Method Article

Wizualizacja dynamiki konformacyjnej receptorów błonowych za pomocą jednocząsteczkowego FRET

DOI:

10.3791/64254

⸱

August 17th, 2022

 ,  , 
1Department of Molecular Biosciences, Northwestern University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie przedstawia szczegółową procedurę przeprowadzania eksperymentów z transferem energii rezonansu fluorescencji pojedynczej cząsteczki (smFRET) na receptorach sprzężonych z białkiem G (GPCR) przy użyciu znakowania specyficznego dla miejsca poprzez inkorporację nienaturalnych aminokwasów (UAA). Protokół zawiera przewodnik krok po kroku dotyczący przygotowania próbek, eksperymentów i analizy danych smFRET.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zdolność komórek do reagowania na sygnały zewnętrzne jest niezbędna dla rozwoju, wzrostu i przetrwania komórek. Aby zareagować na sygnał z otoczenia, komórka musi być w stanie go rozpoznać i przetworzyć. Zadanie to opiera się głównie na funkcji receptorów błonowych, których rolą jest przekształcanie sygnałów w język biochemiczny komórki. Receptory sprzężone z białkiem G (GPCR) stanowią największą rodzinę białek receptorów błonowych u ludzi. Wśród GPCR metabotropowe receptory glutaminianu (mGluR) są unikalną podklasą, która działa jako obligatoryjne dimery i posiada dużą domenę zewnątrzkomórkową, która zawiera miejsce wiązania ligandu. Niedawne postępy w badaniach strukturalnych mGluR pozwoliły lepiej zrozumieć proces ich aktywacji. Jednak propagacja wielkoskalowych zmian konformacyjnych przez mGluRs podczas aktywacji i modulacji jest słabo poznana. Transfer energii rezonansu fluorescencji pojedynczej cząsteczki (smFRET) jest potężną techniką wizualizacji i ilościowego określania dynamiki strukturalnej biomolekuł na poziomie pojedynczego białka. Aby zobrazować dynamiczny proces aktywacji mGluR2, opracowano fluorescencyjne czujniki konformacyjne oparte na inkorporacji nienaturalnych aminokwasów (UAA), które umożliwiły znakowanie białek specyficznych dla miejsca bez zaburzeń natywnej struktury receptorów. Opisany tutaj protokół wyjaśnia, jak przeprowadzać te eksperymenty, w tym nowatorskie podejście do etykietowania UAA, przygotowanie próbki oraz pozyskiwanie i analizę danych smFRET. Strategie te można uogólnić i rozszerzyć w celu zbadania dynamiki konformacyjnej różnych białek błonowych.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Transfer informacji przez błonę plazmatyczną jest silnie zależny od funkcji receptorów błonowych1. Wiązanie liganda z receptorem prowadzi do zmiany konformacyjnej i aktywacji receptora. Proces ten ma często charakter allosteryczny2. Liczące ponad 800 członków receptory sprzężone z białkiem G (GPCR) są największą rodziną receptorów błonowych u ludzi3. Ze względu na ich rolę w prawie wszystkich procesach komórkowych, GPCR stały się ważnymi celami rozwoju terapeutycznego. W kanonicznym modelu sygnalizacji GPCR aktywacja agonistyczną powoduje zmiany konformacyjne receptora, które następnie aktywują he....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ogólny przebieg pracy protokołu jest opisany na rysunku 1.

1. Przygotowanie komory na próbkę

  1. Czyszczenie szkiełek nakrywkowych i nakrywkowych
    UWAGA: Kroki te mają na celu oczyszczenie powierzchni szkiełek podstawowych oraz szkiełek nakrywkowych i przygotowanie ich do aminozylanizacji. Jednym z krytycznych wymagań do przeprowadzania eksperymentów fluorescencyjnych pojedynczych cząsteczek na cząsteczkach związanych z powierzchnią jest pasywowana powierzchnia. Najbardziej niezawodna i powtarzalna technika pasywacji polega na kowalencyjnym łączeniu obojętnych łańcuchów polimerowych z powierzchn....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ekspresja i fluorescencyjne znakowanie czujnika FRET opartego na UAA
W niniejszym artykule omówiono przykładowe wyniki insercji i znakowania fluorescencyjnego UAA (AZP) w CRD mGluR2 (548UAA) 11. Jak wspomniano wcześniej, aby wstawić AZP do mGluR2, konieczna jest koekspresja zaprojektowanej maszynerii translacyjnej, która obejmuje zmodyfikowaną syntetazę tRNA i komplementarne tRNA (pIRE4-Azi) oraz mGluR2 zawierającą bursztynowy kodon w pozycji 548, utworzony przy użyciu mutagen.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

GPCR to białka, które działają na błonę komórkową w celu zainicjowania transdukcji sygnału. Wiele GPCR składa się z wielu domen, przy czym sygnalizacja jest zależna od kooperacyjnej interakcji między domenami. Aby modulować właściwości tych receptorów błonowych, konieczne jest zrozumienie dynamicznego zachowania wielu domen. Transfer energii rezonansu fluorescencji pojedynczej cząsteczki (smFRET) to technika fluorescencyjna, która umożliwia pomiar konformacji i dynamiki białek w czasie rzeczywistym11,32.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy członkom laboratorium Reza Vafabakhsh za dyskusje. Prace te były wspierane przez R01GM140272 grantowe National Institutes of Health (dla R.V.), przez The Searle Leadership Fund for the Life Sciences na Northwestern University oraz przez Chicago Biomedical Consortium przy wsparciu Searle Funds w The Chicago Community Trust (do R.V.). B.W.L. był wspierany przez National Institute of General Medical Sciences (NIGMS) Training Grant T32GM-008061.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
(+)-Askorbinian soduSigma AldrichCat # 11140-250G
4-azydo-L-fenyloalaninaChem-Impex InternationalCat # 06162
548UAALiauw i in. 2021Transfekowany konstrukt
Kwas octowyFisher Chemical64-19-7
AcetonFisher Chemical67-64-1
Adobe Illustrator (2022)https://www.adobe.com/RRID:SCR_010279Oprogramowanie, algorytm
Aminoguanidyna (chlorowodorek)Cayman Chemical81530
AminosilanAldrich919-30-2
Sonikator do kąpieli 2,8 LFisher ScientificKąpiel ultradźwiękowa 2,8 l
Biotyna-PEGLaysan Bio IncPozycja# Biotyna-PEG-SVA-5000-100mg
BTTESClick Narzędzia chemiczne1237-500
Siarczan miedzi (II)Sigma AldrichCat # 451657-10G
Szkiełko nakrywkoweVWR16004-306Komora na próbki
Cy3 AlkineClick Narzędzia chemiczneTA117-5
Cy5 AlkineClick Narzędzia chemiczneTA116-5
DDMAnatraceCzęść # D310 1 GMDetergent
DDM-CHS (10:1)AnatraceCzęść # D310-CH210 1 MLDetergent z cholekterolem
Zdefiniowana płodowa surowica bydlęcaThermo Fisher ScientificSH30070.03
Di01-R405/488/561/635Filtr wycinający Semrock
DMEMCorning10-013-CV
EMCCDKamera AndorDU-897U
ET542lpdługoprzepustowyChroma
FF640-FDi01SemrockFiltr dichroiczny emisji
przeciwciałoGenscriptA01429
Koralik fluorescencyjnyInvitrogen T7279Mikrosfery TetraSpeckKoralik sferyczny
Szkiełkaszklane Fisherfinest12-544-4komora na próbki
GlutaminianSigma AldrichCat # 6106-04-3
HEK 293TSigma AldrichCat # 12022001Linia komórkowa
HEPESFisherBioReagents7365-45-9
Rozdzielacz obrazuOptoSplit II
KOHFluka1310-58-3
LaserOxxius4-liniowy łącznik laserowy
Lipofectamine 3000 Odczynnik do transfekcjiThermo Fisher ScientificL3000015Odczynnik do transfekcji
MetanolFisher Chemical67-56-1
Mikroskop OlympusOlympus IX83
Milli-Q dejonizatorwodyBarnstead
m-PEGLaysan Bio IncPozycja# MPEG-SIL-5000-1g
NF03-405/488/532/635Lustro dichroiczneSemrock
OptiMEMThermo Fisher Scientific51985091Zredukowane podłoże w surowicy
OptiMEM/Zredukowane podłoże w surowicy ThermoFisher Scientific
OriginPro (2020b)https://www.originlab.com/RRID:SCR_014212Oprogramowanie do analizy danych i tworzenia wykresów
Penicylina-StreptomycynaGibco15140-122
pIRE4-AziAddgene Plazmid # 105829Transfekowany konstrukt
Bromowodorek poli-L-lizynySigma AldrichCat # P2636
Kwas protokatechowy (PCA)HWI grupa99-50-3
smCamera (wersja 1.0)http://ha.med.jhmi.edu/resources/Camera oprogramowanie
Wodorowęglan soduFisherBioReagents144-55-8
Wodorotlenek sodu (NaOH)Sigma1310-73-2
Filtr strzykawkowyWhatman UNIFLOCat#9914-2502Filtracja cieczy
TroloxSigma53188-07
Filtr FLAG-tag

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Smock, R. G., Gierasch, L. M. Sending signals dynamically. Science. 324 (5924), 198-203 (2009).
  2. Changeux, J. P., Christopoulos, A. Allosteric modulation as a unifying mechanism for receptor function and regulation. Cell. 166 (5), 1084-1102 (2016).
  3. Tang, X. -l, Wang, Y., Li, D. -l, ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Single Molecule FRETMembrane ReceptorsConformational DynamicsProtein LabelingMetabotropic Glutamate ReceptorsGPCR ActivationHidden Markov ModelingFluorescent SensorsHEK 293T CellsSite Specific Labeling

Related Articles