Artykuł metodologiczny

Opracowywanie i testowanie metylowanych nanostrukturalnych dipeptydów, które hamują aktywność kinazy Src in vitro do zastosowań przeciwnowotworowych

1.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64256

⸱

30 listopada 2022

 ,  , 
1Biochemistry Department, College of Science, King Abdulaziz University, 2Independent Scholar, 3School of Health Sciences and Biomedical Engineering, Hebei University of Technology, 4School of Engineering, Saveetha University, 5Programa de Pós-graduação em Ciência e Engenharia dos Materiais, UFPI

W tym artykule

Retraction Notice

The article Developing and Testing Methylated Nano-Structured Dipeptides that Inhibit Src Kinase Activity In Vitro for Anti-Cancer Applications has been retracted by the journal due to authorship and reproducibility concerns.

Podsumowanie

Prezentowany tutaj jest protokół projektowania i testowania dipeptydów, które mogą hamować aktywność enzymu kinazy Src za pomocą testów bezkomórkowych i komórkowych do zastosowań przeciwnowotworowych. Sformułowane tutaj peptydy (WRCH3, WCH3-R CH3 i W-R(CH3)2) hamowały kinazę Src o wartościach IC50 wynoszących odpowiednio 510 nM, 916 nM i 1 μM.

Streszczenie

Tutaj, w celu opracowania nowatorskiego leczenia przeciwnowotworowego, zaprojektowano siedem dipeptydów, które zawierały metylowany tryptofan i/lub metylowaną argininę i zostały wyprodukowane przy użyciu syntezy peptydów fazy stałej Fmoc. Nadekspresja enzymu kinazy tyrozynowej Src jest zaangażowana w rozwój różnych nowotworów. Wcześniej wykazano, że dipeptydy zawierające nienaturalne aminokwasy, takie jak metylowana arginina (RCH3), dimetyloowana arginina (R(CH3)2) i/lub metylowane reszty tryptofanu (WCH3) hamują kinazę Src. W tym badaniu trzy takie dipeptydy, WRCH3, WCH3-R CH3 i WR(CH3)2, przetestowano przy użyciu testów bezkomórkowych i stwierdzono, że mają wartości IC50 (stężenie, przy którym następuje 50% inhibicja) wynoszące odpowiednio 510 nM, 916 nM i 1 μM. Wartości te były porównywalne z uzyskanymi dla cyklicznych peptydów penta- do nano-W-R ([W-R]5-[W-R]9) syntetyzowanych w poprzednich badaniach. Jednak niemetylowane wersje dipeptydów nie wykazywały żadnej aktywności hamującej wobec kinazy Src. Wszystkie te dipeptydy (50 μM) nie wykazały żadnej cytotoksyczności po inkubacji do 72 godzin z trzema różnymi liniami komórek nowotworowych, w tym białaczką (CCRF-CEM), gruczolakorakiem piersi (MDA-MB-231) i gruczolakorakiem jajnika (SK-OV-3), co wskazuje na ograniczoną przepuszczalność peptydów przez błonę komórkową. Dlatego potrzebne są dalsze badania, aby poprawić przepuszczalność tych peptydów do zastosowań przeciwnowotworowych, takich jak użycie nośnika peptydowego lub dodatkowej funkcjonalizacji peptydów. Podsumowując, badanie to zapewnia protokół syntezy i testowania peptydów, które hamują aktywność kinazy Src, a tym samym mają obiecujące zdolności przeciwnowotworowe, jak wykazano za pomocą testów bezkomórkowych i komórkowych.

Wprowadzenie

Nowotwory są spowodowane nieprawidłowym wzrostem prawidłowych komórek i stanowią jedną z najgroźniejszych chorób na świecie. Nieprawidłowe komórki te rozprzestrzeniają się do różnych narządów w organizmie w procesie zwanym przerzutowaniem. Najczęstszą postacią nowotworu jest rak piersi, który w 2020 roku wystąpił u 2,26 miliona osób. Ponadto w 2020 roku odnotowano około 1,80 miliona zgonów z powodu raka płuc1. Według Światowej Organizacji Zdrowia w 2020 roku z powodu nowotworów zmarło około 10 milionów ludzi2. Komórki nowotworowe różnią się od prawidłowych komórek tym, że nadmiernie eksponują pewne enzymy, takie jak kinazy tyrozynowe białek (PTKs). Narodowy Instytut Nowotworów definiuje kinazy jako enzymy zdolne do fosforylacji innych białek lub cukrów3. Wiedza o funkcji regulacyjnej kinaz może ułatwić opracowanie skutecznych leków przeciwnowotworowych. Na przykład PTKs katalizują fosforylację innych białek lub cukrów, w wyniku czego ATP jest przekształcane w ADP poprzez utratę grupy fosforanowej. Łącznie 80% onkogenów i protoonkogenów koduje PTKs4. Kinazy Src stanowią rodzinę niereceptorowych kinaz tyrozynowych, w tym Lck, Fyn, Hck, Blk, Yes i Yrk, które są nadmiernie eksponowane w komórkach nowotworowych, zwłaszcza w raku piersi5,6. Tyrozynowe kinazy Src są powiązane z mitogenezą, różnicowaniem, aktywacją limfocytów T oraz transformacją komórkową. Src wspomaga inwazję i przerzutowanie komórek nowotworowych ze względu na zdolność do zmniejszania adhezji tych komórek. W kinazie Src występuje pięć różnych domen, ułożonych od końca N- do C- następująco: domena kwasu tłuszczowego, domena homologii Src 3 (SH3), domena homologii Src 2 (SH2), domena kinazy tyrozynowej (SH1) oraz C-końcowa domena regulacyjna7.

figure-introduction-1
Rysunek 1: Domeny docelowe w enzymie kinazy Src, obejmujące domenę SH3, domenę SH2, domenę kinazy (SH1) oraz krótki regulatorowy segment C-końcowy. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Domena kinazy SH1 jest najczęściej wybierana jako cel podczas projektowania inhibitorów kinazy Src, ponieważ zawiera dwie konserwatywne witry wiązania ATP i substratu (Rycina 1). Jeśli sekwencja aminokwasowa domeny kinazy jest znana, substrat może również służyć jako cel do zaprojektowania związku naśladującego wiązanie substratu z kinazą Src8. Ponadto jako cele mogą być wykorzystane inne miejsca, takie jak domeny SH3 i SH2. W porównaniu z innymi środkami chemioterapeutycznymi, inhibitory kinaz wykazują mniejszą toksyczność i wyższą skuteczność9. Według stanu na wrzesień 2021 roku przez FDA zatwierdzono 73 małe cząsteczki działające jako inhibitory kinaz10. Imatynib jest przykładem leku przeciwnowotworowego selektywnie hamującego aktywność tyrozynowej kinazy; jednak niektórzy pacjenci wykazują oporność na ten lek z powodu wystąpienia punktowej mutacji w domenie kinazy11. Firma AstraZeneca wprowadziła Sarakatynib, lek hamujący tyrozynowe kinazy z rodziny Src z wartością IC50 (stężenie, przy którym następuje 50% inhibicji) wynoszącą 2,7 nM, jednak został on odrzucony w badaniach fazy 212. Z 52 inhibitorów PTK zatwierdzonych przez amerykańską FDA do początku 2020 roku13, tylko 28 celuje w receptorowe PTK, 1 blokuje niereceptorowe PTK, 11 hamuje białkowe kinazy serynowo-treoninowe, a dwa blokują MEK1/213. Rosnące zainteresowanie badaniami w onkologii będzie nadal napędzać odkrywanie inhibitorów kinaz jako potencjalnych leków przeciwnowotworowych. Jednak do tej pory celem terapii było tylko 50 z 500 kinaz białkowych; w związku z tym w najbliższej przyszłości spodziewa się badania większej liczby kinaz pod kątem rozwoju leków14. Ponadto istnieje potrzeba odkrycia inhibitorów kinaz w celu zbadania jeszcze niezidentyfikowanych mutacji kinaz prowadzących do nowotworów.

W związku z tym celem niniejszego badania było opracowanie peptydów, które mogłyby służyć jako inhibitory rodziny Src i celować w miejsce wiązania ATP ze względu na jego konserwatywność pomiędzy różnymi kinazami. W tym celu zsyntetyzowano serię dipeptydów zawierających zmetylowany tryptofan i/lub zmetylowaną argininę oraz przetestowano ich synergistyczną zdolność do hamowania kinazy Src. Pierścień indolowy tryptofanu naśladuje adeninę ATP i konkuruje z ATP o wiązanie w miejscu wiązania ATP. Ponadto zmetylowana arginina w ligandzie konkuruje o domenę SH3 białka Src. Badacze wykazali, że polipeptyd zawierający zdemetylowaną argininę hamuje domenę SH3, co prawdopodobnie wynika ze specyficznej konserwatywnej sekwencji w motywie wiążącym SH3 (tj. PXXP), która wykazuje powinowactwo wiązania do ligandów zawierających od dwóch do trzech reszt Arg w części N-końcowej lub od jednej do dwóch reszt Arg w części C-końcowej ligandów15,16,17. Grupa guanidynowa Arg wiąże się z konserwatywną resztą Asp-9 domeny SH318,19, podczas gdy pozostała część Arg wiąże się z konserwatywnym Trp-18 enzymu, co zostało potwierdzone analizą NMR oraz strukturami krystalicznymi kilku domen SH319. Przedstawiono tutaj protokół syntezy siedmiu zmetylowanych dipeptydów oraz testowania ich zdolności hamującej wobec kinazy Src. Ponadto zbadano zdolność tych peptydów do zabijania kilku linii komórkowych raka in vitro.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Synteza peptydów

UWAGA: Synteza W-R została przedstawiona jako przykład reprezentatywny (Rysunek 2).

  1. Odważ 566 mg (0,3 mmol) żywicy H-Arg(Pbf)-2-chlorotriryl i dodaj do naczynia do syntezy peptydów (patrz Tabela materiałów), zgodnie z procedurą zastosowaną przez Mandal i wsp.20Przeprowadzić syntezę peptydów z wykorzystaniem uznanej strategii syntezy peptydów w fazie stałej (SPPS).21.
    UWAGA: Zmetylowane lub zdimetylowane dipeptydy zawierające nienaturalne aminokwasy syntetyzowano na żywicy rink amide (pojemność załadunku 0,3 mmol/g), natomiast dipeptydy zawierające naturalne aminokwasy syntetyzowano na żywicy z przyłączonym pierwszym aminokwasem, np. żywicy H-Arg(Pbf)-2-chlorotriryl (pojemność załadunku 0,3 mmol/g). Istotne jest, że żywica rink amide pozwala na otrzymanie peptydu zakończonego grupą NH2 na C-końcu.2.
  2. Namocz suchą żywicę przez 1 h w 5 ml N,N-dimetyloformamidu (DMF) pod ciśnieniem gazu azotowego w naczyniu do syntezy peptydów.
    UWAGA: Cały proces syntezy należy przeprowadzić w dygestorium. Przez cały czas trwania eksperymentu należy nosić okulary ochronne, rękawiczki oraz fartuch laboratoryjny. Niezbędny jest również stoper do monitorowania odstępów czasowych między etapami dodawania odczynników chemicznych.
  3. Usuwać nadmiar DMF, wykorzystując ciśnienie gazu azotowego podłączonego do naczynia do syntezy peptydów w trakcie całego procesu syntezy.
  4. Odważ 473,9 mg Fmoc-trp(Boc)-OH (0,9 mmol) oraz 341 mg heksafluorofosforanu 2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetrametylouroniu (HBTU) (0,9 mmol) jako odczynniki sprzęgające. Przenieś proszki do probówki i rozpuść je w 5 ml bezwodnego DMF.
  5. Dodaj 313.4 µL (1,8 mmol) N,N-Dodanie do probówki diizopropyloetyloaminy (DIPEA) jako czynnika aktywującego (krok 1.4) i wymieszanie poprzez potrząsanie probówką.
  6. Przenieś zawartość probówki do żywicy i pozostaw do zajścia reakcji na 1 h w atmosferze azotu w temperaturze pokojowej. Następnie usuń nadmiar DMF za pomocą nadciśnienia azotu i przemyj żywicę 3 razy DMF.
  7. Zdeprotekcjonuj N-terminalny Fmoc z użyciem 5 ml 20% piperydyny w DMF (v/v) przez 20 min w atmosferze azotu. Przemyć żywicę 3 razy DMF (3 x 5 ml).
  8. Osusz żywicę, dodając 5 ml dichlorometanu (DCM), i pozostaw ją w atmosferze azotu przez 5 min, a następnie odlej DCM, stosując nadciśnienie azotu. W celu zwiększenia stopnia wysuszenia żywicy dodaj 5 ml metanolu w atmosferze azotu i pozostaw na 5 min.
  9. Dodać 10 ml świeżo przygotowanego koktajlu do odszczepiania składającego się z TFA/tioanizolu/ditiotreitolu/anizolu (90:3:5:2 v/v/w/v) na 2,5 h w celu usunięcia wszystkich grup ochronnych z łańcuchów bocznych i odszczepienia dipeptydu z żywicy.
    OSTRZEŻENIE: Mieszaninę do hydrolizy (cleavage cocktail) należy odmierzać w szklanym cylindrze miarowym, ponieważ TFA jest kwasem i stanowi zagrożenie; należy zachować ostrożność podczas jego używania.
  10. Po 2,5 h przelać roztwór reakcyjny z naczynia z peptydem pod ciśnieniem azotu do kolby okrągłodennej. Dodać 250 ml zimnego eteru dietylowego (Et2do kolby okrągłodennej zawierającej surowy peptyd, aby wyprecypitować peptyd.
  11. Przefiltrować wytrącony peptyd, używając papieru filtracyjnego w lejku stożkowym z jednym ramieniem podłączonym do wody (tak, aby filtracja odbywała się pod wpływem ciśnienia wody), a następnie zebrać osad (peptydy), aby całkowicie usunąć eter. Surowy peptyd wytrąca się w ciągu 10 min.
  12. Oczyść surowy peptyd na kolumnie do wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) w odwróconej fazie (patrz Tabela materiałów) przy użyciu systemu gradientowego. Zastosowano gradient od 0% do 10% acetonitrylu zawierającego 0,1% TFA w wodzie zawierającej 0,1% TFA przez 30–60 min przy szybkości przepływu 1 ml/min.

figure-protocol-1
Rycina 2: Synteza peptydów W-R na fazie stałej. Skróty: HBTU = 2-(1H-Benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate; DIPEA = N,N-diizopropyloetyloamina; TFA = kwas trifluorooctowy; DMF = dimetyloformamid. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

2. Ocena toksyczności komórkowej zsyntetyzowanych peptydów

  1. Wysiać 20 komórek SK-OV-3 na studzienkę, 50 komórek MDA-MB-231 na studzienkę lub 5 × 106 komórek CCRF-CEM na dołek (w całkowitej objętości 100 µL/well) do mikropłytki 96-dołkowej. Inkubować komórki w uwilgotnionej atmosferze z 5% CO2, 95% powietrza przy 37 °C aż do osiągnięcia 75%–80% konfluencji.
    UWAGA: Do hodowli komórek CCRF-CEM stosuje się pożywkę RPMI-16, a do linii komórkowych MDA-MB-231 oraz SK-OV-3 minimalną pożywkę Essential Medium Eagle (EM). Obie pożywki są uzupełnione o 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 1% penicyliny/streptomycyny (10 0 j./ml penicyliny i 10 mg/ml streptomycyny w 0,9% NaCl). Wszystkie pożywki i suplementy należy umieścić w 37 °C kąpiel wodna przez 30 min przed rozpoczęciem eksperymentu. Eksperyment należy przeprowadzić w komorze z laminarnym przepływem powietrza (dygestorium biologocznym), w rękawiczkach i fartuchu laboratoryjnym.
  2. Odssać medium za pomocą pipety i dodać 100 µL z/zs* 50 µM peptyd lub 10 µM doksorubicynę (Dox) jako kontrolę pozytywną w trzech powtórzeniach dołków zawierających trzy różne typy komórek nowotworowych wysianych na płytce 96-dołkowej. Płytkę należy zwrócić do inkubatora na 72 h (w tych samych warunkach, o których wspomniano w kroku 2.1).
  3. Po 72 h dodać 20 µL 3-(4,5-dimetyltiazol-2-yl)-5-(3-karboksymetoksifenylo)-2-(4-sulfofenyl)-2H-tetrazoliu (MTS) do płytki 96-dołkowej. Owiń płytkę folią aluminiową i inkubuj przez 1–4 h w temperaturze 37 °C w atmosferze uwilgotnionej.
    UWAGA: MTS jest barwnikiem stosowanym do wizualizacji żywych komórek (niepoddanych działaniu peptydów lub traktowanych peptydami), ponieważ tylko żywe komórki przekształcają tetrazolium MTS w kolorowy barwnik formazan, który można zmierzyć przy 490 nm.
  4. Zmierz absorbancję produktu formazanu przy 490 nm (A490) za pomocą czytnika płytek mikroplate (patrz Tabela materiałów). W качестве próby blank dla eksperymentu należy zastosować pożywkę zmieszaną z MTS. Użyć samej wody (ponieważ peptydy są rozpuszczalne w wodzie) oraz 0,1 N HCl (ponieważ WCH3 (wymaga HCl do rozpuszczenia) jako kontrole negatywne.
  5. Zmierz procent przeżywalności komórek, korzystając z następującego równania (Eq 1) i programu do arkuszy kalkulacyjnych (patrz Tabela materiałów). Procedura jest taka sama, jak ta zastosowana przez Mandal i współpracowników20.
    figure-protocol-2    Równ. (1)

3. Analiza aktywności kinazy c-Src

UWAGA: Analizę aktywności kinazy Src przeprowadzono przy użyciu komercyjnego zestawu do analiz (patrz Tabela materiałów) w trzech powtórzeniach, zgodnie z procedurą Chhikara i wsp.22Użyj WCH3 oraz RCH3 samodzielnie jako kontroli w celu porównania wpływu samego zmetylowanego aminokwasu na kinazę oraz wpływu innego zmetylowanego lub niezmetylowanego aminokwasu.

  1. Do czarnej mikroplateczki o okrągłym dnie z powierzchnią nieprzylegającą o niskiej objętości i 384 dołkach dodać 2,5 µL koktajlu reakcyjnego zawierającego 0,7 nM domeny kinazy His6-Src w buforze kinazy (wchodzącym w skład zestawu testowego) do 2,5 µL uprzednio rozcieńczonych peptydów rozpuszczonych w 10% DMSO (4x stężenie docelowe). Inkubować przez 10 min w temperaturze pokojowej przy użyciu wstrząsarki do mikroplatek (5 rpm) zgodnie z protokołem producenta.
    UWAGA: Koktajl reakcyjny składa się z buforu kinazy (20 mM HEPES, pH 7,5), MgCl2 (16 mM), DMSO (4%), EGTA (8 mM), 2-merkaptoetanolu (43 mM) oraz Brij-35 (0,04%). Optymalnym substratem reakcji kinazy w tym doświadczeniu jest (AEEEIYGEFEAKKKK).
  2. Dodać do płytki 5 µL koktajlu ATP/substratu (40 µM/60 µM) i inkubować przez 30 min na wstrząsarce do mikroplatek w temperaturze pokojowej.
  3. W tym czasie przygotować 1x mieszaninę detekcyjną ADP zawierającą 8 nM znacznika ADP i 10 µg/mL przeciwciała przeciwko ADP2 sprzężonego z barwnikiem (patrz Tabela materiałów) w buforze do zatrzymania i detekcji B (1x) z zestawu. Zatrzymać reakcję kinazy (krok 3.2), dodając 10 µL 1x mieszaniny detekcyjnej ADP i inkubować przez 1 h w temperaturze pokojowej.
  4. Zmierzyć intensywność fluorescencji za pomocą czytnika mikroplatek przy wzbudzeniu 580 nm, emisji 630 nm i szerokości pasma 10 nm. Odczytać z urządzenia względne jednostki fluorescencji (RFU), aby obliczyć procent inhibicji enzymu zgodnie z równaniem (2).
    figure-protocol-3    Eq (2)
  5. Obliczyć wartość IC50 zgodnie z instrukcją zamieszczoną na stronie internetowej firmy23.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Peptydy W-RCH3, WCH3-RCH3, W-R(CH3)2, WCH3-R, WCH3-R(CH3)2 oraz kontrolny peptyd W-R zostały zsyntetyzowane przy użyciu syntezy peptydów w fazie stałej metodą Fmoc (Rycina 3), osiągając odpowiednio czystość 95%, 98,7%, 99%, 10%, 100% i 9,5%. Struktury chemiczne tych dipeptydów potwierdzono za pomocą ESI-MS. Wartości m/z dla tych dipeptydów wynosiły odpowiednio 374,1624, 38,1949, 38,1794, 374,1815, 402,202...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Peptydy wytworzone i przetestowane tutaj pod kątem hamowania kinazy Src i w konsekwencji zabijania komórek rakowych zawierały metylowany tryptofan i/lub metylowaną argininę, które są nienaturalnymi aminokwasami. Tworzenie się białego osadu po dodaniu eteru dietylowego jest krytycznym etapem syntezy tych peptydów. Jednak nie wszystkie syntetyczne peptydy mogą tworzyć osad; dlatego nawet jeśli osad nie powstaje, pomyślną syntezę peptydów można potwierdzić poprzez określenie pożądanej masy za pomocą chromatografii cieczowej...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować Dziekanatowi Badań Naukowych (DSR) na Uniwersytecie Króla Abdulaziza (KAU), Dżudda, Arabia Saudyjska, który sfinansował ten projekt w ramach grantu nr. (G: 031-130-1443).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1,4-DitiothreitolSigma-Aldrich10708984001Synteza peptydów
Lejek filtracyjny ze spiekanego Aldricha do syntezy w fazie stałejNaczynie do syntezy peptydówSigma-Aldrich
Z283304 Alexa594 TracerBell Brook Labs, Madison, WI3013
AnisoleSigma-Aldrich8014520500
Miano komórki 96 AQueous One  Rozwiązanie  Odczynniki do oznaczania proliferacji komórek PromegaG3582Test proliferacji komórek (odczynnik MTS)
Dichlorometan, 99,9%, ExtraDry FishersciAC326850025
Fmoc-ADMA(Pbf)-OHSigma-Aldrich8521070001
Fmoc-Arg(Me,Pbf)-OHSigma-Aldrich8521050001
Fmoc-Arg(Pbf)-OHSigma-Aldrich8520670025
Fmoc-Trp(Boc)- Kolumna OHSigma-Aldrich47561-25G-F
HPLC C18 Shimadzu  (System RP-HPLC)gradient wody/acetonitrylu
IRDye QC-1 wygaszaczBell Brook Labs, Madison, WI3013
Czytnik mikropłytek SpectraMax M2eUrządzenia molekularne
Microsoft ExcelMicrosoftOprogramowanie arkuszy kalkulacyjnych
N,N-diizopropyloetyloamina (DIPEA)Sigma-Aldrich496219
N,N-dimetyloformamid, bezwodny, 99,8%FishersciAA43997M1
Piperydyna 20%Sigma-Aldrich80645
Żywica amidowa na lodowisku (100-200 oczek)Sigma-Aldrich8550010025
TioanizolSigma-Aldrich92358
Transcreener ADP2 FI TestBell Brook Labs, Madison, WI3013Zestaw do oznaczania aktywności kinazy c-Src

Bibliografia

  1. Sung, H., et al. Global Cancer Statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 71 (3), 209-249 (2021).
  2. Cancer. World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/cancer#:~:text=Cancer%20a%20leading%20cause,and%20rectum%20and%20prostate%20cancers (2022).
  3. Negi, P., Cheke, R. S., Patil, V. M. Recent advances in pharmacological diversification of Src family kinase inhibitors. Egyptian Journal of Medical Human Genetics. 22 (1), 52(2021).
  4. Huang, X. L., et al. Role of receptor tyrosine kinases mediated signal transduction pathways in tumor growth and angiogenesis-New insight and futuristic vision. International Journal of Biological Macromolecules. 180, 739-752 (2021).
  5. Mohammed, S., et al. Sublethal doxorubicin promotes migration and invasion of breast cancer cells: role of Src Family non-receptor tyrosine kinases. Breast Cancer Research. 23 (1), 76(2021).
  6. Biscardi, J. S., Ishizawar, R. C., Silva, C. M., Parsons, S. J. Tyrosine kinase signalling in breast cancer: epidermal growth factor receptor and c-Src interactions in breast cancer. Breast Cancer Research. 2 (3), 1-8 (2000).
  7. Ortiz, M. A., et al. Src family kinases, adaptor proteins and the actin cytoskeleton in epithelial-to-mesenchymal transition. Cell Communication and Signaling. 19 (1), 67(2021).
  8. Hill, Z. B., Perera, B. G., Andrews, S. S., Maly, D. J. Targeting diverse signaling interaction sites allows the rapid generation of bivalent kinase inhibitors. ACS Chemical Biology. 7 (3), 487-495 (2012).
  9. Wu, S., Fu, L. Tyrosine kinase inhibitors enhanced the efficacy of conventional chemotherapeutic agent in multidrug resistant cancer cells. Molecular Cancer. 17 (1), 25(2018).
  10. Ayala-Aguilera, C. C., et al. Small molecule kinase inhibitor drugs (1995-2021): Medical indication, pharmacology, and synthesis. Journal of Medicinal Chemistry. 65 (2), 1047-1131 (2022).
  11. Lyczek, A., et al. Mutation in Abl kinase with altered drug-binding kinetics indicates a novel mechanism of imatinib resistance. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (46), 2111451118(2021).
  12. Musumeci, F., Schenone, S., Brullo, C., Botta, M. An update on dual Src/Abl inhibitors. Future Medicinal Chemistry. 4 (6), 799-822 (2012).
  13. Roskoski, R. Properties of FDA-approved small molecule protein kinase inhibitors: A 2020 update. Pharmacological Research. 152, 104609(2020).
  14. Cohen, P., Cross, D., Jänne, P. A. Kinase drug discovery 20 years after imatinib: Progress and future directions. Nature Reviews Drug Discovery. 20 (7), 551-569 (2021).
  15. Feng, S., Chen, J. K., Yu, H., Simon, J. A., Schreiber, S. L. Two binding orientations for peptides to the Src SH3 domain: development of a general model for SH3-ligand interactions. Science. 266 (5188), 1241-1247 (1994).
  16. Alexandropoulos, K., Cheng, G., Baltimore, D. Proline-rich sequences that bind to Src homology 3 domains with individual specificities. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (8), 3110-3114 (1995).
  17. Feng, S., Kasahara, C., Rickles, R. J., Schreiber, S. L. Specific interactions outside the proline-rich core of two classes of Src homology 3 ligands. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (26), 12408-12415 (1995).
  18. Polverini, E., Rangaraj, G., Libich, D. S., Boggs, J. M., Harauz, G. Binding of the proline-rich segment of myelin basic protein to SH3 domains: Spectroscopic, microarray, and modeling studies of ligand conformation and effects of posttranslational modifications. Biochemistry. 47 (1), 267-282 (2008).
  19. Weng, Z., et al. Structure-function analysis of SH3 domains: SH3 binding specificity altered by single amino acid substitutions. Molecular and Cellular Biology. 15 (10), 5627-5634 (1995).
  20. Mandal, D., Nasrolahi Shirazi, A., Parang, K. Cell-penetrating homochiral cyclic peptides as nuclear-targeting molecular transporters. Angewandte Chemie. 50 (41), 9633-9637 (2011).
  21. Hussein, W. M., Skwarczynski, M., Toth, I. Peptide Synthesis: Methods and Protocols. , Humana Press. (2020).
  22. Chhikara, B. S., et al. Phenylpyrazalopyrimidines as tyrosine kinase inhibitors: Synthesis, antiproliferative activity, and molecular simulations. Molecules. 25 (9), 2135(2020).
  23. TRANSCREENER ADP2 Fl Assay. BellBrook Labs. , Available from: https://www.bellbrooklabs.com/wp-content/uploads/2021/03/Tech-Manual-ADP2-Fl-v031621.pdf (2022).
  24. Sanner, M. F., et al. Cyclic peptides as protein kinase inhibitors: Structure-activity relationship and molecular modeling. Journal of Chemical Information and Modeling. 61 (6), 3015-3026 (2021).
  25. Nahhas, A. F., Nahhas, A. F., Webster, T. J. The physical properties of tripeptide stereocomplex nano-formations. Journal of Biomedical Nanotechnology. 16 (10), 1495-1503 (2020).
  26. Nahhas, A. F., Chang, R., Webster, T. J. Introducing unnatural amino acids-containing tripeptides as antimicrobial and anticancer agents. Journal of Biomedical Nanotechnology. 14 (5), 987-993 (2018).
  27. Deng, G., et al. Tryptophan-containing dipeptide derivatives as potent PPARγ antagonists: design, synthesis, biological evaluation, and molecular modeling. European Journal of Medicinal Chemistry. 43 (12), 2699-2716 (2008).
  28. Chetty, V. T., Sharma, A. M. Can PPARγ agonists have a role in the management of obesity-related hypertension. Vascular Pharmacology. 45 (1), 46-53 (2006).
  29. Skeggs, L. T., Kahn, J. R., Shumway, N. P. The preparation and function of the hypertensin-converting enzyme. Journal of Experimental Medicine. 103 (3), 295-299 (1956).
  30. Lunow, D., Kaiser, S., Brückner, S., Gotsch, A., Henle, T. Selective release of ACE-inhibiting tryptophan-containing dipeptides from food proteins by enzymatic hydrolysis. European Food Research and Technology. 237 (1), 27-37 (2013).
  31. Weber, J., Wilke-Mounts, S., Grell, E., Senior, A. E. Tryptophan fluorescence provides a direct probe of nucleotide binding in the noncatalytic sites of Escherichia coli F1-ATPase. The Journal of Biological Chemistry. 269 (15), 11261-11268 (1994).
  32. Iavarone, A. T., Patriksson, A., vander Spoel, D., Parks, J. H. Fluorescence probe of Trp-cage protein conformation in solution and in gas phase. Journal of the American Chemical Society. 129 (21), 6726-6735 (2007).
  33. Nongonierma, A. B., Fitzgerald, R. J. Inhibition of dipeptidyl peptidase IV (DPP-IV) by tryptophan containing dipeptides. Food & Function. 4 (12), 1843-1849 (2013).
  34. Bjelke, J. R., et al. Dipeptidyl peptidases 8 and 9: specificity and molecular characterization compared with dipeptidyl peptidase IV. The Biochemical Journal. 396 (2), 391-399 (2006).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Inhibicja kinazy Srczmetylowane dipeptydysynteza peptyd w w fazie sta ejpeptydy przeciwnowotworoweaktywno kinazy tyrozynowejtesty acelularneprzepuszczalno peptyd wlinie kom rkowe rakafunkcjonalizacja peptyd wpomiar IC50