Artykuł metodologiczny

Wizualizacja dynamiki konformacyjnej receptorów błonowych za pomocą jednocząsteczkowego FRET

3.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64254

⸱

17 sierpnia 2022

 ,  , 
1Department of Molecular Biosciences, Northwestern University

W tym artykule

Podsumowanie

To badanie przedstawia szczegółową procedurę przeprowadzania eksperymentów z transferem energii rezonansu fluorescencji pojedynczej cząsteczki (smFRET) na receptorach sprzężonych z białkiem G (GPCR) przy użyciu znakowania specyficznego dla miejsca poprzez inkorporację nienaturalnych aminokwasów (UAA). Protokół zawiera przewodnik krok po kroku dotyczący przygotowania próbek, eksperymentów i analizy danych smFRET.

Streszczenie

Zdolność komórek do reagowania na sygnały zewnętrzne jest niezbędna dla rozwoju, wzrostu i przetrwania komórek. Aby zareagować na sygnał z otoczenia, komórka musi być w stanie go rozpoznać i przetworzyć. Zadanie to opiera się głównie na funkcji receptorów błonowych, których rolą jest przekształcanie sygnałów w język biochemiczny komórki. Receptory sprzężone z białkiem G (GPCR) stanowią największą rodzinę białek receptorów błonowych u ludzi. Wśród GPCR metabotropowe receptory glutaminianu (mGluR) są unikalną podklasą, która działa jako obligatoryjne dimery i posiada dużą domenę zewnątrzkomórkową, która zawiera miejsce wiązania ligandu. Niedawne postępy w badaniach strukturalnych mGluR pozwoliły lepiej zrozumieć proces ich aktywacji. Jednak propagacja wielkoskalowych zmian konformacyjnych przez mGluRs podczas aktywacji i modulacji jest słabo poznana. Transfer energii rezonansu fluorescencji pojedynczej cząsteczki (smFRET) jest potężną techniką wizualizacji i ilościowego określania dynamiki strukturalnej biomolekuł na poziomie pojedynczego białka. Aby zobrazować dynamiczny proces aktywacji mGluR2, opracowano fluorescencyjne czujniki konformacyjne oparte na inkorporacji nienaturalnych aminokwasów (UAA), które umożliwiły znakowanie białek specyficznych dla miejsca bez zaburzeń natywnej struktury receptorów. Opisany tutaj protokół wyjaśnia, jak przeprowadzać te eksperymenty, w tym nowatorskie podejście do etykietowania UAA, przygotowanie próbki oraz pozyskiwanie i analizę danych smFRET. Strategie te można uogólnić i rozszerzyć w celu zbadania dynamiki konformacyjnej różnych białek błonowych.

Wprowadzenie

Transfer informacji przez błonę plazmatyczną jest silnie zależny od funkcji receptorów błonowych1. Wiązanie liganda z receptorem prowadzi do zmiany konformacyjnej i aktywacji receptora. Proces ten ma często charakter allosteryczny2. Liczące ponad 800 członków receptory sprzężone z białkiem G (GPCR) są największą rodziną receptorów błonowych u ludzi3. Ze względu na ich rolę w prawie wszystkich procesach komórkowych, GPCR stały się ważnymi celami rozwoju terapeutycznego. W kanonicznym modelu sygnalizacji GPCR aktywacja agonistyczną powoduje zmiany konformacyjne receptora, które następnie aktywują heterotrimeryczny kompleks białka G poprzez wymianę GDP na GTP w kieszeni wiążącej nukleotydyα G. Aktywowane podjednostki Gα-GTP i Gβγ kontrolują następnie aktywność dalszych białek efektorowych i propagują kaskadę sygnalizacyjną4,5. Ten proces sygnalizacji zasadniczo zależy od zdolności ligandów do zmiany trójwymiarowego kształtu receptora. Mechanistyczne zrozumienie, w jaki sposób ligandy to osiągają, ma kluczowe znaczenie dla opracowywania nowych terapii oraz projektowania syntetycznych receptorów i czujników.

Metabotropowe receptory glutaminianu (mGluRs) należą do rodziny GPCR klasy C i są ważne dla powolnego neuromodulacyjnego działania glutaminianu i dostrajania pobudliwości neuronalnej6,7. Spośród wszystkich GPCR, GPCR klasy C są strukturalnie unikalne, ponieważ działają jako obligatoryjne dimery. mGluRs zawierają trzy domeny strukturalne: domenę muchołówki (VFT), domenę bogatą w cysteinę (CRD) i domenę transbłonową (TMD)8. Zmiany konformacyjne podczas procesu aktywacji są złożone i obejmują lokalne i globalne sprzężenie konformacyjne, które rozchodzą się na odległość 12 nm, a także kooperatywność dimerów. Pośrednie konformacje, czasowy porządek stanów i tempo przejścia między stanami są nieznane. Śledząc konformację poszczególnych receptorów w czasie rzeczywistym, możliwe jest zidentyfikowanie przejściowych stanów pośrednich i sekwencji zmian konformacyjnych podczas aktywacji. Można to osiągnąć, stosując transfer energii rezonansu fluorescencji pojedynczej cząsteczki9,10 (smFRET), tak jak zostało to ostatnio zastosowane do wizualizacji propagacji zmian konformacyjnych podczas aktywacji mGluR211. Kluczowym krokiem w eksperymentach FRET jest wygenerowanie czujników FRET poprzez specyficzną dla miejsca insercję fluoroforów donorowych i akceptorowych do białka będącego przedmiotem zainteresowania. Przyjęto strategię inkorporacji nienaturalnych aminokwasów (UAA)12,13,14,15 w celu przezwyciężenia ograniczeń typowych technologii znakowania fluorescencyjnego specyficznych dla danego miejsca, które wymagają stworzenia mutantów bez cysteiny lub wprowadzenia dużego znacznika zakodowanego genetycznie. Pozwoliło to na zaobserwowanie konformacyjnego przegrupowania niezbędnego kompaktowego łącznika allosterycznego, który połączył domeny wiążące ligandy i sygnalizacyjne mGluR2. W tym protokole przedstawiono przewodnik krok po kroku dotyczący przeprowadzania eksperymentów smFRET na mGluR2, w tym podejście do specyficznego dla miejsca znakowania mGluR2 za pomocą UAA w celu przyłączenia fluoroforów za pomocą katalizowanej miedzią reakcji cyklizacji azydku. Ponadto protokół ten opisuje metodologię bezpośredniego wychwytywania białek błonowych i analizy danych. Przedstawiony tutaj protokół ma również zastosowanie do badania dynamiki konformacyjnej innych białek błonowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Ogólny przebieg protokołu przedstawiono na Rysunku 1.

1. Przygotowanie komory próbkowej

  1. Czyszczenie szkiełek i szkiełek nakrywkowych
    UWAGA: Kroki te mają na celu oczyszczenie powierzchni szkiełek oraz szkiełek nakrywkowych i przygotowanie ich do aminosylanizacji. Krytycznym wymogiem przy przeprowadzaniu eksperymentów fluorescencji pojedynczych cząsteczek na cząsteczkach przytwierdzonych do powierzchni jest pasywacja powierzchni. Najbardziej niezawodną i powtarzalną techniką pasywacji jest kowalencyjne przytwierdzenie do powierzchni szkła inertych łańcuchów polimerowych w formie gęstej warstwy. Glikol polietylenowy (PEG) jest najskuteczniejszym polimerem stosowanym do pasywacji powierzchni16. Szczegóły procedury pasywacji z użyciem PEG (PEGylacja) opisano poniżej:
    1. Zaznaczyć markerem miejsca do wywiercenia otworów na szkiełkach (~6 mm od siebie i w pewnej odległości od krawędzi). Użyć narzędzia Dremel do wywiercenia małych otworów (średnica 1 mm) w szkiełku przedmiotowym. Podczas wiercenia zanurzyć szkiełka w wodzie.
    2. Przemyć szkiełka acetonem, aby usunąć pozostałości tuszu z markera.
    3. Wyjąć z acetonu, opłukać szkiełka wodą, a następnie poddać mikrofalowaniu przez 5 min w wodzie przy wysokiej mocy (70 W).
    4. Oczyścić szkiełka wodą przed umieszczeniem ich w szklanym słoiku do barwienia w celu sonikacji. Umieścić szkiełka nakrywkowe w osobnym słoiku.
    5. Sonicować szkiełka i szkiełka nakrywkowe w acetonie przez 30 min w myjce ultradźwiękowej w temperaturze 23 °C.
    6. W międzyczasie oczyścić kolbę szklaną służącą do przygotowania roztworu do aminosylanizacji używanego w następnym kroku. Napełnić kolbę 1 M KOH, sonicować kolbę przez 30 min, dokładnie wypłukać KOH wodą, a następnie sonicować przez kolejne 30 min w metanolu. Pozostawić kolbę w metanolu do momentu etapu aminosylanizacji.
    7. W międzyczasie wyjąć aminosilan, mPEG i biotynowany PEG z zamrażarki (−20 °C) i pozwolić im osiągnąć temperaturę pokojową (RT) w ciemności.
    8. Wylać aceton ze słoików ze szkiełkami i szkiełkami nakrywkowymi do odpowiedniego pojemnika na odpady chemiczne, dokładnie opłukać wodą, a następnie sonicować szkiełka w 5 M KOH przez 30 min.
    9. Opłukać szkiełka i szkiełka nakrywkowe wodą, a następnie sonicować w metanolu przez 2 min (powtórzyć dwukrotnie). Pozostawić słoiki wypełnione metanolem aż do etapu aminosylanizacji.
      UWAGA: W niniejszym badaniu stosowano wodę dejonizowaną, chyba że zaznaczono inaczej. Użyto myjki ultradźwiękowej pracującej w temperaturze 23 °C.
  2. Aminosylanizacja
    UWAGA: Ten etap ma na celu kowalencyjne powiązanie aminosilanu z czystą powierzchnią szkiełka i szkiełka nakrywkowego. Funkcjonalizowane mPEG i biotynowany PEG zwiążą się kowalencyjnie z tą powierzchnią w następnym kroku.
    1. Przygotować mieszaninę do aminosylanizacji w czystej kolbie (krok 1.6). Roztwór przygotować poprzez zmieszanie metanolu (150 mL), kwasu octowego (7,5 mL, użyć pipety szklanej) i aminosilanu (2,5 mL).
    2. Delikatnie zmieszać roztwór w dygestorium, a następnie wlać go do słoików ze szkiełkami i szkiełkami nakrywkowymi. Użyć 50 mL dla szkiełek nakrywkowych i 100 mL dla szkiełek przedmiotowych. Upewnić się, że szkiełka i szkiełka nakrywkowe są całkowicie zanurzone w roztworze.
    3. Inkubować przez 10 min, następnie sonicować słoiki przez 1 min (sonikacja usuwa zanieczyszczenia z powierzchni), a potem inkubować przez kolejne 10 min.
    4. Wylać roztwór do aminosylanizacji do pojemnika na odpady. Dodać metanol do słoików, zamknąć je pokrywkami i delikatnie wstrząsnąć ręcznie. Wylać metanol i napełnić słoiki wodą.
    5. Zwrócić butelkę z aminosilanem do zamrażarki (−20 °C).
  3. PEGylacja
    UWAGA: Te kroki opisują procedurę PEGylacji.
    1. Podczas aminosylanizacji przygotować bufor do PEGylacji. Odważyć 84 mg wodorowęglanu sodu (NaHCO3) i dodać go do 10 mL wody (10 mM). Dodatkowo odważyć mPEG i biotynowany PEG i odstawić je na bok. Dla sześciu szkiełek i szkiełek nakrywkowych użyć 96 mg mPEG i 1,2-2,4 mg biotynowanego PEG.
      UWAGA: Ważne jest, aby nie dodawać zbyt dużo biotynowanego PEG, ponieważ może to zwiększyć liczbę plamek w tle. Nie rozpuszczać mieszaniny PEG aż do momentu bezpośrednio przed nałożeniem na szkiełka.
    2. Opłukać szkiełka wodą, wysuszyć je delikatnym strumieniem powietrza, a następnie umieścić w nawilżanych pudełkach montażowych.
      UWAGA: Niezbędne jest użycie czystego przewodu powietrznego. Unikać stosowania sprężonego powietrza w sprayu, które może pozostawiać osady na szkle.
    3. Dodać bufor do PEGylacji do mieszaniny proszku PEG i delikatnie kilkakrotnie pipetować w górę i w dół, aby rozpuścić substancję. Dodać 5 µL buforu do PEGylacji na jedno szkiełko (dla sześciu szkiełek dodać 330 µL buforu).
    4. Wirować przy 9 60 x g przez 1 min w temperaturze 23 °C, aby wytrącić nierozpuszczone cząstki. Zebrać nadsącz do wykorzystania w następnym kroku.
      UWAGA: Biotynowany PEG szybko ulega hydrolizie ze względu na obecność grupy NHS. Ważne jest, aby szybko przeprowadzić etapy mieszania i wirowania.
    5. Nałożyć 60 µL roztworu do PEGylacji na każde szkiełko, a następnie nałożyć na wierzch szkiełko nakrywkowe tak, aby roztwór do PEGylacji znalazł się pomiędzy szkiełkiem przedmiotowym a nakrywkowym.
      UWAGA: Unikać wprowadzania pęcherzyków powietrza między szkiełko a szkiełko nakrywkowe, ponieważ zmniejszy to wydajność pasywacji. Usunąć pęcherzyki, korygując położenie szkiełka nakrywkowego i przedmiotowego za pomocą końcówki pipety.
    6. Umieścić szkiełka w szufladzie, która jest płaska i ciemna. Szkiełka można przechowywać przez noc; jednak inkubacja przez 4-6 h zapewnia optymalną pasywację.
      UWAGA: Należy pamiętać, która strona została poddana PEGylacji.
    7. Oznaczyć stronę niepoddaną PEGylacji przed przechowywaniem. Po inkubacji delikatnie rozdzielić i dokładnie opłukać szkiełka i szkiełka nakrywkowe wodą.
    8. Wysuszyć szkiełka i szkiełka nakrywkowe, wydmuchując powietrze. Przechowywać szkiełka i szkiełka nakrywkowe w sterylnej probówce (50 mL), powierzchniami poddanymi PEGylacji skierowanymi od siebie. Przechowywać w temperaturze −20 °C do dnia eksperymentu.
      UWAGA: Najlepiej użyć szkiełek i szkiełek nakrywkowych w ciągu 4 tygodni od przygotowania. Powierzchnie poddane PEGylacji powinny być skierowane od siebie. Przechowywanie PEGylowanych szkiełek i szkiełek nakrywkowych w woreczkach próżniowych może zwiększyć ich czas przydatności.

2. Ekspresja mGluR2 z wbudowanym nienaturalnym aminokwasem, znakowanie fluorescencyjne i ekstrakcja

UWAGA: Niniejszy protokół opisuje przygotowanie, odczynniki oraz traktowanie komórek w celu ekspresji mGluR2 zawierającego nienaturalny aminokwas (UAA) 4-azydol-L-fenyloalaninę (AZP). Procedura dotyczy komórek HEK293T hodowanych na szklanych zakryciach o średnicy 18 mm. Procedurę można skalować w zależności od potrzeb.

  1. Sianie komórek
    UWAGA: Komórki HEK293T należy hodować w pożywce DMEM uzupełnionej o 10% (v/v) płodowej surowicy bydlęcej, 10 jednostek·mL−1 penicyliny i streptomycyny oraz bufor HEPES 15 mM (Supplementary File 1) (pH 7,4) w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2.
    1. Przeprowadzić pasaż komórek z użyciem 0,05% trypsyny-EDTA. Wysiać komórki HEK293T na szklanych kowopersach pokrytych poli-L/D-lizyną (PLL/PDL) w taki sposób, aby w momencie transfekcji osiągnęły one stopień konfluencji ≥80%.
  2. Transfekcja
    1. Przygotować 40 mM roztwór zapasowy AZP w 0,1 M NaOH.
    2. Przygotować pożywkę uzupełnioną AZP do wzrostu komórek i ekspresji mGluR2. Do standardowej pożywki (+ FBS, pen/strep, 15 mM HEPES) dodać 40 mM roztwór zapasowy AZP. Końcowe stężenie AZP powinno wynosić 0,6 mM. Dodać roztwór HEPES 1 M (objętość równa połowie objętości dodanego 40 mM roztworu zapasowego AZP). Na przykład, aby przygotować 10 mL pożywki uzupełnionej AZP, należy połączyć 9,75 mL standardowej pożywki, 150 µL 40 mM roztworu zapasowego AZP oraz 75 µL roztworu HEPES 1 M.
    3. Przefiltrować (sterylizować) pożywkę za pomocą filtra strzykawkowego (0,2 µm, PES).
    4. Przed transfekcją zastąpić pożywkę standardową pożywką uzupełnioną AZP.
      UWAGA: Należy uważać, aby nie doprowadzić do wysuszenia komórek podczas wymiany pożywki.
    5. Przeprowadzić transfekcję komórek za pomocą odczynnika do transfekcji (Table of Materials) zgodnie z instrukcją producenta. Transfekcję komórek HEK293T na kowopersie 18 mm przeprowadzić, używając łącznie 2 µg DNA (10 ng tRNA/syntetazy + 10 ng plazmidu białka zawierającego bursztynowy kodon). Stężenia i objętości użytych składników znajdują się w Table 1 .
    6. 24 h po transfekcji wymienić pożywkę na świeżą pożywkę uzupełnioną AZP i inkubować komórki przez kolejne 24 h.
  3. Znakowanie barwnikami cyjaninowymi z grupą alkinową
    1. Na 20 min przed znakowaniem dwukrotnie przemyć kowopersy ciepłym (37 °C) buforem rejestracyjnym (RB) (Supplementary File 1), a następnie przenieść je do ciepłej (37 °C) standardowej pożywki bez AZP (+ FBS, Pen/Strep, 15 mM HEPES).
    2. Przygotować roztwór do znakowania zawierający Cy3-alkin, Cy5-alkin, BTTES, siarczan(II) miedzi (CuSO4), (+) L-askorbinian sodu i aminoguanidynę.
    3. Postępować zgodnie z kolejnością przygotowania i dodawania roztworów (Table 2):
      1. Przygotować 50 mM BTTES.
      2. Przygotować 10 mM aminoguanidynę.
      3. Przygotować 10 mM L-askorbinian sodu.
      4. Przygotować 65,5 µL RB.
      5. Do RB dodać barwnik Cy3/Cy5 alkin (roztwór zapasowy 10 mM w DMSO).
        UWAGA: Do RB dodać aminoguanidynę.
      6. Przygotować 20 mM CuSO4.
      7. W nowej probówce wymieszać CuSO4 i BTTES (roztwór zmieni kolor na niebieski).
      8. Mieszaninę CuSO4 i BTTES dodać do RB (punkt 2.3.3.6.).
      9. Dodać L-askorbinian sodu.
      10. Dla kowopersu 18 mm zastosować objętości podane w poniższej Table 2 .
    4. Dokładnie wymieszać roztwór i inkubować na lodzie w ciemności przez 10 min przed znakowaniem komórek.
    5. Przed dodaniem roztworu do znakowania na kowopersy, usunąć pożywkę i przemyć je buforem RB. Dodać roztwór do znakowania i inkubować przez 15 min w temperaturze 37 °C w ciemności.
    6. UWAGA: Aby poprawić znakowanie, po 10 min dodać glutaminian (stężenie końcowe ~0,5 mM) i inkubować przez dodatkowe 5 min. Miedź jest bardzo toksyczna dla komórek, a reakcja znakowania nie powinna trwać dłużej niż 15 min in vivo. Wszystkie składniki należy przygotować na świeżo. L-askorbinian sodu dodawać na samym końcu. Podczas przygotowania utrzymywać reakcję w temperaturze 4 °C. Jednak po dodaniu roztworu do znakowania komórki muszą być przechowywane w temperaturze 37 °C w inkubatorze.
  4. Zbieranie komórek i ekstrakcja białek (lizą komórek)
    1. Usunąć roztwór do znakowania i dwukrotnie przemyć buforem RB kowopers (18 mm) zawierający transfektowane mGluR2 komórki.
    2. Za pomocą pipety zmyć komórki z kowopersu i resuspenderować w RB (1 mL).
      UWAGA: Od tego momentu należy maksymalnie ograniczyć ekspozycję próbki na światło.
    3. Odwirować komórki przy 1,0 x g w temperaturze 4 °C przez 5 min i usunąć supernatant. Osad komórkowy resuspenderować w 80-130 µL roztworu lizującego.
      UWAGA: Osad komórkowy powinien być widoczny gołym okiem. Objętość lizatu zależy od ilości próbki utraconej podczas procesu znakowania i płukania.
    4. Delikatnie wymieszać pipetując, aby rozbić osad. Zawinąć w folię i umieścić na wytrząsarce przy 4 °C na 0,5-1 h w celu lizy komórek.
    5. Frakcję nierozpuszczalną odwirować przy 20,0 x g w temperaturze 4 °C przez 20 min. Przenieść supernatant do nowej zimnej probówki (lizat białkowy zawierający znakowane fluorescencyjnie białko docelowe) i przechowywać na lodzie do czasu przeprowadzenia eksperymentów.

3. Montaż i funkcjonalizacja komory przepływowej do analizy pojedynczych cząsteczek

  1. Wyjmij preparat i szkiełko nakrywkę z zamrażarki i pozostaw je do ogrzania w temperaturze pokojowej w ciemności (ok. 30 min).
  2. Zmontuj komorę, używając dwustronnej taśmy klejącej i umieszczając jej paski pomiędzy szkiełkiem podstawowym a nakrywką. Upewnij się, że powierzchnie PEGylizowane tworzą wnętrze komory przepływowej.
  3. Za pomocą końcówki pipety docisnąć szkiełko nakrywką, aby upewnić się, że taśma w pełni przylega zarówno do szkiełka nakrywką, jak i do preparatu; należy uważać, aby nie stłuc szkiełka nakrywki. Na krawędzie preparatów nanieść żywicę epoksydową.
    UWAGA: Nie należy nakładać zbyt dużej ilości żywicy epoksydowej, aby nie wypełniła ona wywierconych otworów.
  4. Umieść komorę przepływową stroną z szkiełkiem nakrywkowym skierowaną w dół w wilgotnej ciemnej komorze, aby umożliwić wyschnięcie żywicy epoksydowej (~30 min).
    UWAGA: Dodać bufor T50 (Plik uzupełniający 1) przez wywiercone otwory, aby zapobiec zakryciu ich przez żywicę epoksydową (10-15 µL) podczas okresu suszenia.
  5. Inkubować każdą ścieżkę komory z 500 nM Neutravidinem (rozcieńczonym w T50), powoli aplikując około40 µL do każdej studzienki.
  6. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 min w wilgotnej komorze ciemnej. Przemyć za pomocą ~100 µL buforu T50 na każdą ścieżkę.
  7. Inkubować każdą ścieżkę komory z 20 nM biotynilowanym przeciwciałem11Wybór przeciwciała zależy od znacznika przyłączonego do białka.
    UWAGA: Jeśli przeciwciało pierwszorzędowe nie jest biotynilowane, w pierwszej kolejności należy inkubować z biotynilowanym przeciwciałem drugorzędowym przez 30 min, a następnie inkubować z przeciwciałem pierwszorzędowym.
  8. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 min w wilgotnej ciemnej komorze. Przemyć za pomocą ~200 µL T50 na ścieżkę.
    UWAGA: Należy dopilnować, aby ścieżki nie wyschły podczas procesu przygotowania.

4. Bufor do badań pojedynczych cząsteczek

  1. Bufor Trolox
    UWAGA: Bufor Trolox jest buforem wyjściowym do przygotowania buforu do obrazowania. Składniki buforu zależą od eksperymentu i mogą się różnić w zależności od badanego białka. Bufor zastosowany w opisanym tutaj protokole zawiera sole (NaCl, KCl, CaCl2, MgCl2), czynnik buforujący (HEPES) oraz Trolox (pH ~7,35).
    1. Rozpuścić 9-10 mg Trolox w 10 mL buforu do rejestracji pojedynczych cząsteczek (SRB, Supplementary File 1)
      UWAGA: Trolox sprawia, że bufor staje się lekko kwasowy. Na tym etapie należy skorygować pH, używając roztworu wodorotlenku sodu (NaOH) o stężeniu 10 M (pH 7,35). Precyzyjna regulacja pH zostanie przeprowadzona po całkowitym rozpuszczeniu Trolox; jednak podniesienie pH na tym etapie zwiększa rozpuszczalność Trolox.
    2. Mieszać roztwór w temperaturze pokojowej (RT) za pomocą rockera laboratoryjnego przez 4-8 h (owiniętego folią aluminiową), aby całkowicie rozpuścić Trolox.
    3. Sprawdzić pH i skorygować w razie potrzeby.
    4. Upewnić się, że Trolox jest całkowicie rozpuszczony. Zsterylizować roztwór za pomocą filtra strzykawkowego i przechowywać w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Buforu należy używać po 2-10 dniach „dojrzewania”. Trolox pomaga tłumić migotanie (blinking) i jest powszechnie stosowany w badaniach pojedynczych cząsteczek17. Właściwości przeciwmigotne wynikają z utlenionej pochodnej Trolox18; dlatego zaleca się przechowywanie go w RT przez co najmniej kilka godzin w celu dojrzewania. Dodatkowo naświetlanie świeżego roztworu Trolox promieniowaniem UV przyspiesza proces utleniania i może być wykorzystane do przyspieszenia „dojrzewania” buforu Trolox18.
  2. Skład buforu do obrazowania: Wymieszać bufor Trolox + detergent (~2 razy wartość CMC detergentu) + 4 mM kwasu protokatechowego (PCA).
    UWAGA: Stężenie detergentu utrzymuje się blisko wartości CMC, ponieważ wysokie stężenia detergentu mogą prowadzić do zwiększonej denaturacji białek. Przykładowo, można zastosować następującą mieszaninę: 95 µL Trolox + 5 µL 10% DDM + cholesterol (W%, 10:1) + 40 µL roztworu PCA o stężeniu 10 mM. W tym przypadku PCA działa jako środek antyoksydacyjny i był wcześniej stosowany w badaniach smFRET19. DDM jest detergentem niejonowym, powszechnie stosowanym do solubilizacji białek błonowych20,21 i wykorzystywanym w badaniach pojedynczych cząsteczek. DDM jest dobrym pierwszym wyborem detergentu, jednak zalecamy przetestowanie wielu detergentów i upewnienie się, że wyniki są spójne.

5. Konfiguracja mikroskopu i akwizycja danych smFRET

  1. Włącz komputer i mikroskop. Włącz lasery w celu ich rozgrzania (532 nm dla wzbudzenia Cy3 oraz 640 nm dla wzbudzenia Cy5).
    UWAGA: W tym przypadku użyto mikroskopu odwróconego wyposażonego w obiektyw TIRF 10x (N.A. 1.49), dzielnik obrazu oraz kamerę EMCCD. Układ jest wyposażony w czteroliniowy łącznik laserowy, lustro dichroiczne, filtr długoprzepustowy emisji, dichroiczny filtr emisyjny oraz filtr notch.
  2. Włącz kamerę EMCCD i otwórz oprogramowanie kamery. Odczekaj 20 min, aż kamera osiągnie temperaturę −69 °C i ustabilizuje się.
  3. Zamocuj komorę z próbką na stoliku mikroskopu. Stopniowo dodawaj próbkę białka, aby uzyskać ok. 40 cząsteczek na pole widzenia (krok 2.4.5). Przepłucz komorę 10 µL buforu do obrazowania.
  4. Dostosuj wzmocnienie, szybkość akwizycji oraz moc laserów w taki sposób, aby sygnały fluorescencji pojedynczych cząsteczek były wykrywane w obu kanałach: donora i akceptora. W razie potrzeby dostosuj stężenie białek wewnątrz komory z próbką.
    UWAGA: Przy więcej niż 40 cząsteczkach w polu widzenia rozróżnienie poszczególnych cząsteczek staje się trudniejsze, a szum tła będzie wyższy.
  5. Wzbudź donor i rejestruj przebiegi czasowe, aż przynajmniej 80% cząsteczek donora w polu widzenia ulegnie fotowyblakaniu.
  6. Na koniec filmu włącz laser 640 nm, aby bezpośrednio wzbudzić akceptor, aż część cząsteczek akceptora ulegnie fotowyblakaniu, co ułatwia odróżnienie pojedynczych cząsteczek od multimerów.
  7. Przejdź do innego pola widzenia i powtórz powyższe kroki, aby zebrać co najmniej trzy filmy (replikaty techniczne) dla każdego wariantu.
    UWAGA: Podczas wyboru nowego obszaru zainteresowania (ROI) i ustawiania ostrości używaj jak najniższej mocy lasera, aby zminimalizować fotowyblakanie. Zwracaj uwagę na dryft stolika podczas akwizycji. Jeśli po przejściu do nowego ROI zaobserwowano zauważalny dryft, odczekaj 3 min przed rozpoczęciem akwizycji.

6. Analiza danych

  1. Dopasowanie kanałów donora i akceptora (mapowanie obrazów)
    1. Należy zarejestrować obrazy fluorescencyjnych kulek w kanałach donora i akceptora.
    2. Na podstawie danych z kulek należy wygenerować plik mapowania w celu skorelowania fluorescencji donora i akceptora dla każdej cząsteczki2,23.
      UWAGA: Sygnał emisyjny z pojedynczej cząsteczki jest rozdzielany na sygnały donora i akceptora przez dichroiczny filtr emisyjny wewnątrz rozdzielacza obrazu (image splitter). Obrazy donora i akceptora są rzutowane na kamerę obok siebie. Aby precyzyjnie powiązać intensywności donora i akceptora pojedynczej cząsteczki między tymi dwoma obszarami, często generuje się plik mapowania przy użyciu próbek z fluorescencyjnych kulek. Dzięki temu plikowi mapowania wszystkie cząsteczki wykryte w kanałach donora i akceptora są na siebie naniesione. Analiza generuje następnie przebiegi czasowe, czyli intensywności donora i akceptora w czasie dla każdej cząsteczki.
  2. Wybór przebiegów smFRET dla pojedynczych cząsteczek (wybieranie cząstek)
    UWAGA: Pojedyncze przebiegi cząstek są badane i wybierane do dalszej analizy przy użyciu programu MATLAB. Dokładne kryteria wyboru zależą od systemu. Tutaj przedstawiono ogólne wytyczne dotyczące cech wysokiej jakości cząstki. Wszystkie zmodyfikowane kody są dostępne na GitHub (https://github.com/vafabakhsh-lab).
    1. Należy wybrać przebiegi, w których całkowita intensywność (donor + akceptor) jest stabilna w czasie. Wybiera się przebiegi z antykorelacją zmian intensywności donora i akceptora.
    2. Należy wybrać cząsteczki donora i akceptora wykazujące jednostopniowe fotowybielanie. Wybiera się przebiegi o długości >5 s.
      UWAGA: Tło w każdym kanale po wybielaniu powinno spaść do zera. Przebiegi nie powinny zawierać wielu zdarzeń mrugania (blinking), ponieważ utrudni to analizę.
    3. Należy obliczyć wydajność FRET korzystając z równania E = (IA− 0.08 × ID)/(ID + [IA− 0.08 × ID])24,25,26, gdzie ID i IA to odpowiednio surowe intensywności donora i akceptora.
      UWAGA: Przeciek emisji donora do kanału akceptora określa się przy użyciu próbki znakowanej tylko donorem, wzbudzanej laserem 532 nm26. Współczynnik korekcji przecieku, 0.088, może różnić się w zależności od konfiguracji i stosowanych zestawów filtrów. Należy zauważyć, że ilościowe i wiarygodne przeliczenie wydajności FRET na odległości bezwzględne wymaga korekcji intensywności donora i akceptora o wiele czynników, co zostało szczegółowo omówione we wcześniejszych pracach27.
  3. Identyfikacja stanu konformacyjnego za pomocą modelowania ukrytych Markowa (HMM)
    1. Należy uruchomić program vbFRET28 w programie MATLAB i zaimportować wybrane przebiegi dla danego stanu. Należy ustawić ograniczenia dotyczące liczby potencjalnych stanów i liczby wykonywanych iteracji.
      UWAGA: Na podstawie surowych danych z reprezentatywnych wyników postawiono hipotezę, że sensor konformacyjny zajmuje do czterech dyskretnych stanów FRET; dlatego wyznaczono zakres od jednego do czterech stanów. Wcześniej ustalono, że poprawa dopasowania przy >25 iteracjach jest pomijalna, dlatego do dopasowania reprezentatywnych danych wykorzystano 25 iteracji.
    2. Należy przeanalizować przebiegi smFRET, a następnie wyeksportować zidealizowane przebiegi i sesję analizy. Zidealizowane przebiegi należy zapisać w osobnym folderze do dalszej analizy.
      UWAGA: Programy służące do wyodrębniania danych o przejściach między stanami i czasach przebywania zidealizowanych przebiegów zostały udostępnione w wcześniej opublikowanej pracy29.
    3. Za pomocą programów MATLAB należy wyodrębnić przejścia między stanami i przedstawić je na mapie ciepła (heatmap), gdzie oś X wskazuje konformację początkową, a oś Y konformację końcową.
      UWAGA: W analizowanych tutaj reprezentatywnych wynikach przejścia definiowano jako zmiany wartości FRET >0.1. Próg przejść zależy od hipotetycznych stanów konformacyjnych zajmowanych przez analizowane białko (próg przejścia powinien być mniejszy niż różnica między najbliższymi stanami FRET) oraz od rozdzielczości umożliwianej przez układ eksperymentalny. Analiza map ciepła dla wielu warunków pozwala zidentyfikować najczęstsze stany konformacyjne, przez które przechodzi i których zajmuje sensor. Dla reprezentatywnych wyników zidentyfikowano cztery stany FRET (FRET = 0.31, 0.51, 0.71 oraz 0.89).
    4. Za pomocą programów MATLAB należy wyodrębnić czasy przebywania dla każdego zidentyfikowanego stanu konformacyjnego. Należy wyznaczyć zakres wartości FRET określający każdy stan oraz rozdzielczość czasową podczas akwizycji danych. Zakresy FRET są dzielone równomiernie przez sąsiednie stany FRET. Należy wyeksportować czasy przebywania dla określonych warunków traktowania.
      UWAGA: W większości przypadków dane o czasie przebywania można dobrze oszacować za pomocą funkcji pojedynczego rozkładu wykładniczego. Analizę tę można przeprowadzić w oprogramowaniu do analizy danych i tworzenia wykresów.
  4. Dopasowanie gaussowskie histogramów populacyjnych smFRET w celu ilościowego określenia zajętości stanów
    1. Należy zaimportować populacyjne histogramy FRET dla interesujących warunków do oprogramowania do analizy danych i tworzenia wykresów w celu przeprowadzenia analizy dopasowania wielu pików.
    2. Należy wskazać liczbę obecnych pików (cztery piki lub stany na podstawie analizy HMM). Dopasowanie wykonano przy użyciu wielu rozkładów Gaussa30 zdefiniowanych jako figure-protocol-1, gdzie A to pole powierzchni piku, xc to centrum piku, a w to szerokość piku dla każdego piku.
    3. Parametry dopasowania należy ograniczyć do: A > 0, xc = FRET ± 0.02 oraz 0.1 ≤w≤ 0.24. Cztery piki FRET dla poszczególnych populacyjnych histogramów FRET dopasowywano jednocześnie. Zdefiniowane ograniczenia zastosowano do dopasowań dla wszystkich warunków.
    4. Zajętość stanu (procentowo) oblicza się jako pole powierzchni interesującego piku podzielone przez całkowitą powierzchnię, zdefiniowaną jako suma wszystkich pików.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Ekspresja i znakowanie fluorescencyjne sensora FRET opartego na UAA
W niniejszym rozdziale omówiono przykładowe wyniki wprowadzania oraz znakowania fluorescencyjnego UAA (AZP) w obrębie domeny CRD receptora mGluR2 (548UAA)1. Jak wspomniano wcześniej, aby wprowadzić AZP do mGluR2, konieczna jest koekspresja zmodyfikowanego aparatu translacyjnego, obejmującego zmodyfikowaną syntetazę tRNA i komplementarne tRNA (pIRE4-Azi), oraz mGluR2 zawierającego kodon bursztynowy w pozycji ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

GPCR to białka, które działają na błonę komórkową w celu zainicjowania transdukcji sygnału. Wiele GPCR składa się z wielu domen, przy czym sygnalizacja jest zależna od kooperacyjnej interakcji między domenami. Aby modulować właściwości tych receptorów błonowych, konieczne jest zrozumienie dynamicznego zachowania wielu domen. Transfer energii rezonansu fluorescencji pojedynczej cząsteczki (smFRET) to technika fluorescencyjna, która umożliwia pomiar konformacji i dynamiki białek w czasie rzeczywistym11,32...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Podziękowania

Dziękujemy członkom laboratorium Reza Vafabakhsh za dyskusje. Prace te były wspierane przez R01GM140272 grantowe National Institutes of Health (dla R.V.), przez The Searle Leadership Fund for the Life Sciences na Northwestern University oraz przez Chicago Biomedical Consortium przy wsparciu Searle Funds w The Chicago Community Trust (do R.V.). B.W.L. był wspierany przez National Institute of General Medical Sciences (NIGMS) Training Grant T32GM-008061.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
(+)-Askorbinian soduSigma AldrichCat # 11140-250G
4-azydo-L-fenyloalaninaChem-Impex InternationalCat # 06162
548UAALiauw i in. 2021Transfekowany konstrukt
Kwas octowyFisher Chemical64-19-7
AcetonFisher Chemical67-64-1
Adobe Illustrator (2022)https://www.adobe.com/RRID:SCR_010279Oprogramowanie, algorytm
Aminoguanidyna (chlorowodorek)Cayman Chemical81530
AminosilanAldrich919-30-2
Sonikator do kąpieli 2,8 LFisher ScientificKąpiel ultradźwiękowa 2,8 l
Biotyna-PEGLaysan Bio IncPozycja# Biotyna-PEG-SVA-5000-100mg
BTTESClick Narzędzia chemiczne1237-500
Siarczan miedzi (II)Sigma AldrichCat # 451657-10G
Szkiełko nakrywkoweVWR16004-306Komora na próbki
Cy3 AlkineClick Narzędzia chemiczneTA117-5
Cy5 AlkineClick Narzędzia chemiczneTA116-5
DDMAnatraceCzęść # D310 1 GMDetergent
DDM-CHS (10:1)AnatraceCzęść # D310-CH210 1 MLDetergent z cholekterolem
Zdefiniowana płodowa surowica bydlęcaThermo Fisher ScientificSH30070.03
Di01-R405/488/561/635Filtr wycinający Semrock
DMEMCorning10-013-CV
EMCCDKamera AndorDU-897U
ET542lpdługoprzepustowyChroma
FF640-FDi01SemrockFiltr dichroiczny emisji
przeciwciałoGenscriptA01429
Koralik fluorescencyjnyInvitrogen T7279Mikrosfery TetraSpeckKoralik sferyczny
Szkiełkaszklane Fisherfinest12-544-4komora na próbki
GlutaminianSigma AldrichCat # 6106-04-3
HEK 293TSigma AldrichCat # 12022001Linia komórkowa
HEPESFisherBioReagents7365-45-9
Rozdzielacz obrazuOptoSplit II
KOHFluka1310-58-3
LaserOxxius4-liniowy łącznik laserowy
Lipofectamine 3000 Odczynnik do transfekcjiThermo Fisher ScientificL3000015Odczynnik do transfekcji
MetanolFisher Chemical67-56-1
Mikroskop OlympusOlympus IX83
Milli-Q dejonizatorwodyBarnstead
m-PEGLaysan Bio IncPozycja# MPEG-SIL-5000-1g
NF03-405/488/532/635Lustro dichroiczneSemrock
OptiMEMThermo Fisher Scientific51985091Zredukowane podłoże w surowicy
OptiMEM/Zredukowane podłoże w surowicy ThermoFisher Scientific
OriginPro (2020b)https://www.originlab.com/RRID:SCR_014212Oprogramowanie do analizy danych i tworzenia wykresów
Penicylina-StreptomycynaGibco15140-122
pIRE4-AziAddgene Plazmid # 105829Transfekowany konstrukt
Bromowodorek poli-L-lizynySigma AldrichCat # P2636
Kwas protokatechowy (PCA)HWI grupa99-50-3
smCamera (wersja 1.0)http://ha.med.jhmi.edu/resources/Camera oprogramowanie
Wodorowęglan soduFisherBioReagents144-55-8
Wodorotlenek sodu (NaOH)Sigma1310-73-2
Filtr strzykawkowyWhatman UNIFLOCat#9914-2502Filtracja cieczy
TroloxSigma53188-07
Filtr FLAG-tag

Bibliografia

  1. Smock, R. G., Gierasch, L. M. Sending signals dynamically. Science. 324 (5924), 198-203 (2009).
  2. Changeux, J. P., Christopoulos, A. Allosteric modulation as a unifying mechanism for receptor function and regulation. Cell. 166 (5), 1084-1102 (2016).
  3. Tang, X. -l, Wang, Y., Li, D. -l, Luo, J., Liu, M. -Y. Orphan G protein-coupled receptors (GPCRs): biological functions and potential drug targets. Acta Pharmacologica Sinica. 33 (3), 363-371 (2012).
  4. Chung, K. Y., et al. Conformational changes in the G protein Gs induced by the β2 adrenergic receptor. Nature. 477 (7366), 611-615 (2011).
  5. Vafabakhsh, R., Levitz, J., Isacoff, E. Y. Conformational dynamics of a class C G-protein-coupled receptor. Nature. 524 (7566), 497-501 (2015).
  6. Niswender, C. M., Conn, P. J. Metabotropic glutamate receptors: Physiology, pharmacology, and disease. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 50, 295-322 (2010).
  7. Pin, J. P., Bettler, B. Organization and functions of mGlu and GABA(B) receptor complexes. Nature. 540 (7631), 60-68 (2016).
  8. Kniazeff, J., et al. Closed state of both binding domains of homodimeric mGlu receptors is required for full activity. Nature Structural & Molecular Biology. 11 (8), 706-713 (2004).
  9. Ha, T. Single-molecule fluorescence resonance energy transfer. Methods. 25 (1), 78-86 (2001).
  10. Schuler, B., Eaton, W. A. Protein folding studied by single-molecule FRET. Current Opinion in Structural Biology. 18 (1), 16-26 (2008).
  11. Liauw, B. W. -H., Afsari, H. S., Vafabakhsh, R. Conformational rearrangement during activation of a metabotropic glutamate receptor. Nature Chemical Biology. 17 (3), 291-297 (2021).
  12. Noren, C. J., Anthonycahill, S. J., Griffith, M. C., Schultz, P. G. A general method for site-specific incorporation of unnatural amino acids into proteins. Science. 244 (4901), 182-188 (1989).
  13. Presolski, S. I., Hong, V. P., Finn, M. Copper-catalyzed azide-alkyne click chemistry for bioconjugation. Current Protocols in Chemical Biology. 3 (4), 153-162 (2011).
  14. Huber, T., Naganathan, S., Tian, H., Ye, S. X., Sakmar, T. P. Unnatural amino acid mutagenesis of GPCRs using amber codon suppression and bioorthogonal labeling. G Protein Coupled Receptors: Structure. 520, 281-305 (2013).
  15. Serfling, R., Coin, I. Chapter Four - Incorporation of Unnatural Amino Acids into Proteins Expressed in Mammalian Cells. Methods in Enzymology. Pecoraro, V. 580, Academic Press. Cambridge, MA. 89-107 (2016).
  16. Chandradoss, S. D., et al. Surface passivation for single-molecule protein studies. Journal of Visualized Experiments. (86), e50549(2014).
  17. Rasnik, I., McKinney, S. A., Ha, T. Nonblinking and long-lasting single-molecule fluorescence imaging. Nature Methods. 3 (11), 891-893 (2006).
  18. Cordes, T., Vogelsang, J., Tinnefeld, P. On the mechanism of Trolox as antiblinking and antibleaching reagent. Journal of the American Chemical Society. 131 (14), 5018-5019 (2009).
  19. Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments. Biophysical Journal. 94 (5), 1826-1835 (2008).
  20. Lee, S., et al. How do short chain nonionic detergents destabilize G-protein-coupled receptors. Journal of the American Chemical Society. 138 (47), 15425-15433 (2016).
  21. Cao, A. -M., et al. Allosteric modulators enhance agonist efficacy by increasing the residence time of a GPCR in the active state. Nature Communications. 12 (1), 1-13 (2021).
  22. Mancebo, A., Mehra, D., Banerjee, C., Kim, D. -H., Puchner, E. M. Efficient cross-correlation filtering of one-and two-color single molecule localization microscopy data. Frontiers in Bioinformatics. 1, 739769(2021).
  23. Mehra, D., Adhikari, S., Banerjee, C., Puchner, E. M. Characterizing locus specific chromatin structure and dynamics with correlative conventional and super-resolution imaging in living cells. Nucleic Acids Research. , (2022).
  24. Chen, H., Puhl, H. L., Koushik, S. V., Vogel, S. S., Ikeda, S. R. Measurement of FRET efficiency and ratio of donor to acceptor concentration in living cells. Biophysical Journal. 91 (5), 39-41 (2006).
  25. Gopich, I. V., Szabo, A. FRET efficiency distributions of multistate single molecules. The Journal of Physical Chemistry B. 114 (46), 15221-15226 (2010).
  26. Roy, R., Hohng, S., Ha, T. A practical guide to single-molecule FRET. Nature Methods. 5 (6), 507-516 (2008).
  27. Hellenkamp, B., et al. Precision and accuracy of single-molecule FRET measurements-A multi-laboratory benchmark study. Nature Methods. 15 (9), 669-676 (2018).
  28. Bronson, J. E., Fei, J., Hofman, J. M., Gonzalez, R. L., Wiggins, C. H. Learning rates and states from biophysical time series: A Bayesian approach to model selection and single-molecule FRET data. Biophysical Journal. 97 (12), 3196-3205 (2009).
  29. Zhang, J., et al. Specific structural elements of the T-box riboswitch drive the two-step binding of the tRNA ligand. Elife. 7, 39518(2018).
  30. Goodman, N. R. Statistical analysis based on a certain multivariate complex Gaussian distribution (an introduction). The Annals of Mathematical Statistics. 34 (1), 152-177 (1963).
  31. Brown, R. B., Audet, J. Current techniques for single-cell lysis. Journal of the Royal Society Interface. 5, Suppl 2 131-138 (2008).
  32. Schamber, M. R., Vafabakhsh, R. Mechanism of sensitivity modulation in the calcium-sensing receptor via electrostatic tuning. Nature Communications. 13 (1), 2194(2022).
  33. Jain, A., Liu, R., Xiang, Y. K., Ha, T. Single-molecule pull-down for studying protein interactions. Nature Protocols. 7 (3), 445-452 (2012).
  34. Huang, S. K., et al. Delineating the conformational landscape of the adenosine A(2A) receptor during G protein coupling. Cell. 184 (7), 1884-1894 (2021).
  35. Wingler, L. M., et al. Angiotensin analogs with divergent bias stabilize distinct receptor conformations. Cell. 176 (3), 468-478 (2019).
  36. Gordon, C. G., et al. Reactivity of biarylazacyclooctynones in copper-free click chemistry. Journal of the American Chemical Society. 134 (22), 9199-9208 (2012).
  37. Kim, E., Koo, H. Biomedical applications of copper-free click chemistry: In vitro, in vivo, and ex vivo. Chemical Science. 10 (34), 7835-7851 (2019).
  38. Pickens, C. J., Johnson, S. N., Pressnall, M. M., Leon, M. A., Berkland, C. J. Practical considerations, challenges, and limitations of bioconjugation via azide-alkyne cycloaddition. Bioconjugate Chemistry. 29 (3), 686-701 (2018).
  39. Geng, Y., et al. Structural mechanism of ligand activation in human calcium-sensing receptor. Elife. 5, 13662(2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Znakowanie bia ekmetabotropowe receptory glutaminianuaktywacja GPCRukryte modele Markowasensory fluorescencyjnekom rki HEK 293Tznakowanie specyficzne dla miejsca

Powiązane artykuły