Rekonstrukcja ruchliwości opartej na aktynie za pomocą dostępnych na rynku białek

Podsumowanie

Ten protokół opisuje, jak wytwarzać komety aktynowe na powierzchni koralików przy użyciu dostępnych na rynku składników białkowych. Takie systemy naśladują wystające struktury znajdujące się w komórkach i mogą być wykorzystywane do badania fizjologicznych mechanizmów wytwarzania siły w uproszczony sposób.

Streszczenie

Wiele ruchów komórek i zmian kształtu oraz niektóre typy wewnątrzkomórkowej ruchliwości bakterii i organelli są napędzane przez biopolimer aktyny, który tworzy dynamiczną sieć na powierzchni komórki, organelli lub bakterii. Biochemiczne i mechaniczne podstawy wytwarzania siły podczas tego procesu można badać poprzez odtwarzanie ruchu opartego na aktynie w sposób bezkomórkowy na obojętnych powierzchniach, takich jak kulki, które są funkcjonalizowane i inkubowane z kontrolowanym zestawem składników. W odpowiednich warunkach elastyczna sieć aktynowa gromadzi się na powierzchni koralika i pęka pod wpływem naprężeń generowanych przez wzrost sieci, tworząc "kometę aktynową", która popycha koralik do przodu. Jednak takie eksperymenty wymagają oczyszczenia z wielu różnych białek wiążących aktynę, co często stawia je poza zasięgiem niespecjalistów. W tym artykule szczegółowo opisano protokół powtarzalnego otrzymywania komet aktynowych i ruchliwości kulek przy użyciu dostępnych na rynku odczynników. Powłokę ściegu, rozmiar ściegu i mieszaninę ruchliwości można zmienić, aby zaobserwować wpływ na prędkość ściegu, trajektorie i inne parametry. Test ten może być wykorzystany do badania aktywności biochemicznej różnych białek wiążących aktynę oraz do wykonywania ilościowych pomiarów fizycznych, które rzucają światło na właściwości substancji czynnej sieci aktynowych. Będzie to użyteczne narzędzie dla społeczności, umożliwiające badanie ruchliwości opartej na aktynie in vitro bez specjalistycznej wiedzy na temat oczyszczania białek wiążących aktynę.

Wprowadzenie

Polimeryzacja aktyny w komórkach jest przestrzennie i czasowo kontrolowana przez ścisłą regulację zarodkowania filamentu aktyny poniżej sygnalizacji komórkowej¹. Zarodkowanie zachodzi poprzez tworzenie trimera aktyny, a następnie oba końce powstającego włókna polimeryzują spontanicznie, chociaż jeden koniec jest bardziej dynamiczny (koniec kolczasty) niż drugi (spiczasty koniec)². Kiedy zarodkowanie i polimeryzacja z zadziorowym końcem są skierowane w stronę powierzchni, wytwarzają wystarczającą siłę (w zakresie od piko-nanoniutona), aby wypchnąć błonę komórkową do ruchu i przesunąć obiekty o rozmiarach mikronów do wnętrza komórki z hydrolizą ATP jako źródłem energii³. Niektóre przykłady obejmują bakterie Listeria monocytogenes, które wykorzystują komety aktynowe do rozprzestrzeniania się z komórki do komórki, oraz mitochondria, w których ruch oparty na komecie aktyny jest ważny dla losowego dziedziczenia podczas mitozy^4,5. Komety aktynowe na endosomach i innych pęcherzykach wewnątrzkomórkowych są zaangażowane w oderwanie od błon dawcy^6,7,8.

Dzięki przedstawionej tutaj metodzie, aspekty sygnalizacyjne komórkowej polimeryzacji aktyny są pomijane, a polimeryzacja aktyny jest wytwarzana na mikrometrycznych kulkach polistyrenowych poprzez powlekanie ich aktywatorami rozgałęzionego zarodkowania aktyny, w szczególności aktywną domeną ludzkiego białka WASP, VCA (zwanego również WA lub WCA)¹. Powlekane kulki są następnie inkubowane w mieszance zawierającej składniki niezbędne do polimeryzacji aktyny, w tym główny nukleator polimeryzacji aktyny w komórkach, kompleks Arp2/3, który jest aktywowany przez VCA na powierzchni kulki w celu utworzenia nowych włókien jako rozgałęzień po bokach włókien potomnych¹. Aktyna początkowo polimeryzuje równomiernie wokół koralika, ale potem spontanicznie łamie symetrię, tworząc kometę aktynową, która popycha koralik do przodu, odtwarzając w ten sposób przypominające komórki wystające sieci i komety w kontrolowany sposób. Podobne podejścia z kulkami i innymi powlekanymi powierzchniami były stosowane w przeszłości przez nas i innych do badania biochemii i biofizyki polimeryzacji aktyny^9,10,11,12, ale do tych eksperymentów wymagana była rozległa wiedza specjalistyczna w zakresie białek wiążących aktynę. Przedstawiony tutaj protokół opisuje, w jaki sposób solidnie tworzyć komety aktynowe i ruchliwość całkowicie za pomocą komercyjnie dostępnych (lub wkrótce dostępnych) odczynników, dzięki czemu podejście to jest dostępne dla każdego, w tym w środowisku edukacyjnym do nauczania pojęć biofizycznych. Kluczowe cechy obejmują znaczenie delikatnego i niezawodnego pipetowania, zastosowanie monomeru skompleksowanego z profiliną jako źródła aktyny oraz zasadnicze stosowanie wysoce aktywnego aktywatora kompleksu Apr2/3 jako odczynnika do powlekania kulek.

Protokół

1. Przygotowanie

UWAGA: Użyj ultraczystego H₂O dla wszystkich. Nie musi być sterylny. Przefiltrować wszystkie roztwory opisane w krokach 1.1-1.4 za pomocą filtra strzykawkowego 0,2 μm, porcjować porcje po 500 μl-2 ml na probówkę w zależności od użycia i przechowywać w temperaturze -20 °C.

1. Przygotować 10% BSA, ważąc 2 g BSA do stożkowej probówki o pojemności 50 ml i wypełniając do oznaczenia 20 ml_H2O. Mieszać aż do rozpuszczenia BSA (około 30 min), a następnie uzupełnić objętość do 20 ml.
   UWAGA: Używaj wysokiej jakości BSA (patrz Tabela Materiałów). 10% roztwór BSA jest stosowany zarówno do przygotowania perełek, jak i mieszanki ruchliwości.
2. Do przygotowania kulek należy przygotować bufor Xb (10 mM HEPES, 0,1 M KCl, 1 mM MgCl₂ i 0,1 mM CaCl₂, pH 7,5) jako 10x roztwór i rozcieńczyć przed użyciem (100 μL 10x roztwór podstawowy Xb + 900 μL_H2O). Przygotować Xb/1% BSA, mieszając 100 μL 10x roztwór podstawowy Xb + 100 μL 10% BSA + 800 μL_H2O.
3. Przygotuj bufor G (2 mM Tris, 0,2 mM CaCl₂, 0,2 mM DTT, 2 mM ATP), który jest buforem używanym do rozcieńczania aktyny monomerycznej (G-aktyny). Dostosuj do pH 7, a nie pH 8, jak tradycyjnie stosuje się (patrz dyskusja).
4. Przygotować bufor ruchliwości MB13 (10 mM HEPES, 1,5 mM ATP, 3 mM DTT, 1,5 mM MgCl₂, 1 mM EGTA, 50 mM KCl, 1% BSA, pH 7,5). W przypadku niektórych zastosowań przydatne jest 10x MB13. Należy jednak przygotować 10x MB13 bez BSA, ponieważ prowadzi to do problemów podczas regulacji pH. Dodać BSA z 10% roztworu podstawowego (przygotowanego w kroku 1.1) podczas odtwarzania 1x MB13 z 10x MB13.

2. Przygotowanie roztworów białkowych

UWAGA: Używaj ultraczystego H₂O do wszystkich zawieszeń. Nie musi być sterylny. Przenieś wszystkie białka na lodzie i porcje do wstępnie schłodzonych probówek. Manipuluj delikatnie, aby nie wytwarzać pęcherzyków i nigdy nie wiruj roztworów białkowych. W przypadku przechowywania zapasów w temperaturze -80°C nie jest konieczne błyskawiczne zamrażanie w ciekłym azocie. Dostosuj wielkość podwielokrotności, aby uniknąć więcej niż około pięciu cykli zamrażania i rozmrażania, ponieważ wydaje się, że nie wpływa to na aktywność żadnego z białek. Robocze porcje mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C przez kilka tygodni.

1. Przygotuj roztwór G-aktyny (mięśnie szkieletowe królika) zgodnie z poniższym opisem.
   1. Pulsacyjnie odwirować proszek aktyny (patrz tabela materiałów) w temperaturze 4 °C w celu zebrania ciała stałego na dnie probówki.
   2. Dodać_H2Ozgodnie z instrukcjami producenta (1 mg białka w 100 μL zimnego_H2Odla nieznakowanej aktyny, 100 μg białka w 100 μL zimnego_H2Odla aktyny znakowanej ATTO).
   3. Pozostaw na lodzie na co najmniej 15 minut. Delikatnie wymieszaj, pipetując w górę i w dół, pozostaw na lodzie przez co najmniej kolejne 15 minut i ponownie wymieszaj. Wirować pulsacyjnie w temperaturze 4 °C w celu zebrania roztworu na dnie probówki i ponownie wymieszać.
   4. Przygotować 10-50 μl porcji nieznakowanej aktyny w zależności od zastosowania i 20 μl podwielokrotności aktyny znakowanej ATTO. Przechowywać podwielokrotności w temperaturze -80 °C.
   5. Aby zdepolimeryzować oligomery aktyny, które tworzą się podczas liofilizacji i zamrażania, rozcieńczyć porcję ponownie zawieszonej aktyny ~ 8-krotnie w buforze G wzbogaconym dodatkowym ATP i DTT (na przykład do 20 μl ponownie zawieszonego roztworu aktyny z kroku 2.1.4 dodaj 134 μl buforu G, 0,32 μl 0,2 mM ATP i 0,16 μl 1 M DTT). W przypadku znakowania fluorescencyjnego dodaj około 10% znakowanej aktyny; na przykład dodaj 5 μl aktyny znakowanej ATTO do 40 μl rozcieńczonej nieznakowanej aktyny. Pozostawić do depolimeryzacji na lodzie, od czasu do czasu mieszając (pipetując), co najmniej kilka dni do tygodnia przed pomiarem stężenia białka za pomocą testu Bradforda, jak opisano w kroku 3.
      UWAGA: Rozcieńczoną, nieoznakowaną i fluorescencyjną aktynę należy przechowywać na lodzie w chłodni lub lodówce; Nigdy nie zamrażaj ani nie pozwól się rozgrzać. Preparat będzie kontynuował depolimeryzację w miarę upływu czasu, a przy odpowiednim obchodzeniu się z nim można go stosować przez co najmniej 6 miesięcy.
2. Zawiesić kompleks Arp2/3 (mózg świni) (patrz tabela materiałów) zgodnie z instrukcjami producenta (20 μg białka w 20 μl zimnego_H2O), z sekwencją pulsacyjnego wirowania, mieszania itd. na lodzie, jak opisano dla aktyny w kroku 2.1. Połącz roztwory białkowe z ponownego zawieszenia dwóch probówek z proszkiem, aby uzyskać większy zapas do powtarzalnych eksperymentów. Przygotować 2 μl porcji i przechowywać w temperaturze -80 °C.
3. Zawiesić profilinę (rekombinowaną przez człowieka) (patrz tabela materiałów) w stężeniu 4 razy wyższym niż określone w instrukcjach producenta (100 μg białka w 25 μl zimnego_H2O), z sekwencją pulsacyjnego wirowania, mieszania itd. na lodzie, jak dla aktyny w kroku 2.1. Połącz roztwory białkowe z ponownego zawieszenia dwóch probówek proszku przed określeniem stężenia białka, aby uzyskać większy zapas do powtarzalnych eksperymentów.
   UWAGA: Przechowywać na lodzie w chłodni lub lodówce; Nigdy nie zamrażaj ani nie pozwól się rozgrzać. Przy prawidłowym obchodzeniu się z zawieszoną profiliną jest ona dobra przez co najmniej 6 miesięcy do 1 roku.
4. Zawiesić białko zamykające (α1β2, rekombinowany przez człowieka) (patrz tabela materiałów) zgodnie z instrukcjami producenta (50 μg białka w 50 μl zimnego_H2O), z sekwencją pulsacyjnego wirowania, mieszania itd. na lodzie, jak opisano dla aktyny w kroku 2.1. Schłodzić 50 μl glicerolu na lodzie i dodać do niego 50 μl zawieszonego białka zamykającego; Delikatnie wymieszaj. Przechowywać w temperaturze -20 °C.
   UWAGA: Roztwór nie zamarza, a jego aktywność jest duża, więc roztwór może być przechowywany jako pojedyncza porcja przez miesiące, a nawet lata, jeśli obchodzi się z nim ostrożnie. Rekombinowane białko capping u myszy, najczęściej stosowane w przeszłości w eksperymentach in vitro¹³, będzie wkrótce dostępne na rynku.
5. Zawiesić żelsolinę (rekombinowaną przez człowieka, znakowaną His) (patrz tabela materiałów) zgodnie z instrukcjami producenta (20 μg białka w 20 μl zimnego_H2O), z sekwencją pulsacyjnego wirowania, mieszania itd. na lodzie, jak opisano dla aktyny w kroku 2.1. Na dzień eksperymentów zużywa się około 2 μl żelsoliny; dlatego należy przygotować duże porcje (5-10 μl) i przechowywać w temperaturze -80 °C.
   UWAGA: Protokół z żelsoliną jest dostarczany jako alternatywa. Zaleca się stosowanie białka capping zamiast gelsoliny, zakupionego lub oczyszczonego, jak w¹³.
6. Zawiesić VCA (ludzka WASP-VCA, znakowana GST) (patrz tabela materiałów) w stężeniu 2x wyższym niż określone w instrukcjach producenta (500 μg białka w 250 μl zimnego_H2O), z sekwencją pulsacyjnego wirowania, mieszania itp. na lodzie, jak dla aktyny w kroku 2.1. Przygotować 10 μl porcji i przechowywać w temperaturze -80 °C.
   UWAGA: Po komercjalizacji SpVCA (human pVCA, streptavidin i His-tagged) lub jeśli możliwe jest oczyszczanie białek¹⁴, zaleca się stosowanie SpVCA zamiast VCA. VCA nie daje w sposób powtarzalny komet w opisanych tutaj warunkach.

3. Pomiar stężenia białka

1. Skonstruuj standardową krzywą Bradforda składającą się z dwóch nakładających się na siebie szeregowych rozcieńczeń BSA.
   UWAGA: Krzywa standardowa musi być konstruowana tylko co kilka miesięcy (lub nawet rzadziej), o ile spektrofotometr się nie zmienia.
   1. W rzędzie 1 stojaka na mikroprobówki umieść probówki do rozcieńczania BSA serii #1: cztery probówki o pojemności 2 ml, a następnie cztery probówki o pojemności 1,5 ml. W rzędzie 3 stojaka umieść probówki do rozcieńczania BSA serii #2 jak dla serii #1. W rzędzie 5 stojaka umieść jedną probówkę o pojemności 2 ml dla każdej mierzonej próbki wraz z dwiema probówkami o pojemności 1,5 ml. Dodaj pojedynczą probówkę o pojemności 1,5 ml w rzędzie 5 dla ślepej próby.
   2. Odmierz odczynnik Bradford (patrz tabela materiałów) do probówek o pojemności 1.5 ml.
      1. Napełnij stożkową probówkę o pojemności 15 ml do góry odczynnikiem Bradford, aby ułatwić pipetowanie (nadmiar zostanie zwrócony do butelki bulionowej w lodówce) na lodzie. Weź 200 μl odczynnika Bradford i wyrzuć go z powrotem do stożkowej rurki, aby zwilżyć końcówkę pipety. Ponieważ roztwór jest lepki, pipetuj powoli, aby roztwór mógł dostać się i całkowicie opuścić końcówkę, nie tworząc pęcherzyków.
      2. Za pomocą "wstępnie zwilżonej" końcówki powoli odpipetuj 200 μl odczynnika Bradford do każdej z probówek o pojemności 1,5 ml w stojaku (cztery na każde rozcieńczenie BSA, jedna dla ślepej próby i dwie dla każdej mierzonej próbki). Zrób to najpierw, aby odczynnik Bradforda dokładnie ogrzał się do temperatury pokojowej przed zmieszaniem z roztworami białkowymi. Pozostałą zawartość stożkowej probówki o pojemności 15 ml umieścić z powrotem w butelce.
   3. Odmierzyć_H2Odo probówek o pojemności 2 ml. W rzędzie 1 stojaka dodaj 1,990 μL H₂O do pierwszej probówki i 900 μl do trzech pozostałych probówek. W rzędzie 3 dodaj 1 992,5 μl do pierwszej probówki i 900 μl do trzech pozostałych probówek. Dodać 2 000 μL_H2Odo każdej z probówek na próbkę w rzędzie 5.
      UWAGA: W przypadku wszystkich objętości większych niż 1 000 μl należy użyć pipety o pojemności 1 000 μl, ale należy podać pełną ilość pipetując dwukrotnie. Ważne jest, aby wszystko przygotować przed rozpoczęciem kolejnych kroków, aby uniknąć pozostawiania białek silnie rozcieńczonych w_H2Oprzez długi czas.
   4. Aby przygotować serię rozcieńczeń BSA #1, zmieszać 10 μl skalibrowanego 2 mg/ml BSA (patrz Tabela Materiałów) z probówką z 1,990 μl_H2O, aby uzyskać roztwór o stężeniu 10 μg/ml. Na tej podstawie wykonać trzy seryjne rozcieńczenia (5 μg/ml, 2,5 μg/ml i 1,25 μg/ml BSA), przenosząc 900 μl każdego roztworu do następnej probówki (zawierającej 900 μl_H2O).
   5. Aby przygotować serię rozcieńczeń BSA #2, zmieszaj 7,5 μl skalibrowanego 2 mg/ml BSA z probówką z 1,992,5 μl_H2O, aby uzyskać roztwór o stężeniu 7,5 μg/ml. Na tej podstawie należy wykonać trzy seryjne rozcieńczenia (3,75 μg/ml, 1,875 μg/ml i 0,9375 μg/ml BSA), przenosząc 900 μl każdego roztworu do następnej probówki (zawierającej 900 μl_H2O).
   6. Wymieszaj i odczytaj absorbancję, aby wygenerować krzywą wzorcową. Dodaj 800 μl H₂O do probówki z odczynnikiem Bradford dla ślepej próby i uruchom stoper. Tak efektywnie, jak to możliwe, bez tworzenia pęcherzyków, wymieszaj 800 μl każdego wzorca BSA z 200 μl odczynnikiem Bradford w przygotowanych probówkach. Po wymieszaniu wszystkich wzorców z odczynnikiem Bradford (< 5 min), wlej każdy wzorzec do jednorazowej kuwety i odczytaj absorbancję przy 600 nm w spektrofotometrze po wygaszeniu maszyny.
      UWAGA: Ta sama kuweta może być używana do odczytu całej serii, jeśli najpierw odczytywany jest najmniej skoncentrowany wzorzec, a kuweta jest dobrze opróżniona między odczytami. Powtarzaj krzywą standardową, aż dopasowanie liniowe będzie miało wartość R co najmniej 0,99. Dopiero po opanowaniu pipetowania i delikatnego mieszania należy przystąpić do odczytywania próbek.
2. Pomiar stężeń aktyny i białek wiążących aktynę
   1. W probówkach o pojemności 2 ml zawierających 2 000 μl_H2O(przygotowanych w kroku 3.1.3) delikatnie wymieszać następujące elementy: po 2 μl kompleksu Arp2/3 i profiliny, 4 μl znakowanej G-aktyny, po 5 μl żelsoliny i VCA oraz 8 μl białka cappingującego (rekombinowanego człowieka). Natychmiast pobrać 800 μl roztworu i wymieszać z już przygotowanym odczynnikiem Bradforda, a następnie powtórzyć, aby uzyskać dwa odczyty w odległości 5%-10% od siebie dla każdej próbki. Większa różnica wskazuje na problem z ponownym zawieszeniem lub obsługą. Odczyt w ciągu kilku minut od zmieszania z odczynnikiem Bradford.
      UWAGA: W przypadku stosowania krzywej wzorcowej z innego dnia, oprócz próbek należy przygotować tylko ślepą próbę z kroku 3.1.6.
3. Obliczyć stężenia aktyny i białek wiążących aktynę, stosując krzywą wzorcową i współczynnik rozcieńczenia. Powtórz pomiar dla każdego nowego wymieszania. Masy cząsteczkowe do przeliczania odczytów mg / ml uzyskanych za pomocą testu Bradforda na μM to: aktyna 43 kD, kompleks Arp2 / 3 224 kD, profilina 15 kD, żelsolina 95 kD, białko capping 68 kD (rekombinant ludzki) lub 63,5 kD (rekombinant myszy), VCA 43 kD i SpVCA 54 kD (masa cząsteczkowa monomeru).

4. Powlekanie koralików

1. Wstępnie schłodzić wirówkę do temperatury 4 °C i ustawić suchy blok mieszania (patrz tabela materiałów) na 18 °C.
2. Przemyć kulki: odpipetować 50 μl buforu Xb do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml, dodać 9 μl zawiesiny kulek o średnicy 4,5 μm lub 2 μl zawiesiny kulek o średnicy 1 μm (2,5 % w/v zawiesiny) (patrz tabela materiałów). Dokładnie wymieszać i odwirować próbki o masie 20 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
   UWAGA: Całkowita powierzchnia ściegu obu rozmiarów koralików wynosi 3 cm²:
   
   wyprowadza się przez obliczenie liczby ściegów, a następnie ich całkowitej powierzchni przy użyciu klasycznych równań dla objętości i pola powierzchni kul. Można użyć innych rozmiarów koralików, jeśli ich ilość zostanie dostosowana tak, aby utrzymać stałą powierzchnię na poziomie 3^cm2.
3. Pokryć kulki: ostrożnie usunąć supernatant bez naruszania kulek i ponownie zawiesić granulkę w 40 μl 2 μM SpVCA (lub 7 μM VCA) w buforze Xb, delikatnie pipetując. Mieszać w temperaturze 18 °C, 1 000 obr./min przez 20 min.
4. Umyć pokryte kulki: odwirować mieszaninę (20 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C) i ostrożnie usunąć supernatant. Zawiesić kulki w 50 μl zimnego Xb/1% BSA i odwirować przy 20 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant i powtórzyć etap mycia 1x.
5. Ponownie zawiesić powlekany granulat kulki z kroku 4.4 w 120 μL zimnego Xb/1% BSA dla obu rozmiarów kulek, tak aby ilość powierzchni kulki/μl roztworu kulki była taka sama. Przechowywać na lodzie w lodówce lub chłodni. Powlekane koraliki będą funkcjonować normalnie przez co najmniej kilka tygodni.

5. Przygotowanie mieszanki ruchliwości i preparatów do obserwacji

UWAGA: Całkowita objętość mieszanki o ruchliwości wynosi 8,4 μL, co pozwala na około 25 μm luzu między szkiełkiem podstawowym a szkiełkiem nakrywkowym 18 mm x 18 mm, dzięki czemu koraliki wszystkich rozmiarów (do 10 μm średnicy) nie są ściskane. Podstawowa mieszanina ruchliwości to około 5 μM G-aktyny (10% znakowana aktyna fluorescencyjna) z 5 μM profiliną, 50 nM kompleksem Arp2/3 i białkiem cappingującym 25 nM (lub 240 nM żelsoliną).

1. Przygotować mieszaninę reakcji ruchliwości. Dokładne ilości aktyny (a tym samym profiliny) zależą od stężenia obliczonego w kroku 3.3, ale reprezentatywna reakcja jest następująca. Wymieszać na lodzie, w następującej kolejności: 3,2 μl MB13, 1,5 μL profiliny w 30 μM rozcieńczonej w MB13, 1 μL białka zamykającego w 0,21 μM rozcieńczonego w MB13 lub żelsoliny rozcieńczonej do 2 μM w MB13, 1 μL kompleksu Arp2/3 w 0,47 μM rozcieńczonego w MB13, 0,2 μl zawiesiny perełkowej (wir tuż przed użyciem) i 1,5 μl aktyny w 30 μM w buforze G. Wymieszaj dobrze, ale szybko i uruchom minutnik.
2. Znajdź całą mieszaninę reakcji ruchliwości na szkiełku. Przykryj szkiełkiem nakrywkowym o wymiarach 18 mm x 18 mm i zaklej szkiełko nakrywkowym stopionym VALAP za pomocą małego pędzla. VALAP jest mieszaniną lanoliny, parafiny i wazeliny (patrz tabela materiałów) wagowo w stosunku 1:1:1, stopioną i wymieszaną razem.

6. Obserwacja mikroskopowa

1. Natychmiast obserwuj reakcje ruchliwości za pomocą obiektywu 100x na mikroskopie pionowym lub odwróconym (patrz Tabela materiałów), wyposażonym w kontrast fazowy i/lub mikroskopię epifluorescencyjną (kostka GFP, patrz Tabela materiałów). Obserwacje przeprowadza się w temperaturze pokojowej (23-25 °C).
   1. Aby uzyskać średnie prędkości przemieszczenia dla całej populacji koralików, należy zarejestrować kontrast fazowy lub fluorescencyjne obrazy nieruchome w czasie, skanując cały szkiełko. Zmierz długość komety ręcznie i wykreśl w funkcji czasu. Nachylenie pasowania liniowego to średnia prędkość wzrostu.
   2. Aby ocenić prędkość poszczególnych koralików, zbierz filmy poklatkowe w mikroskopii kontrastu fazowego. W zależności od prędkości ściegu i wymaganej rozdzielczości rób klatki co 1-10 s. Użyj narzędzia do śledzenia dowolnego programu do przetwarzania obrazu, aby uzyskać prędkości i trajektorie ściegów.

Wyniki

Jednym z kluczowych aspektów powtarzalnego tworzenia komet aktynowych na koralikach jest delikatne i precyzyjne pipetowanie delikatnych białek wiążących aktynę. Wygenerowanie krzywej wzorcowej Bradforda jest dobrym sposobem oceny umiejętności pipetowania. Rysunek 1A,B pokazuje probówki dla krzywej standardowej oraz przykład, jak wyglądają dwa seryjne rozcieńczenia BSA po zmieszaniu z odczynnikiem Bradforda. Zwróć uwagę na stopniowany niebieski odcień (wyższe stężenie białka daje bardziej niebieski roztwór). Po odczytaniu ze spektrofotometru i wykreśleniu, roztwory te dają krzywą standardową, jak pokazano na Rysunek 1C. Aby ćwiczyć staranne pipetowanie, test należy powtarzać do momentu, gdy współczynnik korelacji liniowej wyniesie 0,999, jak pokazano.

Po dokładnym oszacowaniu stężenia komercyjnych zawieszonych białek za pomocą testu Bradforda, powlekane kulki i mieszanka ruchliwości są przygotowywane i mieszane razem. Rysunek 2A pokazuje reprezentatywne obrazy różnych etapów powstawania komety: chmury aktyny tworzą się w ciągu kilku minut od zmieszania koralików pokrytych SpVCA i medium ruchliwości; Polaryzacja chmur następuje po ~5 min, a produkcja komety po 15-20 min. Komety aktynowe, widoczne zarówno za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej, jak i kontrastu fazowego (Ryc. 2A), kontynuują wydłużanie się przez wiele godzin, ale nie jest utrzymywana stała prędkość, więc ruchliwość kulek jest zwykle oceniana w ciągu 1 godziny. Z drugiej strony, potrzeba 30 minut z koralikami pokrytymi VCA, aby uzyskać jasne chmury aktynowe (Rysunek 2B), i nie tworzą się komety, chociaż symetria zaczyna się załamywać po 1-2 godzinach (strzałka w Rysunek 2B), a chmury wykazują polaryzację po całonocnej inkubacji.

Rysunek 3 pokazuje przykład oceny prędkości kulki w obecności białka ograniczającego. Ponieważ wszystkie koraliki łamią symetrię mniej więcej w tym samym czasie, wykonywane są nagrania "pseudo-poklatkowe", w których skanowany jest slajd i wykonywane są zdjęcia całej populacji komet w czasie (Rysunek 3A). Komety nie ulegają depolimeryzacji; w związku z tym wzrost długości komet mierzony w czasie może być wykorzystany do obliczenia prędkości przemieszczenia (Rysunek 3B). Gelsolin może być stosowany zamiast białka capping do tworzenia komet, jeśli doda się 10 razy więcej gelsoliny, aby skompensować jej zmniejszoną aktywność cappingu. Komety powstałe w obecności żelsoliny są jakościowo takie same i poruszają się z mniej więcej takimi samymi prędkościami jak koraliki z białkiem zamykającym (Rysunek 3C). Aktywność cappingu jest kluczowa dla koncentracji polimeryzacji na powierzchni kulki, a gdy ani białko capping, ani gelsolin nie są zawarte w mieszance ruchliwości, chmury aktyny nigdy nie polaryzują się, tworząc komety, chociaż jasne chmury aktyny tworzą się wokół kulek (Rysunek 3D). Komety na koralikach mogą być używane do pomiaru produkcji sił opartych na aktynie w różnych kontekstach biochemicznych poprzez zmianę mieszanki ruchliwości i obserwację wyniku na ruchliwość przy użyciu różnych technik mikromanipulacji, na przykład¹⁵.

Rysunek 1: Krzywa standardowa Bradforda. (A) Obraz, jak ustawić rurki do wykonania krzywej standardowej Bradforda. Probówki na próbki nie są pokazane. (B) Zdjęcie dwóch nakładających się na siebie seryjnych rozcieńczeń BSA po zmieszaniu z odczynnikiem Bradforda. (C) Absorbancja roztworów pokazanych w (B) przy 600 nm jest mierzona w spektrofotometrze i wykreślana na wykresie jako funkcja stężeń białek w roztworach BSA. Pasowanie liniowe służy do obliczania stężenia próbki. Współczynnik korelacji R dopasowania liniowego wynosi 0,999. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Formacja komety na koralikach pokrytych SpVCA, w przeciwieństwie do koralików pokrytych VCA. (A) Reprezentatywne koraliki pokryte SpVCA (różne koraliki na każdym obrazie) pokazane w czasie. Wskazany jest czas od momentu wymieszania. Chmury aktynowe tworzą się natychmiast, a polaryzacja chmur daje komety, które wydłużają się przez wiele godzin. (B) Reprezentatywne koraliki pokryte VCA (różne koraliki na każdym obrazie) pokazane w czasie. Potrzeba więcej niż 1 godziny, aby zobaczyć początki polaryzacji chmur aktynowych (strzałka) i nawet długie inkubacje nie wytwarzają komet. Wszystkie obrazy przedstawiają kulki o średnicy 4,5 μm, obrazowanie epifluorescencyjne aktyny fluorescencji w połączeniu z wizualizacją kontrastu fazowego dla 15 i 20 minutowych punktów czasowych w (A), podziałka = 5 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Analiza prędkości komet i koralików. (A) i (C) W obecności białka ograniczającego (CP) lub żelsoliny, chmury aktynowe polaryzują się, tworząc komety w ciągu pierwszych 20 minut reakcji, a komety wydłużają się z czasem. Czas od wymieszania wskazany dla każdego obrazu; Każdy obraz to inny koralik. Istnieje pewna zmienność między kulkami i przygotowaniem, ale średnio kulki poruszają się z prędkościami mikronów/submikronów na minutę (0,2-1 μm/min) w standardowych warunkach opisanych tutaj. (B) Reprezentatywny wykres przedstawiający ocenę długości komety (całej populacji koralików) w czasie. Nachylenie korelacji liniowej odpowiada średniej prędkości przemieszczenia, w tym przypadku 0,24 μm/min. (D) W przypadku braku aktywności cappingu (brak białka capping lub gelsoliny) wokół kulek tworzą się chmury aktynowe, ale komety nie powstają. Wszystkie obrazy przedstawiają kulki o średnicy 4,5 μm, obrazowanie epifluorescencyjne aktyny fluorescencyjnej, podziałka = 5 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

Opisany tutaj protokół opisuje, w jaki sposób uzyskać wzrost sieci aktynowej na powierzchni koralików, powstawanie komet i ruchliwość koralików przy użyciu komercyjnie dostępnych białek. Czasami jednak komety nie są obserwowane w sposób powtarzalny lub są niejednorodne między szkiełkiem a szkiełkiem nakrywkowym. Poniższa dyskusja podkreśla niektóre kluczowe punkty protokołu i sugeruje niektóre parametry, które można dostosować. Jednym z czynników, o których należy pamiętać, jest to, że na powstawanie komet i prędkość koralików ma wpływ temperatura, przy czym temperatury znacznie powyżej 25 °C lub znacznie poniżej 23 °C negatywnie wpływają na powstawanie komet i dostarczają niepowtarzalnych danych. Zdecydowanie zaleca się korzystanie z mikroskopu o kontrolowanej temperaturze lub mikroskopu w pomieszczeniu o kontrolowanym klimacie. Chociaż znakowana fluorescencyjnie aktyna jest często włączana do mieszanki ruchliwości w celu obserwacji komet za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, gdy komety mają długość większą niż średnica koralika, są również widoczne pod mikroskopią kontrastu fazowego jako ciemna plama obok koralika. Wizualizacja z kontrastem fazowym jest bardziej odpowiednia dla obrazowania poklatkowego, ponieważ pewna fototoksyczność jest związana z obrazowaniem fluorescencyjnym, nawet za pomocą wirującego dysku. Ponieważ koraliki osiadają z czasem, mikroskop odwrócony wytwarza mniejszy dryf poziomych ściegów niż mikroskop pionowy i jest bardziej odpowiedni do filmów. Stosowanie stopionego VALAP do uszczelniania szkieł jest ważne, ponieważ substancje takie jak lakier do paznokci zakłócają tworzenie się komet. Duże ilości VALAP można przygotować w zlewce, a następnie zgarnąć w celu ponownego napełnienia mniejszych zlewek, które są bardziej podatne na szybkie topnienie. VALAP jest dobry przez lata w temperaturze pokojowej.

Kolejnym kluczowym aspektem technicznym jest skrupulatne przygotowanie mieszanki buforowej i ruchliwej. Należy zachować ostrożność podczas przygotowywania MB13, szczególnie na etapie regulacji pH. pH MB13 należy szybko dostosować do obojętnego za pomocą NaOH, aby uniknąć hydrolizy ATP, ale nie za szybko, ponieważ EGTA rozpuszcza się, gdy pH zbliża się do neutralnego. EGTA jest kluczowym składnikiem, ponieważ kompleksuje wapń związany z aktyną, dając w mieszance ruchliwości bardziej aktywną formę magnezu¹⁶. MB13 przygotowana zbyt szybko lub zbyt wolno powoduje nieoptymalne formowanie się komety lub nawet jej brak. Dodatkową kluczową kwestią jest uważne śledzenie stężenia KCl w mieszance ruchliwości podczas zabawy z warunkami. Na przykład, przy użyciu 1x MB13 w mieszaninie reakcyjnej i rozcieńczaniu profiliny, białka zamykającego i kompleksu Arp2/3 w MB13, końcowe stężenie KCl w reakcji ruchliwości wynosi około 40-50 mM ze względu na rozcieńczenie buforem G. To stężenie daje najlepsze wyniki w teście komet, a każde więcej niż 60 mM KCl zmniejsza aktywność zarodkowania kompleksu Arp2/3.

Jeśli chodzi o białka, krytycznym technicznym aspektem otrzymywania komet aktynowych jest właściwe obchodzenie się z komercyjnymi białkami wiążącymi aktynę, w szczególności precyzyjne pipetowanie ilości mikrolitrów. Liniowość krzywej wzorcowej Bradforda jest dobrym testem pipetowania, a krzywa może być następnie wykorzystana do rutynowych pomiarów stężeń białek. Rzeczywiście, w przypadku stosowania ponownie zawieszonych białek komercyjnych w procedurze komety, ważne jest, aby zawsze weryfikować stężenia białka, ponieważ zmienność partii i błąd użytkownika podczas ponownego zawieszania mogą prowadzić do różnic między rzeczywistymi a oczekiwanymi stężeniami. Czasami niewielkie różnice w stężeniach białek mogą prowadzić do całkowitego braku komet.

Innym ważnym aspektem przedstawionej tutaj metody jest zastosowanie G-aktyny skompleksowanej z profiliną jako paliwa do polimeryzacji. Historycznie rzecz biorąc, systemy in vitro wykorzystywały wstępnie spolimeryzowaną aktynę nitkowatą (F-aktynę) jako źródło aktyny: depolimeryzacja w polimeryzacji podawanej luzem na powierzchni^10,17. Miało to tę zaletę, że kontrolowało poziomy G-aktyny, ale dodawało warstwę złożoności wymagającą dodatkowych składników do katalizowania depolimeryzacji. Ponieważ obrót sieci aktyny nie jest konieczny do wytwarzania sił i ruchliwości, które są napędzane przez zarodkowanie i polimeryzację na powierzchni kulki, podczas gdy czynniki depolimeryzacji aktyny, takie jak ADF / kofilina, działają na starzejące się sieci daleko od powierzchni¹⁸, większość odtworzenia in vitro ruchliwości opartej na aktynie odbywa się obecnie bez obrotu dla uproszczenia. Istnieją jednak pewne wady stosowania G-aktyny. Po pierwsze, przy stosowaniu komercyjnej aktyny, która została poddana liofilizacji, obecne są oligomery. Opisane tutaj etapy depolimeryzacji są bardzo ważne w uzyskaniu powtarzalnych wyników. W szczególności, chociaż bufor G jest tradycyjnie dostosowywany do pH 8, niższe pH (na przykład pH 7) wydaje się działać lepiej w testach opisanych w tym artykule, prawdopodobnie dlatego, że niskie pH zwiększa depolimeryzację¹⁹. Inną wadą stosowania G-aktyny jest to, że po umieszczeniu w warunkach soli sprzyjających polimeryzacji dochodzi do spontanicznego zarodkowania i F-aktyna tworzy się zarówno w masie, jak i na powierzchni kulki. Kompleksowanie G-aktyny z profiliną hamuje spontaniczne zarodkowanie w polimeryzacji masowej i spiczastej końca, skupiając w ten sposób zarówno zarodkowanie, jak i polimeryzację z zadziorowym końcem na powierzchni²⁰. Profilina-G-aktyna jest fizjologicznie istotna, ponieważ duża część aktyny w komórce jest obecna w tej formie²¹. W tym przypadku stosuje się stosunek profiliny do aktyny 1:1; jednak wyższe współczynniki (na przykład 3:1) dokładniej hamują polimeryzację w masie, chociaż wyższe proporcje hamują również kompleks Arp2/3 i do pewnego stopnia wydłużenie kolczastego końca^22,23.

Aktywność cappingu jest również kluczowa dla formowania się komet, ponieważ zapewnia wprowadzenie nowej aktyny na powierzchnię poprzez cykle zarodkowania przez aktywowany powierzchniowo kompleks Arp2/3^24,25. Bez pokrywy, chmury aktyny nie łamią symetrii, tworząc komety, ponieważ polimeryzacja na powierzchni nie wytwarza wystarczającego napięcia, aby rozbić obłok²⁶. W przeszłości używaliśmy oczyszczonego w domu rekombinowanego mysiego białka capping¹³, ale testy przeprowadzone na potrzeby tego artykułu wskazują, że dostępne na rynku rekombinowane ludzkie białko capping jest równie skuteczne, jak komercyjnie dostępna gelsolina, chociaż należy użyć 10 razy więcej żelsoliny, a w przypadku niektórych zastosowań może nie być odpowiednia, ponieważ ma działanie odcinające aktynę, a także capping²⁷.

Wreszcie, solidność tej metody polega na zastosowaniu bardzo aktywnego aktywatora kompleksu Arp2/3, streptawidyny-pVCA (SpVCA)²⁸. SpVCA obejmuje domenę wiążącą profilinę-G-aktynę WASP (domena p) oprócz domeny wiązania kompleksu Arp2/3, ponieważ stwierdzono, że jest ona najbardziej efektywna w warunkach profiliny-G-aktyny²⁹. Co ważniejsze, zastosowanie znacznika streptawidyny, pierwotnie wprowadzonego w celu umożliwienia funkcjonalizacji powierzchni poprzez połączenie biotyna-streptawidyna, ma dodatkowy efekt zwiększenia aktywacji kompleksu Arp2/3, prawdopodobnie ze względu na fakt, że streptawidyna jest tetramerem, a zatem grupuje aktywator, o którym wiadomo, że zwiększa aktywność kompleksu Arp2/3³⁰. Komercyjnie produkowany SpVCA jest obecnie w fazie rozwoju i wkrótce będzie dostępny w sprzedaży. Należy również zauważyć, że chociaż 40 μL 2 μM SpVCA jest rutynowo używane do pokrycia 3^cm2 powierzchni koralików, inne stężenia powłok (wyższe i niższe) również działają, a zabawa z tymi warunkami daje różne prędkości wzrostu i morfologie komety. Rzeczywiście, gdy komety się nie tworzą lub rozmiar komety nie jest jednorodny na szkiełku, należy przetestować różne warunki powlekania, a także różne stężenia KCl i profiliny w mieszance ruchliwości. Stężenia aktyny, kompleksu Arp2/3 i białka ograniczającego w mieszance ruchliwości mogą być również zmieniane w celu optymalizacji powstawania komet, ale w naszych rękach zmiana tych proporcji często daje mylące wyniki.

Podsumowując, opisane tutaj metody powodują składanie aktyny na powierzchniach i ruchliwości koralików, ale można użyć dowolnej powierzchni, którą można sfunkcjonalizować za pomocą SpVCA. W przypadkach, gdy opisana tutaj adsorpcja nie działa, ugrupowanie streptawidyny można wykorzystać do przyłączenia SpVCA do powierzchni zainteresowania po biotynylacji. Powstałe w ten sposób struktury aktynowe, komety lub inne, mogą być używane do testowania różnych biochemicznych i biofizycznych aspektów sieci aktynowych i są szczególnie odpowiednie do fizycznych manipulacji za pomocą mikropipet, pęset optycznych i ablacji laserowych 15,26,31,32. Oprócz zastosowań dla społeczności naukowej, opisane tutaj podejście jest odpowiednie jako narzędzie dydaktyczne dla studentów biofizyki do studiowania pojęć materii aktywnej, takich jak łamanie symetrii i samoorganizacja.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Aktyna, mięsień królika, koniugat Alexa Fluor 488	Invitrogen (ThermoFisher Scientific)	A12373 (niedawno wycofany)	Ten produkt można zastąpić aktyną ATTO-488 firmy Hypermol.
Aktyna, mięsień królika, ATTO-488	Hypermol	8153
Aktyna, mięśnie szkieletowe królika	Cytoszkielet	AKL99
Kompleks Arp2/3	Cytoszkielet	RP01P
ATP	Sigma	A7699
BioSpectrometer, podstawowy	Eppendorf	035739
Bradford Odczynnik	Bio-Rad	500-0006
BSA, wysokiej jakości	standard Sigma	A3059
BSA 2 mg / ml (Pierce)	Thermo Scientific	23209
Białko cappingowe (a1b2, rekombinowane myszy)	Oczyszczane w domu (odniesienie 13)		Ten produkt będzie wkrótce dostępny na rynku w Cytoskeleton.
Białko zamykające (a1b2, rekombinowany ludzko)	Hypermol	8322
Cube, GFP: U-MNIBA3 lub U-MWB2	Olympus	wycofane	Można użyć dowolnej kostki GFP, dostosowanej do używanego mikroskopu.
Suchy blok, mieszanie: ThermoMixer C (chłodzony)	Eppendorf	035963
** ze SmartBlock, 24 mikroprobówki 2 ml	Eppendorf	035969
Gelsolin (rekombinowany przez człowieka, His-tagged)	Cytoszkielet	HPG6
Lanolina	Sigma	49909
Mikrowirówka 5427R + rotor	Eppendorf	934126
Mikroskop pionowy: BX51	Olympus	wycofany z produkcji	Można użyć dowolnego pionowego mikroskopu epifluorescencyjnego wyposażonego w optykę z kontrastem fazowym.
Mikroskop odwrócony: IX70	Olympus	wycofany z produkcji	Można użyć dowolnego mikroskopu odwróconego epifluorescencji wyposażonego w optykę z kontrastem fazowym.
Parafina	Sigma	76244
Wazelina	Sigma	16415
Pipety Research Plus	Pipety Eppendorf		Gilson nie sprawdzają się tak dobrze w przypadku dostarczania bardzo małych objętości (0,5 i mikro; L, na przykład).
**10 &mikro; L		933954
**2,5 &mikro; L		933953	Te dwa rozmiary są niezbędne, ale zaleca się stosowanie wysokiej jakości pipet (na przykład pełnego zestawu Research Plus).
Kulki karboksylowe z polistyrenu	Polysciences
**ok. 1 &mikro; M średnica		08226
**ok. 4,5 &mikro; m średnica		17140-5
Profilin 1 (rekombinowana przez człowieka, nieoznakowana)	Cytoszkielet	PR02
SpVCA (ludzka domena WASP pVCA, N-ter His-tag, C-ter Streptawidin tag)	Oczyszczany w domu (odniesienie 14)		Ten produkt będzie wkrótce dostępny na rynku w Cytoskeleton.
VCA (ludzka domena WASP VCA, oznaczona GST)	Cytoszkielet	VCG03