Wizualizacja dynamiki konformacyjnej receptorów błonowych za pomocą jednocząsteczkowego FRET

Transfer informacji przez błonę plazmatyczną jest silnie zależny od funkcji receptorów błonowych¹. Wiązanie liganda z receptorem prowadzi do zmiany konformacyjnej i aktywacji receptora. Proces ten ma często charakter allosteryczny². Liczące ponad 800 członków receptory sprzężone z białkiem G (GPCR) są największą rodziną receptorów błonowych u ludzi³. Ze względu na ich rolę w prawie wszystkich procesach komórkowych, GPCR stały się ważnymi celami rozwoju terapeutycznego. W kanonicznym modelu sygnalizacji GPCR aktywacja agonistyczną powoduje zmiany konformacyjne receptora, które następnie aktywują heterotrimeryczny kompleks białka G poprzez wymianę GDP na GTP w kieszeni wiążącej nukleotydy_α G. Aktywowane podjednostki G_α-GTP i G_βγ kontrolują następnie aktywność dalszych białek efektorowych i propagują kaskadę sygnalizacyjną^4,5. Ten proces sygnalizacji zasadniczo zależy od zdolności ligandów do zmiany trójwymiarowego kształtu receptora. Mechanistyczne zrozumienie, w jaki sposób ligandy to osiągają, ma kluczowe znaczenie dla opracowywania nowych terapii oraz projektowania syntetycznych receptorów i czujników.

Metabotropowe receptory glutaminianu (mGluRs) należą do rodziny GPCR klasy C i są ważne dla powolnego neuromodulacyjnego działania glutaminianu i dostrajania pobudliwości neuronalnej6^,7. Spośród wszystkich GPCR, GPCR klasy C są strukturalnie unikalne, ponieważ działają jako obligatoryjne dimery. mGluRs zawierają trzy domeny strukturalne: domenę muchołówki (VFT), domenę bogatą w cysteinę (CRD) i domenę transbłonową (TMD)⁸. Zmiany konformacyjne podczas procesu aktywacji są złożone i obejmują lokalne i globalne sprzężenie konformacyjne, które rozchodzą się na odległość 12 nm, a także kooperatywność dimerów. Pośrednie konformacje, czasowy porządek stanów i tempo przejścia między stanami są nieznane. Śledząc konformację poszczególnych receptorów w czasie rzeczywistym, możliwe jest zidentyfikowanie przejściowych stanów pośrednich i sekwencji zmian konformacyjnych podczas aktywacji. Można to osiągnąć, stosując transfer energii rezonansu fluorescencji pojedynczej cząsteczki^9,10 (smFRET), tak jak zostało to ostatnio zastosowane do wizualizacji propagacji zmian konformacyjnych podczas aktywacji mGluR2¹¹. Kluczowym krokiem w eksperymentach FRET jest wygenerowanie czujników FRET poprzez specyficzną dla miejsca insercję fluoroforów donorowych i akceptorowych do białka będącego przedmiotem zainteresowania. Przyjęto strategię inkorporacji nienaturalnych aminokwasów (UAA)^12,13,14,15 w celu przezwyciężenia ograniczeń typowych technologii znakowania fluorescencyjnego specyficznych dla danego miejsca, które wymagają stworzenia mutantów bez cysteiny lub wprowadzenia dużego znacznika zakodowanego genetycznie. Pozwoliło to na zaobserwowanie konformacyjnego przegrupowania niezbędnego kompaktowego łącznika allosterycznego, który połączył domeny wiążące ligandy i sygnalizacyjne mGluR2. W tym protokole przedstawiono przewodnik krok po kroku dotyczący przeprowadzania eksperymentów smFRET na mGluR2, w tym podejście do specyficznego dla miejsca znakowania mGluR2 za pomocą UAA w celu przyłączenia fluoroforów za pomocą katalizowanej miedzią reakcji cyklizacji azydku. Ponadto protokół ten opisuje metodologię bezpośredniego wychwytywania białek błonowych i analizy danych. Przedstawiony tutaj protokół ma również zastosowanie do badania dynamiki konformacyjnej innych białek błonowych.

Ogólny przebieg pracy protokołu jest opisany na rysunku 1.

1. Przygotowanie komory na próbkę

1. Czyszczenie szkiełek nakrywkowych i nakrywkowych
   UWAGA: Kroki te mają na celu oczyszczenie powierzchni szkiełek podstawowych oraz szkiełek nakrywkowych i przygotowanie ich do aminozylanizacji. Jednym z krytycznych wymagań do przeprowadzania eksperymentów fluorescencyjnych pojedynczych cząsteczek na cząsteczkach związanych z powierzchnią jest pasywowana powierzchnia. Najbardziej niezawodna i powtarzalna technika pasywacji polega na kowalencyjnym łączeniu obojętnych łańcuchów polimerowych z powierzchnią szkła w postaci gęstej warstwy. Glikol polietylenowy (PEG) jest najbardziej wydajnym polimerem stosowanym do pasywacji powierzchni¹⁶. Szczegóły procedury pasywacji z wykorzystaniem PEG (PEGylacji) opisano poniżej:
   1. Zaznacz markerem otwory do wywiercenia na szkiełkach (w odległości ~6 mm od siebie i z dala od krawędzi). Za pomocą narzędzia Dremel wywiercić małe otwory (o średnicy 1 mm) w szkiełku podstawowym. Zanurz szkiełka w wodzie podczas procesu wiercenia.
   2. Umyj szkiełka acetonem, aby usunąć resztki atramentu z markera.
   3. Wyjmij z acetonu i opłucz szkiełka wodą, a następnie podgrzewaj je w kuchence mikrofalowej przez 5 minut w wodzie o dużej mocy (700 W).
   4. Wyczyść szkiełka wodą przed umieszczeniem ich w szklanym słoiku do barwienia, który ma być poddany sonikacji. Umieść szkiełka nakrywkowe w innym słoiku do barwienia.
   5. Sonikować szkiełka i szkiełka nakrywkowe w acetonie przez 30 minut w sonikatorze kąpielowym w temperaturze 23 °C.
   6. W międzyczasie należy oczyścić szklaną kolbę w celu przygotowania roztworu aminozylanizacji użytego w następnym kroku. Napełnić kolbę 1 M KOH, sonikować kolbę przez 30 minut, dokładnie wypłukać KOH wodą, a następnie sonikować przez dodatkowe 30 minut w metanolu. Pozostawić kolbę w metanolu do czasu etapu aminozylanizacji.
   7. W międzyczasie wyjmij aminozlan, mPEG i biotynę-PEG z zamrażarki (-20 °C) i pozwól im osiągnąć temperaturę pokojową (RT) w ciemności.
   8. Wyrzuć aceton ze szkiełka i szkiełka nakrywkowego do odpowiedniego pojemnika na odpady chemiczne, dokładnie spłucz wodą, a następnie poddaj je sonikacji w 5 M KOH przez 30 minut.
   9. Szkiełka podstawowe i szkiełka nakrywkowe opłukać wodą, a następnie poddać sonikacji w metanolu przez 2 minuty (powtórzyć dwukrotnie). Pozostaw słoiki wypełnione metanolem do etapu aminozylanizacji.
      UWAGA: W tym badaniu używana jest woda dejonizowana, chyba że zaznaczono inaczej. Stosuje się sonikator do kąpieli pracujący w temperaturze 23 °C.
2. Aminozylanizacja
   UWAGA: Ten krok ma na celu kowalencyjne powiązanie aminozlanu z czystą powierzchnią szkiełka i szkiełka nakrywkowego. Funkcjonalizowane mPEG i biotyna-PEG będą kowalencyjnie wiązać się z tą powierzchnią w następnym kroku.
   1. Przygotować mieszaninę aminozylanizacji w czystej kolbie (krok 1.6). Przygotuj roztwór, mieszając metanol (150 ml), kwas octowy (7,5 ml, użyj szklanej pipety) i amiinozylanu (2,5 ml).
   2. Delikatnie wymieszaj roztwór w dygestoriach chemicznych, a następnie wlej go do słoików na szkiełko podstawowe i nakrywkowe. Użyj 50 ml na szkiełka nakrywkowe i 100 ml na szkiełka. Upewnij się, że szkiełka podstawowe i nakrywkowe są całkowicie zanurzone w roztworze.
   3. Inkubować przez 10 minut, następnie sonikować słoiki przez 1 minutę (sonikacja usuwa zanieczyszczenia z powierzchni) i inkubować przez kolejne 10 minut.
   4. Roztwór aminozylanizacji wyrzucić do pojemnika na odpady. Dodaj metanol do słoików, zamknij słoiki pokrywkami i delikatnie wstrząśnij ręką. Wyrzuć metanol i napełnij słoiki wodą.
   5. Umieścić butelkę z aminozlanem z powrotem w zamrażarce (−20 °C).
3. PEGylacja
   UWAGA: Te kroki opisują procedurę pegylacji.
   1. Podczas aminozylanizacji należy przygotować bufor pegylacyjny. Odważyć 84 mg wodorowęglanu sodu (NaHCO₃) i dodać do 10 ml wody (10 mM). Ponadto zważ mPEG i biotynę-PEG i odłóż je na bok. Na sześć szkiełek podstawowych i nakrywkowych należy użyć 96 mg mPEG i 1,2-2,4 mg biotyny-PEG.
      UWAGA: Ważne jest, aby nie dodawać zbyt dużo biotyny-PEG, ponieważ może to zwiększyć liczbę plam tła. Nie rozpuszczaj mieszaniny PEG aż do momentu nałożenia jej na szkiełka.
   2. Opłucz szkiełka wodą, osusz je delikatnym nadmuchem powietrza, a następnie umieść je w nawilżonych skrzynkach montażowych.
      UWAGA: Konieczne jest korzystanie z czystej linii lotniczej. Unikaj używania sprężonego powietrza w puszce, które może pozostawić ślady na szkle.
   3. Dodaj bufor pegylacyjny do mieszaniny proszku PEG i delikatnie pipetuj w górę i w dół wiele razy, aby się rozpuścił. Dodać 55 μl buforu pegylacyjnego na szkiełko (na sześć szkiełek dodać 330 μl buforu pegylacyjnego).
   4. Wirować przy 9 600 x g przez 1 minutę w temperaturze 23 °C w celu wytrącenia nierozpuszczonych cząstek. Zebrać supernatant do użycia w następnym kroku.
      UWAGA: Biotyna-PEG szybko hydrolizuje ze względu na obecność grupy NHS. Ważne jest, aby szybko wykonać etapy mieszania i wirowania.
   5. Nanieść 60 μl roztworu PEGylacji na każde szkiełko, a następnie umieścić szkiełko nakrywkowe na wierzchu, tak aby roztwór PEGylacji został umieszczony między szkiełkiem podstawowym a szkiełkiem nakrywkowym.
      UWAGA: Unikaj wprowadzania pęcherzyków powietrza między szkiełkiem podstawowym a szkiełkiem nakrywkowym, ponieważ zmniejszy to skuteczność pasywacji. Usuń wszelkie pęcherzyki, regulując szkiełko nakrywkowe i szkiełko za pomocą końcówki pipety.
   6. Umieść prowadnice w szufladzie, która jest płaska i ciemna. Szkiełka można przechowywać przez noc; Jednak inkubacja przez 4-6 godzin zapewnia optymalną pasywację.
      UWAGA: Ważne jest, aby pamiętać, która strona jest pegylowana.
   7. Zaznacz stronę niepegylowaną przed przechowywaniem. Po inkubacji delikatnie zdemontować i dokładnie spłukać szkiełka podstawowe i nakrywkowe wodą
   8. Wysuszyć szkiełka podstawowe i nakrywki, wdmuchując powietrze. Szkiełka podstawowe i nakrywkowe należy przechowywać w sterylnej probówce (50 ml), z powierzchnią PEGylowaną skierowaną od siebie. Przechowywać w temperaturze -20 °C do dnia eksperymentu.
      UWAGA: Szkiełka podstawowe i nakrywkowe najlepiej stosować w ciągu 4 tygodni od przygotowania. Powierzchnie PEGylowane powinny być odwrócone od siebie. Przechowywanie szkiełek PEGylowanych i szkiełek nakrywkowych w workach zamykanych próżniowo może wydłużyć ich okres przydatności do spożycia.

2. Ekspresja mGluR2 z włączonym nienaturalnym aminokwasem, znakowaniem fluorescencyjnym i ekstrakcją

UWAGA: Ten protokół opisuje przygotowanie, odczynniki i leczenie komórek do ekspresji mGluR2 zawierających 4-azydo-L-fenyloalaninę UAA (AZP). Procedura dotyczy komórek HEK293T wyhodowanych na szkiełkach nakrywkowych o średnicy 18 mm. W razie potrzeby procedurę można zwiększyć.

1. Siew
   UWAGA: Utrzymuj HEK293T komórki w DMEM uzupełnione 10% (v/v) płodową surowicą bydlęcą, 100 jednostkami ·mL⁻¹ penicyliny-streptomycyny i 15 mM buforem HEPES (plik uzupełniający 1) (pH 7,4) w temperaturze 37 °C poniżej 5% CO₂ .
   1. Pasaż komórki z 0,05% trypsyną-EDTA. Komórki nasienne HEK293T na szkiełkach nakrywkowych z poli-L/D-lizyny (PLL/PDL) tak, aby osiągnęły ≥80% zbieżności w czasie transfekcji.
2. Transfekcja
   1. Przygotować 40 mM roztwór podstawowy AZP w 0,1 M NaOH.
   2. Przygotuj pożywkę z dodatkiem AZP do wzrostu komórek i ekspresji mGluR2. Uzupełnij standardowe pożywki (+ FBS, długopis/paciorkowce, 15 mM HEPES) za pomocą roztworu podstawowego 40 mM AZP. Doprowadzić końcowe stężenie AZP do 0,6 mM. Dodać 1 M roztwór HEPES (dodano połowę objętości 40 mM roztworu podstawowego AZP). Na przykład, aby przygotować 10 ml pożywki z dodatkiem AZP, połącz 9,775 ml pożywki wzorcowej, 150 μl roztworu podstawowego 40 mM AZP i 75 μl 1 M roztworu HEPES.
   3. Przefiltrować (wysterylizować) pożywkę za pomocą filtra strzykawkowego (0,2 μm, PES).
   4. Przed transfekcją należy zastąpić standardowe nośniki nośnikami zawierającymi nośniki z dodatkiem AZP.
      UWAGA: Uważaj, aby nie wysuszyć komórek podczas wymiany nośnika.
   5. Przetransfekować ogniwa odczynnikiem do transfekcji (tabela materiałów) zgodnie z instrukcją producenta. Transfekować komórki HEK293T na szkiełku nakrywkowym o średnicy 18 mm, używając łącznie 2 μg DNA (1000 ng tRNA/syntetazy + 1000 ng plazmidu białkowego zawierającego bursztynowy kodon). Patrz Tabela 1, aby zapoznać się ze stężeniem i objętością użytych składników.
   6. Zmień pożywkę 24 godziny po transfekcji na świeżą pożywkę uzupełnioną AZP i pozwól komórkom rosnąć przez dodatkowe 24 godziny.
3. Etykietowanie barwnikami alkinowo-cyjaninowymi
   1. 20 minut przed etykietowaniem umyj szkiełka nakrywkowe ciepłym (37 °C) buforem zapisu (RB) (Plik uzupełniający 1) i przenieś je na ciepłe (37 °C) standardowe nośniki bez AZP (+ FBS, Pen/Strep, 15 mM HEPES).
   2. Przygotować roztwór do etykietowania zawierający Cy3-alkin, Cy5-alkin, BTTES, siarczan miedzi (II) (CuSO4), (+) L-askorbinian sodu i aminoguanidynę.
   3. Postępuj zgodnie z kolejnością tworzenia i dodawania rozwiązań (Tabela 2):
      1. Przygotuj 50 mM BTTES.
      2. Przygotować 100 mM aminoguanidyny.
      3. Przygotować 100 mM Na-askorbinianu.
      4. Przygotować 655,5 μl RB.
      5. Dodaj barwnik alkinowy Cy3/Cy5 (10 mM w DMSO) do RB.
         UWAGA: Dodaj aminoguanidynę do RB.
      6. Przygotować 20 mM CuSO_4.
      7. Wymieszaj CuSO4 i BTTES w nowej probówce (roztwór zmieni kolor na niebieski).
      8. Dodać mieszaninę CuSO4 i BTTES do RB (2.3.3.6.)
      9. Dodaj Na-askorbinian.
      10. Postępuj zgodnie z objętością podaną w tabeli 2 poniżej dla szkiełka nakrywkowego o grubości 18 mm.
   4. Dokładnie wymieszaj roztwór i inkubuj na lodzie i w ciemności przez 10 minut przed znakowaniem komórek.
   5. Przed dodaniem roztworu do etykietowania do szkiełek nakrywkowych należy usunąć podłoże i umyć je płynem RB. Dodać roztwór do etykietowania i inkubować przez 15 minut w temperaturze 37 °C w ciemnościach.
   6. UWAGA: Aby poprawić znakowanie, po 10 minutach dodaj glutaminian (stężenie końcowe ~0,5 mM) i inkubuj przez dodatkowe 5 minut. Miedź jest bardzo toksyczna dla komórek, a reakcja znakowania nie powinna trwać dłużej niż 15 minut in vivo. Przygotuj wszystkie składniki na świeżo. Na końcu dodaj Na-askorbinian. Podczas przygotowywania utrzymuj reakcję w temperaturze 4°C. Jednakże po dodaniu roztworu do etykietowania, komórki mają być przechowywane w temperaturze 37 °C wewnątrz inkubatora.
4. Pobieranie komórek i ekstrakcja białek (liza komórek)
   1. Usunąć roztwór do etykietowania i dwukrotnie przemyć szkiełko nakrywkowe (18 mm) zawierające transfekowane komórki mGluR2 za pomocą RB.
   2. Za pomocą pipety zmyj komórki z szkiełka nakrywkowego i ponownie zawieś w RB (1 ml).
      UWAGA: Po tym momencie zminimalizuj ekspozycję próbki na światło tak bardzo, jak to możliwe.
   3. Osadzać komórki, wirując w temperaturze 1 000 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut i usunąć supernatant. Zawiesić osad komórkowy w 80-130 μl roztworu do lizy.
      UWAGA: Osad komórkowy powinien być widoczny gołym okiem. Objętość lizy zależy od ilości próbki utraconej podczas procesu etykietowania i mycia.
   4. Delikatnie wymieszać pipetując, aby rozbić granulki. Zawiń w folię i umieść na bujaku w temperaturze 4 °C na 0,5-1 godzinę w celu lizy komórek.
   5. Frakcję nierozpuszczalną osadzać przez odwirowanie w temperaturze 20 000 x g i w temperaturze 4 °C przez 20 minut. Przenieść supernatant do świeżej zimnej probówki (lizowane białko, które zawiera fluorescencyjnie znakowane białko będące przedmiotem zainteresowania) i przechowywać go na lodzie do celów eksperymentalnych.

3. Montaż i funkcjonalizacja komory przepływu pojedynczej cząsteczki

1. Wyjmij szkiełko podstawowe i szkiełko nakrywkowe z zamrażarki i pozwól im się ogrzać w temperaturze RT w ciemności (~30 min).
2. Zmontuj komorę za pomocą taśmy dwustronnej, umieszczając paski taśmy dwustronnej między szkiełkiem a szkiełkiem nakrywkowym. Upewnij się, że powierzchnie PEGylowane tworzą wnętrze komory przepływowej.
3. Za pomocą końcówki do pipety dociśnij szkiełko nakrywkowe, aby upewnić się, że taśma całkowicie styka się zarówno ze szkiełkiem nakrywkowym, jak i szkiełkiem; należy uważać, aby nie naruszyć szkiełka nakrywkowego. Nałóż żywicę epoksydową na krawędzie szkiełek.
   UWAGA: Nie dodawaj tyle, aby żywica epoksydowa wypełniła wywiercone otwory.
4. Umieść komorę przepływową stroną szkiełka nakrywkowego skierowaną w dół w nawilżonym ciemnym pudełku, aby żywica epoksydowa wyschła (~ 30 min).
   UWAGA: Dodaj bufor T50 (plik uzupełniający 1) przez wywiercone otwory, aby zapobiec zakrywaniu otworów przez żywicę epoksydową (10-15 μl) w okresie schnięcia.
5. Inkubować każdy tor komory z 500 nM neutrawidyną (rozcieńczoną w T50), powoli nakładając ~40 μl na każdy pas.
6. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 minuty w nawilżonym ciemnym pudełku. Przemyć ~100 μL buforu T50 na pas.
7. Inkubować każdy tor komory z biotynylowanym przeciwciałem 20 nM¹¹. Wybór przeciwciała zależy od znacznika białka.
   UWAGA: Jeśli przeciwciało pierwszorzędowe nie jest biotynylowane, najpierw inkubuj z biotynylowanym przeciwciałem drugorzędowym przez 30 minut, a następnie inkubuj z przeciwciałem pierwszorzędowym.
8. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut w nawilżonym ciemnym pudełku. Umyć ~200 μL T50 na pas.
   UWAGA: Upewnij się, że pasy nigdy nie wysychają podczas procesu przygotowania.

4. jednocząsteczkowe

1. Bufor Trolox
   UWAGA: Bufor Trolox jest buforem wyjściowym do tworzenia bufora obrazowania. Składniki buforu są zależne od doświadczenia i mogą się różnić w zależności od białka będącego przedmiotem zainteresowania. Bufor stosowany w opisanym tutaj protokole zawiera sole (NaCl, KCl, CaCl₂, MgCl₂), środek buforujący (HEPES) i Trolox (pH ~7,35).
   1. Rozpuścić 9-10 mg leku Trolox w 10 ml jednocząsteczkowego buforu rejestrującego (SRB, plik uzupełniający 1)
      UWAGA: Trolox sprawia, że bufor jest lekko kwaśny. Dostosuj pH na tym etapie za pomocą roztworu wodorotlenku sodu (NaOH), 10 M (pH 7,35). Precyzyjna regulacja pH zostanie dokonana po całkowitym rozpuszczeniu leku Trolox; jednak zwiększenie pH w tym momencie zwiększa rozpuszczalność Troloxu.
   2. Mieszać roztwór w temperaturze pokojowej za pomocą stołowego kołyska przez 4-8 godzin (owiniętego folią aluminiową), aby całkowicie rozpuścić Trolox.
   3. Sprawdź pH i dostosuj w razie potrzeby.
   4. Upewnij się, że lek Trolox jest całkowicie rozpuszczony. Wysterylizować roztwór za pomocą filtra strzykawkowego i przechowywać w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Bufor należy zużyć po 2-10 dniach leżakowania. Trolox pomaga tłumić mruganie i jest powszechnie stosowany w badaniach nad pojedynczymi cząsteczkami¹⁷. Właściwości zapobiegające mruganiu pochodzą z utlenionej pochodnej Trolox¹⁸; dlatego zaleca się trzymanie go w temperaturze pokojowej przez co najmniej kilka godzin, aby dojrzał. Dodatkowo, promieniowanie UV świeżego roztworu Trolox przyspiesza proces utleniania i może być wykorzystane do przyspieszenia "starzenia" Trolox buffer¹⁸.
2. Receptura bufora do obrazowania: Wymieszaj bufor Trolox + detergent (~2-krotność wartości CMC detergentu) + 4 mM kwas protokatechowy (PCA).
   UWAGA: Stężenie detergentu jest utrzymywane w pobliżu CMC, ponieważ wysokie stężenia detergentu mogą powodować zwiększoną denaturację białek. Na przykład można użyć następującej mieszaniny: 955 μL Trolox + 5 μL 10% DDM + cholesterol (W%, 10:1) + 40 μL 100 mM roztworu podstawowego PCA. W tym przypadku PCA działa jako środek przeciwutleniający i był wcześniej stosowany w badaniach smFRET¹⁹. DDM jest niejonowy, jest powszechnie stosowany do rozpuszczania białek błonowych^20,21 i był stosowany w badaniach pojedynczych cząsteczek. DDM to dobry detergent pierwszego wyboru; Zalecamy jednak przetestowanie wielu detergentów i upewnienie się, że wyniki są spójne.

5. Konfiguracja mikroskopu i akwizycja danych smFRET

1. Włącz komputer i mikroskop. Włącz lasery, aby się rozgrzały (532 nm dla wzbudzenia Cy3 i 640 nm dla wzbudzenia Cy5).
   UWAGA: W tym przypadku użyto odwróconego mikroskopu wyposażonego w obiektyw TIRF 100x (N.A. 1.49), rozdzielacz obrazu i kamerę EMCCD. Zestaw jest wyposażony w czteroliniowy sumator laserowy, lustro dichroiczne, filtr emisyjny długiego przejścia, filtr dichroiczny emisyjny i filtr wycinający.
2. Włącz kamerę EMCCD i otwórz oprogramowanie aparatu. Odczekaj 20 minut, aż kamera osiągnie temperaturę -69 °C i ustabilizuje się.
3. Zamontuj komorę na próbkę na stoliku mikroskopu. Dodawaj próbkę białka stopniowo, aby uzyskać ~400 cząsteczek na pole widzenia (krok 2.4.5). Przemyć komorę 100 μl buforu do obrazowania.
4. Dostosuj wzmocnienie, szybkość akwizycji i moce lasera tak, aby sygnały fluorescencji pojedynczej cząsteczki były wykrywane zarówno w kanale donorowym, jak i akceptorowym. W razie potrzeby dostosować stężenie białek w komorze na próbkę.
   UWAGA: Przy ponad 400 cząsteczkach w polu widzenia rozróżnienie poszczególnych cząsteczek staje się trudniejsze, a szum tła będzie wyższy.
5. Pobudź dawcę i uzyskaj ślady czasowe, aż co najmniej 80% cząsteczek donora w polu widzenia zostanie fotowybielonych.
6. Pod koniec filmu włącz laser 640 nm, aby bezpośrednio wzbudzić akceptor, aż niektóre cząsteczki akceptora wytryśnieją, ułatwiając dyskryminację pojedynczej cząsteczki z multimerów.
7. Przejdź do innego pola widzenia i powtórz powyższe kroki, aby zebrać co najmniej trzy filmy (repliki techniczne) dla każdego warunku.
   UWAGA: Użyj najniższej możliwej mocy lasera podczas wybierania nowego obszaru zainteresowania (ROI) i ustawiania ostrości, aby zminimalizować fotowybielanie. Zwróć uwagę na dryf etapu podczas akwizycji. Jeśli po przejściu do nowego zwrotu z inwestycji zostanie zaobserwowany zauważalny dryf, odczekaj 3 minuty przed rozpoczęciem akwizycji.

6. Analiza danych

1. Wyrównanie kanału dawcy i akceptora (mapowanie filmu)
   1. Zapisz obrazy kulek fluorescencyjnych w kanałach dawczych i akceptorowych.
   2. Wygeneruj plik mapowania, korzystając z danych o kulkach, aby skorelować fluorescencję donora i akceptora z każdej cząsteczki^22,23.
      UWAGA: Sygnał emisyjny z pojedynczej cząsteczki jest dzielony na sygnały donorowe i akceptorowe przez dichroiczny filtr emisyjny wewnątrz rozdzielacza obrazu. Obrazy dawcy i akceptora są wyświetlane w kamerze obok siebie. Aby dokładnie powiązać intensywność donora i akceptora pojedynczej cząsteczki między tymi dwoma obszarami, często generowany jest plik mapowania przy użyciu próbek kulek fluorescencyjnych. Za pomocą tego pliku mapowania wszystkie cząsteczki wykryte w kanałach donorowym i akceptorowym są mapowane na siebie. Następnie analiza generuje ślady czasowe, które są intensywnościami donora i akceptora w czasie, dla każdej cząsteczki.
2. Wybór jednocząsteczkowych śladów FRET (zbieranie cząstek)
   UWAGA: Poszczególne ślady cząstek są badane i wybierane do dalszej analizy za pomocą MATLAB. Dokładne kryteria wyboru zależą od systemu. Ogólne wytyczne dotyczące tego, co stanowi cząstkę wysokiej jakości, są przedstawione tutaj. Wszystkie niestandardowe zmodyfikowane kody są dostępne w serwisie GitHub (https://github.com/vafabakhsh-lab).
   1. Wybrać ślady, w których całkowita intensywność śladów (dawca + akceptor) jest stabilna w czasie. Wybrać ślady z antyskorelowanymi zmianami intensywności dawców i akceptorów.
   2. Wybierz cząsteczki dawcy i akceptora, które wykazują jednoetapowe fotowybielanie. Zaznacz ślady o długości >5 s.
      UWAGA: Tło w każdym kanale po wybieleniu powinno spaść do zera. Ślady nie powinny mieć wielu mrugających zdarzeń; Zwiększy to trudność analizy.
   3. Oblicz wydajność FRET za pomocą równania E = (I_A− 0,088 × I_D)/(I_D + [I_A− 0,088 × I_D])^24,25,26, gdzie I_D i_{I A} to odpowiednio surowe intensywności dawcy i akceptora.
      UWAGA: Wyciek emisji donorowej do kanału akceptora określa się za pomocą próbki znakowanej tylko przez donor wzbudzonej za pomocą lasera 532 nm ²⁶. Współczynnik korekcji wycieku, 0,088, może się różnić dla różnych konfiguracji w zależności od zastosowanych zestawów filtrów. Ważne jest, aby zauważyć, że ilościowa i solidna konwersja wydajności FRET na odległości bezwzględne wymaga korekty intensywności donora i akceptora dla wielu czynników i została szeroko omówiona wcześniej²⁷.
3. Zidentyfikuj stan konformacyjny za pomocą ukrytego modelowania Markowa (HMM)
   1. Uruchamiamy program vbFRET²⁸ w MATLABie i importujemy wybrane ślady dla danego warunku. Ustaw ograniczenia dotyczące liczby potencjalnych stanów i iteracji do wykonania.
      UWAGA: Na podstawie surowych danych z reprezentatywnych wyników postawiono hipotezę, że czujnik konformacyjny zajmował do czterech dyskretnych stanów FRET; W ten sposób wyznaczono zakres od jednego do czterech stanów. Wcześniej stwierdzono, że poprawa dopasowania nieznacznie wzrasta wraz z iteracjami >25; W związku z tym do dopasowania reprezentatywnych danych wykorzystano 25 iteracji.
   2. Przeanalizuj ślady smFRET i wyeksportuj wyidealizowane ślady oraz sesję analizy. Zapisz wyidealizowane ślady w osobnym folderze do dalszej analizy.
      UWAGA: Programy używane do wyodrębniania danych o przejściach stanów i czasie przebywania z wyidealizowanych śladów zostały udostępnione we wcześniej opublikowanych work²⁹.
   3. Korzystając z programów MATLAB, wyodrębnij przejścia stanów i wykreśl je jako mapę cieplną ze współrzędną X wskazującą konformację początkową i współrzędną Y wskazującą konformację końcową.
      UWAGA: Przejścia definiuje się jako zmiany wartości FRET >0,1 w omówionych tutaj reprezentatywnych wynikach. Próg przejść zależy od hipotetycznych stanów konformacyjnych, w których znajduje się białko będące przedmiotem zainteresowania (należy ustawić próg przejścia na wartość mniejszą niż różnica między najbliższymi stanami FRET), a także od rozdzielczości dozwolonej przez układ eksperymentalny. Badanie map cieplnych dla wielu warunków umożliwia identyfikację najczęstszych stanów konformacyjnych, przez które przechodzi czujnik, a tym samym je zajmuje. Dla reprezentatywnych wyników zidentyfikowano cztery stany FRET (FRET = 0,31, 0,51, 0,71 i 0,89).
   4. Korzystając z programów MATLAB, wyodrębnij czasy przebywania dla każdego zidentyfikowanego stanu konformacyjnego. Wyznacz zakres wartości FRET wyznaczających każdy stan i rozdzielczość czasową podczas pozyskiwania danych. Zakresy FRET są równomiernie podzielone przez sąsiednie stany FRET. Eksport czasów przebywania dla danych warunków leczenia.
      UWAGA: W większości przypadków dane dotyczące czasu przebywania można dobrze oszacować za pomocą pojedynczej funkcji rozkładu wykładniczego. Analizę tę można przeprowadzić w oprogramowaniu do analizy danych i tworzenia wykresów.
4. Dopasowanie Gaussa histogramów populacji smFRET w celu ilościowego określenia obłożenia stanu
   1. Importuj histogramy FRET populacji dla interesujących warunków do analizy danych i oprogramowania do tworzenia wykresów w celu analizy dopasowania wielu pików.
   2. Wskaż liczbę obecnych pików (cztery piki lub stany na podstawie analizy HMM). Dopasowanie zostało przeprowadzone przy użyciu wielu rozkładów Gaussa³⁰ zdefiniowany jako , gdzie A to obszar piku, xc to środek szczytu, a w to szerokość piku dla każdego piku.
   3. Ogranicz parametry dopasowania jako A > 0, xc = FRET ± 0,02 i 0,1 ≤w≤ 0,24. Cztery piki FRET dla histogramów FRET dla poszczególnych populacji były dopasowane jednocześnie. Zastosuj zdefiniowane wiązania dla łączników we wszystkich warunkach.
   4. Oblicz stan zajętości (w procentach) jako obszar szczytu zainteresowania podzielony przez powierzchnię całkowitą, zdefiniowaną jako suma wszystkich szczytów.

Ekspresja i fluorescencyjne znakowanie czujnika FRET opartego na UAA
W niniejszym artykule omówiono przykładowe wyniki insercji i znakowania fluorescencyjnego UAA (AZP) w CRD mGluR2 (548UAA) 11. Jak wspomniano wcześniej, aby wstawić AZP do mGluR2, konieczna jest koekspresja zaprojektowanej maszynerii translacyjnej, która obejmuje zmodyfikowaną syntetazę tRNA i komplementarne tRNA (pIRE4-Azi) oraz mGluR2 zawierającą bursztynowy kodon w pozycji 548, utworzony przy użyciu mutagenezy (Rysunek 2A,B). Znakowanie AZP barwnikami cyjaninowymi uzyskuje się w reakcji cykloaddycji katalizowanej miedzią ( Rysunek 2C) i powoduje skuteczne znakowanie błony plazmatycznej 548UAA ( Rysunek 2D). Aby zweryfikować translację 548UAA o pełnej długości i integralność receptora dimerycznego, przeprowadzono elektroforezę SDS-PAGE na lizacie komórkowym z HEK293T komórek wykazujących ekspresję 548UAA znakowanych Cy5. Zaobserwowano pojedyncze pasmo o mocy 250 kDa, które zbiegło się z dimerykiem mGluR2 o pełnej długości (Rysunek 2E).

Akwizycja i analiza danych
Komórki wykazujące ekspresję 548UAA z C-końcowym znacznikiem FLAG znakowano Cy3 (donor) i Cy5 (akceptor), a następnie poddano lizie detergentem31 w obecności inhibitora proteazy do badania in vitro. Po zakończeniu lizy komórek i usunięciu nierozpuszczalnej frakcji przez odwirowanie, supernatant nałożono na pasywowany glikolem polietylenowym (PEG) szkiełko nakrywkowe funkcjonalizowane przeciwciałem anty-FLAG-tag do obrazowania całkowitej fluorescencji wewnętrznego odbicia (TIRF) (Rysunek 3). Próbka została oświetlona za pomocą lasera o długości fali 532 nm, a cząstki zostały wybrane do dalszej analizy za pomocą oprogramowania smCamera. Surowe ślady donora, akceptora i FRET wygenerowano dla wszystkich wybranych cząsteczek w smCamera i wybrano za pomocą MATLAB (sekcja 6; Rysunek 4). Do intensywności akceptorów zastosowano 8,8% korektę krwawienia dawcy dla zastosowanej tutaj konfiguracji eksperymentalnej. Ten współczynnik korekcyjny będzie się różnił w zależności od konfiguracji eksperymentalnej, zastosowanych filtrów dichroicznych i filtrów emisyjnych i powinien być określony poprzez pomiar sygnałów donorowych i akceptorowych w standardowych warunkach eksperymentalnych przy użyciu komórek znakowanych tylko fluoroforem donorowym i obliczenie krwawienia ([intensywność akceptora]/[intensywność dawcy]). Rysunek 4 pokazuje kilka reprezentatywnych ścieżek FRET i odpowiadające im sygnały donorowe i akceptorowe. Ślady te zostały wybrane przy użyciu kryteriów opisanych wcześniej w protokole (sekcja 6). Reprezentatywne wybrane ślady, które pokazują przejścia między wieloma stanami oraz zdarzeniami bielenia dawcy i akceptora, są pokazane w Rysunek 4B-D.

Identyfikacja stanów konformacyjnych
W celu zidentyfikowania stanów konformacyjnych zajmowanych przez 548UAA oraz relacji tych stanów względem siebie, przeprowadzono analizę modelowania Ukrytego Markowa (HMM). Analizę HMM przeprowadzono za pomocą programu vbFRET wykonanego na MATLAB28 (Rysunek 5A). Rysunek 5 wykorzystuje dane z pośredniego stężenia glutaminianu (5μM) do zilustrowania procesu identyfikacji stanu. Na podstawie surowych śladów smFRET postawiono hipotezę, że dla CRD istnieją do czterech potencjalnych stanów FRET. W ten sposób liczba stanów została ograniczona do jednego do czterech. Ogólnie rzecz biorąc, przeprowadzono 25 iteracji dopasowania dla każdej ścieżki, aby określić liczbę obecnych stanów. Z tych wyidealizowanych dopasowań można wyodrębnić przejścia między dyskretnymi stanami FRET i wykreślić je jako mapę cieplną gęstości przejścia (Rysunek 5B). Mapa cieplna przedstawia cztery dyskretne stany FRET o wartościach 0,31, 0,51, 0,71 i 0,89, oznaczone liniami przerywanymi. Przejścia zdefiniowano jako zmiany w FRET >0,1. Wyidealizowane ślady FRET dostarczają również informacji o czasie przebywania dla każdej zidentyfikowanej konformacji (Rysunek 5C).

Generowanie histogramu FRET populacji i dopasowanie szczytu
Reprezentatywne ślady pojedynczych cząsteczek dla 548UAA w obecności różnych stężeń glutaminianu, które zostały ręcznie wybrane do dalszej analizy, pokazano w Rysunek 6A,B. Ogólna analiza eksperymentów smFRET polega na wygenerowaniu histogramów populacji z setek śladów smFRET dla każdego warunku eksperymentalnego (Rysunek 6C). Histogramy populacji FRET są tworzone z segmentu śladów przed bieleniem. Aby uniknąć stronniczości histogramu w kierunku zachowania dłuższych śladów, konieczne jest wygenerowanie znormalizowanego histogramu FRET z każdego śladu przed uśrednieniem. Dzięki temu każdy ślad ma równy udział w końcowym histogramie. W tym systemie histogramy FRET wykazują ogólne przesunięcie w kierunku wyższego FRET wraz ze wzrostem stężenia glutaminianu, co wskazuje na zmniejszenie odległości między CRD i przesunięcie w kierunku aktywnej konformacji. Jednak niezależnie od stężenia glutaminianu, sygnał FRET pozostaje dość sporadyczny, co wskazuje na wysoki stopień wewnętrznej dynamiki CRD. Oprócz ogólnego przesunięcia w kierunku wyższego FRET, redystrybucja zespołu konformacyjnego staje się widoczna na histogramie (krzywe kolorów). Pojedyncze cząsteczki można również zobaczyć odwiedzające te stany konformacyjne (linie przerywane) (Rysunek 6B). Aby określić prawdopodobieństwo zajęcia przez stan, należy podzielić obszar piku przez obszar całkowity, zdefiniowany jako suma wszystkich czterech pojedynczych obszarów szczytu. Histogram smFRET wygenerowany w eksperymencie smFRET CRD mGluR2 wykazywał cztery stany dynamiczne z pikami odpowiednio na poziomie 0,31, 0,51, 0,71 i 0,89 (oznaczone w stanach 1-4).

Rysunek 1: Schemat blokowy protokołu roboczego i analizy danych. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Specyficzne dla miejsca oznaczanie mGluR2 za pomocą chemii kliknięć. (A) Schemat procesu inkorporacji nienaturalnego aminokwasu 4-azydo-L-fenyloalaniny w komórkach. (B) Schemat przedstawiający specyficzne dla miejsca znakowanie fluorescencyjne mGluR2, z nienaturalnym aminokwasem w pozycji 548, w katalizowanej miedzią reakcji klikania azydkowo-alkinowego. (C) Trójwymiarowa struktura znakowanego fluorescencyjnie mGluR2 (cząsteczka donorowa na zielono, cząsteczka akceptorowa na czerwono) z zadokowanymi cząsteczkami Cy3 i Cy5. (D) Reprezentatywny obraz mikroskopu konfokalnego komórek HEK293T eksprymujących 548UAA z populacją powierzchni komórek znakowaną fluoroforami donorowymi (zielony: Cy3) i akceptorowymi (czerwony: Cy5) za pomocą chemii kliknięć. Podziałka = 10 μm. (E) Obraz nieredukcyjnej elektroforezy w żelu poliakrylamidowym 4%-20% lizatu komórkowego z komórek HEK293T eksprymujących 548UAA i znakowanych Cy5-alkinem. Żel jest obrazowany za pomocą długości fali wzbudzenia 633 nm i filtra emisyjnego 670-BP30-Lane a: drabinka białkowa; Pas B: lizat komórkowy; Pas c: Barwnik Cy5-alkinowy. Wyniki są reprezentatywne dla pojedynczego eksperymentu. Panele B, D i E są ponownie używane z Liauw et al.11. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Schematyczne przedstawienie eksperymentów smFRET i konfiguracji mikroskopu (TIRF). Obraz fluorescencji pojedynczej cząsteczki dawcy jest pokazany na zielono (podziałka = 1000 nm), a akceptora na czerwono. Dawca został wzbudzony przy długości fali 532 nm za pomocą lasera. Akceptor jest podekscytowany FRET od dawcy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Ślady intensywności dawcy (zielony) i akceptora (czerwony) oznaczone jako mGluR2. (A) Rysunek przedstawiający dynamikę receptora i zmianę odległości między sondami FRET. (B) Długotrwały stan wysokiego FRET. (C) Wiele stanów FRET z najpierw fotowybielaniem akceptorowym, a następnie fotowybielaniem dawcy. (D) Krótkotrwały stan FRET z fotowybielaniem akceptorowym. (E) Długożyciowy stabilny stan FRET z akceptorowym fotowybielaniem. Ten rysunek jest odtworzony z minimalnymi modyfikacjami przez Liauw et al.11. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Identyfikacja stanu konformacyjnego. (A) Reprezentatywny ślad FRET z nałożonym idealizowanym dopasowaniem (czerwony) wraz z odpowiednim sygnałem donorowym i akceptorowym. (B) Mapa cieplna gęstości przejścia przedstawiająca najczęstsze przejścia konformacyjne zachodzące w 548UAA. Linie przerywane wskazują stany FRET. (C) Średni czas przebywania dla każdego stanu konformacyjnego. Ten rysunek jest odtworzony z minimalną modyfikacją przez Liauw et al.11. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6: Jednocząsteczkowy FRET ujawnia cztery stany konformacyjne mGluR2 CRD. (A) Reprezentatywna klatka z filmu o pojedynczej cząsteczce z kanałem donorowym (Cy3) po lewej i kanałem akceptorowym (Cy5) po prawej. Cząsteczki wybrane przez oprogramowanie analityczne do dalszego przetwarzania są oznaczone zielonymi kółkami. Pasek skali = 3 μm. (B) Przykładowe ślady czasowe pojedynczej cząsteczki 548UAA przy różnych stężeniach glutaminianu. Pokazane są intensywności dawcy (zielony) i akceptora (czerwony) oraz odpowiadający im FRET (niebieski). Linie przerywane reprezentują cztery różne stany FRET. (C) histogramy populacji smFRET w zakresie stężeń glutaminianu. Dane reprezentują średnią ± SEM. wynoszącą N = 3 niezależne eksperymenty. Ten rysunek jest odtworzony z minimalną modyfikacją przez Liauw et al.11. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 7: Podsumowanie całego protokołu. (A) Proces uprawy i znakowania komórek wyrażających białko zawierające nienaturalny aminokwas. (B) Przepływ pracy eksperymentalnej i analitycznej pojedynczej cząsteczki FRET stosowany do identyfikacji stanów konformacyjnych i charakteryzowania właściwości dynamicznych domeny CRD w mGluR2. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela 1: Odczynniki do transfekcji limfocytu T HEK 293.

Tabela 2: Skład roztworu do etykietowania (kliknij chemię).

Plik uzupełniający 1: Skład różnych użytych w tym badaniu. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.