlewki z mieszadłem magnetycznym. Podłącz kasetę o mocy 7 000 MWCO do boi pływakowej i umieść ją w buforze do dializy na co najmniej 5 minut, aby wstępnie przygotować membranę. Wyjmij kasetę i osusz plastikowe krawędzie niestrzępiącą się chusteczką. Unikać dotykania membrany dializy.
    2. Wstrzyknąć przeciwciało/barwnik do kasety przez jeden z czterech portów za pomocą igły 18-20 G. Umieścić kasetę z przeciwciałem/barwnikiem w buforze do dializy. Umieścić zlewkę na mieszadle magnetycznym i dializować przez co najmniej 1 godzinę w temperaturze 4 °C. Zmienić bufor do dializy.
    3. Powtórzyć dializę i wymianę buforu dializacyjnego w kroku 1.2.2 jeszcze co najmniej dwa razy (co najmniej trzy wymiany).
    4. Wyjmij kasetę i osusz plastikowe krawędzie niestrzępiącą się chusteczką. Unikać dotykania membrany dializy. Odessać przeciwciało/barwnik z kasety przez nieużywany port za pomocą igły 18-20 G.
    5. W kapturze do hodowli tkankowych wysterylizuj preparaty za pomocą filtra 0,2 μm przed użyciem u zwierząt. Niewykorzystane porcje przechowywać w sterylnych probówkach w temperaturze 4 °C.
  3. Formantów
    1. Chociaż dokładne kontrole niezbędne w każdym eksperymencie będą się różnić w zależności od projektu badania, należy pamiętać o uwzględnieniu odpowiednich kohort pozorowanych, grup leczonych nośnikiem i nieleczonych nośnikiem, a także kontroli izotypowych, aby wykluczyć niespecyficzne znakowanie i efekty biologiczne podczas analizy wyników badania.

2. Dootrzewnowe wstrzyknięcie endotoksyny

UWAGA: Aby ocenić interakcje płytk-neutrofile-śródbłonek w sinusoidach wątroby w eksperymentalnym modelu mysiej sepsy, można zastosować wstrzyknięcie endotoksyny.

  1. Zważyć myszy, aby określić ilość endotoksyny do wstrzyknięcia (5 mg/kg; Escherichia coli, serotyp O111:B4; zawartość endotoksyn 1 x 106 EU/mg).
    UWAGA: Siła działania i działanie endotoksyn są zależne od gatunku i szczepu i mogą się różnić w zależności od partii11. Dlatego, aby zmaksymalizować spójność wyników, eksperymenty powinny być przeprowadzane z tą samą partią endotoksyny12.
  2. Pobrać endotoksynę rozcieńczoną solą fizjologiczną (0,9% chlorku sodu) do strzykawki z dołączoną igłą 27 G. W ręce niedominującej trzymaj mysz za kark za pomocą kciuka i palca wskazującego. Drugą ręką nałóż trakcję na ogon, aby odsłonić brzuch i umieść ogon między piątą cyfrą a dłonią niedominującą.
  3. Oczyść brzuch 70% etanolem. Wbić igłę w lewy dolny (lub prawy) brzuch i wstrzyknąć endotoksynę.
    UWAGA: Należy zachować ostrożność, aby nie wbijać igły zbyt głęboko, ponieważ istnieje ryzyko uszkodzenia narządów, które może zakłócić eksperymenty (np. uszkodzenie jelit, jelit, nerek itp.).
  4. Wykonaj kroki 2.1-2.3 u zwierząt kontrolnych przy użyciu zwykłego roztworu soli fizjologicznej (lub nośnika).
    UWAGA: Uszkodzenie wątroby wywołane przez APAP można osiągnąć przy użyciu podobnej metodologii jak powyżej, przy użyciu APAP, a nie endotoksyny6. Zobacz dyskusję, aby uzyskać szczegółowe informacje związane z modelem uszkodzenia wątroby wywołanego przez APAP.

3. Indukcja i utrzymanie znieczulenia zwierząt oraz eutanazja

  1. Umieść zwierzęta w znieczuleniu chirurgicznym. Utrzymuj znieczulenie, podając wziewny izofluran przez nos lub rurkę tracheostomijną. Oceń i dostosuj poziom znieczulenia, monitorując ruch po uszczypnięciu palca u nogi.
  2. Przeprowadzić eutanazję na zakończenie wszystkich eksperymentów poprzez wykrwawienie w znieczuleniu chirurgicznym, a następnie obustronne odmy opłucnowe.

4. Cewnikowanie żyły szyjnej i tchawicy

  1. Wykonać tracheotomię, aby ułatwić oddychanie i umieszczenie cewników naczyniowych do wstrzykiwania znakowanych przeciwciał/barwników.
    UWAGA: Chirurgiczny mikroskop preparacyjny lub lupy są pomocne w cewnikowaniu.
  2. Ogol sierść z szyi i brzucha; usuń nadmiar włosów. Umieść zwierzę na podkładce rozgrzewającej, aby utrzymać temperaturę ciała na poziomie 37 °C, używając sondy doodbytniczej do monitorowania temperatury głębokiej. Wyszoruj szyję betadyną, a następnie 70% etanolem.
  3. Wykonaj pionowe nacięcie w linii środkowej szyi i odsłoń tchawicę za pomocą rozwarstwienia.
    1. Tracheostomii
      1. Przygotuj rurkę tracheostomijną PE90 z włożoną igłą 21 G (Rysunek 1A).
        UWAGA: Dodanie skosu ~45° do końca rurki tracheostomijnej może ułatwić jej wprowadzenie do tchawicy. Alternatywnie obwodowy cewnik dożylny o sile 18-20 G można również zastąpić rurką PE90.
      2. Po nacięciu skóry i powięzi odbij gruczoły ślinowe od środka.
      3. Za pomocą sekcji oddziel mięsień mostkowo-tarczowy, aby zapewnić lepszy dostęp do tchawicy.
        UWAGA: Uważaj, aby ominąć naczynia zasilające i tętnice szyjne, które przylegają do tchawicy.
      4. Wykonaj małe (~1-2 mm) poziome nacięcie między pierścieniami tchawicy po brzusznej/przedniej stronie tchawicy (Rysunek 1B).
        UWAGA: Użycie nożyczek Vannas ułatwi prawidłowe rozwarstwienie. Upewnij się, że nacięta jest tylko przednia powierzchnia tchawicy; Całkowite przecięcie tchawicy utrudni kaniulację tchawicy i grozi uszkodzeniem pobliskich struktur naczyniowych.
      5. Przełóż rurkę tracheostomijną do otworu. Upewnij się, że końcówka rurki nie jest włożona poza carinę.
      6. Zabezpiecz rurkę tracheostomijną w tchawicy, zawiązując jedwabny szew #4-0 wokół tchawicy i rurki, używając pierścieni tchawicy jako podparcia (Rysunek 1C).
    2. Kaniulacja szyjna zewnętrzna
      1. Przygotuj cewnik szyjny (Rysunek 2) za pomocą rurki PE50 (średnica zewnętrzna 0,97 mm, średnica wewnętrzna 0,58 mm) z rurką PE10 (średnica zewnętrzna 0,61 mm, średnica wewnętrzna 0,28 mm) włożoną na jeden koniec (wstawka z rysunku 2) i igłą o średnicy 22 G lub 23 G włożoną w drugi. Użyj kleju, aby upewnić się, że rurka nie ślizga się ani nie przecieka. Podłączyć strzykawkę wypełnioną sterylnym solą fizjologiczną, aby przepłukać cewnik.
      2. Odsłoń żyłę szyjną zewnętrzną (EJV) po odbiciu gruczołu ślinowego. Używając sekcji, uwolnij EJV z otaczającej tkanki łącznej (Rysunek 3A).
      3. Używając jedwabnych szwów #4-0, podwiąż czaszkowy koniec wizualizowanego EJV i umieść luźną pętlę wokół ogonowego końca EJV (Ryc. 3B). Zacisnąć końce każdego szwu razem z hemostatykami i delikatnie odsunąć oba hemostatyki od siebie, aby odsłonić EJV.
        UWAGA: Optymalnym obszarem do kantonacji jest obszar między gałęziami przedniej żyły szyjnej czaszki a wewnętrzną żyłą szyjną doogonowo. Aby ułatwić zakładanie szwów, złóż kawałek (~15 cm) szwu na pół i przełóż zgięty koniec pod EJV za pomocą jednej pary kleszczy, jednocześnie podnosząc EJV za pomocą oddzielnej pary kleszczy, aby zapobiec stoczeniu się naczynia. Następnie odetnij szew, aby uzyskać dwie oddzielne długości.
      4. Za pomocą nożyczek Vannas wykonaj małe (~1 mm) nacięcie w przedniej powierzchni EJV. Wprowadzić wygiętą, igłę 30 G (uzupełnioną szpilką o średnicy 0,15 mm, tępo spiłowaną i włożoną w końcówkę igły) do EJV przez nacięcie i delikatnie podnieść, aby ułatwić przejście cewnika zawierającego sól fizjologiczną do EJV.
        UWAGA: Upewnij się, że cewnik i piasta nie mają żadnych pęcherzyków powietrza przed włożeniem i przepłukaniem do myszy. Zator powietrzny może być śmiertelny dla zwierzęcia.
      5. Gdy cewnik znajdzie się w EJV, poluzuj pętlę ogonową na tyle, aby umożliwić przejście cewnika głębiej do żyły. Sprawdź, czy cewnik jest umieszczony, zasysając krew i przepłukując cewnik w celu sprawdzenia, czy nie ma wycieków (Rysunek 3C).
      6. Za pomocą pętli ogonowej zabezpiecz cewnik w EJV. Używając szwu czaszkowego, przymocuj cewnik do czaszkowego końca EJV, aby zminimalizować przypadkową dekaniulację (Rysunek 3D).
      7. Zamknij nacięcie skóry szyi jedwabnym szwem #4-0.

5. Eksterioryzacja wątroby

  1. Oczyść brzuch peelingiem betadynowym, a następnie 70% etanolem.
  2. Wykonaj pionowe nacięcie ~1 cm w skórze górnej części brzucha, zaczynając od podstawy mostka. Za pomocą rozwarstwienia oddziel skórę od mięśni brzucha. Kauteryzuj duże naczynia pokarmowe skóry i mięśni, aby zminimalizować krwawienie podczas następujących kroków (Rysunek 4A).
  3. Wykonaj ~1-2 cm poziome nacięcie skóry, a następnie mięsień brzucha, przecinając pionowe nacięcie w kroku 5.2 mniej więcej na górze widocznej wątroby; użyj narzędzia do kauteryzacji, aby wspomóc hemostazę skóry (Rysunek 4B).
    UWAGA: Rozmiar nacięcia brzucha ma kluczowe znaczenie dla optymalnego obrazowania wątroby. Jeśli otwór jest zbyt mały, istnieje ryzyko niedokrwienia wątroby z powodu nadmiernego rozciągania lub uderzenia w tętnicę wątrobową i/lub żyłę wrotną. Jeśli otwór jest zbyt duży, inne narządy, takie jak jelita, mogą być również zewnętrznione i zakłócać obrazowanie.
  4. Wytnij okrąg o średnicy około 1 cm na środku gazy o wymiarach 2 x 2 i zwilż go ciepłą normalną solą fizjologiczną. Umieść gazę tak, aby otwór był wyśrodkowany nad nacięciem. Delikatnie rozsuń krawędzie nacięcia i lekko uciskaj brzuch w górę, aby zewnętrzizować wątrobę, tak aby wątroba łatwo spoczywała na zwilżonej gazie (Ryc. 4C).
  5. Umieść mysz na tacy do obrazowania w pozycji leżącej, z wątrobą wyśrodkowaną nad szkiełkiem nakrywkowym (Rysunek 4D).
    UWAGA: U zwierzęcia kontrolnego wątroba powinna być bordowa. W tym protokole do IVM używany jest odwrócony, laserowy skaningowy mikroskop konfokalny z dwukierunkowym skanerem głowicy rezonansowej. W związku z tym do stworzenia niestandardowego zasobnika IVM użyto drukarki 3D (Rysunek 5). Dostarczane są pliki .stl utworzone do drukowania 3D (plik uzupełniający 1); Konieczne może być dostosowanie do indywidualnych potrzeb.
  6. Przenieś zwierzę do odwróconego mikroskopu.

6. Obrazowanie pod mikroskopem przyżyciowym wątroby

UWAGA: Ten protokół wykorzystuje laserowy skaningowy mikroskop konfokalny z dwukierunkowym skanerem głowicy rezonansowej do mikroskopii przyżyciowej. Aby ustabilizować częstotliwość głowicy rezonansowej, włącz system na co najmniej 30 minut przed obrazowaniem. Różne systemy mogą mieć różne możliwości. Dyskusja na ten temat wykracza poza zakres tego artykułu. Skontaktuj się z przedstawicielami sprzętu, aby uzyskać szczegółowe informacje techniczne dotyczące konkretnych systemów.

  1. Aby utrzymać chirurgiczną płaszczyznę znieczulenia, podłącz zwierzę do systemu dostarczania izofluranu.
    UWAGA: W zależności od protokołu eksperymentalnego może być konieczna wentylacja mechaniczna (w przeciwieństwie do wentylacji spontanicznej).
  2. Umieść promiennik rozgrzewający nad zwierzęciem, używając sondy doodbytniczej, aby utrzymać temperaturę rdzenia 37 °C.
    UWAGA: W tym protokole prostokątny kawałek pianki, który pasuje do tacki IVM, działa jako izolator i przekładka, na której umieszcza się podkładkę do ogrzewania promiennika (Rysunek 4D).
  3. Ustaw wieżyczkę obiektywu na żądane powiększenie, w razie potrzeby nakładając olejek immersyjny. Aby postępować zgodnie z tym protokołem, użyj obiektywu z olejkiem silikonowym 60x/NA1.30 z 1-krotnym zoomem optycznym.
  4. Po zidentyfikowaniu płaszczyzny ogniskowej zidentyfikuj ≥10 losowych pól widzenia, unikając obszarów w pobliżu krawędzi wątroby.
    UWAGA: Ponieważ wątroba wykazuje autofluorescencję w kanale izotiocyjanianu fluoresceiny (FITC), użyj epifluorescencji, aby szybko zidentyfikować ogólną płaszczyznę ogniskową.
    1. W zależności od systemu, zidentyfikuj krawędzie widocznej wątroby za pomocą epifluorescencji w kanale FITC i zapisz współrzędne (x,y) etapu.
    2. Użyj granic (x,y) wątroby i generatora liczb losowych, aby zidentyfikować współrzędne losowe (x,y). Aby uzyskać akceptowalne pole widzenia, należy zwrócić uwagę na: a) na obecność naczyń rozsianych po całym polu widzenia; b) ≥80 % statków znajdujących się w tej samej płaszczyźnie ogniskowej; oraz (c) ≥1 pole widzenia z dala od krawędzi wątroby (przykład w Rysunek 6). Jeśli analiza obrazu koncentruje się na interakcjach płytkowych-leukocytów-śródbłonka w sinusoidach wątrobowych, należy wykluczyć pola z naczyniami o średnicy ≥15 μm (sinusoidy mysie mają zwykle średnicę ≤10 μm).

7. Analiza obrazu

UWAGA: ImageJ/FIJI został użyty do przetworzenia wszystkich obrazów w tym artykule. FIJI (fiji.sc) to wersja Image J (imagej.nih.gov) o otwartym kodzie źródłowym, która ma większą funkcjonalność dzięki zastosowaniu dodatkowych wtyczek i makr13.

  1. Otwórz wielokanałowe pliki poklatkowe w folderze ImageJ/FIJI.
    UWAGA: W zależności od platformy mogą być wymagane dodatkowe programy/wtyczki. ImageJ/FIJI posiada importer formatów biologicznych, który może otwierać wiele różnych typów plików, takich jak pliki .oir firmy Olympus. Tutaj pliki zostały przekonwertowane na .tif, ponieważ jest to szerzej stosowany format.
  2. Upewnij się, że ustawiona jest prawidłowa skala; poszukaj stosunku pikseli do μm i interwału czasu w metadanych/właściwościach.
  3. Użyj różnych filtrów, aby usunąć szum tła (np. filtr mediany o promieniu 2 pikseli używany w tym protokole). Upewnij się, że przetwarzanie jest podobne dla wszystkich obrazów, aby zminimalizować różnice w przetwarzaniu końcowym. Ponieważ w tych eksperymentach porównuje się liczby i długości, zamiast średniej intensywności fluorescencji, należy przefiltrować w celu poprawy przejrzystości oraz identyfikacji i pomiaru interakcji komórka-komórka.
    UWAGA: Użycie i wielkość filtrów będą zależeć od wielkości interesującego obiektu (celów) oraz stosunku sygnału do szumu na obrazach.
  4. Ponieważ istnieje niejednorodność między polami widzenia w gęstości naczyń krwionośnych, zmierz całkowity obszar naczyń krwionośnych w każdym polu za pomocą pędzla do zaznaczania (Rysunek 7).
    1. Kliknij prawym przyciskiem myszy narzędzie do zaznaczania owalu i wybierz narzędzie pędzla zaznaczania.
    2. Dostosuj rozmiar pędzla, klikając dwukrotnie ikonę narzędzia pędzla zaznaczania.
    3. Obrysuj naczynia, aby je podświetlić/zaznaczyć. Aby usunąć części zaznaczenia, użyj [alt]-lewy przycisk myszy i dodaj części, używając [shift]-lewy przycisk myszy.
    4. Naciśnij [M], aby zmierzyć wybrany obszar.
      UWAGA: Jeśli skala obrazu została prawidłowo ustawiona, wyjście powinno być w μm2, które jest konwertowane na mm2.
  5. Policz liczbę płytek krwi i leukocytów w terenie. Rozważ komórki jako komórki przylegające, jeśli poruszały się <1 ciałem komórki w ciągu 30 sekund. Obliczyć liczbę komórek (płytek krwi i/lub leukocytów) namm2.
  6. Aby oszacować względny przepływ krwi w każdym naczyniu, zmierz średnią prędkość czerwonych krwinek (RBC) jako substytut za pomocą wtyczki MTrackJ w ImageJ/FIJI (imagescience.org/meijering/ software/mtrackj)14, zgodnie z wcześniejszym opisem5. Zidentyfikuj erytrocyty jako okrągłe lub dyskowate defekty wypełnienia w kanale dekstranu. Zapisz ścieżki do prowadzenia dokumentacji, analizy asynchronicznej i weryfikacji.
    UWAGA: Przykład tego jest pokazany w Rysunek 8 i Dodatkowy film S1.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Ocena wpływu domeny pręcików wimentyny na adhezję leukocytów do śródbłonka w stanie zapalnym
Wiązanie ligandu glikoproteiny 1 selektyny P-1 leukocytów z śródbłonkiem i płytkami krwi występuje podczas ostrej fazy zapalenia wątroby wywołanego sepsą. Wykazano jednak, że rekombinowana ludzka domena pręcikowa wimentyny (rhRod) wiąże się z selektyną P i blokuje adhezję leukocytów zarówno do śródbłonka, jak i płytek krwi. Protokół ten został wykorzystany w mysim modelu sepsy w celu wizualizacji wpływu rhRod...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Celem tego artykułu jest nakreślenie niezbędnych kroków wymaganych do wiarygodnego przechwytywania wysokiej rozdzielczości obrazów i filmów przyżyciowych wątroby myszy w warunkach homeostatycznych i po podaniu endotoksyny lub APAP. Chociaż protokół ten pozwolił na spójne tworzenie danych na temat interakcji płytkowość-leukocyty-śródbłonek w wątrobie, istnieje szereg krytycznych kroków wymaganych do osiągnięcia sukcesu, a także potencjalnych pułapek, których należy unikać podczas korzystania z tego paradygmatu obrazowania...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów. Fundatorzy nie odgrywali żadnej roli w projektowaniu badania, gromadzeniu i analizie danych, podejmowaniu decyzji o publikacji lub przygotowaniu manuskryptu. Treść nie reprezentuje poglądów Departamentu ds. Weteranów Stanów Zjednoczonych ani rządu Stanów Zjednoczonych.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez NIH/NIGMS GM-123261 (FWL) i NIH/NHLBI HL139425 (JC). Wsparcie badawcze zostało również sfinansowane przez NIH/NHLBI HL116524.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
2" x 2"McKesson Med. Surg92242000Do izolacji wątroby
# 4-0 jedwabny pleciony szew z igłąSOFSILKN/A4-0 Pleciony z miękkiego jedwabiu, niewchłanialny: Igła do cięcia C-1
# 4-0 jedwabny szew pleciony bez igłyEthiconN/A4-0 pleciona jedwab, niewchłanialna
igła 21 G (0,5 cala)SAI Infusion TechnologiesB21-50Służy do mocowania do końca rurki tracheostomijnej, aby umożliwić podłączenie do respiratora. Alternatywnym źródłem jest
igła Instech 23 G (0,5 cala)SAI Infusion TechnologiesB23-50Jest ona używana do cewnika naczyniowego, aby umożliwić połączenie ze strzykawką. Alternatywnym źródłem są
nożyczki preparacyjne Instech (spiczasta końcówka)Kent ScientificINS600393-GMicro Nożyczki preparacyjne; Ostrza z węglików spiekanych; Prosty; Ostre punkty; 24 mm Długość ostrza; 4 1/2 "Długość całkowita
Mikronożyczki McPherson-Vannas (Vannas)Kent Scientific INS600124Są one przydatne do tworzenia otworów w tchawicy i naczyniach
Rurki polietylenowe 10InstechBTPE-10Służy do wykonania wewnątrznaczyniowej części cewnika. Alternatywnym źródłem jest rurka polietylenowa BD Intramedic
50InstechBTPE-50Służy do wykonania zewnątrznaczyniowej części cewnika.  Alternatywnym źródłem jest rurka polietylenowa BD Intramedic
90InstechBTPE-90Służy do produkcji rurki tracheostomijnej.  Alternatywnym źródłem jest BD Intramedic
USP grade sterylny roztwór soli fizjologicznejCoviden8881570121Hospira 0,0% Chlorek sodu do wstrzykiwań, USP
Microscopy Supplies
Isofluran i respiratorKent ScientificSomnosuiteKombinacja respiratora dla gryzoni i systemu
dostarczania lotnego środka znieczulającegoPodkładka dystansowa piankowa do podkładki rozgrzewającej podczas mikroskopiiNIEDOTYCZYTa przekładka powinna być wycięta z wysokiej jakości pianki, powinna pasować do tacki mikroskopu wątrobowego, a konkretne wymiary wysokości zależą od systemu mikroskopu
System laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego ze skanerem głowicy rezonansowejOlympusFV3000Chociaż opisujemy użycie Olympus FV3000 przy użyciu skanera głowicy rezonansowej, ten protokół współpracuje z większością systemów obrazowania
Taca mikroskopu wątrobowegoN/AN/ATaca mikroskopu wątrobowego została zaprojektowana dla mikroskopu odwróconego
przeciwciała i Powiązane odczynniki< / strong>
Brilliant Violet 421 / przeciwciało anty-mysie Ly6GBioLegend1276283 i mikro; g/myszka. Do znakowania przeciwciała przeciwko granulocytom obojętnochłonnym
BV421/F4/80BioLegend1231320,75 mg/kg. Do oznaczania komórek Kupffera
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco bez wapnia lub magnezuGibco/ThermoFisher Scientific14190144Stosowany jako dialilat do usuwania azydku sodu z przeciwciał
DyLight649/anty-GPIbβ emfret przeciwciałaAnalyticsX6493 µ g/myszka. Do oznaczania płytek
krwi DyLight488/anti-mouse GPIbβ antibodyemfret AnalyticsX4886 µ g/myszka. Do oznaczania płytek krwi
Endotoksyna z Escherichia coli serotyp O111:B4Sigma-AldrichL30245 mg/kg; Siła działania endotoksyny może się różnić w zależności od partii. Dlatego ta sama partia powinna być użyta do serii eksperymentów w celu zminimalizowania zmienności spowodowanej partią endotoksyny
PerCP-eFluor 710 / przeciwciało anty-mysie selektyny PInvitrogen46-0626-824 &mikro; g/myszka. Do oznaczania kasety P-selectin
Slide-a-Lyzer 7,000 MWCOThermo Scientific66370Służy do dializy przeciwciał w celu usunięcia azydku sodu
Redlabeled dekstranSigma-AldrichT1287~150 kDa; 250 &mikro; g/mysi
TRITC/albumina surowicy bydlęcejSigma-AldrichA2289500 µ g/myszka. Rozcieńczyć do stężenia podstawowego 50 mg/ml (5%) w roztworze soli fizjologicznej. Służy do oznaczania naczyń krwionośnych. Podczas stanu zapalnego może łatwiej przenikać do przestrzeni śródmiąższowej niż dekstran o dużej masie cząsteczkowej
Gąbki włókninowe Texas

Bibliografia

  1. Deitch, E. A. Rodent models of intra-abdominal infection. Shock. 24, Suppl 1 19-23 (2005).
  2. Nolan, J. P. The role of intestinal endotoxin in liver injury: A long and evolving history. Hepatology. 52 (5), 1829-1835 (2010).
  3. Miyakawa, K., et al. Platelets and protease-activated receptor-4 contribute to acetaminophen-induced liver injury in mice. Blood. 126 (15), 1835-1843 (2015).
  4. Da, Q., Derry, P. J., Lam, F. W., Rumbaut, R. E. Fluorescent labeling of endogenous platelets for intravital microscopy: Effects on platelet function. Microcirculation. 25 (6), 12457(2018).
  5. Lam, F. W., et al. The vimentin rod domain blocks P-selectin-P-selectin glycoprotein ligand 1 interactions to attenuate leukocyte adhesion to inflamed endothelium. PLoS One. 15 (10), 0240164(2020).
  6. Shan, Z., et al. Chitinase 3-like-1 contributes to acetaminophen-induced liver injury by promoting hepatic platelet recruitment. eLife. 10, 68571(2021).
  7. Daley, J. M., Thomay, A. A., Connolly, M. D., Reichner, J. S., Albina, J. E. Use of Ly6G-specific monoclonal antibody to deplete neutrophils in mice. Journal of Leukocyte Biology. 83 (1), 64-70 (2008).
  8. Pollenus, E., et al. Limitations of neutrophil depletion by anti-Ly6G antibodies in two heterogenic immunological models. Immunology Letters. 212, 30-36 (2019).
  9. Wang, J. X., et al. Ly6G ligation blocks recruitment of neutrophils via a β2-integrin-dependent mechanism. Blood. 120 (7), 1489-1498 (2012).
  10. Cunin, P., et al. Differential attenuation of β2 integrin-dependent and -independent neutrophil migration by Ly6G ligation. Blood Advances. 3 (3), 256-267 (2019).
  11. Weary, M. E., Donohue, G., Pearson, F. C., Story, K. Relative potencies of four reference endotoxin standards as measured by the Limulus amoebocyte lysate and USP rabbit pyrogen tests. Applied and Environmental Microbiology. 40 (6), 1148-1151 (1980).
  12. Kiers, D., et al. Comparison of different lots of endotoxin and evaluation of in vivo potency over time in the experimental human endotoxemia model. Innate Immunity. 25 (1), 34-45 (2019).
  13. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  14. Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Methods for cell and particle tracking. Methods in Enzymology. 504, 183-200 (2012).
  15. Sierro, F., et al. A liver capsular network of monocyte-derived macrophages restricts hepatic dissemination of intraperitoneal bacteria by neutrophil recruitment. Immunity. 47 (2), 374-388 (2017).
  16. Guidotti, L. G., et al. Immunosurveillance of the liver by intravascular effector CD8+ T cells. Cell. 161 (3), 486-500 (2015).
  17. Davis, R. P., et al. Optimization of in vivo imaging provides a first look at mouse model of non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) using intravital microscopy. Frontiers in Immunology. 10, 2988(2020).
  18. Reif, R., et al. In vivo imaging of systemic transport and elimination of xenobiotics and endogenous molecules in mice. Archives of Toxicology. 91 (3), 1335-1352 (2017).
  19. Sloboda, D. D., Brooks, S. V. Treatment with selectin blocking antibodies after lengthening contractions of mouse muscle blunts neutrophil accumulation but does not reduce damage. Physiological Reports. 4 (1), 12667(2016).
  20. Lam, F. W., Da, Q., Guillory, B., Cruz, M. A. Recombinant human vimentin binds to P-selectin and blocks neutrophil capture and rolling on platelets and endothelium. Journal of Immunology. 200 (5), 1718-1726 (2018).
  21. Mossanen, J. C., Tacke, F. Acetaminophen-induced acute liver injury in mice. Laboratory Animals. 49, 30-36 (2015).
  22. Guerrero Munoz, F., Fearon, Z. Sex related differences in acetaminophen toxicity in the mouse. Journal of Toxicology. Clinical Toxicology. 22 (2), 149-156 (1984).
  23. Larsen, A. K., et al. Autofluorescence in freshly isolated adult human liver sinusoidal cells. European Journal of Histochemistry. 65 (4), 3337(2021).
  24. Ritsma, L., et al. Intravital microscopy through an abdominal imaging window reveals a pre-micrometastasis stage during liver metastasis. Science Translational Medicine. 4 (158), (2012).
  25. Jost, A. P., Waters, J. C. Designing a rigorous microscopy experiment: Validating methods and avoiding bias. Journal of Cell Biology. 218 (5), 1452-1466 (2019).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Interakcje p ytek krwi z leukocytamisinusoidy w troboweostre uszkodzenie w trobyobrazowanie ywych zwierz tzapalenie mikrokr eniamodele zakrzepicyobrazowanie in vivo
Film wkrótce dostępny

Powiązane artykuły