Artykuł metodologiczny

Obrazowanie chemiczne infekcji związanych z implantami o wysokiej rozdzielczości przestrzennej za pomocą obrazowania chemicznego luminescencji wzbudzonej promieniowaniem rentgenowskim przez tkankę

DOI:

10.3791/64252

⸱

30 września 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry, Clemson University, 2Department of Biological Sciences, Clemson University, 3Department of Bioengineering, Clemson University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy protokół do optycznego wykrywania informacji chemicznych o wysokiej rozdzielczości wokół wszczepionych urządzeń medycznych z obrazowaniem chemicznym wzbudzonym promieniowaniem rentgenowskim (XELCI). Ta nowatorska technika obrazowania została opracowana w naszym laboratorium, co umożliwia badanie biochemii zakażeń związanych z implantami.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Infekcje mikrobiologiczne związane z wszczepialnymi urządzeniami medycznymi są głównym problemem w przypadku niepowodzenia zespolenia złamań. Wczesna diagnoza takiej infekcji pozwoli na skuteczne zwalczenie antybiotykami bez dodatkowych kosztów za drugą operację. W niniejszym dokumencie opisujemy XELCI jako technikę o wysokiej rozdzielczości promieniowania rentgenowskiego, specyficzności implantu i wrażliwości chemicznej na nieinwazyjne obrazowanie stężeń chemicznych w pobliżu powierzchni wszczepionych wyrobów medycznych. Urządzenia są pokryte powierzchniami chemicznie raportującymi. Ta chemicznie reagująca powierzchnia składa się z dwóch warstw pokrytych wszczepialnym urządzeniem medycznym; warstwa wrażliwa na pH (hydrożel z dodatkiem błękitu bromotymolowego lub zieleni bromokrezolowej), która jest pokryta warstwą scyntylatora emitującego światło czerwone (Gd2O2S: Eu) w celu monitorowania. Skupiona wiązka promieniowania rentgenowskiego naświetla miejsce na implancie, a czerwone światło generowane przez scyntylator (o szczytach 620 nm i 700 nm) jest przenoszone przez warstwę detekcyjną, która zmienia stosunek widmowy w zależności od pH. Obraz jest generowany poprzez skanowanie wiązki promieniowania rentgenowskiego w poprzek implantu i pomiar stosunku widmowego światła przechodzącego przez tkankę punkt po punkcie. Wykorzystaliśmy tę technikę obrazowania do monitorowania infekcji związanych z implantami, które wcześniej znajdowały się na powierzchni kości udowej za pomocą zmodyfikowanego czujnika płytki implantowalnej. Teraz badamy zmiany pH, które zachodzą w wyniku infekcji pszczelowego pręta śródszpikowego. W badaniach przedpilotażowych na królikach stosowano dwa różne typy prętów śródszpikowych i dowiedzieliśmy się, że technika XELCI może być stosowana do monitorowania wszelkich zmian chemicznych zachodzących nie tylko na powierzchni kości, ale także wewnątrz kości. W ten sposób umożliwia to nieinwazyjne obrazowanie o wysokiej rozdzielczości przestrzennej i niskim pH tła w celu zbadania biochemii infekcji związanych z implantami.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W Stanach Zjednoczonych rocznie zakłada się około 2 milionów urządzeń do mocowania złamań, a 5%-10% z nich prowadzi do infekcji związanych z implantami1. Zakażenia te są trudniejsze do leczenia antybiotykami na późniejszych etapach ze względu na niejednorodność i oporność biofilmów na antybiotyki2,3. Jeśli zostaną wcześnie zdiagnozowane, infekcje można leczyć antybiotykami i chirurgicznym oczyszczeniem, aby zapobiec dodatkowym kosztom medycznym związanym z drugą operacją w celu wymiany sprzętu w leczonym miejscu złamania. Zwykła radiografia i inne zaawansowane techniki radiograficzne są stosowane w diagnostyce zakażeń związanych z implantami ortopedycznymi, braku zrostów i związanych z nimi powikłań. Chociaż techniki te są często stosowane do pozyskiwania informacji strukturalnych o otaczającej kości i tkance na implancie ortopedycznym, nie są one w stanie dostarczyć informacji biochemicznych w określonym środowisku. W związku z tym opracowaliśmy nowatorską technikę obrazowania chemicznego luminescencji wzbudzonej promieniowaniem rentgenowskim (XELCI) do nieinwazyjnego obrazowania informacji biochemicznych w wysokiej rozdzielczości w miejscu implantacji. Diagnostyka zakażeń związanych z implantami ortopedycznymi jest zwykle przeprowadzana za pomocą jednego lub kombinacji różnych środków. Obserwacje kliniczne (ból, obrzęk, zaczerwienienie, wydzielina z rany itp.) sugerują pierwsze oznaki infekcji. Później przeprowadzane są eksperymenty radiologiczne i laboratoryjne w celu potwierdzenia niepowodzenia progresji gojenia się kości i zidentyfikowania organizmu chorobotwórczego4,5. Techniki medycyny nuklearnej, takie jak tomografia komputerowa (CT), obrazowanie metodą rezonansu magnetycznego (MRI) oraz metody radionukleotydowe, takie jak tomografia komputerowa z emisją pojedynczych fotonów (SPECT) i pozytonowa tomografia emisyjna (PET), są stosowane w celu lepszej wizualizacji zakażonego implantu i związanej z nim infekcji6,7. Tomografia komputerowa i rezonans magnetyczny są korzystne w określaniu odpowiednio martwicy kości i nieprawidłowości tkanek miękkich, ale powodują zakłócenia w bliskiej odległości od metalowych implantów8. Różne metodologie rentgenowskie, takie jak SPECT i PET, w połączeniu z analitami znakowanymi izotopami promieniowymi jako środkami kontrastowymi do obrazowania in vivo, są szeroko stosowane do diagnozowania zapalenia kości i szpiku związanego z implantami2. Obecne aplikacje łączą zarówno dane z tomografii komputerowej, jak i dane z etykietowania z SPECT lub PET w celu wygenerowania informacji anatomicznych9. Chociaż jedna lub więcej z tych metod obrazowania jest stosowana do wspomagania diagnozowania infekcji, nie są one w stanie wcześnie wykryć zmian pH związanych z infekcją, aby rozpocząć leczenie antybiotykami, aby uniknąć dodatkowych wydatków medycznych i chirurgicznych.

Główną zaletą wykorzystania systemu obrazowania użytego w tym badaniu do monitorowania infekcji związanych z implantami jest jego zdolność do ujawniania informacji biochemicznych o mikrośrodowisku biofilmu z odniesieniem spektralnym. Chociaż główny nacisk kładziony jest na obrazowanie i mapowanie pH w zakażonym miejscu, metoda ta może zostać zmieniona w celu monitorowania innych biomarkerów specyficznych dla zakażeń związanych z implantami. W ten sposób XELCI pozwala zrozumieć patofizjologię infekcji. Obrazowanie o wysokiej rozdzielczości przestrzennej umożliwia mapowanie niejednorodności w miarę rozwoju infekcji. pH na powierzchni, na której zachodzi tworzenie biofilmu, jest bardzo ważne dla zrozumienia zmian biochemicznych. Również inne zmiany w mikrośrodowisku mogą wystąpić z powodu reakcji bakterii na stres związany z antybiotykami10,11. Dzięki obrazowaniu specyficznemu dla powierzchni i wysokiej rozdzielczości przestrzennej można monitorować wpływ antybiotyku na mikrośrodowisko biofilmu. Technika ta może być również wykorzystana do badania środowiska biofilmu w eksperymentach z celowanym dostarczaniem leków. Możemy badać celowe uwalnianie leków o niskim pH lub podnoszenie pH, aby były bardziej podatne na pracę przy wyższym pH.

Trzy specyficzne cechy tej techniki obrazowania to rozdzielczość rentgenowska, specyficzność powierzchni implantu i wrażliwość chemiczna (Rysunek 1A). Cechy te można porównać z obecnie dostępnymi technikami obrazowania zakażeń związanych z implantami ortopedycznymi (ryc. 1B). Po napromieniowaniu promieniami rentgenowskimi cząsteczki luminoforu pokryte powierzchnią implantu generują światło czerwone i bliskie podczerwieni (NIR), które może przenikać przez kilka centymetrów tkanki (choć z pewnym tłumieniem)12,13. Tabela 1 przedstawia niektóre cechy opracowanego systemu obrazowania w porównaniu z innymi sposobami stosowanymi do pomiaru pH w biofilmach lub tkankach.

XELCI to nowatorska technika obrazowania, pozwalająca na optyczne pozyskiwanie informacji chemicznych o wysokiej rozdzielczości przestrzennej w pobliżu wszczepionych urządzeń medycznych w połączeniu z wzbudzeniem rentgenowskim, jak pokazano na Rysunek 2. W tym przypadku wykorzystuje się selektywne wzbudzenie i optyczne wykrywanie pobudliwych cząstek luminoforu promieniowania rentgenowskiego. Implant jest pokryty dwiema warstwami, wrażliwą na pH warstwą polimeru wbudowaną w barwnik na warstwie cząstek scyntylatora. Gdy sekwencja skupionych wiązek promieniowania rentgenowskiego naświetli implant, warstwa scyntylatora generuje światło widzialne (620 nm i 700 nm). W ten sposób wytworzone światło przechodzi przez warstwę wrażliwą na pH, modulując widmo luminescencji w zależności od pH otaczającego środowiska. Niskie pH jest na ogół związane z infekcją i tworzeniem się biofilmu; w miarę postępu infekcji pH zmienia się z fizjologicznego pH (pH 7,2) na kwaśne (poniżej pH 7), a barwnik pH w czujniku zmienia kolor, a tym samym absorbancję. Zmienność widma luminescencji jest pokazana w Rysunek 2E dla barwnika pH z zielenią bromokrezolową o pH 7 i pH 4. Światło przepuszczane przez tkankę i kość jest zbierane, a stosunek widmowy określa pH. Aby wygenerować obraz pH, skupiona wiązka promieniowania rentgenowskiego naświetla punkt po punkcie na filmie scyntylatora i skanuje wiązkę punkt po punkcie w poprzek próbki. Wcześniej technika ta została zastosowana do obrazowania zmian pH na powierzchni implantów ortopedycznych14,15 i przetestowano ją w celu monitorowania zmian pH w kanale śródszpikowym przez kość i tkanki.

Rysunek 3 poniżej pokazuje schemat systemu obrazowania. Podstawowymi elementami systemu obrazowania są źródło wzbudzenia promieniowania rentgenowskiego z optyką polikapilarną, jednoczęściowy akrylowy światłowód łączący się z dwiema lampami fotopowielaczy, zmotoryzowany stolik x, y i z (skok 30 cm x 15 cm x 6 cm) oraz komputer podłączony do akwizycji danych. Źródło promieniowania rentgenowskiego, stolik x,y,z i optyka zbierająca (kolanko, światłowód, lampy fotopowielacza (PMT)) znajdują się w obudowie odpornej na promieniowanie rentgenowskie, podczas gdy kontroler rentgenowski, źródło zasilania dla PMT, generator funkcyjny podłączony do płytki akwizycji danych (DAQ) i komputer są przechowywane na zewnątrz. Przyciskowy, normalnie otwarty przełącznik, umieszczony między obudową a frontem drzwi, służy jako blokada. Jeśli drzwi nie są całkowicie zamknięte (przełącznik blokady jest otwarty), źródło promieniowania rentgenowskiego nie włączy się i automatycznie wyłączy źródło promieniowania rentgenowskiego, jeśli zostanie otwarte podczas pracy. Silniki mogą wykonywać ciągłe skanowanie, a także mogą być przenoszone w dowolne, dyskretne miejsce. Prędkość skanowania dla osi y wynosi zwykle 1-5 mm/s, podczas gdy rozmiar kroku na osi x można wybrać zwykle w zakresie 150-2000 μm. Parametry można dobierać w zależności od wymaganej rozdzielczości przestrzennej. Nawet czasy naświetlania są potwierdzane przez stałą prędkość podczas ciągłego skanowania.

Gdy skupiona wiązka promieniowania rentgenowskiego zostanie naświetlana na cząstki luminescencji promieniowania rentgenowskiego, wygenerowane światło przejdzie przez folię wrażliwą na pH, modulując światło w zależności od otaczającego pH. Światło przepuszczane będzie oddziaływać (rozpraszać i częściowo pochłaniać) z tkanką, podczas gdy tłumienie światła przez rozpraszanie i absorpcję będzie rosło wraz ze wzrostem grubości tkanki. Optyka kolekcji zawiera jednoczęściowy, rozwidlony akrylowy światłowód wyposażony w odblaskowe aluminiowe kolanko (z zagięciem pod kątem 90° i polerowaną odblaskową powierzchnią wewnętrzną) na początku. Ma to na celu zapewnienie, że światło zostanie skolimowane, gdy tylko światło dotrze do światłowodu. Dodatki te znacznie poprawiły wydajność zbierania światła. Aby uzyskać więcej informacji, Rysunek 4 pokazuje rysunki maszynowe łokcia i światłowodu. Kolano 90° zostało obrobione z aluminium, z wewnętrzną powierzchnią wypolerowaną do lustrzanego wykończenia, a światłowód został obrobiony akrylem. Na początku łokcia zamocowaliśmy również filtr światła niebieskiego długiego przepustowego (blokujący światło o długości fali 350-450 nm), aby zapewnić, że przejdzie przez niego tylko światło czerwone. Koniec jednoczęściowego akrylowego światłowodu rozdziela się na dwa strumienie, co prowadzi do dwóch różnych PMT. PMT są zamknięte w małym, światłoszczelnym metalowym pudełku, które styka się z chłodnicą termoelektryczną w celu schłodzenia PMT do ~5 °C. Na początku jednego z PMT dołączony jest filtr długoprzepustowy o wąskim zakresie (blokujący światło 570-640 nm i przepuszczający światło 640-740 nm), który mierzy tylko światło 700 nm. Dlatego światło 620 nm i 700 nm można obliczyć osobno. PMT są ustawione w trybie zliczania fotonów i generują impulsy logiczne tranzystor-tranzystor (TTL) dla każdego wykrytego fotonu. System DAQ zlicza impulsy (punkt nasycenia 20 milionów impulsów na sekundę) za pomocą komunikacji USB. Po przetworzeniu danych generowane są dwie oddzielne mapy intensywności, a ostateczny obraz jest tworzony z uwzględnieniem stosunku natężenia długości fali sygnału (620 nm) do natężenia referencyjnej długości fali (700 nm). Stosunek ten uwzględnia różnice w całkowitej skuteczności zbierania światła, które silnie zależą od położenia optyki zbierającej, intensywności promieniowania rentgenowskiego i grubości tkanki. Ponadto przestrzennie oddzielony obszar referencyjny bez żadnego barwnika wskaźnikowego pH odpowiada za zniekształcenia widma spowodowane penetracją tkanek zależną od długości fali. Do sterowania systemem obrazowania używany jest graficzny język programowania, a poniżej przedstawiono podstawowy schemat blokowy operacji. Konfiguracja obrazowania, z wyjątkiem komputera, kontrolera rentgenowskiego i jednostki DAQ, jest zamknięta w bezpiecznej obudowie rentgenowskiej, aby zminimalizować narażenie na promieniowanie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta procedura jest zgodna z protokołami użytkowania zwierząt zatwierdzonymi przez Clemson University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Eksperymenty są przeprowadzane zgodnie z Komitetem ds. Bezpieczeństwa Biologicznego Uniwersytetu Clemson (IBC) i Komitetem ds. Bezpieczeństwa Radiologicznego (RSC), a także zgodnie z odpowiednimi wytycznymi i przepisami.

UWAGA: Schemat przepływu wykonywania skanowania XELCI jest pokazany poniżej w Rysunek 5, po którym następuje szczegółowy opis procedury obrazowania krok po kroku.

1. Zainicjuj system i zdobądź zwykłe zdjęcie rentgenowskie

  1. Włącz chłodnicę PMT, zwykle osiągnięcie wartości zadanej zajmuje ~15 minut (np. 4 °C). Wykonaj pozostałe kroki inicjalizacji przed włączeniem PMT.
  2. Otwórz oprogramowanie sterujące systemem obrazowania. Program sterujący komunikuje się i inicjalizuje zmotoryzowany stolik osi x-y-z. Przesuń osie x stołu montażowego i oś y do żądanego położenia początkowego.
  3. Umieścić próbkę na ruchomym stoliku x-y-z. Ustaw wysokość próbki (oś z), tak aby urządzenie radioluminescencyjne znajdowało się 5-5,5 cm poniżej optyki polikapilarnej, podnosząc lub opuszczając źródło promieniowania rentgenowskiego i/lub stolik. Umieść również próbkę w płaszczyźnie x-y za pomocą poprzeczki laserowej (dwa czerwone wskaźniki laserowe w kształcie linii przymocowane do kapilary ogniskującej promieniowanie rentgenowskie i ustawione pod kątem 90° względem siebie, tak aby linie przecinały się w miejscu, w którym skupi się promieniowanie rentgenowskie). Wyłącz lasery przed włączeniem promieni rentgenowskich i PMT.
  4. Zamocuj blokadę przycisku na przednich drzwiach obudowy obrazu. Włącz zasilanie źródła promieniowania. Zdemontować optykę skupiającą, aby uzyskać zwykły radiogram próbki.
  5. Otwórz oprogramowanie sterujące promieniowaniem rentgenowskim i ustaw moc promieniowania rentgenowskiego (regulując napięcie i prąd). Otwórz migawkę rentgenowską za pomocą oprogramowania sterującego promieniowaniem rentgenowskim.
  6. Otwórz oprogramowanie kamery rentgenowskiej. Naciśnij przycisk ekspozycji, aby zrobić zwykłe zdjęcie rentgenowskie. Wyłącz ekspozycję i wyłącz X-ray.
    UWAGA: W razie potrzeby przesuń próbkę, aby poprawić pozycję próbki lub uzyskaj serię promieni rentgenowskich w różnych pozycjach, aby można je było zestawić w celu uzyskania większego widoku rentgenowskiego. Można również uzyskać zdjęcie rentgenowskie w osobnym systemie, ale jednoczesna rejestracja między XELCI a radiografią staje się trudniejsza, jeśli próbka się porusza.
  7. Otwórz drzwi obudowy.

2. Opcjonalnie, wykonaj skanowanie tła przy wyłączonym promieniowaniu rentgenowskim

  1. Ponownie podłącz optykę polikapilarną do źródła promieniowania rentgenowskiego.
  2. Zamknij obudowę i zabezpiecz blokadę. Włącz zasilacz PMT.
    UWAGA: Zasilanie PMT powinno być zawsze wyłączane, gdy drzwi są otwarte lub mają być otwarte, aby uniknąć nadmiernej ekspozycji na światło.
  3. Otwórz oprogramowanie sterujące systemem obrazowania i określ rozmiar kroku, szybkość skanowania i obszar skanowania. Po ustawieniu wszystkich parametrów rozpocznij skanowanie, naciskając przycisk Uruchom.
    UWAGA: W przypadku skanowania o wysokiej rozdzielczości rozmiar kroku będzie wynosił 1000 μm, a w przypadku skanowania o niskiej rozdzielczości rozmiar kroku będzie wynosił 250 μm. Prędkość skanowania można wybrać od 5 mm/s do 1 mm/s. Obszar skanowania zależy od wymiarów próbki.
  4. Uruchom skanowanie tła przy wyłączonym promieniowaniu rentgenowskim, aby określić ciemne zliczenia od dowolnego światła obecnego w obudowie innego niż próbka.

3. Wykonaj skan próbki z włączonym promieniowaniem rentgenowskim

  1. Upewnij się, że próbka jest nadal we właściwej pozycji za pomocą krzyżowej głowicy lasera, aby rozpocząć skanowanie.
  2. Zamknij obudowę i zabezpiecz blokadę. Jeśli PMT są wyłączone (np. wyłączone przed otwarciem drzwi), włącz zasilanie PMT.
  3. Otwórz oprogramowanie sterujące systemem obrazowania. Wprowadź wartości rozmiaru kroku, szybkości skanowania i obszaru skanowania. Po ustawieniu wszystkich parametrów naciśnij przycisk Uruchom, aby rozpocząć skanowanie.
    UWAGA: W przypadku skanowania o wysokiej rozdzielczości rozmiar kroku będzie wynosił 1000 μm, a w przypadku skanowania o niskiej rozdzielczości rozmiar kroku będzie wynosił 250 μm. Prędkość skanowania można wybrać od 5 mm/s do 1 mm/s. Obszar skanowania zależy od wymiarów próbki.
  4. Uzyskaj skan próbki z włączonym promieniowaniem rentgenowskim.
  5. Najpierw wykonaj skanowanie w niskiej rozdzielczości z większymi rozmiarami kroków i większą prędkością skanowania, aby uzyskać wstępny obraz celu. Po uzyskaniu skanu o niskiej rozdzielczości żądanego obszaru próbki, uzyskaj skan o wyższej rozdzielczości z mniejszym rozmiarem kroku i niższą prędkością skanowania.
  6. Wyłącz zasilanie PMT przed otwarciem drzwi.

4. Formowanie obrazu

  1. Sprawdź, czy bieżące skanowanie obrazuje obszar zainteresowania celu. Jeśli nie, zatrzymaj bieżące skanowanie, naciskając przycisk Zatrzymaj.
  2. Ponownie dostosuj pozycje skanowania w oprogramowaniu sterującym i ponownie naciśnij przycisk Uruchom.
    UWAGA: Oś y jest rejestrowana w sposób ciągły, począwszy od pierwszego wiersza skanowania. Podczas wykonywania skanowania rejestrowana jest liczba zliczeń na każdą długość fali i czas od ostatniej zaktualizowanej pozycji silnika. Zarejestrowany czas będzie uwzględniał wszelkie zmiany prędkości silnika, a tym samym czas ekspozycji. Dla każdego piksela normalizowana jest liczba zliczeń na sekundę. Silnik osi y porusza się, aby zeskanować koniec bieżącego rzędu osi y, a silnik wraca do pozycji wyjściowej. Następnie silnik osi X zwiększa swoje położenie o rozmiar kroku zdefiniowany przez użytkownika i skanuje drugi rząd osi y. Proces ten jest cyklicznie powtarzany, dopóki silnik osi x nie osiągnie określonej szerokości dla kierunku x. Użytkownik może kontrolować rozmiar skanu, prędkość silnika i pozycje startowe silnika. Rozmiar kroku określi rozmiar pikseli na końcowym obrazie osi y.

5. Hodowla bakterii do obrazowania w sterylnych warunkach (jeśli obrazowane są czujniki wyhodowane przez bakterie)

  1. Aby przygotować świeżą kulturę Staphylococcus aureus 1945 (ATCC 25923), użyj jednej kolonii z płytki TSA (Tryptic soy agar) smugowanej w ciągu 1 tygodnia, aby zaszczepić 5 ml sterylnego tryptycznego bulionu sojowego (TSB).
  2. Delikatnie wstrząsać kulturą bakteryjną w temperaturze 37 °C przez 16-18 godzin, aż do fazy stacjonarnej.
  3. Następnie osadzać kulturę z TSB przez wirowanie przy 4000 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej (RT) i dwukrotnie przemyć osad roztworem buforu fosforanowego (PBS) i ponownie zawiesić osad w 5 ml sterylnego PBS.
  4. Określ ilościowo stężenie bakterii za pomocą gęstości optycznej przy 600 nm, korzystając z zakresu liniowego, który jest zakresem OD, w którym weryfikuje się prawo Beera-Lamberta (OD = kN; k jest współczynnikiem odnoszącym się do ekstynkcji molekularnej i długości ścieżki optycznej, N to stężenie bakterii)16. Następnie rozcieńczyć próbkę do 105 komórek/ml za pomocą sterylnego PBS.
  5. Wysterylizuj Tryptic Soy Agar (TSA) przez autoklawowanie, a następnie schłodzić przez mieszanie, aż temperatura osiągnie 45 °C. Zaszczep bakterie do TSA.
  6. Odpipetować rozcieńczoną kulturę bakteryjną (100 μl) na powierzchnię wszczepialnego czujnika.
    UWAGA: Implanty sterylizowano przez zanurzenie w 70% etanolu przez 5 minut i przechowywano w sterylnym PBS.
  7. Pobrać pipetę 100 μl niezaszczepionego TSA na inny sterylny implant jako kontrolę
  8. Dodać dodatkowe 100 μl niezaszczepionego TSA na wszczepialny czujnik przed jego inkubacją w temperaturze 37 °C przez 48 godzin przed implantacją.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jako wstępne badanie, zobrazowaliśmy czujnik pręta śródszpikowego w rozwierconej kości piszczelowej zwłok królika14. Czujnik ma trzy odrębne regiony: region odniesienia, obszar pH 8 (pH zasadowe) i obszar pH 4 (pH kwaśne). Obszarem odniesienia jest cząstka scyntylatora (Gd2O2S:Eu) zawarta w chropowatej folii epoksydowej. Charakterystyczne kwaśne i zasadowe obszary pH reprezentują zakażone i niezakażone sytuacje wewnątrz kanału śródszpikowego (Rysunek 6A,B)...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby móc wcześnie wykrywać i badać infekcje związane z implantami ortopedycznymi, aby uniknąć powikłań związanych z zapaleniem kości i szpiku oraz wtórnymi zabiegami chirurgicznymi, wprowadziliśmy XELCI jako nową, funkcjonalną technikę obrazowania. Jest ona porównywalna z obecnie dostępnymi technikami monitorowania pH za pomocą tkanek.

Podczas pozycjonowania próbki do obrazowania używamy laserowej głowicy krzyżowej połączonej z polikapilarną optyką skupiającą z dwoma przecinającymi się wskaźnik...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy twierdzą, że nie ma konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy chcieliby podziękować Clemson University, COMSET i Clemson SC BioCRAFT. Konfiguracja XELCI została początkowo opracowana dzięki funduszom z NSF CAREER CHE 12255535, a później przez NIH NIAMS R01 AR070305-01.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Kolano 90 stopniWyprodukowano w Hilltop Technology Laboratory, 51 Parker, Irvine, CA
Bromo Cresol GreenSigma-Aldrich45ZW10
Bromo Thymol BlueSigma76-59-5
ElectraCOOL Zaawansowana termoelektryczna płyta chłodzącaPollock industries, White River, VT, USATCP 50
EtanolBeantown Chemical, 9 Sagamore Park Road
Hudson, NH 03051		64-17-5
Oksysiarczek gadolinu domieszkowany europem (Gd2O2S:Eu) cząstki-~8,0 i mikro; mPhosphor Technologies Inc., Stevenage, AngliaUKL63/N-R1
LabVIEWNational Instruments, Austin, TX
Zmotoryzowany liniowy pionowy model sceniczny (dla osi Z)Motion Control, Smithtown, NY, USAAT10-60
National instruments c-DAQ 9171National Instruments, Austin, TXNI cDAQ™-9171
Jednoczęściowa lampa akrylowa przewodnikWyprodukowano w Hilltop Technology Laboratory, 51 Parker, Irvine, CA
Bufor pH 4VWR BDH ChemicalsBDH5024
Bufor pH 8VWR BDH ChemicalsBDH5060
Roztwór buforu fosforanowegoMP Biomedicals, Irvine, CA. Stany Zjednoczone2810305
Probówki powielacza fotograficznego Model P25PC-16SensTech, Surrey, Wielka BrytaniaModel P25PC-16
Staphylococcus aureus subsp. aureus RosenbachAmerican Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VAATCC 25923
Tryptic Soy AgarTeknova, Hollister, CA, USA  T0520
Tryptyczny bulion sojowyEMD Millipore, Burlington, MA, USA1005255000
Źródło promieniowania rentgenowskiego - iMOXSInstitute for Scientific Instruments GmbH, Berlin, Niemcy
Zmotoryzowany stolik X,Y - 30 cm x 15 cm x 6 cm podróżThorlabs Inc., Newton, NJ, USALTS300 i LTS150

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Arciola, C. R., Alvi, F. I., An, Y. H., Campoccia, D., Montanaro, L. Implant infection and infection resistant materials: A mini review. International Journal of Artificial Organs. 28 (11), 1119-1125 (2005).
  2. Renick, P., Tang, L. Device-related infections. Racing for the Surface. Li, B., Moriarty, T. F., Webster, T., Xing, M. , Springer International Publishing. Cham. 171-188 (2020).
  3. Stewart, P. S., Franklin, M. J. Physiological heterogeneity in biofilms. Nature Reviews Microbiology. 6 (3), 199-210 (2008).
  4. Metsemakers, W. J., et al. Fracture-related infection: A consensus on definition from an international expert group. Injury. 49 (3), 505-510 (2018).
  5. Arciola, C. R., Campoccia, D., Montanaro, L. Implant infections: Adhesion, biofilm formation and immune evasion. Nature Reviews Microbiology. 16 (7), 397-409 (2018).
  6. Polvoy, I., Flavell, R. R., Rosenberg, O. S., Ohliger, M. A., Wilson, D. M. Nuclear Imaging of Bacterial Infection: The State of the Art and Future Directions. Journal of Nuclear Medicine. 61 (12), 1708-1716 (2020).
  7. vander Bruggen, W., Bleeker-Rovers, C. P., Boerman, O. C., Gotthardt, M., Oyen, W. J. G. PET and SPECT in Osteomyelitis and Prosthetic Bone and Joint Infections: A Systematic Review. Seminars in Nuclear Medicine. 40 (1), 3-15 (2010).
  8. Trampuz, A., Zimmerli, W. Diagnosis and Treatment of infections associated with fracture-fixation devices. Injury. 37 (2), 59-66 (2006).
  9. Ady, J., Fong, Y. Imaging for infection: From visualization of inflammation to visualization of microbes. Surgical Infections. 15 (6), 700-707 (2014).
  10. Truong-Bolduc, Q. C., et al. Implication of the NorB Efflux pump in the adaptation of Staphylococcus Aureus to growth at acid pH and in resistance to Moxifloxacin. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 55 (7), 3214-3219 (2011).
  11. Hengge-Aronis, R. Signal transduction and regulatory mechanisms involved in control of the σS (RpoS) subunit of RNA polymerase. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 66 (3), 373-395 (2002).
  12. Gao, R., Yan, D. Molecular phosphors for x-ray detection. Science Bulletin. 67 (10), 1015-1017 (2022).
  13. Gao, R., Fang, X., Yan, D. Recent developments in stimuli-responsive luminescent films. Journal of Materials Chemistry C. 7 (12), 3399-3412 (2019).
  14. Uzair, U., et al. Conformal coating of orthopedic plates with x-ray scintillators and ph indicators for x-ray excited luminescence chemical imaging through tissue. ACS Applied Materials & Interfaces. 12 (47), 52343-52353 (2020).
  15. Uzair, U., Benza, D., Behrend, C. J., Anker, J. N. Noninvasively imaging pH at the surface of implanted orthopedic devices with x-ray excited luminescence chemical imaging. ACS Sensors. 4 (9), 2367-2374 (2019).
  16. Begot, C., Desnier, I., Daudin, J. D., Labadie, J. C., Lebert, A. Recommendations for calculating growth parameters by optical density measurements. Journal of Microbiological Methods. 25 (3), 225-232 (1996).
  17. Giering, K., Minet, O., Lamprecht, I., Müller, G. Review of thermal properties of biological tissues. Proceedings of SPIE - The International Society for Optical Engineering. , 45-65 (1995).
  18. Hunter, R. C., Beveridge, T. J. Application of a pH-sensitive fluoroprobe (C-SNARF-4) for pH microenvironment analysis in Pseudomonas aeruginosa biofilms. Applied and Environmental Microbiology. 71 (5), 2501-2510 (2005).
  19. Pogue, B. W., Leblond, F., Krishnaswamy, V., Paulsen, K. D. Radiologic and Near-Infrared/Optical Spectroscopic Imaging: Where Is the Synergy. American Journal of Roentgenology. 195 (2), 321-332 (2010).
  20. Ryan, S. G., et al. Imaging of X-ray-excited emissions from quantum dots and biological tissue in whole mouse. Scientific Reports. 9 (1), 19223(2019).
  21. Yang, Y., Wang, K. -Z., Yan, D. Ultralong persistent room temperature phosphorescence of metal coordination polymers exhibiting reversible pH-responsive emission. ACS Applied Materials & Interfaces. 8 (24), 15489-15496 (2016).
  22. Chen, H., Rogalski, M. M., Anker, J. N. Advances in functional X-ray imaging techniques and contrast agents. Physical Chemistry Chemical Physics. 14 (39), 13469(2012).
  23. Allan, V. J. M., Macaskie, L. E., Callow, M. E. Development of a pH gradient within a biofilm is dependent upon the limiting nutrient. Biotechnology letters. 21 (5), 407-413 (1999).
  24. Wang, Z., Deng, H., Chen, L., Xiao, Y., Zhao, F. In situ measurements of dissolved oxygen, pH and redox potential of biocathode microenvironments using microelectrodes. Bioresource Technology. 132, 387-390 (2013).
  25. Xiao, Y., et al. In situ probing the effect of potentials on the microenvironment of heterotrophic denitrification biofilm with microelectrodes. Chemosphere. 93 (7), 1295-1130 (2013).
  26. Nakata, E., et al. A novel strategy to design latent ratiometric fluorescent pH probes Based on self-assembled SNARF derivatives. RSC Adv. 2014 (4), 348-357 (2014).
  27. Villano, D., et al. A fast multislice sequence for 3D MRI-CEST pH. Magnetic Resonance in Medicine. 85 (3), 1335-1349 (2021).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Obrazowanie luminescencyjne promieniami rentgenowskimiobrazowanie pHemisja scyntylatoragwo d r dszpikowyhodowla bakteryjnaStaphylococcus aureusg sto optyczna

Powiązane artykuły