Method Article

Opracowywanie i testowanie metylowanych nanostrukturalnych dipeptydów, które hamują aktywność kinazy Src in vitro do zastosowań przeciwnowotworowych

DOI:

10.3791/64256

⸱

November 30th, 2022

 ,  , 
1Biochemistry Department, College of Science, King Abdulaziz University, 2Independent Scholar, 3School of Health Sciences and Biomedical Engineering, Hebei University of Technology, 4School of Engineering, Saveetha University, 5Programa de Pós-graduação em Ciência e Engenharia dos Materiais, UFPI

In This Article

Retraction Notice

The article Developing and Testing Methylated Nano-Structured Dipeptides that Inhibit Src Kinase Activity In Vitro for Anti-Cancer Applications has been retracted by the journal due to authorship and reproducibility concerns.

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prezentowany tutaj jest protokół projektowania i testowania dipeptydów, które mogą hamować aktywność enzymu kinazy Src za pomocą testów bezkomórkowych i komórkowych do zastosowań przeciwnowotworowych. Sformułowane tutaj peptydy (WRCH3, WCH3-R CH3 i W-R(CH3)2) hamowały kinazę Src o wartościach IC50 wynoszących odpowiednio 510 nM, 916 nM i 1 μM.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj, w celu opracowania nowatorskiego leczenia przeciwnowotworowego, zaprojektowano siedem dipeptydów, które zawierały metylowany tryptofan i/lub metylowaną argininę i zostały wyprodukowane przy użyciu syntezy peptydów fazy stałej Fmoc. Nadekspresja enzymu kinazy tyrozynowej Src jest zaangażowana w rozwój różnych nowotworów. Wcześniej wykazano, że dipeptydy zawierające nienaturalne aminokwasy, takie jak metylowana arginina (RCH3), dimetyloowana arginina (R(CH3)2) i/lub metylowane reszty tryptofanu (WCH3) hamują kinazę Src. W tym badaniu trzy takie dipeptydy, WRCH3, WCH3-R CH3 i WR(CH3)2, przetestowano przy użyciu testów bezkomórkowych i stwierdzono, że mają wartości IC50 (stężenie, przy którym następuje 50% inhibicja) wynoszące odpowiednio 510 nM, 916 nM i 1 μM. Wartości te były porównywalne z uzyskanymi dla cyklicznych peptydów penta- do nano-W-R ([W-R]5-[W-R]9) syntetyzowanych w poprzednich badaniach. Jednak niemetylowane wersje dipeptydów nie wykazywały żadnej aktywności hamującej wobec kinazy Src. Wszystkie te dipeptydy (50 μM) nie wykazały żadnej cytotoksyczności po inkubacji do 72 godzin z trzema różnymi liniami komórek nowotworowych, w tym białaczką (CCRF-CEM), gruczolakorakiem piersi (MDA-MB-231) i gruczolakorakiem jajnika (SK-OV-3), co wskazuje na ograniczoną przepuszczalność peptydów przez błonę komórkową. Dlatego potrzebne są dalsze badania, aby poprawić przepuszczalność tych peptydów do zastosowań przeciwnowotworowych, takich jak użycie nośnika peptydowego lub dodatkowej funkcjonalizacji peptydów. Podsumowując, badanie to zapewnia protokół syntezy i testowania peptydów, które hamują aktywność kinazy Src, a tym samym mają obiecujące zdolności przeciwnowotworowe, jak wykazano za pomocą testów bezkomórkowych i komórkowych.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rak jest spowodowany nieprawidłowym wzrostem normalnych komórek i jest jedną z najbardziej śmiertelnych chorób na całym świecie. Te nieprawidłowe komórki rozprzestrzeniają się do różnych narządów w ciele w procesie zwanym przerzutami. Najczęstszą postacią raka jest rak piersi, który wystąpił u 2,26 miliona osób w 2020 roku. Co więcej, w 2020 roku odnotowano około 1,80 miliona zgonów z powodu raka płuc1. Według Światowej Organizacji Zdrowia około 10 milionów ludzi zmarło na raka w 2020 roku2. Komórki rakowe różnią się od normalnych komórek tym, że wykazują nadekspresję niektórych enzymów, takich jak białkowe kinazy tyrozynowe (PTK). National Cancer Institute definiuje kinazy jako enzymy zdolne do fosforylacji innych białek lub cukrów3. Wiedza na temat funkcji regulacyjnej kinaz może ułatwić projektowanie skutecznych leków przeciwnowotworowych. Na przykład PTK katalizują fosforylację innych białek lub cukrów, w wyniku czego ATP jest przekształcane w ADP przez utratę grupy fosforanowej. W sumie 80% onkogenów i protoonkogenów koduje PTKs4. Kinazy Src to rodzina niereceptorowych kinaz tyrozynowych, w tym Lck, Fyn, Hck, Blk, Yes i Yrk, które ulegają nadekspresji w komórkach rakowych, zwłaszcza w raku piersi5,6. Kinazy tyrozynowe Src są związane z mitogenezą, różnicowaniem, aktywacją komórek T i transformacją komórek. Src pomaga w inwazji komórek rakowych i przerzutach ze względu na swoją zdolność do zmniejszania adhezji komórek rakowych. W kinazie Src występuje pięć różnych domen, uporządkowanych od N- do C-końców jako: domena kwasów tłuszczowych, domena homologii Src 3 (SH3), domena homologii Src 2 (SH2), domena kinazy tyrozynowej (SH1) i domena regulatorowa C-końcowa7.

figure-introduction-1
Rysunek 1: Domeny docelowe w enzymie kinazy Src, w tym domena SH3, domena SH2, domena kinazy (SH1) i krótki C-końcowy segment regulatorowy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Domena kinazy SH1 jest najczęściej celem podczas projektowania inhibitorów kinazy Src, ponieważ zawiera dwa konserwatywne miejsca do wiązania ATP i substratu (Rysunek 1). Jeśli znana jest sekwencja aminokwasowa domeny kinazy, substrat może być również wykorzystany jako cel do zaprojektowania związku, który naśladuje wiązanie substratu z kinazą Src8. Ponadto inne witryny, takie jak domeny SH3 i SH2, mogą być używane jako cele. W porównaniu z innymi środkami chemioterapeutycznymi, inhibitory kinaz wykazują mniejszą toksyczność i wyższą skuteczność9. Według stanu na wrzesień 2021 r. istnieją 73 małe cząsteczki, które działają jako inhibitory kinaz, które zostały zatwierdzone przez FDA10. Imatynib jest przykładem leku przeciwnowotworowego, który selektywnie hamuje aktywność kinazy tyrozynowej; Jednak niektórzy pacjenci są oporni na lek ze względu na pojawienie się mutacji punktowej w domenie kinazy11. AstraZeneca wypuściła na rynek Saracatinib, który jest lekiem hamującym rodzinę kinaz tyrozynowych Src o wartości IC50 (stężenie, przy którym następuje 50% hamowanie) wynoszącej 2,7 nM, ale został on zdyskontowany w badaniach fazy 212. Spośród 52 inhibitorów PTK zatwierdzonych przez amerykańską FDA na początku 2020 r13, tylko 28 docelowych receptorów PTK, 11 blokuje niereceptorowe PTK, 11 hamuje kinazy białkowo-serynowo-treoninowe, a dwa blokują MEK1/213. Rosnące zainteresowanie badaniami w onkologii będzie nadal napędzać odkrywanie inhibitorów kinaz jako potencjalnych leków przeciwnowotworowych. Jednak do tej pory tylko 50 z 500 kinaz białkowych zostało skierowanych do leczenia; W związku z tym oczekuje się, że w niedalekiej przyszłości zostanie przebadana większa liczba kinaz pod kątem opracowania leków14. Ponadto istnieje potrzeba odkrycia inhibitorów kinaz w celu zbadania jeszcze niezidentyfikowanych mutacji kinaz, które prowadzą do raka.

Tak więc, to badanie miało na celu opracowanie peptydów, które mogłyby być używane jako inhibitory dla rodziny Src i celować w miejsce wiązania ATP ze względu na jego zdolność do pełnienia funkcji konserwatywnego miejsca między różnymi kinazami. W tym celu zsyntetyzowano szereg dipeptydów zawierających metylowany tryptofan i/lub metylowaną argininę i przetestowano je pod kątem ich synergistycznej zdolności do hamowania kinazy Src. Pierścień indolowy tryptofanu naśladuje adeninę ATP i konkuruje z ATP od wiązania się z miejscem wiązania ATP. Ponadto metylowana arginina w ligandzie konkuruje o domenę SH3 Src. Naukowcy wykazali, że polipeptyd zawierający zdemetylowaną argininę hamuje domenę SH3, prawdopodobnie ze względu na specyficzną konserwatywną sekwencję na motywie wiążącym SH3 (tj. PXXP), która ma powinowactwo wiązania do liganda zawierającego dwie do trzech reszt Arg w N-końcu lub jedną do dwóch reszt Arg na C-końcu ligandów15, 16,17. Grupa guanidynowa Arg wiąże się z konserwowaną resztą Asp-99 domeny SH318,19, podczas gdy pozostała część Arg wiąże się z konserwatywnym Trp-118 enzymu, co potwierdzono na podstawie analizy NMR i struktur krystalicznych kilku domen SH319. W tym artykule przedstawiono protokół syntezy siedmiu metylowanych dipeptydów i badania ich zdolności hamowania wobec kinazy Src. Ponadto zbadano zdolność tych peptydów do zabijania kilku linii komórek rakowych in vitro.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Synteza peptydów

UWAGA: Synteza W-R jest opisana jako reprezentatywny przykład (Rysunek 2).

  1. Odważyć 566 mg (0,3 mmol) żywicy H-Arg(Pbf)-2-chlorotrirylu i dodać ją do naczynia do syntezy peptydów (patrz tabela materiałów), zgodnie z procedurą zastosowaną przez Mandal et al20. Przeprowadź syntezę peptydów przy użyciu dobrze znanej strategii syntezy peptydów w fazie stałej (SPPS)21.
    UWAGA: Metylowane lub dimetylowane dipeptydy zawierające nienaturalne aminokwasy zostały złożone na żywicy amidowej lodowiska (nośność 0,3 mmol/g), podczas gdy dipeptydy zawierające naturalne aminokwasy zostały złożone na żywicy, do której przyłączony był pierwszy aminokwas, taki jak żywica H-Arg(Pbf)-2-chlorotriryl (nośność 0,3 mmol/g). Co ważne, żywica amidowa na lodowisku wytwarza peptyd pokryty C-końcowym NH2.
  2. Pęcznieć suchą żywicę przez 1 godzinę w 5 ml N,N-dimetyloformamidu (DMF) pod ciśnieniem azotu gazowego połączonego z naczyniem peptydowym.
    UWAGA: Cały proces syntezy należy przeprowadzić w dygestorium. Przez cały czas trwania eksperymentu należy nosić gogle, rękawice i fartuch laboratoryjny. Timer jest również niezbędny do śledzenia między etapami dodawania odczynników chemicznych.
  3. Usunąć nadmiar DMF za pomocą azotu pod ciśnieniem połączonym z naczyniem do syntezy peptydów przez cały proces syntezy.
  4. Odważyć 473,9 mg Fmoc-trp(Boc)-OH (0,9 mmol) i 341 mg 2-(1H-benzotriazolo-1-ylo)-1,1,3,3-tetrametylofluorofosforanu (HBTU) (0,9 mmol) jako odczynniki sprzęgające. Dodaj proszki do probówki i rozpuść je w 5 ml suchego DMF.
  5. Dodać 313,4 μl (1,8 mmol) N,N-diizopropyloetyloaminy (DIPEA) jako czynnika aktywującego do probówki (krok 1.4) i wymieszać, potrząsając probówką.
  6. Dodać zawartość probówki do żywicy i pozostawić reakcję do przebiegu przez 1 godzinę w atmosferze azotu w temperaturze pokojowej. Następnie odcedź nadmiar DMF za pomocą ciśnienia azotu gazowego i umyj żywicę 3x DMF.
  7. Odbezpiecz N-końcowy Fmoc za pomocą 5 ml 20% piperydyny w DMF (v/v) przez 20 minut w gazowym azocie. Umyj żywicę 3x DMF (3 x 5 mL).
  8. Wysuszyć żywicę, dodając 5 ml dichlorometanu (DCM) i trzymać ją pod gazowym azotem przez 5 minut, a następnie opróżnić DCM za pomocą ciśnienia azotu gazowego. Dodaj 5 ml metanolu pod gazowym azotem przez 5 minut, aby zwiększyć suchość żywicy.
  9. Dodaj 10 ml świeżo przygotowanego koktajlu rozszczepienia składającego się z TFA/tioanizolu/ditiotreitolu/anizolu (90:3:5:2 v/v/w/v) przez 2,5 godziny, aby odbezpieczyć wszystkie łańcuchy boczne i odciąć dipeptyd od żywicy.
    UWAGA: Koktajl z łupliwości należy dodać do szklanego cylindra miarowego, ponieważ TFA jest kwaśny i niebezpieczny; Zachowaj ostrożność podczas korzystania z niego.
  10. Po 2,5 godziny spuścić roztwór reakcyjny z naczynia peptydowego pod ciśnieniem azotu do kolby okrągłodennej. Dodać 250 ml zimnego eteru dietylowego (Et2O) do kolby okrągłodennej zawierającej surowy peptyd w celu wytrącenia peptydu.
  11. Przefiltruj wytrącony peptyd za pomocą bibuły filtracyjnej w stożkowym lejku z jednym bocznym ramieniem, które jest połączone z wodą (tak, aby filtracja zachodziła z powodu ciśnienia wody) i zebrać osad (peptydy), aby całkowicie usunąć eter. Surowy peptyd wytrąca się w ciągu 10 minut.
  12. Oczyścić surowy peptyd na kolumnie wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) z odwróconymi fazami (patrz tabela materiałów) przy użyciu systemu gradientowego. Stosować gradient 0%-100% acetonitrylu zawierający 0,1% TFA w wodzie zawierającej 0,1% TFA przez 30-60 minut przy natężeniu przepływu 1 ml/min.

figure-protocol-1
Rysunek 2: Synteza peptydów w fazie stałej W-R. Skróty: HBTU = heksafluorofosforan 2-(1H-benzotriazol-1-ylo)-1,1,3,3-tetrametyloironium; DIPEA = N,N-diizopropyloetyloamina; TFA = kwas trifluorooctowy; DMF = dimetyloformamid. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

2. Określenie toksyczności komórkowej syntetyzowanych peptydów

  1. Płytka 2,000 komórek / dołek komórek SK-OV-3, 5,000 komórek / studzienka komórek MDA-MB-231 lub 5 × 106 komórek / studzienka komórek CCRF-CEM (w całkowitej objętości 100 μL / dołek) do 96-dołkowej mikropłytki. Inkubuj komórki w wilgotnej atmosferze o zawartości 5% CO2 i 95% powietrza o temperaturze 37 °C, aż osiągną 75%-80% konfluencji.
    UWAGA: Pożywka RPMI-16 jest używana do hodowli komórek CCRF-CEM i minimalnej niezbędnej pożywki Eagle (EMEM) zarówno dla linii komórkowych MDA-MB-231, jak i SK-OV-3. Obie pożywki są uzupełnione 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1% penicyliną/streptomycyną (10 000 jednostek/ml penicyliny i 10 mg/ml streptomycyny w 0,9% NaCl). Umieść wszystkie podłoża i suplementy w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na 30 minut przed rozpoczęciem eksperymentu. Eksperyment powinien być przeprowadzony w kapturze bezpieczeństwa biologicznego, w rękawiczkach i fartuchu laboratoryjnym.
  2. Odessać pożywkę za pomocą pipety i dodać 100 μl peptydu 50 μM lub 10 μM doksorubicyny (Dox) użytej jako kontrola pozytywna w trzech próbkach do studzienek zawierających trzy różne typy komórek rakowych posianych na płytce 96-dołkowej. Umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze na 72 godziny (w takich samych warunkach, jak opisano w kroku 2.1).
  3. Po 72 godzinach dodać 20 μl 3-(4,5-dimetylotiazol-2-ylo)-5-(3-karboksymetoksyfenylo)-2-(4-sulfofenylo)-2H-tetrazolium (MTS) do płytki 96-dołkowej. Owinąć płytkę folią aluminiową i inkubować płytkę przez 1-4 godziny w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze.
    UWAGA: MTS jest barwnikiem używanym do wizualizacji żywych komórek (nietraktowanych lub traktowanych peptydami), ponieważ tylko żywe komórki przekształcają tetrazolium MTS w kolorowy barwnik formazanu, który można zmierzyć przy 490 nm.
  4. Zmierzyć absorbancję produktu formazanu przy długości fali 490 nm (A490) na czytniku mikropłytek (patrz tabela materiałów). Dołącz pożywkę zmieszaną z MTS jako ślepą próbę do eksperymentu. Stosować samą wodę (ponieważ peptydy są rozpuszczalne w wodzie) i 0,1 N HCl (ponieważ WCH3 wymaga HCl do rozpuszczenia) jako kontrole ujemne.
  5. Zmierz procent przeżywalności komórek za pomocą następującego równania (Równanie 1), używając arkusza kalkulacyjnego (patrz Tabela materiałów). Procedura jest taka sama, jak w przypadku Mandal et al20.
    figure-protocol-2 Eq (1)

3. Test aktywności kinazy c-Src

UWAGA: Test aktywności kinazy Src został przeprowadzony przy użyciu komercyjnego zestawu testowego (patrz Tabela Materiałów) w trzech egzemplarzach, zgodnie z procedurą Chhikara et al.22. Użyj samego WCH3 i RCH3 jako kontroli w celu porównania wpływu samego metylowanego aminokwasu na kinazę i z innym metylowanym lub niemetylowanym aminokwasem.

  1. W 384-dołkowej mikropłytce o czarnym, niewiążącej powierzchni o okrągłym dnie o małej objętości dodać 2,5 μl koktajlu reakcyjnego zawierającego 0,7 nM domeny kinazy 6-Src w buforze kinazy, który jest częścią zestawu testowego, do 2,5 μl wstępnie rozcieńczonych peptydów rozpuszczonych w 10% DMSO (4x stężenie docelowe). Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej za pomocą wytrząsarki do mikropłytek (5 obr./min) zgodnie z protokołem producenta.
    UWAGA: Koktajl reakcyjny składa się z buforu kinazy (200 mM HEPES, pH 7,5), MgCl2 (16 mM), DMSO (4%), EGTA (8 mM), 2-merkaptoetanolu (43 mM) i Brij-35 (0,04%). Optymalnym substratem reakcji kinazy w tym eksperymencie jest (AEEEIYGEFEAKKKK).
  2. Dodać 5 μl koktajlu ATP/substratu (40 μM/600 μM) do płytki i inkubować przez 30 minut na wytrząsarce do mikropłytek w temperaturze pokojowej.
  3. W międzyczasie przygotuj 1x mieszaninę detekcyjną ADP zawierającą 8 nM znacznika ADP i 10 μg/ml przeciwciała ADP2 sprzężonego z barwnikiem (patrz Tabela materiałów) do oporu i wykryj bufor B (1x) z zestawu. Zatrzymać reakcję kinazy (krok 3.2) dodając 10 μl 1x mieszaniny detekcyjnej ADP i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  4. Zmierz intensywność fluorescencji za pomocą czytnika mikropłytek, ze wzbudzeniem przy 580 nm, emisją przy 630 nm i szerokością pasma 10 nm. Uzyskaj względne jednostki fluorescencji (RFU) z urządzenia, aby uzyskać procent hamowania enzymu, zgodnie z Eq (2).
    figure-protocol-3 Eq (2)
  5. Oblicz wartość IC50 zgodnie z informacją na stronie internetowej firmy23.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W-RCH3, WCH3-R CH3, W-R(CH3)2,W CH3-R, WCH3-R(CH3)2, oraz kontrolne peptydy W-R zostały zsyntetyzowane przy użyciu syntezy peptydów Fmoc w fazie stałej (Rysunek 3), o czystości odpowiednio 95%, 98,7%, 99%, 100%, 100% i 99,5%. Strukturę chemiczną tych dipeptydów potwierdzono za pomocą ESI-MS. Wartości m/z tych dipeptydów wynosiły odpowiednio 374,1624, 388,1949, 388,1794, 374,1815, 402,2022 i 361,1457.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Peptydy wytworzone i przetestowane tutaj pod kątem hamowania kinazy Src i w konsekwencji zabijania komórek rakowych zawierały metylowany tryptofan i/lub metylowaną argininę, które są nienaturalnymi aminokwasami. Tworzenie się białego osadu po dodaniu eteru dietylowego jest krytycznym etapem syntezy tych peptydów. Jednak nie wszystkie syntetyczne peptydy mogą tworzyć osad; dlatego nawet jeśli osad nie powstaje, pomyślną syntezę peptydów można potwierdzić poprzez określenie pożądanej masy za pomocą chromatografii cieczowej...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chcielibyśmy podziękować Dziekanatowi Badań Naukowych (DSR) na Uniwersytecie Króla Abdulaziza (KAU), Dżudda, Arabia Saudyjska, który sfinansował ten projekt w ramach grantu nr. (G: 031-130-1443).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1,4-DitiothreitolSigma-Aldrich10708984001Synteza peptydów
Lejek filtracyjny ze spiekanego Aldricha do syntezy w fazie stałejNaczynie do syntezy peptydówSigma-Aldrich
Z283304 Alexa594 TracerBell Brook Labs, Madison, WI3013
AnisoleSigma-Aldrich8014520500
Miano komórki 96 AQueous One  Rozwiązanie  Odczynniki do oznaczania proliferacji komórek PromegaG3582Test proliferacji komórek (odczynnik MTS)
Dichlorometan, 99,9%, ExtraDry FishersciAC326850025
Fmoc-ADMA(Pbf)-OHSigma-Aldrich8521070001
Fmoc-Arg(Me,Pbf)-OHSigma-Aldrich8521050001
Fmoc-Arg(Pbf)-OHSigma-Aldrich8520670025
Fmoc-Trp(Boc)- Kolumna OHSigma-Aldrich47561-25G-F
HPLC C18 Shimadzu  (System RP-HPLC)gradient wody/acetonitrylu
IRDye QC-1 wygaszaczBell Brook Labs, Madison, WI3013
Czytnik mikropłytek SpectraMax M2eUrządzenia molekularne
Microsoft ExcelMicrosoftOprogramowanie arkuszy kalkulacyjnych
N,N-diizopropyloetyloamina (DIPEA)Sigma-Aldrich496219
N,N-dimetyloformamid, bezwodny, 99,8%FishersciAA43997M1
Piperydyna 20%Sigma-Aldrich80645
Żywica amidowa na lodowisku (100-200 oczek)Sigma-Aldrich8550010025
TioanizolSigma-Aldrich92358
Transcreener ADP2 FI TestBell Brook Labs, Madison, WI3013Zestaw do oznaczania aktywności kinazy c-Src

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sung, H., et al. Global Cancer Statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 71 (3), 209-249 (2021).
  2. Cancer. World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/cancer#:~:text=Cancer%20a%20leading%20cause,and%20rectum%20and%20prostate%20cancers (2022).
  3. Negi, P., Cheke, R. S., Patil, V. M. Recent advances in pharmacological diversification of Src family kinase inhibitors. Egyptian Journal of Medical Human Genetics. 22 (1), 52(2021).
  4. Huang, X. L., et al. Role of receptor tyrosine kinases mediated signal transduction pathways in tumor growth and angiogenesis-New insight and futuristic vision. International Journal of Biological Macromolecules. 180, 739-752 (2021).
  5. Mohammed, S., et al. Sublethal doxorubicin promotes migration and invasion of breast cancer cells: role of Src Family non-receptor tyrosine kinases. Breast Cancer Research. 23 (1), 76(2021).
  6. Biscardi, J. S., Ishizawar, R. C., Silva, C. M., Parsons, S. J. Tyrosine kinase signalling in breast cancer: epidermal growth factor receptor and c-Src interactions in breast cancer. Breast Cancer Research. 2 (3), 1-8 (2000).
  7. Ortiz, M. A., et al. Src family kinases, adaptor proteins and the actin cytoskeleton in epithelial-to-mesenchymal transition. Cell Communication and Signaling. 19 (1), 67(2021).
  8. Hill, Z. B., Perera, B. G., Andrews, S. S., Maly, D. J. Targeting diverse signaling interaction sites allows the rapid generation of bivalent kinase inhibitors. ACS Chemical Biology. 7 (3), 487-495 (2012).
  9. Wu, S., Fu, L. Tyrosine kinase inhibitors enhanced the efficacy of conventional chemotherapeutic agent in multidrug resistant cancer cells. Molecular Cancer. 17 (1), 25(2018).
  10. Ayala-Aguilera, C. C., et al. Small molecule kinase inhibitor drugs (1995-2021): Medical indication, pharmacology, and synthesis. Journal of Medicinal Chemistry. 65 (2), 1047-1131 (2022).
  11. Lyczek, A., et al. Mutation in Abl kinase with altered drug-binding kinetics indicates a novel mechanism of imatinib resistance. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (46), 2111451118(2021).
  12. Musumeci, F., Schenone, S., Brullo, C., Botta, M. An update on dual Src/Abl inhibitors. Future Medicinal Chemistry. 4 (6), 799-822 (2012).
  13. Roskoski, R. Properties of FDA-approved small molecule protein kinase inhibitors: A 2020 update. Pharmacological Research. 152, 104609(2020).
  14. Cohen, P., Cross, D., Jänne, P. A. Kinase drug discovery 20 years after imatinib: Progress and future directions. Nature Reviews Drug Discovery. 20 (7), 551-569 (2021).
  15. Feng, S., Chen, J. K., Yu, H., Simon, J. A., Schreiber, S. L. Two binding orientations for peptides to the Src SH3 domain: development of a general model for SH3-ligand interactions. Science. 266 (5188), 1241-1247 (1994).
  16. Alexandropoulos, K., Cheng, G., Baltimore, D. Proline-rich sequences that bind to Src homology 3 domains with individual specificities. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (8), 3110-3114 (1995).
  17. Feng, S., Kasahara, C., Rickles, R. J., Schreiber, S. L. Specific interactions outside the proline-rich core of two classes of Src homology 3 ligands. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (26), 12408-12415 (1995).
  18. Polverini, E., Rangaraj, G., Libich, D. S., Boggs, J. M., Harauz, G. Binding of the proline-rich segment of myelin basic protein to SH3 domains: Spectroscopic, microarray, and modeling studies of ligand conformation and effects of posttranslational modifications. Biochemistry. 47 (1), 267-282 (2008).
  19. Weng, Z., et al. Structure-function analysis of SH3 domains: SH3 binding specificity altered by single amino acid substitutions. Molecular and Cellular Biology. 15 (10), 5627-5634 (1995).
  20. Mandal, D., Nasrolahi Shirazi, A., Parang, K. Cell-penetrating homochiral cyclic peptides as nuclear-targeting molecular transporters. Angewandte Chemie. 50 (41), 9633-9637 (2011).
  21. Hussein, W. M., Skwarczynski, M., Toth, I. Peptide Synthesis: Methods and Protocols. , Humana Press. (2020).
  22. Chhikara, B. S., et al. Phenylpyrazalopyrimidines as tyrosine kinase inhibitors: Synthesis, antiproliferative activity, and molecular simulations. Molecules. 25 (9), 2135(2020).
  23. TRANSCREENER ADP2 Fl Assay. BellBrook Labs. , Available from: https://www.bellbrooklabs.com/wp-content/uploads/2021/03/Tech-Manual-ADP2-Fl-v031621.pdf (2022).
  24. Sanner, M. F., et al. Cyclic peptides as protein kinase inhibitors: Structure-activity relationship and molecular modeling. Journal of Chemical Information and Modeling. 61 (6), 3015-3026 (2021).
  25. Nahhas, A. F., Nahhas, A. F., Webster, T. J. The physical properties of tripeptide stereocomplex nano-formations. Journal of Biomedical Nanotechnology. 16 (10), 1495-1503 (2020).
  26. Nahhas, A. F., Chang, R., Webster, T. J. Introducing unnatural amino acids-containing tripeptides as antimicrobial and anticancer agents. Journal of Biomedical Nanotechnology. 14 (5), 987-993 (2018).
  27. Deng, G., et al. Tryptophan-containing dipeptide derivatives as potent PPARγ antagonists: design, synthesis, biological evaluation, and molecular modeling. European Journal of Medicinal Chemistry. 43 (12), 2699-2716 (2008).
  28. Chetty, V. T., Sharma, A. M. Can PPARγ agonists have a role in the management of obesity-related hypertension. Vascular Pharmacology. 45 (1), 46-53 (2006).
  29. Skeggs, L. T., Kahn, J. R., Shumway, N. P. The preparation and function of the hypertensin-converting enzyme. Journal of Experimental Medicine. 103 (3), 295-299 (1956).
  30. Lunow, D., Kaiser, S., Brückner, S., Gotsch, A., Henle, T. Selective release of ACE-inhibiting tryptophan-containing dipeptides from food proteins by enzymatic hydrolysis. European Food Research and Technology. 237 (1), 27-37 (2013).
  31. Weber, J., Wilke-Mounts, S., Grell, E., Senior, A. E. Tryptophan fluorescence provides a direct probe of nucleotide binding in the noncatalytic sites of Escherichia coli F1-ATPase. The Journal of Biological Chemistry. 269 (15), 11261-11268 (1994).
  32. Iavarone, A. T., Patriksson, A., vander Spoel, D., Parks, J. H. Fluorescence probe of Trp-cage protein conformation in solution and in gas phase. Journal of the American Chemical Society. 129 (21), 6726-6735 (2007).
  33. Nongonierma, A. B., Fitzgerald, R. J. Inhibition of dipeptidyl peptidase IV (DPP-IV) by tryptophan containing dipeptides. Food & Function. 4 (12), 1843-1849 (2013).
  34. Bjelke, J. R., et al. Dipeptidyl peptidases 8 and 9: specificity and molecular characterization compared with dipeptidyl peptidase IV. The Biochemical Journal. 396 (2), 391-399 (2006).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Src Kinase InhibitionMethylated DipeptidesSolid Phase Peptide SynthesisAnti Cancer PeptidesTyrosine Kinase ActivityAcellular AssaysPeptide PermeabilityCancer Cell LinesPeptide FunctionalizationIC50 Measurement