Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wykrywanie produktów pośrednich rekombinacji homologicznej poprzez ligację zbliżeniową i ilościową reakcję PCR u Saccharomyces cerevisiae

2.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64240

⸱

11 września 2022

 ,  ,  , 
1Department of Microbiology & Molecular Genetics, University of California, Davis, 2Laboratory of Biology & Modeling of the Cell, École Normale Supérieure de Lyon, 3Department of Molecular & Cellular Biology, University of California, Davis

W tym artykule

Podsumowanie

Testy wychwytywania pętli D (DLC) i przedłużania pętli D (DLE) wykorzystują zasadę ligacji zbliżeniowej wraz z ilościowym PCR do ilościowego określenia powstawania pętli D, wydłużania pętli D i tworzenia produktu w miejscu indukowalnego dwuniciowego pęknięcia u Saccharomyces cerevisiae.

Streszczenie

Uszkodzenia DNA, w tym pęknięcia dwuniciowe DNA i międzyniciowe wiązania krzyżowe, powstałe podczas faz S i G2 cyklu komórkowego mogą być naprawione przez rekombinację homologiczną (HR). Ponadto HR stanowi ważny mechanizm ratowania widełek replikacyjnych po zatrzymaniu lub zawaleniu. Regulacja wielu odwracalnych i nieodwracalnych etapów tej złożonej ścieżki sprzyja jej wierności. Fizyczna analiza produktów pośrednich rekombinacji powstających podczas HR umożliwia scharakteryzowanie tych kontroli przez różne czynniki nukleoproteinowe i ich interaktory. Chociaż istnieją dobrze ugruntowane metody oznaczania określonych zdarzeń i produktów pośrednich w szlaku rekombinacji, wykrywanie tworzenia i wydłużania pętli D, dwóch krytycznych etapów w tej ścieżce, do niedawna okazywało się wyzwaniem. Opisano tu skuteczne metody wykrywania kluczowych zdarzeń w szlaku HR, a mianowicie tworzenia dwuniciowych pęknięć DNA, tworzenia pętli D, wydłużania pętli D oraz tworzenia produktów poprzez replikację indukowaną przerwaniem (BIR) u Saccharomyces cerevisiae. Testy te wykrywają ich odpowiednie produkty pośrednie i produkty rekombinacji z wysoką czułością i są niezależne od żywotności komórek. Wykrywanie pętli D, przedłużenia pętli D i produktu BIR opiera się na ligacji zbliżeniowej. Łącznie testy te pozwalają na badanie kinetyki HR na poziomie populacji w celu precyzyjnego zajęcia się funkcjami białek i regulatorów HR na istotnych etapach szlaku.

Wprowadzenie

Rekombinacja homologiczna (HR) to wysoce wierny mechanizm naprawy dwuniciowych pęknięć DNA (DSB), międzyniciowych wiązań krzyżowych i luk w ssDNA, a także ścieżka tolerancji uszkodzeń DNA. HR różni się od podatnych na błędy ścieżek naprawy/tolerancji uszkodzeń DNA, takich jak niehomologiczne łączenie końców (NHEJ) i synteza translezji, tym, że wykorzystuje nienaruszone, homologiczne dupleksowe DNA jako dawcę do szablonowania zdarzenia naprawy. Co więcej, wiele kluczowych produktów pośrednich w ścieżce HR jest odwracalnych, co pozwala na znakomitą regulację poszczególnych etapów ścieżki. Podczas faz S, G2 i M cyklu komórkowego HR konkuruje z NHEJ o naprawę dwustronnych DSBs1. Ponadto HR jest niezbędny do replikacji DNA w celu naprawy uszkodzeń DNA związanych z replikacją, w tym luk w ssDNA i jednostronnych DSB, oraz jako mechanizm obejścia uszkodzeń DNA2.

Krytycznym produktem pośrednim w ścieżce HR jest pętla przemieszczenia, czyli pętla D (Rysunek 1). Po resekcji końcowej, centralna rekombinaza w reakcji, Rad51, ładuje się na nowo wycięte ssDNA uszkodzonej cząsteczki, tworząc spiralne włókno2. Następnie Rad51 przeprowadza poszukiwanie homologii w celu zidentyfikowania odpowiedniego homologicznego dawcy, zazwyczaj chromatydy siostrzanej w komórkach somatycznych. Pętla D powstaje, gdy włókno Rad51-ssDNA atakuje homologiczny dupleks DNA, co prowadzi do parowania zasad Watsona-Cricka zerwanej nici z komplementarną nicią dawcy, wypierając przeciwną nić donora. Wydłużenie końca 3' pękniętej nici przez polimerazę DNA zastępuje zasady, które zostały utracone podczas zdarzenia uszkodzenia DNA i sprzyja rozdzielczości przedłużonej pętli D pośredniej do produktu dsDNA poprzez wyżarzanie nici zależnej od syntezy (SDSA), podwójne złącze Hollidaya (dHJ) lub podszlaki HR replikacji indukowanej przerwaniem (BIR).

Testy, które fizycznie monitorują produkty pośrednie w ścieżce HR, pozwalają na analizę wymagań genetycznych dla każdego kroku (np. analizę szlaku). Powstawanie DSB, resekcja końcowa, dHJs, pęcherzyki replikacji BIR i produkty HR są łatwo obserwowane przez Southern blotting3,4,5,6,7. Jednak Southern blotting nie informuje o powstających i rozszerzonych pętlach D, a zatem wymagana jest alternatywna metoda wiarygodnego pomiaru tych wspólnych cząsteczek4,8,9. Jedną z szeroko stosowanych strategii analizy powstającego powstawania pętli D jest immunoprecypitacja chromatyny (ChIP) Rad51 w połączeniu z ilościowym PCR (qPCR)10,11. Jednak związek Rad51 z dsDNA, mierzony za pomocą ChIP-qPCR, jest niezależny od homologii sekwencji i czynnika akcesoriów Rad51 Rad5410,11. W przeciwieństwie do tego, znaczący sygnał wykorzystujący przedstawioną tutaj metodę analizy pętli D, zwaną testem przechwytywania pętli D (DLC), zależy od tworzenia DSB, homologii sekwencji, Rad51 i białek pomocniczych Rad51 Rad52 i Rad548. Odkrycie, że tworzenie pętli D promowane przez Saccharomyces cerevisiae Rad51 zależy od Rad54 in vivo, jest zgodne z licznymi eksperymentami rekonstytucji in vitro wskazującymi, że Rad54 jest wymagany do poszukiwania homologii i tworzenia pętli D przez pączkujące drożdże Rad518,12,13,14,15.

Obecne podejścia do pomiaru wydłużenia pętli D, głównie za pomocą półilościowego PCR, są podobnie problematyczne. Typowy test oparty na PCR w celu wykrycia wydłużenia pętli D amplifikuje unikalną sekwencję, wynikającą z rekombinacji między miejscem pęknięcia a donorem ektopowym, a następnie syntezy DNA związanej z rekombinacją, poprzez starter przed regionem homologii na zerwanej nici i kolejny starter poniżej regionu homologii na nici donorowej. Stosując tę metodę, detekcja syntezy DNA związanej z rekombinacją wymaga nieistotnego czynnika procesywności Pol δ Pol3216. Odkrycie to jest sprzeczne z obserwacją, że delecja POL32 ma tylko łagodny wpływ na konwersję genów in vivo17. Co więcej, te testy oparte na PCR nie są w stanie tymczasowo rozwiązać wydłużenia pętli D i tworzenia produktu BIR, co sugeruje, że sygnał pochodzi z produktów dsDNA, a nie z produktów pośrednich ssDNA17,18,19. Test rozszerzenia pętli D (DLE) został niedawno opracowany w celu rozwiązania tych rozbieżności. Test DLE określa ilościowo syntezę DNA związaną z rekombinacją w miejscu ~ 400 par zasad (bp) poniżej początkowego 3' atakującego końca < klasy sup = "xref">9. Dzięki tej metodzie wydłużenie pętli D jest niezależne od Pol32 i jest wykrywalne w ciągu 4 godzin po indukcji DSB, podczas gdy produkty BIR są po raz pierwszy obserwowane po 6 godzinach. Rzeczywiście, niedawna publikacja z laboratoriów Haber i Malkova zauważyła, że użycie tej metody przygotowania genomowego DNA pojedynczo skutkuje zachowaniem ssDNA9,20.

Tutaj szczegółowo opisane są testy DLC i DLE. Testy te opierają się na podwiązaniu zbliżeniowym w celu wykrycia powstających i wydłużonych pętli D u S. cerevisiae (Rysunek 2)8,9. Produkty BIR można określić ilościowo przy użyciu tego samego systemu oznaczania. W przypadku obu testów tworzenie DSB w miejscu cięcia endonukleazy HO znajdującym się w locus URA3 na chromosomie (Chr.) V jest indukowane przez ekspresję endonukleazy HO pod kontrolą promotora indukowanego galaktozą. Inwazja nici DNA za pośrednictwem Rad51 prowadzi do powstającego powstania pętli D w miejscu dawcy ektopowego znajdującego się w locus LYS2 na Chr. II. Ponieważ prawa strona DSB nie jest homologiczna względem dawcy, naprawa poprzez SDSA i tworzenie dHJ nie jest możliwa. Początkowa naprawa DSB przez BIR jest możliwa, ale tworzenie żywotnych produktów jest hamowane przez obecność centromeru21. Ta celowa konstrukcja zapobiega produktywnej naprawie DSB, unikając w ten sposób wznowienia wzrostu przez komórki z naprawionymi DBS, które w przeciwnym razie mogłyby wyprzedzić hodowlę podczas analizy przebiegu czasu.

W teście DLC, sieciowanie psoralenu dwóch nici heterodupleksowego DNA w pętli D zachowuje pośrednią rekombinację. Po odtworzeniu enzymu restrykcyjnego w miejscu przerwanej (wyciętej) nici i trawieniu, sieciowanie pozwala na ligację unikalnych sekwencji przed homologicznym uszkodzonym i donorowym DNA. Za pomocą qPCR określa się ilościowo poziom chimerycznej cząsteczki DNA obecnej w każdej próbce. W teście DLE sieciowanie nie jest wymagane, a przywrócenie i trawienie enzymu restrykcyjnego, a następnie ligacja wewnątrzcząsteczkowa zamiast tego łączą koniec 5' uszkodzonej cząsteczki z nowo wydłużonym końcem 3'. Ponownie, qPCR służy do ilościowego określenia względnych ilości tego chimerycznego produktu w każdej próbce. W przypadku braku odbudowy miejsca enzymu restrykcyjnego, test DLE informuje o względnych poziomach produktu BIR (dsDNA), który powstaje po rozszerzeniu pętli D.

Pokazane są reprezentatywne wyniki dla każdego testu z użyciem dzikiego szczepu, a czytelnicy są odsyłani do Piazza et al.8 i Piazza et al.9 w celu wykorzystania tych testów do analizy mutantów rekombinacyjnych8,9. Celem tego wkładu jest umożliwienie innym laboratoriom przyjęcia testów DLC i DLE, a wsparcie dla nich jest dostępne na żądanie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Wstępny wzrost, indukcja DSB i pobieranie próbek

UWAGA: Suplementacja wszystkich pożywek 0,01% adeniny jest zalecana dla szczepów Ade.

  1. Na drożdżach peptonowych dekstrozoadeninowych (YPDA) rozprowadzić odpowiednie szczepy haploidalne (patrz Tabela 1) (1% ekstraktu drożdżowego, 2% peptonu, 2% glukozy, 2% agaru, 0,001% adeniny) i rosnąć przez 2 dni w temperaturze 30 °C.
  2. Użyj pojedynczej kolonii do zaszczepienia 5 ml YPDA w szklanej probówce o pojemności 15 ml. Hodować kultury do nasycenia w temperaturze 30 °C z wytrząsaniem lub obracaniem w celu napowietrzenia.
  3. Test DLC: Przygotować 5x roztwór podstawowy psoralenu (0,5 mg/ml trioksalenu w 200-procentowym etanolu) w dygestorium, rozpuszczając psoralen w stożkowej probówce o pojemności 50 ml owiniętej folią aluminiową przez noc w temperaturze pokojowej z ciągłym wstrząsaniem lub odwróceniem. Uszczelnij górną część przezroczystej folii, aby zapobiec parowaniu. Nie należy przygotowywać więcej niż 7 ml 5 x roztworu podstawowego psoralenu na 50 ml stożkowej probówki, aby zapewnić prawidłowe rozpuszczenie psoralenu.
  4. Następnego dnia użyj 5 ml kultury YPDA wyhodowanej przez noc, aby zaszczepić 50-100 ml mleczanu YEP (1% ekstraktu drożdżowego, 2% peptonu, 2% mleczanu w/w, 0,001% adeniny) w kolbie o odpowiedniej wielkości (pączkujące drożdże rosną optymalnie w kolbie, która ma co najmniej 5 razy większą objętość kultury) do OD600 ~0,03.
  5. Hodować kulturę przez ~16 h w temperaturze 30 °C z wytrząsaniem przy 220 obr./min. Po ~16 h zmierz OD600 kultury i powinno wynosić ~0,5-0,8. Nie używaj kultur zbyt rzadkich lub zarośniętych.
  6. Dla każdego punktu czasowego zbierz odpowiednią objętość komórek w stożkowej probówce i umieść na lodzie. Zazwyczaj jest to 1 x 108 komórek (około 7,5 ml kultury w OD600 1,0 dla haploidalnego szczepu typu dzikiego) dla testu DLC i 5 x 107 komórek (około 2,5 ml kultury w OD600 1,0) dla testu DLE.
  7. Aby zapewnić dokładność wartości OD600, należy przygotować rozcieńczenia 1:5 dla kultur o OD600≥0,2, aby utrzymać odczyt OD na poziomie 0,2 lub niższym. Dla szczepów typu dzikiego, optymalne punkty czasowe dla analizy DLC wynoszą od 2 h do 6 h, a optymalne punkty czasowe dla analizy DLE to od 4 h do 8 h (patrz Rysunek 3 i Rysunek 4).
  8. Test DLC
    1. Przed każdym punktem czasowym przygotuj wystarczającą ilość 1x roztworu psoralenu (0,1 mg / ml trioxsalen, 50 mM Tris-HCl pH 8,0, 50 mM EDTA pH 8,0, 20% etanolu) w dygestorii dla wszystkich próbek w stożkowej probówce o pojemności 50 ml owiniętej folią. Wyjdź w RT.
    2. Odwirować próbki przy masie 2 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Zawiesić osad w 2,5 ml 1 x roztworu psoralenu w dygestorium i przenieść na szalkę Petriego o wymiarach 60 mm x 15 mm. Alternatywnie, ponownie zawiesić osad w 2,5 ml roztworu TE1 (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 50 mM EDTA pH 8,0) w celu kontroli bez sieciowania.
    3. Usieciuj próbki. Aby urządzenie sieciujące UV pasowało do żarówek długofalowych (365 nm), należy umieścić szalki Petriego 1-2 cm poniżej źródła światła UV ze zdjętą pokrywką na plastikowej lub pleksiszklanej płytce, która została wstępnie schłodzona w temperaturze -20°C. W przypadku kasetonu ze światłem UV umieść szalki Petriego bezpośrednio na źródle światła UV. Próbki należy naświetlić przez 10 minut, delikatnie wstrząsając.
      UWAGA: Zaleca się ustawienie źródła światła UV na wytrząsarce orbitalnej ustawionej na ~50 obr./min.
    4. W dygestorium przenieść próbkę do nowej probówki o pojemności 15 ml. Opłucz szalkę Petriego 2,5 ml roztworu TE1 i dodaj go do probówki. Odwirować próbki o masie 2 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C, odpowiednio zutylizować supernatant i przechowywać osad w temperaturze -20 °C. Próbki można przechowywać do 1 tygodnia przed przejściem do następnego etapu.
  9. Test DLE
    1. Odwirować próbki o masie 2 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Umyć osad komórkowy w 2,5 ml zimnego roztworu TE1 przed powtórzeniem wirowania i przechowywaniem granulek w temperaturze -20 °C. Próbki można przechowywać do 1 tygodnia przed przejściem do następnego etapu.
  10. W przypadku pobierania próbek po upływie 0 godzin należy pobrać próbki przed dodaniem 20% galaktozy. Dla kolejnych punktów czasowych indukuj tworzenie DSB, dodając 20% galaktozy do kultur do końcowego stężenia 2%. Zebrać pozostałe próbki zgodnie z powyższym opisem, osadzać i zamrażać w stosunku do czasu po indukcji DSB (tj. 4-godzinną próbkę pobiera się 4 godziny po dodaniu 20% galaktozy).

2. Sferoplastyka, liza i odbudowa miejsca restrykcji komórek

  1. Rozmrozić próbki na lodzie. Podgrzej suchą kąpiel do temperatury 30 °C.
  2. Zawiesić próbki w 1 ml buforu sferoplastycznego (0,4 M sorbitolu, 0,4 M KCl, 40 mM buforu fosforanu sodu o pH 7,2, 0,5 mM MgCl2) i przenieść do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.
  3. Dodać 3,5 μl roztworu zymoliazy (2% glukozy, 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 5 mg/ml zymoliazy 100T; 17,5 μg/ml końcowe stężenie zymoliazy). Delikatnie wymieszaj, stukając lub odwracając. Inkubować w temperaturze 30 °C przez 15 minut, a następnie umieścić na lodzie. Podczas 15 minutowej inkubacji należy uzyskać ciekły azot lub suchy lód.
  4. Wirować przez 3 minuty przy 2 500 x g w temperaturze 4 °C i umieścić próbki na lodzie. Przemyć próbki 3x w 1 ml buforu sferoplastycznego. Odwirowywać próbki przez 3 minuty przy 2 500 x g w temperaturze 4 °C.
  5. Zawiesić próbki w 1 ml zimnego buforu enzymatycznego 1x restrykcyjnego (50 mM octanu potasu, 20 mM octanu tris, 10 mM octanu magnezu, 100 μg/ml BSA pH ~8,0 w temperaturze pokojowej) i wirować przez 3 minuty przy 16 000 x g w temperaturze 4 °C. Umieścić próbki na lodzie. Powtórz pranie 1x.
  6. Zawiesić próbki w 1 ml zimnego buforu enzymatycznego 1x. Podziel próbkę (po 0,5 ml każda) na dwie probówki do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml. Odwirować próbki przez 3 minuty przy 16 000 x g w temperaturze 4 °C.
  7. Zawiesić jedną probówkę z każdej próbki w 180 μl 1,4-krotnego buforu enzymu restrykcyjnego z hybrydyzującymi oligonukleotydami (patrz Tabela 2) i jedną probówkę w 180 μl 1,4-krotnego buforu enzymu restrykcyjnego bez hybrydyzujących oligonukleotydów. Każdy oligo hybrydyzujący jest ponownie zawieszany w 1x TE (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA pH 8,0) i stosowany w końcowym stężeniu 7 nM. 1x TE zastępuje hybrydyzujące oligonukleotydy w buforze enzymu restrykcyjnego 1,4x bez hybrydyzacji oligonukleotydów.
    UWAGA: Oligonukleotydy hybrydyzujące muszą być przechowywane w temperaturze -20 °C w małych porcjach w rozcieńczeniu roboczym. Stężenie hybrydyzujących oligonukleotydów może wymagać optymalizacji; zobacz Dyskusja.
  8. Próbki należy zamrozić błyskawicznie w ciekłym azocie lub suchym lodzie/etanolu i przechowywać w temperaturze -80 °C. Na tym etapie próbki można przechowywać przez kilka miesięcy.

3. Trawienie enzymów restrykcyjnych i ligacja wewnątrzcząsteczkowa

  1. Rozmrozić próbki na lodzie. Podgrzej jedną suchą kąpiel do 65 °C, a drugą do 37 °C.
  2. Odpipetować 36 μl próbki do nowej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml na lodzie. Pozostałą próbkę należy niezwłocznie przywrócić do temperatury -80 °C w celu przechowywania.
  3. Dodaj 4 μl 1% SDS (0,1% stężenia końcowego) i wymieszaj, delikatnie stukając w bok tubki. Inkubować w temperaturze 65 °C przez 15 minut, delikatnie stukając co 5 minut. Umieścić próbki na lodzie bezpośrednio po inkubacji.
    UWAGA: To leczenie SDS sprzyja denaturacji białek związanych z DNA, solucjalizacji otoczki jądrowej i dostępności chromatyny przed etapami trawienia enzymu restrykcyjnego i ligacji wewnątrzcząsteczkowej.
  4. Dodać 4,5 μl 10% Triton X-100 (1% stężenie końcowe) i wymieszać pipetując. Dodać 20-50 j. enzymu restrykcyjnego (EcoRI-HF lub HindIII-HF) do każdej próbki i inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę z delikatnym mieszaniem co 20-30 minut. W tym czasie podgrzej suchą kąpiel do 55 °C, a łaźnię wodną nastaw na 16 °C.
  5. Dodać 8,6 μl 10% SDS (1,5% stężenia końcowego) do każdej próbki i wymieszać przez pipetowanie i stukanie. Inkubować w temperaturze 55 °C przez 10 minut. Dodać 80 μl 10% Triton X-100 (6% stężenia końcowego) do każdej próbki i wymieszać przez pipetowanie.
  6. Dodać 660 μl 1x buforu ligacyjnego bez ATP (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 2,5 μg/ml BSA) + 1 mM ATP pH 8,0 + ligaza DNA T4 (8 U/próbkę) do każdej próbki i wymieszać przez delikatne odwrócenie. Inkubować w temperaturze 16 °C przez 1,5 godziny z inwersją co 30 minut. Umieścić próbki na lodzie natychmiast po inkubacji.

4. Oczyszczanie DNA

  1. Podgrzej jedną suchą kąpiel do temperatury 65 °C, a drugą do 37 °C. Dodać 1 μl 10 mg/ml proteinazy K (przygotowanej w 1x TE pH 8,0) do każdej próbki (12,5 μg/ml stężenie końcowe). Inkubować w temperaturze 65 °C przez 30 minut i umieścić próbki na lodzie natychmiast po inkubacji, aż ostygną.
  2. Przenieść próbki do probówek o pojemności 2 ml. Pracując pod wyciągiem, dodać równą objętość (~800 μl) fenolu/chloroformu/alkoholu izoamylowego (P/C/IA; pH 8,0) do każdej próbki. Wirować próbki przez ~30 s i odwirowywać próbki przez 5-10 minut przy 16 000 x g w mikrowirówce.
  3. Ostrożnie usunąć 600 μl górnej fazy każdej próbki do nowej probówki o pojemności 1,5 ml. Prawidłowo zutylizować dolną fazę i probówki o pojemności 2 ml.
  4. Wytrącić DNA, dodając 1/10 objętości 3 M octanu sodu o pH 5,2 (~ 60 μL) do każdej próbki, a następnie 1 objętość izopropanolu (~ 660 μL). Odwrócić próbki 5x-10x i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
  5. Umieścić próbki na lodzie na 2 minuty, a następnie odwirować próbki o stężeniu 16 500 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C w mikrowirówce. Umieścić próbki z powrotem w lodzie, wylać supernatant i opróżnić probówkę na ręczniku papierowym.
  6. Umyj osad DNA 200 μl 70% etanolu. Wirować przy 16 500 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C, umieścić próbki z powrotem na lodzie, wylać supernatant i usunąć pozostały alkohol za pomocą pipety. Suszyć próbki z otwartymi nakrętkami probówek w temperaturze 37 °C przez 15-20 minut.
  7. Ponownie zawiesić granulki DNA w 50 μL 1x TE przez wirowanie. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut, wirować, a następnie inkubować w temperaturze 37 °C w suchej łaźni przez 30 minut. Ponownie zwiruj próbki, a następnie umieść je na lodzie. Próbki mogą być przechowywane na tym etapie w temperaturze -20 °C przez kilka miesięcy, ale zaleca się natychmiastowe przystąpienie do etapów decrosslinkingu (tylko DLC) i qPCR.

5. Odwrócenie usieciowania Psoralen (tylko dla testu DLC)

  1. Odpipetować 9 μl oczyszczonego DNA do probówki PCR na lodzie. Dodać 1 μl 1 M KOH (0,1 M stężenie końcowe). Próbki inkubować w temperaturze 90 °C przez 30 minut w termocyklerze.
  2. Dodać 19,73 μl roztworu octanu sodu (0,1 M octanu sodu, 9,6 mM Tris-HCl pH 8,0, 1,0 mM EDTA pH 8,0). Próbki mogą być przechowywane na tym etapie w temperaturze -20 °C przez kilka miesięcy, ale zaleca się natychmiastowe przejście do etapu qPCR.

6. Ilościowy PCR, kontrole i analiza

  1. Używając 2 μl oczyszczonego DNA, z sieciowaniem lub bez, należy przeprowadzić reakcję qPCR o objętości 20 μl zgodnie z instrukcjami producenta. Ustaw każdą reakcję w dwóch egzemplarzach. Zarówno w przypadku testów DLC, jak i DLE występuje pięć reakcji kontrolnych i jedna reakcja kwantyfikacji DLC/DLE, czyli łącznie sześć reakcji na próbkę, przebiega w dwóch powtórzeniach. Tabela uzupełniająca S1 i tabela uzupełniająca S2 zawierają szablon do ustawiania tych reakcji i analizy, a sekwencje starterów qPCR są wymienione w tabeli 3.
  2. Warunki cykliczne qPCR muszą być zoptymalizowane dla każdego zestawu qPCR.
    1. Należy zastosować następujące warunki DLC qPCR, w zależności od użytych zestawów qPCR: początkowa denaturacja (95 °C przez 3 min); 50 rund amplifikacji (95 °C przez 15 s, 61 °C przez 25 s, 72 °C przez 15 s z pojedynczą akwizycją); analiza krzywej topnienia (95 °C przez 5 s, 65 °C przez 1 min), 97 °C z ciągłą akwizycją); i chłodzenie (37 °C przez 30 s).
    2. Do testu DLE należy zastosować następujące warunki qPCR: początkowa denaturacja (95 °C przez 5 min); 50 rund amplifikacji (95 °C przez 15 s, 60 °C przez 30 s, 72 °C przez 15 s z pojedynczą akwizycją); analiza krzywej topnienia (95 °C przez 5 s, 65 °C przez 1 min), 97 °C z ciągłą akwizycją); i chłodzenie (37 °C przez 30 s). Należy pamiętać, że może być wymagana optymalizacja dla różnych maszyn/zestawów qPCR.
  3. Test DLC
    1. Kontrole: Patrz lista starterów qPCR w Tabeli 3. Mapa miejsc wiązania startera jest pokazana na rysunku S1. Aby uzyskać dodatkowe pliki sekwencji dla odpowiednich cech genomowych i amplikonów, sprawdź pliki edytora plazmidów A (ApE); Dodatkowe pliki sekwencji 1-5.
      1. Genomowe DNA w ARG4: Użyj olWDH1760/olWDH1761 do amplifikacji dsDNA znajdującego się w ARG4. Użyj tej reakcji jako kontroli ładowania i znormalizuj wszystkie inne reakcje z wyjątkiem reakcji sygnału DLC na tę kontrolkę.
      2. Wydajność ligacji wewnątrzcząsteczkowej w DAP2: Użyj fragmentu 1,904 pz utworzonego przez trawienie EcoRI do ligacji wewnątrzcząsteczkowej równolegle z ligacją DLC. Wzmocnienie na tym złączu ligacyjnym informuje o wydajności ligacji wewnątrzcząsteczkowej i służy jako kontrola, do której sygnał DLC jest znormalizowany.
      3. Indukcja DSB: Użyj olWDH1766/olWDH1767, aby wzmocnić region, który obejmuje indukowany DSB.
      4. Sieciowanie i resekcja psoralenu: Użyj olWDH2019/olWDH2020, aby wzmocnić unikalny region PhiX poniżej miejsca rozpoznawania EcoRI. Bez odwrócenia usieciowania użyj stosunku ssDNA (bez sieciowania) do ARG4 (usieciowanego dsDNA), aby określić skuteczność sieciowania. W przypadku odwrócenia usieciowania resekcja doprowadzi do postępującego spadku od 1 do 0,5 sygnału w stosunku do ARG4.
      5. Przywracaniei wycinanie miejsca rozpoznawania EcoR I: Użyj olWDH1768/olWDH1764, aby wzmocnić region, który obejmuje przywrócone miejsce rozpoznawania EcoRI przed DSB na wyciętym pasmie. olWDH1769/olWDH1763 amplifikują region, który obejmuje miejsce enzymu restrykcyjnego EcoRI w DAP2. Wykonaj rozszczepienie EcoRI w tym miejscu, aby użyć go jako kontroli ligacji wewnątrzcząsteczkowej.
    2. Sygnał DLC: Użyj olWDH1764/olWDH1765 do amplifikacji chimerycznej cząsteczki DNA utworzonej przez wewnątrzcząsteczkową ligację wyciętej (inwazyjnej) nici i dawcy.
    3. Analiza: Oblicz średnią i odchylenie standardowe wartości Cp dla każdej z powtarzających się reakcji. Użyj wartości QPCR Cp genomowego DNA ARG4 jako odniesienia, aby znormalizować wszystkie inne kontrolne qPCR. Znormalizuj sygnał DLC do wewnątrzcząsteczkowej kontroli ligacji w DAP2. Zobacz Rysunek 3 dla typowych wartości sygnału DLC po 2 godzinach.
  4. Test DLE
    1. Kontrole: Patrz lista starterów qPCR w Tabeli 3. Mapa miejsc wiązania startera jest pokazana na rysunku S1. Aby uzyskać dodatkowe pliki sekwencji dla odpowiednich cech genomowych i amplikonów, sprawdź pliki edytora plazmidów A (ApE) (Uzupełniające pliki sekwencji 1-5).
      1. Genomowe DNA w ARG4: Patrz sekcja 6.3.1.1.
      2. Skuteczność ligacji wewnątrzcząsteczkowej przy YLR050C: Użyj trawienia HindIII, aby utworzyć fragment o długości 765 pz, który zostanie poddany ligacji wewnątrzcząsteczkowej równolegle z ligacją DLE. Wzmocnienie na tym złączu ligacyjnym informuje o wydajności ligacji wewnątrzcząsteczkowej i służy jako kontrola, do której sygnał DLE jest znormalizowany.
      3. Indukcja DSB: Patrz sekcja 6.3.1.3.
      4. Przywracaniei cięcie miejsca rozpoznawania Hind III: Użyj olWDH2010/olWDH2012 i olWDH2009/2011, aby amplifikować region, który obejmuje miejsca enzymu restrykcyjnego HindIII na uszkodzonej nici, gdzie została odpowiednio wycięta i rozszerzona.
    2. Sygnał DLE: Użyj olWDH2009 / olWDH2010 do amplifikacji chimerycznej cząsteczki DNA utworzonej przez wewnątrzcząsteczkową ligację wyciętego końca inwazyjnej nici przed DSB do nowo przedłużonego końca za DSB.
    3. Analiza: Oblicz średnią i odchylenie standardowe wartości Cp dla każdej z powtarzających się reakcji. Użyj wartości QPCR Cp genomowego DNA ARG4 jako odniesienia, aby znormalizować wszystkie inne kontrolne qPCR. Znormalizuj sygnał DLE do wewnątrzcząsteczkowej kontroli ligacji w YLR050C. Typowe wartości sygnału DLE po 6 godzinach są podane w Rysunek 4 i poprzednie publikacje9.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Analiza DLC
Analiza DLC wykrywa zarówno nowo powstałe, jak i wydłużone pętle D (D-loops) tworzone przez inwazję specyficznego miejsca pęknięcia DSB w pojedynczego donora (Rysunek 2). Sieciowanie psoralenem fizycznie łączy przerwaną nić z donorem via heterodupleks DNA w obrębie pętli D. Przywrócenie miejsca cięcia enzymu restrykcyjnego za pomocą długiego, hybrydyzującego oligonukleotydu na resekowanej nici pęknięcia umożliwia cięcie enzymem restrykcyjnym, a nastę...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Przedstawione testy pozwalają na wykrycie powstających i rozszerzonych pętli D (test DLC), wydłużenia pętli D (test DLE) oraz tworzenia produktu BIR (test DLE bez hybrydyzujących oligonukleotydów) za pomocą ligacji zbliżeniowej i qPCR. ChIP-qPCR Rad51 do miejsc odległych od DSB był wcześniej używany jako proxy do poszukiwania homologii za pośrednictwem Rad51 i tworzenia pętli D. Jednak ten sygnał ChIP-qPCR jest niezależny od homologii sekwencji między miejscem przerwania a potencjalnym donorem, a także od czynnika Rad54 ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Praca w laboratorium Heyer jest wspierana przez granty GM58015 i GM137751 dla W.-D.H. Badania w laboratorium na Piazza są wspierane przez Europejską Radę ds. Badań Naukowych (pętla 3D ERC-STG, wielka umowa 851006). D.R. jest wspierany przez T32CA108459 i Fundację A.P. Gianniniego. Dziękujemy Shih-Hsun Hung (Heyer Lab) za udostępnienie wyników testów DLC/DLE oraz za dodatkową walidację zmian w testach, które są wyszczególnione w tym protokole.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1. Wstępny wzrost, indukcja DSB i pobieranie próbek
Sprzęt
15 i 50 ml probówki
15 ml szklane probówki
hodowlane 250 ml, 500 ml lub 1 l kolby
60 mm x 15 mm optycznie przezroczyste szalki Petriego z płaskim dnemSugerowane: Corning, numer katalogowy 430166; lub Genesee Scientific, numer katalogowy 32-150G
Wirówka stołowa ze stożkowymi adapterami
Wytrząsarka orbitalna stołowa lub rotator/rewolwer
Rotator
sieciujący UV lub kaseton świetlny z żarówkami UV 365 nm umieszczonymi na szczycie wytrząsarkiorbitalnejSugerowane: Spectrolinker XL-1500 UV Crosslinker (Spectronics Corporation) lub Vilbert Lourmat BLX-365 BIO-LINK, Numer katalogowy 611110831
Materiały
60% w/w syrop DL-mleczanowy soduSigma-AldrichL1375Do przygotowania pożywki
AgarFisherBP1423500Do przygotowania podłoża
Bacto peptonBD Difco211840Do przygotowania pożywki
Ekstrakt drożdżowy BactoBD Difco212750Do przygotowania pożywki
D-(+)-glukozaBD Difco0155-17-4Do przygotowania pożywki
TrioxsalenSigma-AldrichT6137Do sieciowania psoralenu
2. Sferoplastyka, liza i restrykcyjna odbudowa miejsca enzymu
Materiały
1,5 ml probówki
Sucha kąpiel
Ciekły azot lub suchy lód/etanol
Mikrowirówka lub mikrowirówka z chłodzeniem
Materials
10X bufor enzymu restrykcyjnego (CutSmart) (500 mM octan potasu, 200 mM octan tris, 100 mM octan magnezu, 1 mg / ml BSA, pH 7,8-8,0)
Zymoliaza 100TUS BiologicalZ1004Do sferoplastyki
3. Trawienie enzymów restrykcyjnych i ligacja wewnątrzcząsteczkowa
Supplies
Kąpiel
Materiały
EcoRI-HFNew England BiolabsR3101Trawienie enzymu restrykcyjnego do testu DLC
HindIII-HFNew England BiolabsR3104Trawienie enzymu restrykcyjnego do testu DLE
Ligaza DNAT4 New England BiolabsM0202Ligacja wewnątrzcząsteczkowa
4. Oczyszczanie DNA
Supplies
1,5 i 2 ml probówek
Materials
Phenol/chloroform/isoamyl alcohol (P/C/IA) o godzinie 25:24:1Oczyszczanie
DNA Sigma-Aldrich P20695. Odwrócenie usieciowania psoralenu
Supplies
Thermocycler/PCR
6. qPCR
Supplies
Lightcycler 480Roche5015278001Maszyna qPCR używana przez autorów
5815916001qPCR Lightcycler 96Rocheużywana przez autorów
Materials
LightCycler 480 96-Well Plate, biała472969200196-dołkowe płytki do qPCR
SsoAdvanced Universal SYBR Green Super MixBioRad1725271zestaw qPCR używany przez autorów
SYBR Green I Master MixZestawdo qPCR firmy Roche 4707516001 używany przez autorów
stożkoweprobówek 15 i 50 mlrurowydo mikrowirówek wodna do mikrowirówekMaszyna Roche

Bibliografia

  1. Symington, L. S., Gautier, J. Double-strand break end resection and repair pathway choice. Annual Review of Genetics. 45 (1), 247-271 (2011).
  2. Heyer, W. -D. Regulation of recombination and genomic maintenance. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (8), 016501(2015).
  3. Mimitou, E. P., Symington, L. S. Sae2, Exo1 and Sgs1 collaborate in DNA double-strand break processing. Nature. 455 (7214), 770-774 (2008).
  4. Bzymek, M., Thayer, N. H., Oh, S. D., Kleckner, N., Hunter, N. Double Holliday junctions are intermediates of DNA break repair. Nature. 464 (7290), 937-941 (2010).
  5. Chen, H., Lisby, M., Symington, L. S. RPA coordinates DNA end resection and prevents formation of DNA hairpins. Molecular Cell. 50 (4), 589-600 (2013).
  6. Mazón, G., Symington, L. S. Mph1 and Mus81-Mms4 prevent aberrant processing of mitotic recombination intermediates. Molecular Cell. 52 (1), 63-74 (2013).
  7. Saini, N., et al. Migrating bubble during break-induced replication drives conservative DNA synthesis. Nature. 502 (7471), 389-392 (2013).
  8. Piazza, A., et al. Dynamic processing of displacement loops during recombinational DNA repair. Molecular Cell. 73 (6), 1255-1266 (2019).
  9. Piazza, A., Koszul, R., Heyer, W. -D. A proximity ligation-based method for quantitative measurement of D-loop extension in S. cerevisiae. Methods in Enzymology. 601, 27-44 (2018).
  10. Sugawara, N., Wang, X., Haber, J. E. In vivo roles of Rad52, Rad54, and Rad55 proteins in Rad51-mediated recombination. Molecular Cell. 12 (1), 209-219 (2003).
  11. Renkawitz, J., Lademann, C. A., Kalocsay, M., Jentsch, S. Monitoring homology search during DNA double-strand break repair in vivo. Molecular Cell. 50 (2), 261-272 (2013).
  12. Petukhova, G., Stratton, S., Sung, P. Catalysis of homologous DNA pairing by yeast Rad51 and Rad54 proteins. Nature. 393 (6680), 91-94 (1998).
  13. Wright, W. D., Heyer, W. -D. Rad54 functions as a heteroduplex DNA pump modulated by its DNA substrates and Rad51 during D-loop formation. Molecular Cell. 53 (3), 420-432 (2014).
  14. Tavares, E. M., Wright, W. D., Heyer, W. -D., Cam, E. L., Dupaigne, P. In vitro role of Rad54 in Rad51-ssDNA filament-dependent homology search and synaptic complexes formation. Nature Communications. 10 (1), 4058(2019).
  15. Crickard, J. B., Moevus, C. J., Kwon, Y., Sung, P., Greene, E. C. Rad54 drives ATP hydrolysis-dependent DNA sequence alignment during homologous recombination. Cell. 181 (6), 1380-1394 (2020).
  16. Lydeard, J. R., Jain, S., Yamaguchi, M., Haber, J. E. Break-induced replication and telomerase-independent telomere maintenance require Pol32. Nature. 448 (7155), 820-823 (2007).
  17. Jain, S., et al. A recombination execution checkpoint regulates the choice of homologous recombination pathway during DNA double-strand break repair. Genes & Development. 23 (3), 291-303 (2009).
  18. Donnianni, R. A., Symington, L. S. Break-induced replication occurs by conservative DNA synthesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (33), 13475-13480 (2013).
  19. Liu, L., et al. Tracking break-induced replication shows that it stalls at roadblocks. Nature. 590 (7847), 655-659 (2021).
  20. Liu, L., Sugawara, N., Malkova, A., Haber, J. E. Determining the kinetics of break-induced replication (BIR) by the assay for monitoring BIR elongation rate (AMBER). Methods in Enzymology. 661, 139-154 (2021).
  21. Pham, N., et al. Mechanisms restraining break-induced replication at two-ended DNA double-strand breaks. The EMBO Journal. 40 (10), 104847(2021).
  22. Cimino, G. D., Gamper, H. B., Isaacs, S. T., Hearst, J. E. Psoralens as photoactive probes of nucleic acid structure and function: Organic chemistry, photochemistry, and biochemistry. Annual Review of Biochemistry. 54 (1), 1151-1193 (1985).
  23. Yeung, A. T., Dinehart, W. J., Jones, B. K. Alkali reversal of psoralen cross-link for the targeted delivery of psoralen monoadduct lesion. Biochemistry. 27 (17), 6332-6338 (1988).
  24. Shi, Y. B., Spielmann, H. P., Hearst, J. E. Base-catalyzed reversal of a psoralen-DNA cross-link. Biochemistry. 27 (14), 5174-5178 (1988).
  25. Prakash, R., et al. Yeast Mph1 helicase dissociates Rad51-made D-loops: Implications for crossover control in mitotic recombination. Genes & Development. 23 (1), 67-79 (2009).
  26. Liu, J., et al. Srs2 promotes synthesis-dependent strand annealing by disrupting DNA polymerase δ-extending D-loops. eLife. 6, 22195(2017).
  27. Fasching, C. L., Cejka, P., Kowalczykowski, S. C., Heyer, W. -D. Top3-Rmi1 dissolve Rad51-mediated D loops by a topoisomerase-based mechanism. Molecular Cell. 57 (4), 595-606 (2015).
  28. Shah, S. S., Hartono, S. R., Chédin, F., Heyer, W. -D. Bisulfite treatment and single-molecule real-time sequencing reveal D-loop length, position, and distribution. eLife. 9, 59111(2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Tworzenie p tli Dp kni cie dwuniciowe DNAwyd u anie p tli Dreplikacja indukowana p kni ciemimmunoprecypitacja chromatynySouthern blotting
Wykrywanie produktów pośrednich rekombinacji homologicznej poprzez ligację zbliżeniową i ilościową reakcję PCR u Saccharomyces cerevisiae
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.