Method Article

Wizualizacja dynamiki konformacyjnej receptorów błonowych za pomocą jednocząsteczkowego FRET

DOI:

10.3791/64254

⸱

August 17th, 2022

 ,  , 
1Department of Molecular Biosciences, Northwestern University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie przedstawia szczegółową procedurę przeprowadzania eksperymentów z transferem energii rezonansu fluorescencji pojedynczej cząsteczki (smFRET) na receptorach sprzężonych z białkiem G (GPCR) przy użyciu znakowania specyficznego dla miejsca poprzez inkorporację nienaturalnych aminokwasów (UAA). Protokół zawiera przewodnik krok po kroku dotyczący przygotowania próbek, eksperymentów i analizy danych smFRET.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zdolność komórek do reagowania na sygnały zewnętrzne jest niezbędna dla rozwoju, wzrostu i przetrwania komórek. Aby zareagować na sygnał z otoczenia, komórka musi być w stanie go rozpoznać i przetworzyć. Zadanie to opiera się głównie na funkcji receptorów błonowych, których rolą jest przekształcanie sygnałów w język biochemiczny komórki. Receptory sprzężone z białkiem G (GPCR) stanowią największą rodzinę białek receptorów błonowych u ludzi. Wśród GPCR metabotropowe receptory glutaminianu (mGluR) są unikalną podklasą, która działa jako obligatoryjne dimery i posiada dużą domenę zewnątrzkomórkową, która zawiera miejsce wiązania ligandu. Niedawne postępy w badaniach strukturalnych mGluR pozwoliły lepiej zrozumieć proces ich aktywacji. Jednak propagacja wielkoskalowych zmian konformacyjnych przez mGluRs podczas aktywacji i modulacji jest słabo poznana. Transfer energii rezonansu fluorescencji pojedynczej cząsteczki (smFRET) jest potężną techniką wizualizacji i ilościowego określania dynamiki strukturalnej biomolekuł na poziomie pojedynczego białka. Aby zobrazować dynamiczny proces aktywacji mGluR2, opracowano fluorescencyjne czujniki konformacyjne oparte na inkorporacji nienaturalnych aminokwasów (UAA), które umożliwiły znakowanie białek specyficznych dla miejsca bez zaburzeń natywnej struktury receptorów. Opisany tutaj protokół wyjaśnia, jak przeprowadzać te eksperymenty, w tym nowatorskie podejście do etykietowania UAA, przygotowanie próbki oraz pozyskiwanie i analizę danych smFRET. Strategie te można uogólnić i rozszerzyć w celu zbadania dynamiki konformacyjnej różnych białek błonowych.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Transfer informacji przez błonę plazmatyczną jest silnie zależny od funkcji receptorów błonowych1. Wiązanie liganda z receptorem prowadzi do zmiany konformacyjnej i aktywacji receptora. Proces ten ma często charakter allosteryczny2. Liczące ponad 800 członków receptory sprzężone z białkiem G (GPCR) są największą rodziną receptorów błonowych u ludzi3. Ze względu na ich rolę w prawie wszystkich procesach komórkowych, GPCR stały się ważnymi celami rozwoju terapeutycznego. W kanonicznym modelu sygnalizacji GPCR aktywacja agonistyczną powoduje zmiany konformacyjne receptora, które następnie aktywują heterotrimeryczny kompleks białka G poprzez wymianę GDP na GTP w kieszeni wiążącej nukleotydyα G. Aktywowane podjednostki Gα-GTP i Gβγ kontrolują następnie aktywność dalszych białek efektorowych i propagują kaskadę sygnalizacyjną4,5. Ten proces sygnalizacji zasadniczo zależy od zdolności ligandów do zmiany trójwymiarowego kształtu receptora. Mechanistyczne zrozumienie, w jaki sposób ligandy to osiągają, ma kluczowe znaczenie dla opracowywania nowych terapii oraz projektowania syntetycznych receptorów i czujników.

Metabotropowe receptory glutaminianu (mGluRs) należą do rodziny GPCR klasy C i są ważne dla powolnego neuromodulacyjnego działania glutaminianu i dostrajania pobudliwości neuronalnej6,7. Spośród wszystkich GPCR, GPCR klasy C są strukturalnie unikalne, ponieważ działają jako obligatoryjne dimery. mGluRs zawierają trzy domeny strukturalne: domenę muchołówki (VFT), domenę bogatą w cysteinę (CRD) i domenę transbłonową (TMD)8. Zmiany konformacyjne podczas procesu aktywacji są złożone i obejmują lokalne i globalne sprzężenie konformacyjne, które rozchodzą się na odległość 12 nm, a także kooperatywność dimerów. Pośrednie konformacje, czasowy porządek stanów i tempo przejścia między stanami są nieznane. Śledząc konformację poszczególnych receptorów w czasie rzeczywistym, możliwe jest zidentyfikowanie przejściowych stanów pośrednich i sekwencji zmian konformacyjnych podczas aktywacji. Można to osiągnąć, stosując transfer energii rezonansu fluorescencji pojedynczej cząsteczki9,10 (smFRET), tak jak zostało to ostatnio zastosowane do wizualizacji propagacji zmian konformacyjnych podczas aktywacji mGluR211. Kluczowym krokiem w eksperymentach FRET jest wygenerowanie czujników FRET poprzez specyficzną dla miejsca insercję fluoroforów donorowych i akceptorowych do białka będącego przedmiotem zainteresowania. Przyjęto strategię inkorporacji nienaturalnych aminokwasów (UAA)12,13,14,15 w celu przezwyciężenia ograniczeń typowych technologii znakowania fluorescencyjnego specyficznych dla danego miejsca, które wymagają stworzenia mutantów bez cysteiny lub wprowadzenia dużego znacznika zakodowanego genetycznie. Pozwoliło to na zaobserwowanie konformacyjnego przegrupowania niezbędnego kompaktowego łącznika allosterycznego, który połączył domeny wiążące ligandy i sygnalizacyjne mGluR2. W tym protokole przedstawiono przewodnik krok po kroku dotyczący przeprowadzania eksperymentów smFRET na mGluR2, w tym podejście do specyficznego dla miejsca znakowania mGluR2 za pomocą UAA w celu przyłączenia fluoroforów za pomocą katalizowanej miedzią reakcji cyklizacji azydku. Ponadto protokół ten opisuje metodologię bezpośredniego wychwytywania białek błonowych i analizy danych. Przedstawiony tutaj protokół ma również zastosowanie do badania dynamiki konformacyjnej innych białek błonowych.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ogólny przebieg pracy protokołu jest opisany na rysunku 1.

1. Przygotowanie komory na próbkę

  1. Czyszczenie szkiełek nakrywkowych i nakrywkowych
    UWAGA: Kroki te mają na celu oczyszczenie powierzchni szkiełek podstawowych oraz szkiełek nakrywkowych i przygotowanie ich do aminozylanizacji. Jednym z krytycznych wymagań do przeprowadzania eksperymentów fluorescencyjnych pojedynczych cząsteczek na cząsteczkach związanych z powierzchnią jest pasywowana powierzchnia. Najbardziej niezawodna i powtarzalna technika pasywacji polega na kowalencyjnym łączeniu obojętnych łańcuchów polimerowych z powierzchnią szkła w postaci gęstej warstwy. Glikol polietylenowy (PEG) jest najbardziej wydajnym polimerem stosowanym do pasywacji powierzchni16. Szczegóły procedury pasywacji z wykorzystaniem PEG (PEGylacji) opisano poniżej:
    1. Zaznacz markerem otwory do wywiercenia na szkiełkach (w odległości ~6 mm od siebie i z dala od krawędzi). Za pomocą narzędzia Dremel wywiercić małe otwory (o średnicy 1 mm) w szkiełku podstawowym. Zanurz szkiełka w wodzie podczas procesu wiercenia.
    2. Umyj szkiełka acetonem, aby usunąć resztki atramentu z markera.
    3. Wyjmij z acetonu i opłucz szkiełka wodą, a następnie podgrzewaj je w kuchence mikrofalowej przez 5 minut w wodzie o dużej mocy (700 W).
    4. Wyczyść szkiełka wodą przed umieszczeniem ich w szklanym słoiku do barwienia, który ma być poddany sonikacji. Umieść szkiełka nakrywkowe w innym słoiku do barwienia.
    5. Sonikować szkiełka i szkiełka nakrywkowe w acetonie przez 30 minut w sonikatorze kąpielowym w temperaturze 23 °C.
    6. W międzyczasie należy oczyścić szklaną kolbę w celu przygotowania roztworu aminozylanizacji użytego w następnym kroku. Napełnić kolbę 1 M KOH, sonikować kolbę przez 30 minut, dokładnie wypłukać KOH wodą, a następnie sonikować przez dodatkowe 30 minut w metanolu. Pozostawić kolbę w metanolu do czasu etapu aminozylanizacji.
    7. W międzyczasie wyjmij aminozlan, mPEG i biotynę-PEG z zamrażarki (-20 °C) i pozwól im osiągnąć temperaturę pokojową (RT) w ciemności.
    8. Wyrzuć aceton ze szkiełka i szkiełka nakrywkowego do odpowiedniego pojemnika na odpady chemiczne, dokładnie spłucz wodą, a następnie poddaj je sonikacji w 5 M KOH przez 30 minut.
    9. Szkiełka podstawowe i szkiełka nakrywkowe opłukać wodą, a następnie poddać sonikacji w metanolu przez 2 minuty (powtórzyć dwukrotnie). Pozostaw słoiki wypełnione metanolem do etapu aminozylanizacji.
      UWAGA: W tym badaniu używana jest woda dejonizowana, chyba że zaznaczono inaczej. Stosuje się sonikator do kąpieli pracujący w temperaturze 23 °C.
  2. Aminozylanizacja
    UWAGA: Ten krok ma na celu kowalencyjne powiązanie aminozlanu z czystą powierzchnią szkiełka i szkiełka nakrywkowego. Funkcjonalizowane mPEG i biotyna-PEG będą kowalencyjnie wiązać się z tą powierzchnią w następnym kroku.
    1. Przygotować mieszaninę aminozylanizacji w czystej kolbie (krok 1.6). Przygotuj roztwór, mieszając metanol (150 ml), kwas octowy (7,5 ml, użyj szklanej pipety) i amiinozylanu (2,5 ml).
    2. Delikatnie wymieszaj roztwór w dygestoriach chemicznych, a następnie wlej go do słoików na szkiełko podstawowe i nakrywkowe. Użyj 50 ml na szkiełka nakrywkowe i 100 ml na szkiełka. Upewnij się, że szkiełka podstawowe i nakrywkowe są całkowicie zanurzone w roztworze.
    3. Inkubować przez 10 minut, następnie sonikować słoiki przez 1 minutę (sonikacja usuwa zanieczyszczenia z powierzchni) i inkubować przez kolejne 10 minut.
    4. Roztwór aminozylanizacji wyrzucić do pojemnika na odpady. Dodaj metanol do słoików, zamknij słoiki pokrywkami i delikatnie wstrząśnij ręką. Wyrzuć metanol i napełnij słoiki wodą.
    5. Umieścić butelkę z aminozlanem z powrotem w zamrażarce (−20 °C).
  3. PEGylacja
    UWAGA: Te kroki opisują procedurę pegylacji.
    1. Podczas aminozylanizacji należy przygotować bufor pegylacyjny. Odważyć 84 mg wodorowęglanu sodu (NaHCO3) i dodać do 10 ml wody (10 mM). Ponadto zważ mPEG i biotynę-PEG i odłóż je na bok. Na sześć szkiełek podstawowych i nakrywkowych należy użyć 96 mg mPEG i 1,2-2,4 mg biotyny-PEG.
      UWAGA: Ważne jest, aby nie dodawać zbyt dużo biotyny-PEG, ponieważ może to zwiększyć liczbę plam tła. Nie rozpuszczaj mieszaniny PEG aż do momentu nałożenia jej na szkiełka.
    2. Opłucz szkiełka wodą, osusz je delikatnym nadmuchem powietrza, a następnie umieść je w nawilżonych skrzynkach montażowych.
      UWAGA: Konieczne jest korzystanie z czystej linii lotniczej. Unikaj używania sprężonego powietrza w puszce, które może pozostawić ślady na szkle.
    3. Dodaj bufor pegylacyjny do mieszaniny proszku PEG i delikatnie pipetuj w górę i w dół wiele razy, aby się rozpuścił. Dodać 55 μl buforu pegylacyjnego na szkiełko (na sześć szkiełek dodać 330 μl buforu pegylacyjnego).
    4. Wirować przy 9 600 x g przez 1 minutę w temperaturze 23 °C w celu wytrącenia nierozpuszczonych cząstek. Zebrać supernatant do użycia w następnym kroku.
      UWAGA: Biotyna-PEG szybko hydrolizuje ze względu na obecność grupy NHS. Ważne jest, aby szybko wykonać etapy mieszania i wirowania.
    5. Nanieść 60 μl roztworu PEGylacji na każde szkiełko, a następnie umieścić szkiełko nakrywkowe na wierzchu, tak aby roztwór PEGylacji został umieszczony między szkiełkiem podstawowym a szkiełkiem nakrywkowym.
      UWAGA: Unikaj wprowadzania pęcherzyków powietrza między szkiełkiem podstawowym a szkiełkiem nakrywkowym, ponieważ zmniejszy to skuteczność pasywacji. Usuń wszelkie pęcherzyki, regulując szkiełko nakrywkowe i szkiełko za pomocą końcówki pipety.
    6. Umieść prowadnice w szufladzie, która jest płaska i ciemna. Szkiełka można przechowywać przez noc; Jednak inkubacja przez 4-6 godzin zapewnia optymalną pasywację.
      UWAGA: Ważne jest, aby pamiętać, która strona jest pegylowana.
    7. Zaznacz stronę niepegylowaną przed przechowywaniem. Po inkubacji delikatnie zdemontować i dokładnie spłukać szkiełka podstawowe i nakrywkowe wodą
    8. Wysuszyć szkiełka podstawowe i nakrywki, wdmuchując powietrze. Szkiełka podstawowe i nakrywkowe należy przechowywać w sterylnej probówce (50 ml), z powierzchnią PEGylowaną skierowaną od siebie. Przechowywać w temperaturze -20 °C do dnia eksperymentu.
      UWAGA: Szkiełka podstawowe i nakrywkowe najlepiej stosować w ciągu 4 tygodni od przygotowania. Powierzchnie PEGylowane powinny być odwrócone od siebie. Przechowywanie szkiełek PEGylowanych i szkiełek nakrywkowych w workach zamykanych próżniowo może wydłużyć ich okres przydatności do spożycia.

2. Ekspresja mGluR2 z włączonym nienaturalnym aminokwasem, znakowaniem fluorescencyjnym i ekstrakcją

UWAGA: Ten protokół opisuje przygotowanie, odczynniki i leczenie komórek do ekspresji mGluR2 zawierających 4-azydo-L-fenyloalaninę UAA (AZP). Procedura dotyczy komórek HEK293T wyhodowanych na szkiełkach nakrywkowych o średnicy 18 mm. W razie potrzeby procedurę można zwiększyć.

  1. Siew
    UWAGA: Utrzymuj HEK293T komórki w DMEM uzupełnione 10% (v/v) płodową surowicą bydlęcą, 100 jednostkami ·mL−1 penicyliny-streptomycyny i 15 mM buforem HEPES (plik uzupełniający 1) (pH 7,4) w temperaturze 37 °C poniżej 5% CO2 .
    1. Pasaż komórki z 0,05% trypsyną-EDTA. Komórki nasienne HEK293T na szkiełkach nakrywkowych z poli-L/D-lizyny (PLL/PDL) tak, aby osiągnęły ≥80% zbieżności w czasie transfekcji.
  2. Transfekcja
    1. Przygotować 40 mM roztwór podstawowy AZP w 0,1 M NaOH.
    2. Przygotuj pożywkę z dodatkiem AZP do wzrostu komórek i ekspresji mGluR2. Uzupełnij standardowe pożywki (+ FBS, długopis/paciorkowce, 15 mM HEPES) za pomocą roztworu podstawowego 40 mM AZP. Doprowadzić końcowe stężenie AZP do 0,6 mM. Dodać 1 M roztwór HEPES (dodano połowę objętości 40 mM roztworu podstawowego AZP). Na przykład, aby przygotować 10 ml pożywki z dodatkiem AZP, połącz 9,775 ml pożywki wzorcowej, 150 μl roztworu podstawowego 40 mM AZP i 75 μl 1 M roztworu HEPES.
    3. Przefiltrować (wysterylizować) pożywkę za pomocą filtra strzykawkowego (0,2 μm, PES).
    4. Przed transfekcją należy zastąpić standardowe nośniki nośnikami zawierającymi nośniki z dodatkiem AZP.
      UWAGA: Uważaj, aby nie wysuszyć komórek podczas wymiany nośnika.
    5. Przetransfekować ogniwa odczynnikiem do transfekcji (tabela materiałów) zgodnie z instrukcją producenta. Transfekować komórki HEK293T na szkiełku nakrywkowym o średnicy 18 mm, używając łącznie 2 μg DNA (1000 ng tRNA/syntetazy + 1000 ng plazmidu białkowego zawierającego bursztynowy kodon). Patrz Tabela 1, aby zapoznać się ze stężeniem i objętością użytych składników.
    6. Zmień pożywkę 24 godziny po transfekcji na świeżą pożywkę uzupełnioną AZP i pozwól komórkom rosnąć przez dodatkowe 24 godziny.
  3. Etykietowanie barwnikami alkinowo-cyjaninowymi
    1. 20 minut przed etykietowaniem umyj szkiełka nakrywkowe ciepłym (37 °C) buforem zapisu (RB) (Plik uzupełniający 1) i przenieś je na ciepłe (37 °C) standardowe nośniki bez AZP (+ FBS, Pen/Strep, 15 mM HEPES).
    2. Przygotować roztwór do etykietowania zawierający Cy3-alkin, Cy5-alkin, BTTES, siarczan miedzi (II) (CuSO4), (+) L-askorbinian sodu i aminoguanidynę.
    3. Postępuj zgodnie z kolejnością tworzenia i dodawania rozwiązań (Tabela 2):
      1. Przygotuj 50 mM BTTES.
      2. Przygotować 100 mM aminoguanidyny.
      3. Przygotować 100 mM Na-askorbinianu.
      4. Przygotować 655,5 μl RB.
      5. Dodaj barwnik alkinowy Cy3/Cy5 (10 mM w DMSO) do RB.
        UWAGA: Dodaj aminoguanidynę do RB.
      6. Przygotować 20 mM CuSO4.
      7. Wymieszaj CuSO4 i BTTES w nowej probówce (roztwór zmieni kolor na niebieski).
      8. Dodać mieszaninę CuSO4 i BTTES do RB (2.3.3.6.)
      9. Dodaj Na-askorbinian.
      10. Postępuj zgodnie z objętością podaną w tabeli 2 poniżej dla szkiełka nakrywkowego o grubości 18 mm.
    4. Dokładnie wymieszaj roztwór i inkubuj na lodzie i w ciemności przez 10 minut przed znakowaniem komórek.
    5. Przed dodaniem roztworu do etykietowania do szkiełek nakrywkowych należy usunąć podłoże i umyć je płynem RB. Dodać roztwór do etykietowania i inkubować przez 15 minut w temperaturze 37 °C w ciemnościach.
    6. UWAGA: Aby poprawić znakowanie, po 10 minutach dodaj glutaminian (stężenie końcowe ~0,5 mM) i inkubuj przez dodatkowe 5 minut. Miedź jest bardzo toksyczna dla komórek, a reakcja znakowania nie powinna trwać dłużej niż 15 minut in vivo. Przygotuj wszystkie składniki na świeżo. Na końcu dodaj Na-askorbinian. Podczas przygotowywania utrzymuj reakcję w temperaturze 4°C. Jednakże po dodaniu roztworu do etykietowania, komórki mają być przechowywane w temperaturze 37 °C wewnątrz inkubatora.
  4. Pobieranie komórek i ekstrakcja białek (liza komórek)
    1. Usunąć roztwór do etykietowania i dwukrotnie przemyć szkiełko nakrywkowe (18 mm) zawierające transfekowane komórki mGluR2 za pomocą RB.
    2. Za pomocą pipety zmyj komórki z szkiełka nakrywkowego i ponownie zawieś w RB (1 ml).
      UWAGA: Po tym momencie zminimalizuj ekspozycję próbki na światło tak bardzo, jak to możliwe.
    3. Osadzać komórki, wirując w temperaturze 1 000 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut i usunąć supernatant. Zawiesić osad komórkowy w 80-130 μl roztworu do lizy.
      UWAGA: Osad komórkowy powinien być widoczny gołym okiem. Objętość lizy zależy od ilości próbki utraconej podczas procesu etykietowania i mycia.
    4. Delikatnie wymieszać pipetując, aby rozbić granulki. Zawiń w folię i umieść na bujaku w temperaturze 4 °C na 0,5-1 godzinę w celu lizy komórek.
    5. Frakcję nierozpuszczalną osadzać przez odwirowanie w temperaturze 20 000 x g i w temperaturze 4 °C przez 20 minut. Przenieść supernatant do świeżej zimnej probówki (lizowane białko, które zawiera fluorescencyjnie znakowane białko będące przedmiotem zainteresowania) i przechowywać go na lodzie do celów eksperymentalnych.

3. Montaż i funkcjonalizacja komory przepływu pojedynczej cząsteczki

  1. Wyjmij szkiełko podstawowe i szkiełko nakrywkowe z zamrażarki i pozwól im się ogrzać w temperaturze RT w ciemności (~30 min).
  2. Zmontuj komorę za pomocą taśmy dwustronnej, umieszczając paski taśmy dwustronnej między szkiełkiem a szkiełkiem nakrywkowym. Upewnij się, że powierzchnie PEGylowane tworzą wnętrze komory przepływowej.
  3. Za pomocą końcówki do pipety dociśnij szkiełko nakrywkowe, aby upewnić się, że taśma całkowicie styka się zarówno ze szkiełkiem nakrywkowym, jak i szkiełkiem; należy uważać, aby nie naruszyć szkiełka nakrywkowego. Nałóż żywicę epoksydową na krawędzie szkiełek.
    UWAGA: Nie dodawaj tyle, aby żywica epoksydowa wypełniła wywiercone otwory.
  4. Umieść komorę przepływową stroną szkiełka nakrywkowego skierowaną w dół w nawilżonym ciemnym pudełku, aby żywica epoksydowa wyschła (~ 30 min).
    UWAGA: Dodaj bufor T50 (plik uzupełniający 1) przez wywiercone otwory, aby zapobiec zakrywaniu otworów przez żywicę epoksydową (10-15 μl) w okresie schnięcia.
  5. Inkubować każdy tor komory z 500 nM neutrawidyną (rozcieńczoną w T50), powoli nakładając ~40 μl na każdy pas.
  6. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 minuty w nawilżonym ciemnym pudełku. Przemyć ~100 μL buforu T50 na pas.
  7. Inkubować każdy tor komory z biotynylowanym przeciwciałem 20 nM11. Wybór przeciwciała zależy od znacznika białka.
    UWAGA: Jeśli przeciwciało pierwszorzędowe nie jest biotynylowane, najpierw inkubuj z biotynylowanym przeciwciałem drugorzędowym przez 30 minut, a następnie inkubuj z przeciwciałem pierwszorzędowym.
  8. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut w nawilżonym ciemnym pudełku. Umyć ~200 μL T50 na pas.
    UWAGA: Upewnij się, że pasy nigdy nie wysychają podczas procesu przygotowania.

4. jednocząsteczkowe

  1. Bufor Trolox
    UWAGA: Bufor Trolox jest buforem wyjściowym do tworzenia bufora obrazowania. Składniki buforu są zależne od doświadczenia i mogą się różnić w zależności od białka będącego przedmiotem zainteresowania. Bufor stosowany w opisanym tutaj protokole zawiera sole (NaCl, KCl, CaCl2, MgCl2), środek buforujący (HEPES) i Trolox (pH ~7,35).
    1. Rozpuścić 9-10 mg leku Trolox w 10 ml jednocząsteczkowego buforu rejestrującego (SRB, plik uzupełniający 1)
      UWAGA: Trolox sprawia, że bufor jest lekko kwaśny. Dostosuj pH na tym etapie za pomocą roztworu wodorotlenku sodu (NaOH), 10 M (pH 7,35). Precyzyjna regulacja pH zostanie dokonana po całkowitym rozpuszczeniu leku Trolox; jednak zwiększenie pH w tym momencie zwiększa rozpuszczalność Troloxu.
    2. Mieszać roztwór w temperaturze pokojowej za pomocą stołowego kołyska przez 4-8 godzin (owiniętego folią aluminiową), aby całkowicie rozpuścić Trolox.
    3. Sprawdź pH i dostosuj w razie potrzeby.
    4. Upewnij się, że lek Trolox jest całkowicie rozpuszczony. Wysterylizować roztwór za pomocą filtra strzykawkowego i przechowywać w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Bufor należy zużyć po 2-10 dniach leżakowania. Trolox pomaga tłumić mruganie i jest powszechnie stosowany w badaniach nad pojedynczymi cząsteczkami17. Właściwości zapobiegające mruganiu pochodzą z utlenionej pochodnej Trolox18; dlatego zaleca się trzymanie go w temperaturze pokojowej przez co najmniej kilka godzin, aby dojrzał. Dodatkowo, promieniowanie UV świeżego roztworu Trolox przyspiesza proces utleniania i może być wykorzystane do przyspieszenia "starzenia" Trolox buffer18.
  2. Receptura bufora do obrazowania: Wymieszaj bufor Trolox + detergent (~2-krotność wartości CMC detergentu) + 4 mM kwas protokatechowy (PCA).
    UWAGA: Stężenie detergentu jest utrzymywane w pobliżu CMC, ponieważ wysokie stężenia detergentu mogą powodować zwiększoną denaturację białek. Na przykład można użyć następującej mieszaniny: 955 μL Trolox + 5 μL 10% DDM + cholesterol (W%, 10:1) + 40 μL 100 mM roztworu podstawowego PCA. W tym przypadku PCA działa jako środek przeciwutleniający i był wcześniej stosowany w badaniach smFRET19. DDM jest niejonowy, jest powszechnie stosowany do rozpuszczania białek błonowych20,21 i był stosowany w badaniach pojedynczych cząsteczek. DDM to dobry detergent pierwszego wyboru; Zalecamy jednak przetestowanie wielu detergentów i upewnienie się, że wyniki są spójne.

5. Konfiguracja mikroskopu i akwizycja danych smFRET

  1. Włącz komputer i mikroskop. Włącz lasery, aby się rozgrzały (532 nm dla wzbudzenia Cy3 i 640 nm dla wzbudzenia Cy5).
    UWAGA: W tym przypadku użyto odwróconego mikroskopu wyposażonego w obiektyw TIRF 100x (N.A. 1.49), rozdzielacz obrazu i kamerę EMCCD. Zestaw jest wyposażony w czteroliniowy sumator laserowy, lustro dichroiczne, filtr emisyjny długiego przejścia, filtr dichroiczny emisyjny i filtr wycinający.
  2. Włącz kamerę EMCCD i otwórz oprogramowanie aparatu. Odczekaj 20 minut, aż kamera osiągnie temperaturę -69 °C i ustabilizuje się.
  3. Zamontuj komorę na próbkę na stoliku mikroskopu. Dodawaj próbkę białka stopniowo, aby uzyskać ~400 cząsteczek na pole widzenia (krok 2.4.5). Przemyć komorę 100 μl buforu do obrazowania.
  4. Dostosuj wzmocnienie, szybkość akwizycji i moce lasera tak, aby sygnały fluorescencji pojedynczej cząsteczki były wykrywane zarówno w kanale donorowym, jak i akceptorowym. W razie potrzeby dostosować stężenie białek w komorze na próbkę.
    UWAGA: Przy ponad 400 cząsteczkach w polu widzenia rozróżnienie poszczególnych cząsteczek staje się trudniejsze, a szum tła będzie wyższy.
  5. Pobudź dawcę i uzyskaj ślady czasowe, aż co najmniej 80% cząsteczek donora w polu widzenia zostanie fotowybielonych.
  6. Pod koniec filmu włącz laser 640 nm, aby bezpośrednio wzbudzić akceptor, aż niektóre cząsteczki akceptora wytryśnieją, ułatwiając dyskryminację pojedynczej cząsteczki z multimerów.
  7. Przejdź do innego pola widzenia i powtórz powyższe kroki, aby zebrać co najmniej trzy filmy (repliki techniczne) dla każdego warunku.
    UWAGA: Użyj najniższej możliwej mocy lasera podczas wybierania nowego obszaru zainteresowania (ROI) i ustawiania ostrości, aby zminimalizować fotowybielanie. Zwróć uwagę na dryf etapu podczas akwizycji. Jeśli po przejściu do nowego zwrotu z inwestycji zostanie zaobserwowany zauważalny dryf, odczekaj 3 minuty przed rozpoczęciem akwizycji.

6. Analiza danych

  1. Wyrównanie kanału dawcy i akceptora (mapowanie filmu)
    1. Zapisz obrazy kulek fluorescencyjnych w kanałach dawczych i akceptorowych.
    2. Wygeneruj plik mapowania, korzystając z danych o kulkach, aby skorelować fluorescencję donora i akceptora z każdej cząsteczki22,23.
      UWAGA: Sygnał emisyjny z pojedynczej cząsteczki jest dzielony na sygnały donorowe i akceptorowe przez dichroiczny filtr emisyjny wewnątrz rozdzielacza obrazu. Obrazy dawcy i akceptora są wyświetlane w kamerze obok siebie. Aby dokładnie powiązać intensywność donora i akceptora pojedynczej cząsteczki między tymi dwoma obszarami, często generowany jest plik mapowania przy użyciu próbek kulek fluorescencyjnych. Za pomocą tego pliku mapowania wszystkie cząsteczki wykryte w kanałach donorowym i akceptorowym są mapowane na siebie. Następnie analiza generuje ślady czasowe, które są intensywnościami donora i akceptora w czasie, dla każdej cząsteczki.
  2. Wybór jednocząsteczkowych śladów FRET (zbieranie cząstek)
    UWAGA: Poszczególne ślady cząstek są badane i wybierane do dalszej analizy za pomocą MATLAB. Dokładne kryteria wyboru zależą od systemu. Ogólne wytyczne dotyczące tego, co stanowi cząstkę wysokiej jakości, są przedstawione tutaj. Wszystkie niestandardowe zmodyfikowane kody są dostępne w serwisie GitHub (https://github.com/vafabakhsh-lab).
    1. Wybrać ślady, w których całkowita intensywność śladów (dawca + akceptor) jest stabilna w czasie. Wybrać ślady z antyskorelowanymi zmianami intensywności dawców i akceptorów.
    2. Wybierz cząsteczki dawcy i akceptora, które wykazują jednoetapowe fotowybielanie. Zaznacz ślady o długości >5 s.
      UWAGA: Tło w każdym kanale po wybieleniu powinno spaść do zera. Ślady nie powinny mieć wielu mrugających zdarzeń; Zwiększy to trudność analizy.
    3. Oblicz wydajność FRET za pomocą równania E = (IA− 0,088 × ID)/(ID + [IA− 0,088 × ID])24,25,26, gdzie ID iI A to odpowiednio surowe intensywności dawcy i akceptora.
      UWAGA: Wyciek emisji donorowej do kanału akceptora określa się za pomocą próbki znakowanej tylko przez donor wzbudzonej za pomocą lasera 532 nm 26. Współczynnik korekcji wycieku, 0,088, może się różnić dla różnych konfiguracji w zależności od zastosowanych zestawów filtrów. Ważne jest, aby zauważyć, że ilościowa i solidna konwersja wydajności FRET na odległości bezwzględne wymaga korekty intensywności donora i akceptora dla wielu czynników i została szeroko omówiona wcześniej27.
  3. Zidentyfikuj stan konformacyjny za pomocą ukrytego modelowania Markowa (HMM)
    1. Uruchamiamy program vbFRET28 w MATLABie i importujemy wybrane ślady dla danego warunku. Ustaw ograniczenia dotyczące liczby potencjalnych stanów i iteracji do wykonania.
      UWAGA: Na podstawie surowych danych z reprezentatywnych wyników postawiono hipotezę, że czujnik konformacyjny zajmował do czterech dyskretnych stanów FRET; W ten sposób wyznaczono zakres od jednego do czterech stanów. Wcześniej stwierdzono, że poprawa dopasowania nieznacznie wzrasta wraz z iteracjami >25; W związku z tym do dopasowania reprezentatywnych danych wykorzystano 25 iteracji.
    2. Przeanalizuj ślady smFRET i wyeksportuj wyidealizowane ślady oraz sesję analizy. Zapisz wyidealizowane ślady w osobnym folderze do dalszej analizy.
      UWAGA: Programy używane do wyodrębniania danych o przejściach stanów i czasie przebywania z wyidealizowanych śladów zostały udostępnione we wcześniej opublikowanych work29.
    3. Korzystając z programów MATLAB, wyodrębnij przejścia stanów i wykreśl je jako mapę cieplną ze współrzędną X wskazującą konformację początkową i współrzędną Y wskazującą konformację końcową.
      UWAGA: Przejścia definiuje się jako zmiany wartości FRET >0,1 w omówionych tutaj reprezentatywnych wynikach. Próg przejść zależy od hipotetycznych stanów konformacyjnych, w których znajduje się białko będące przedmiotem zainteresowania (należy ustawić próg przejścia na wartość mniejszą niż różnica między najbliższymi stanami FRET), a także od rozdzielczości dozwolonej przez układ eksperymentalny. Badanie map cieplnych dla wielu warunków umożliwia identyfikację najczęstszych stanów konformacyjnych, przez które przechodzi czujnik, a tym samym je zajmuje. Dla reprezentatywnych wyników zidentyfikowano cztery stany FRET (FRET = 0,31, 0,51, 0,71 i 0,89).
    4. Korzystając z programów MATLAB, wyodrębnij czasy przebywania dla każdego zidentyfikowanego stanu konformacyjnego. Wyznacz zakres wartości FRET wyznaczających każdy stan i rozdzielczość czasową podczas pozyskiwania danych. Zakresy FRET są równomiernie podzielone przez sąsiednie stany FRET. Eksport czasów przebywania dla danych warunków leczenia.
      UWAGA: W większości przypadków dane dotyczące czasu przebywania można dobrze oszacować za pomocą pojedynczej funkcji rozkładu wykładniczego. Analizę tę można przeprowadzić w oprogramowaniu do analizy danych i tworzenia wykresów.
  4. Dopasowanie Gaussa histogramów populacji smFRET w celu ilościowego określenia obłożenia stanu
    1. Importuj histogramy FRET populacji dla interesujących warunków do analizy danych i oprogramowania do tworzenia wykresów w celu analizy dopasowania wielu pików.
    2. Wskaż liczbę obecnych pików (cztery piki lub stany na podstawie analizy HMM). Dopasowanie zostało przeprowadzone przy użyciu wielu rozkładów Gaussa30 zdefiniowany jako figure-protocol-1, gdzie A to obszar piku, xc to środek szczytu, a w to szerokość piku dla każdego piku.
    3. Ogranicz parametry dopasowania jako A > 0, xc = FRET ± 0,02 i 0,1 ≤w≤ 0,24. Cztery piki FRET dla histogramów FRET dla poszczególnych populacji były dopasowane jednocześnie. Zastosuj zdefiniowane wiązania dla łączników we wszystkich warunkach.
    4. Oblicz stan zajętości (w procentach) jako obszar szczytu zainteresowania podzielony przez powierzchnię całkowitą, zdefiniowaną jako suma wszystkich szczytów.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ekspresja i fluorescencyjne znakowanie czujnika FRET opartego na UAA
W niniejszym artykule omówiono przykładowe wyniki insercji i znakowania fluorescencyjnego UAA (AZP) w CRD mGluR2 (548UAA) 11. Jak wspomniano wcześniej, aby wstawić AZP do mGluR2, konieczna jest koekspresja zaprojektowanej maszynerii translacyjnej, która obejmuje zmodyfikowaną syntetazę tRNA i komplementarne tRNA (pIRE4-Azi) oraz mGluR2 zawierającą bursztynowy kodon w pozycji 548, utworzony przy użyciu mutagen...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

GPCR to białka, które działają na błonę komórkową w celu zainicjowania transdukcji sygnału. Wiele GPCR składa się z wielu domen, przy czym sygnalizacja jest zależna od kooperacyjnej interakcji między domenami. Aby modulować właściwości tych receptorów błonowych, konieczne jest zrozumienie dynamicznego zachowania wielu domen. Transfer energii rezonansu fluorescencji pojedynczej cząsteczki (smFRET) to technika fluorescencyjna, która umożliwia pomiar konformacji i dynamiki białek w czasie rzeczywistym11,32...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy członkom laboratorium Reza Vafabakhsh za dyskusje. Prace te były wspierane przez R01GM140272 grantowe National Institutes of Health (dla R.V.), przez The Searle Leadership Fund for the Life Sciences na Northwestern University oraz przez Chicago Biomedical Consortium przy wsparciu Searle Funds w The Chicago Community Trust (do R.V.). B.W.L. był wspierany przez National Institute of General Medical Sciences (NIGMS) Training Grant T32GM-008061.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
(+)-Askorbinian soduSigma AldrichCat # 11140-250G
4-azydo-L-fenyloalaninaChem-Impex InternationalCat # 06162
548UAALiauw i in. 2021Transfekowany konstrukt
Kwas octowyFisher Chemical64-19-7
AcetonFisher Chemical67-64-1
Adobe Illustrator (2022)https://www.adobe.com/RRID:SCR_010279Oprogramowanie, algorytm
Aminoguanidyna (chlorowodorek)Cayman Chemical81530
AminosilanAldrich919-30-2
Sonikator do kąpieli 2,8 LFisher ScientificKąpiel ultradźwiękowa 2,8 l
Biotyna-PEGLaysan Bio IncPozycja# Biotyna-PEG-SVA-5000-100mg
BTTESClick Narzędzia chemiczne1237-500
Siarczan miedzi (II)Sigma AldrichCat # 451657-10G
Szkiełko nakrywkoweVWR16004-306Komora na próbki
Cy3 AlkineClick Narzędzia chemiczneTA117-5
Cy5 AlkineClick Narzędzia chemiczneTA116-5
DDMAnatraceCzęść # D310 1 GMDetergent
DDM-CHS (10:1)AnatraceCzęść # D310-CH210 1 MLDetergent z cholekterolem
Zdefiniowana płodowa surowica bydlęcaThermo Fisher ScientificSH30070.03
Di01-R405/488/561/635Filtr wycinający Semrock
DMEMCorning10-013-CV
EMCCDKamera AndorDU-897U
ET542lpdługoprzepustowyChroma
FF640-FDi01SemrockFiltr dichroiczny emisji
przeciwciałoGenscriptA01429
Koralik fluorescencyjnyInvitrogen T7279Mikrosfery TetraSpeckKoralik sferyczny
Szkiełkaszklane Fisherfinest12-544-4komora na próbki
GlutaminianSigma AldrichCat # 6106-04-3
HEK 293TSigma AldrichCat # 12022001Linia komórkowa
HEPESFisherBioReagents7365-45-9
Rozdzielacz obrazuOptoSplit II
KOHFluka1310-58-3
LaserOxxius4-liniowy łącznik laserowy
Lipofectamine 3000 Odczynnik do transfekcjiThermo Fisher ScientificL3000015Odczynnik do transfekcji
MetanolFisher Chemical67-56-1
Mikroskop OlympusOlympus IX83
Milli-Q dejonizatorwodyBarnstead
m-PEGLaysan Bio IncPozycja# MPEG-SIL-5000-1g
NF03-405/488/532/635Lustro dichroiczneSemrock
OptiMEMThermo Fisher Scientific51985091Zredukowane podłoże w surowicy
OptiMEM/Zredukowane podłoże w surowicy ThermoFisher Scientific
OriginPro (2020b)https://www.originlab.com/RRID:SCR_014212Oprogramowanie do analizy danych i tworzenia wykresów
Penicylina-StreptomycynaGibco15140-122
pIRE4-AziAddgene Plazmid # 105829Transfekowany konstrukt
Bromowodorek poli-L-lizynySigma AldrichCat # P2636
Kwas protokatechowy (PCA)HWI grupa99-50-3
smCamera (wersja 1.0)http://ha.med.jhmi.edu/resources/Camera oprogramowanie
Wodorowęglan soduFisherBioReagents144-55-8
Wodorotlenek sodu (NaOH)Sigma1310-73-2
Filtr strzykawkowyWhatman UNIFLOCat#9914-2502Filtracja cieczy
TroloxSigma53188-07
Filtr FLAG-tag

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Smock, R. G., Gierasch, L. M. Sending signals dynamically. Science. 324 (5924), 198-203 (2009).
  2. Changeux, J. P., Christopoulos, A. Allosteric modulation as a unifying mechanism for receptor function and regulation. Cell. 166 (5), 1084-1102 (2016).
  3. Tang, X. -l, Wang, Y., Li, D. -l, Luo, J., Liu, M. -Y. Orphan G protein-coupled receptors (GPCRs): biological functions and potential drug targets. Acta Pharmacologica Sinica. 33 (3), 363-371 (2012).
  4. Chung, K. Y., et al. Conformational changes in the G protein Gs induced by the β2 adrenergic receptor. Nature. 477 (7366), 611-615 (2011).
  5. Vafabakhsh, R., Levitz, J., Isacoff, E. Y. Conformational dynamics of a class C G-protein-coupled receptor. Nature. 524 (7566), 497-501 (2015).
  6. Niswender, C. M., Conn, P. J. Metabotropic glutamate receptors: Physiology, pharmacology, and disease. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 50, 295-322 (2010).
  7. Pin, J. P., Bettler, B. Organization and functions of mGlu and GABA(B) receptor complexes. Nature. 540 (7631), 60-68 (2016).
  8. Kniazeff, J., et al. Closed state of both binding domains of homodimeric mGlu receptors is required for full activity. Nature Structural & Molecular Biology. 11 (8), 706-713 (2004).
  9. Ha, T. Single-molecule fluorescence resonance energy transfer. Methods. 25 (1), 78-86 (2001).
  10. Schuler, B., Eaton, W. A. Protein folding studied by single-molecule FRET. Current Opinion in Structural Biology. 18 (1), 16-26 (2008).
  11. Liauw, B. W. -H., Afsari, H. S., Vafabakhsh, R. Conformational rearrangement during activation of a metabotropic glutamate receptor. Nature Chemical Biology. 17 (3), 291-297 (2021).
  12. Noren, C. J., Anthonycahill, S. J., Griffith, M. C., Schultz, P. G. A general method for site-specific incorporation of unnatural amino acids into proteins. Science. 244 (4901), 182-188 (1989).
  13. Presolski, S. I., Hong, V. P., Finn, M. Copper-catalyzed azide-alkyne click chemistry for bioconjugation. Current Protocols in Chemical Biology. 3 (4), 153-162 (2011).
  14. Huber, T., Naganathan, S., Tian, H., Ye, S. X., Sakmar, T. P. Unnatural amino acid mutagenesis of GPCRs using amber codon suppression and bioorthogonal labeling. G Protein Coupled Receptors: Structure. 520, 281-305 (2013).
  15. Serfling, R., Coin, I. Chapter Four - Incorporation of Unnatural Amino Acids into Proteins Expressed in Mammalian Cells. Methods in Enzymology. Pecoraro, V. 580, Academic Press. Cambridge, MA. 89-107 (2016).
  16. Chandradoss, S. D., et al. Surface passivation for single-molecule protein studies. Journal of Visualized Experiments. (86), e50549(2014).
  17. Rasnik, I., McKinney, S. A., Ha, T. Nonblinking and long-lasting single-molecule fluorescence imaging. Nature Methods. 3 (11), 891-893 (2006).
  18. Cordes, T., Vogelsang, J., Tinnefeld, P. On the mechanism of Trolox as antiblinking and antibleaching reagent. Journal of the American Chemical Society. 131 (14), 5018-5019 (2009).
  19. Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments. Biophysical Journal. 94 (5), 1826-1835 (2008).
  20. Lee, S., et al. How do short chain nonionic detergents destabilize G-protein-coupled receptors. Journal of the American Chemical Society. 138 (47), 15425-15433 (2016).
  21. Cao, A. -M., et al. Allosteric modulators enhance agonist efficacy by increasing the residence time of a GPCR in the active state. Nature Communications. 12 (1), 1-13 (2021).
  22. Mancebo, A., Mehra, D., Banerjee, C., Kim, D. -H., Puchner, E. M. Efficient cross-correlation filtering of one-and two-color single molecule localization microscopy data. Frontiers in Bioinformatics. 1, 739769(2021).
  23. Mehra, D., Adhikari, S., Banerjee, C., Puchner, E. M. Characterizing locus specific chromatin structure and dynamics with correlative conventional and super-resolution imaging in living cells. Nucleic Acids Research. , (2022).
  24. Chen, H., Puhl, H. L., Koushik, S. V., Vogel, S. S., Ikeda, S. R. Measurement of FRET efficiency and ratio of donor to acceptor concentration in living cells. Biophysical Journal. 91 (5), 39-41 (2006).
  25. Gopich, I. V., Szabo, A. FRET efficiency distributions of multistate single molecules. The Journal of Physical Chemistry B. 114 (46), 15221-15226 (2010).
  26. Roy, R., Hohng, S., Ha, T. A practical guide to single-molecule FRET. Nature Methods. 5 (6), 507-516 (2008).
  27. Hellenkamp, B., et al. Precision and accuracy of single-molecule FRET measurements-A multi-laboratory benchmark study. Nature Methods. 15 (9), 669-676 (2018).
  28. Bronson, J. E., Fei, J., Hofman, J. M., Gonzalez, R. L., Wiggins, C. H. Learning rates and states from biophysical time series: A Bayesian approach to model selection and single-molecule FRET data. Biophysical Journal. 97 (12), 3196-3205 (2009).
  29. Zhang, J., et al. Specific structural elements of the T-box riboswitch drive the two-step binding of the tRNA ligand. Elife. 7, 39518(2018).
  30. Goodman, N. R. Statistical analysis based on a certain multivariate complex Gaussian distribution (an introduction). The Annals of Mathematical Statistics. 34 (1), 152-177 (1963).
  31. Brown, R. B., Audet, J. Current techniques for single-cell lysis. Journal of the Royal Society Interface. 5, Suppl 2 131-138 (2008).
  32. Schamber, M. R., Vafabakhsh, R. Mechanism of sensitivity modulation in the calcium-sensing receptor via electrostatic tuning. Nature Communications. 13 (1), 2194(2022).
  33. Jain, A., Liu, R., Xiang, Y. K., Ha, T. Single-molecule pull-down for studying protein interactions. Nature Protocols. 7 (3), 445-452 (2012).
  34. Huang, S. K., et al. Delineating the conformational landscape of the adenosine A(2A) receptor during G protein coupling. Cell. 184 (7), 1884-1894 (2021).
  35. Wingler, L. M., et al. Angiotensin analogs with divergent bias stabilize distinct receptor conformations. Cell. 176 (3), 468-478 (2019).
  36. Gordon, C. G., et al. Reactivity of biarylazacyclooctynones in copper-free click chemistry. Journal of the American Chemical Society. 134 (22), 9199-9208 (2012).
  37. Kim, E., Koo, H. Biomedical applications of copper-free click chemistry: In vitro, in vivo, and ex vivo. Chemical Science. 10 (34), 7835-7851 (2019).
  38. Pickens, C. J., Johnson, S. N., Pressnall, M. M., Leon, M. A., Berkland, C. J. Practical considerations, challenges, and limitations of bioconjugation via azide-alkyne cycloaddition. Bioconjugate Chemistry. 29 (3), 686-701 (2018).
  39. Geng, Y., et al. Structural mechanism of ligand activation in human calcium-sensing receptor. Elife. 5, 13662(2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Single Molecule FRETMembrane ReceptorsConformational DynamicsProtein LabelingMetabotropic Glutamate ReceptorsGPCR ActivationHidden Markov ModelingFluorescent SensorsHEK 293T CellsSite Specific Labeling

Related Articles