Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Pomiar termogenezy mięśni szkieletowych u myszy i szczurów

3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64264

⸱

27 lipca 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Biomedical Sciences, Kent State University, 2College of Public Health, Kent State University, 3Department of Biological Sciences, Kent State University

W tym artykule

Podsumowanie

Myszy i szczury są chirurgicznie wszczepiane za pomocą zdalnych transponderów temperatury, a następnie przyzwyczajane do środowiska testowego i procedury. Zmiany temperatury mięśni są mierzone w odpowiedzi na bodźce farmakologiczne lub kontekstowe w klatce domowej lub podczas zalecanej aktywności fizycznej (np. chodzenie na bieżni ze stałą prędkością).

Streszczenie

Termogeneza mięśni szkieletowych stanowi potencjalną drogę do lepszego zrozumienia homeostazy metabolicznej i mechanizmów leżących u podstaw wydatkowania energii. Zaskakująco mało jest dostępnych dowodów na bezpośrednie powiązanie neuronalnych, mięśniowokomórkowych i molekularnych mechanizmów termogenezy z mierzalnymi zmianami temperatury mięśni. W artykule opisano metodę, w której transpondery temperatury są wykorzystywane do pobierania bezpośrednich pomiarów temperatury mięśni szkieletowych myszy i szczurów.

Zdalne transpondery są chirurgicznie wszczepiane w mięśnie myszy i szczurów, a zwierzęta mają czas na regenerację. Myszy i szczury muszą być następnie wielokrotnie przyzwyczajane do środowiska i procedury testowej. Zmiany temperatury mięśni są mierzone w odpowiedzi na bodźce farmakologiczne lub kontekstowe w klatce domowej. Temperaturę mięśni można również mierzyć podczas zalecanej aktywności fizycznej (tj. chodzenia na bieżni ze stałą prędkością), aby uwzględnić zmiany w aktywności jako czynniki przyczyniające się do zmian temperatury mięśni wywołanych przez te bodźce.

Ta metoda została z powodzeniem wykorzystana do wyjaśnienia mechanizmów leżących u podstaw kontroli termogenicznej mięśni na poziomie mózgu, układu współczulnego układu nerwowego i mięśni szkieletowych. Podano demonstracje tego sukcesu przy użyciu zapachu drapieżnika (PO; zapach fretki) jako bodźca kontekstowego i wstrzyknięć oksytocyny (Oxt) jako bodźca farmakologicznego, gdzie zapach drapieżnika indukuje termogenezę mięśni, a Oxt tłumi temperaturę mięśni. W ten sposób te zestawy danych pokazują skuteczność tej metody w wykrywaniu gwałtownych zmian temperatury mięśni.

Wprowadzenie

W ramach badań metabolicznych, badanie termogenezy mięśni szkieletowych jest obiecującą nową drogą do badania homeostazy masy ciała. Opublikowana literatura potwierdza tezę, że reakcje termogeniczne jednego z największych układów narządów organizmu - mięśni szkieletowych - zapewniają drogę do zwiększenia wydatku energetycznego i innych efektów metabolicznych, tym samym skutecznie przywracając równowagę systemów w chorobach takich jak otyłość1,2,3. Jeśli mięsień można uznać za narząd termogeniczny, badania muszą wykorzystywać praktyczną metodologię badania zmian termogenicznych w obrębie tego narządu. Chęć zrozumienia endotermicznego wpływu mięśni szkieletowych i użyteczność tej metodologii do badania termogenezy mięśni bez dreszczy nie są specyficzne dla badań metabolicznych. Dyscypliny takie jak evolution4, fizjologia porównawcza5 i ekofizjologia6,7 wykazały zainteresowanie zrozumieniem, w jaki sposób termogeneza mięśni może przyczyniać się do endotermii i jak ten mechanizm dostosowuje się do środowiska. Przedstawiony protokół zawiera kluczowe metody niezbędne do odpowiedzi na te pytania.

Podana metoda może być wykorzystana do oceny zarówno kontekstowej, jak i farmakologicznej modulacji temperatury mięśni, w tym unikalnej techniki dostarczania zapachu drapieżnika (PO) w celu zmiany kontekstu w celu odtworzenia zagrożenia ze strony drapieżnika. Wcześniejsze doniesienia wykazały zdolność PO do szybkiego indukowania znacznego wzrostu termogenezy mięśni8. Co więcej, bodźce farmakologiczne mogą również zmieniać temperaturę mięśni. Wykazano to w kontekście termogenezy mięśni indukowanej PO, gdzie farmakologiczna blokada obwodowych receptorów β-adrenergicznych, przy użyciu nadololu, hamowała zdolność PO do indukowania termogenezy mięśni bez istotnego wpływu na termogenezę skurczową podczas chodzenia na bieżni8. Centralne podawanie agonistów receptora melanokortyny u szczurów było również wykorzystywane do rozpoznawania mechanizmów mózgowych zmieniających termogenezę9,10.

Podane tutaj jest wstępne badanie zdolności neurohormonu oksytocyny (Oxt) do zmiany termogenezy mięśni u myszy. Podobnie jak w przypadku zagrożenia ze strony drapieżnika, spotkania społeczne z przedstawicielami tego samego gatunku podnoszą temperaturę ciała, zjawisko określane jako hipertermia społeczna11. Biorąc pod uwagę znaczenie Oxt dla zachowań społecznych12, spekuluje się, że Oxt jest mediatorem hipertermii społecznej u myszy. Rzeczywiście, antagonista receptora oksytocyny zmniejsza hipertermię społeczną u myszy11, a młode myszy pozbawione Oxt wykazują deficyty w behawioralnych i fizjologicznych aspektach termoregulacji, w tym termogenezy13. Biorąc pod uwagę, że Harshaw i in. (2021) nie znaleźli dowodów potwierdzających termogenezę brązowej tkanki tłuszczowej zależnej od receptora β3 adrenergicznego (BAT) z hipertermią społeczną11, założono, że hipertermia społeczna może być napędzana przez indukcję termogenezy mięśni przez Oxt.

Aby zmierzyć termogenezę mięśni szkieletowych, poniższy protokół wykorzystuje implantację wstępnie zaprogramowanych transponderów IPTT-300 przylegających do interesującego mięśnia u myszy lub szczura8,10,14,15. Transpondery te są mikroczipami w szklanych obudowach, które są odczytywane za pomocą odpowiednich czytników transponderów. Niewiele lub żadne badania nie wykorzystywały tej technologii w tym charakterze, chociaż badania sugerowały potrzebę specyficzności zapewnianej przez tę metodę16,17. Wcześniejsze badania wykazały niezawodność tej metody i różnorodność sposobów wykorzystania transponderów temperatury w porównaniu z innymi metodami badania temperatury18 lub w połączeniu z metodami chirurgicznymi (np. kaniulacja19). Jednak badania tego rodzaju opierają się na różnych strategicznych umiejscowieniach do pomiaru ogólnej temperatury ciała20,21,22 lub określonych tkanek, takich jak BAT23,24,25.

Zamiast mierzyć temperaturę z tych miejsc lub podczas korzystania z termometrów dousznych lub doodbytniczych26, opisana tutaj metoda zapewnia specyficzność dla interesującego mięśnia. Zdolność do celowania w miejsce poprzez bezpośrednie wszczepianie transponderów przylegających do mięśni będących przedmiotem zainteresowania jest bardziej skuteczna w badaniu termogenezy mięśni. Zapewnia nową drogę oprócz tych zapewnianych przez powierzchniową termometrię w podczerwieni27,28 lub pomiary temperatury skóry za pomocą termopary29. Co więcej, dane dostarczone za pomocą tej metody oferują szereg ścieżek badawczych, unikając konieczności stosowania dużego, drogiego, zaawansowanego technologicznie sprzętu i oprogramowania, takiego jak termografia w podczerwieni30,31,32.

Ta metoda została z powodzeniem wykorzystana do pomiaru temperatury w mięśniu czworogłowym i brzuchatym łydce, zarówno jednostronnie, jak i dwustronnie. Ta metoda okazała się również skuteczna w połączeniu z chirurgią stereotaktyczną14,15. W odległości ~7-10 cm od ramienia transpondera służą przenośne czytniki transponderów (DAS-8027/DAS-7007R) do skanowania, pomiaru i wyświetlania temperatury. Ta odległość była krytyczna i cenna dla wcześniejszych badań8,9,10, ponieważ minimalizuje potencjalne czynniki stresogenne i zmienne zmieniające temperaturę, takie jak obchodzenie się ze zwierzętami podczas procedur testowych. Za pomocą timerów można następnie rejestrować i zbierać pomiary przez pewien czas bez bezpośredniej interakcji ze zwierzętami.

Aby jeszcze bardziej zminimalizować przeszkadzanie myszom podczas testowania, ta metoda opisuje montaż i użycie pionów z rur PVC, aby umożliwić eksperymentatorowi dostęp do dolnej części klatek domowych podczas testowania. Za pomocą taśm nośnych w połączeniu z czytnikiem cyfrowym można dokonywać pomiarów temperatury kończyny transpondera bez jakiejkolwiek interakcji ze zwierzętami po umieszczeniu bodźca. Przy minimalnych kosztach metoda ta może być stosowana w połączeniu z bodźcami farmakologicznymi i kontekstowymi, dzięki czemu jest dość dostępna dla badaczy. Dodatkowo, metoda ta może być stosowana ze znaczną liczbą badanych (~16 myszy lub ~12 szczurów) jednocześnie, oszczędzając czas na zwiększenie ogólnej przepustowości dla dowolnego projektu badawczego.

W tej metodzie wprowadzono stworzony mechanizm prezentowania zapachów myszom za pomocą kulek do zaparzania herbaty z siatki ze stali nierdzewnej, od teraz nazywanych "kulkami do herbaty". Chociaż te kulki do herbaty są idealne do przechowywania dowolnego materiału zapachowego, w tych badaniach ręczniki, które służyły jako ściółka w klatce przez 2-3 tygodnie dla fretek, naturalnego drapieżnika myszy i szczurów, są umieszczane w każdej kulce do herbaty. Każdy ręcznik jest cięty na kwadraty o wymiarach 5 cm x 5 cm. To poddawanie jest również powtarzane z identycznymi bezwonnymi ręcznikami kontrolnymi. Prezentowanie tych zapachów bez bariery (np. kulki herbaty) doprowadziło do tego, że myszy rozdrabniały włókna w swoich klatkach, zwiększając aktywność fizyczną. To zachowanie nie było tak wyraźne u szczurów. Kulki do herbaty zapewniają wentylowaną osłonę ręcznika, zapewniając pełny dostęp do zapachu, jednocześnie pozostając chronionym przez cały czas trwania badania eksperymentalnego. Te kulki do herbaty można odkażać zgodnie z protokołami użytkowania zwierząt, przygotowywać i wprowadzać bezpośrednio po operacji, aby rozpocząć przyzwyczajanie zwierząt do struktury wraz z bodźcem kontrolnym. Myszy mogą wtedy żyć z dodatkowym wzbogaceniem, zmniejszając znaczenie prezentacji ostrego bodźca.

Przyzwyczajenie do obecności kulki herbaty to tylko jeden aspekt przyzwyczajenia, który jest krytyczny dla tej metody. Opisany protokół habituacji składa się również z wielokrotnego wystawiania na działanie procedury testowej w celu normalizacji środowiska testowego (tj. personelu, transportu i przemieszczania się do miejsca testowania, ekspozycji na bodziec). Ta rozszerzona habituacja minimalizuje zniuansowane reakcje zwierząt i koncentruje pomiary na pożądanych zmiennych zależnych (np. bodźcach farmakologicznych lub kontekstowych). Poprzednia ocena tego protokołu zidentyfikowała cztery próby jako minimalną liczbę przyzwyczajeń niezbędną przed testem temperatury w klatkach domowych u szczurów8. Jeśli badania są oddzielone od siebie długimi okresami (ponad 2-3 tygodnie), zwierzęta muszą zostać ponownie przyzwyczajone. Do powtórnego przyzwyczajenia wystarczy co najmniej jedna lub dwie próby. Jeśli jednak testy temperaturowe są oddzielone dłuższymi okresami czasu, konieczne może być powtórzenie większej liczby prób.

W ciągłym wysiłku przyzwyczajenia myszy i szczurów do procedury testowej, okres aklimatyzacji przed prezentacją bodźca powinien być uwzględniony w każdej próbie eksperymentalnej. Ten czas aklimatyzacji ma kluczowe znaczenie dla przywrócenia równowagi temperatury i aktywności po przeniesieniu do miejsca testowania. Gryzonie mają tendencję do gwałtownego wzrostu temperatury z powodu translokacji. Aklimatyzacja powinna składać się z co najmniej 1 godziny bez interakcji ze strony eksperymentatora w dniu badania, przed jakimkolwiek dodaniem środka farmakologicznego lub bodźców kontekstowych. Jest to konieczne każdego dnia testowania.

W opisanych testach temperatury w klatce domowej, myszy mają wolny zasięg swojej klatki domowej do poruszania się w odpowiedzi na testowany bodziec. Może to powodować zmienne przesunięcia w aktywności, wpływając na dokładność odczytów temperatury, a tym samym na analizę efektów termogenicznych zmiennej niezależnej (np. bodźca farmakologicznego lub kontekstowego). Uznając potencjalne zmiany temperatury spowodowane poziomem aktywności, poniżej znajduje się protokół opisujący stosowanie temperatury podczas chodzenia na bieżni. Opublikowana literatura opisuje udane zastosowanie tej procedury u szczurów i jest ona obecnie stosowana u myszy8,10,14,15. Chodzenie na bieżni utrzymuje stałą prędkość aktywności osoby badanej. W tym badaniu bieżnie są ściśle używane do kontrolowania poziomu aktywności i dlatego są ustawione na najniższą dostępną prędkość na bieżni, aby promować chodzenie dla myszy i podobnie niskie ustawienie dla szczurów.

Poniższa procedura jest opisana do pomiaru temperatury jednostronnego brzuchatego łydki u myszy i prezentacji zapachu drapieżnika. Wzór może być stosowany w połączeniu ze środkami farmakologicznymi i można go przenieść na szczury i inne grupy mięśni szkieletowych (tj. Mięsień czworogłowy) u myszy. W przypadku szczurów transpondery można umieścić w mięśniu brzuchatym łydki obustronnie oraz w brunatnej tkance tłuszczowej. Ze względu na ograniczenia dotyczące rozmiaru i odległości, na jedną mysz można używać tylko jednego transpondera. Niewielkie modyfikacje (np. usunięcie bodźców kontekstowych) mogą być wprowadzone w celu oceny reakcji termogenicznych na środki farmakologiczne.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Metody te można zastosować zarówno w modelach szczura, jak i myszy; zostały one przeprowadzone za zgodą instytucjonalną (Kent State University, IACUC Approval #359 oraz #340 CN 12-04). Przed wdrożeniem protokołu zwierzęta powinny być utrzymywane zgodnie z wytycznymi Guide for the Care and Use of Laboratory Animals.

1. Przygotowanie czytnika transponderów

UWAGA: Przed użyciem należy skonfigurować czytnik transponderów; poniższe kroki obejmują jedynie zmiany ustawień niezbędne dla niniejszego badania. Ta część protokołu odnosi się bezpośrednio do przenośnych czytników DAS-8027-IUS; w przypadku innych modeli czytników należy postępować zgodnie z instrukcją obsługi w celu uzyskania odpowiednich wyników programowania.

  1. Zestaw Sygnał dźwiękowy do WYŁ..
    1. Włącz urządzenie, naciskając przycisk Skanowanie przycisk i poczekaj, aż na wyświetlaczu OLED pojawi się podświetlenie. Naciśnij i przytrzymaj przycisk WSTECZ/MENU przycisk prowadzący do menu ekran
    2. Korzystając z DALEJ/ZATWIERDŹ przycisk, przewijaj opcje, aż KONFIGURACJA OPERACYJNAW tym miejscu należy użyć strzałek w górę lub w dół, aby przełączyć TAK i otwórz podmenu operacyjne.
    3. Korzystając z NASTĘPNY/ZATWIERDŹ przycisk, przewiń do Sygnał dźwiękowyPonieważ ustawienie domyślne jest WŁ.przełącz strzałki w górę lub w dół i zmień ustawienie na WYŁ..
    4. Naciśnij DALEJ/ENTER przycisk służący do zapisania tej zmiany ustawień.
  2. Zestaw Wibracja po odczycie Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. WŁ..
    1. Postępuj zgodnie z krokiem 1.1 poprzez krok 1.2 lub wykonując następny krok bezpośrednio po kroku 1.4.
    2. Używając DALEJ/ENTER przycisk, przewiń do WIBRUJ PO PRZECZYTANIUPonieważ ustawienie domyślne to WYŁ.przełącz strzałki w górę i w dół, a następnie zmień ustawienie na WŁ. odczuwać, poprzez wibracja po zakończeniu odczytu, niezależnie od możliwości wyświetlenia obrazu na ekranie.

2. Programowanie transponderów

UWAGA: Każdy wszczepiony transponder powinien zostać najpierw zaprogramowany z identyfikatorem zwierzęcia (ID zwierzęcia lub ID transpondera). Nazewnictwo to może służyć jako wtórna identyfikacja obiektu testowego (np. cztery cyfry dla skrótu szczepu myszy, lokalizacja transpondera oraz dodatkowe trzy do czterech cyfr określających numer zwierzęcia). Programowanie można przeprowadzić na kilka dni przed operacją, dbając o zachowanie sterylności transponderów do momentu zabiegu.

  1. Wprowadź kod identyfikacyjny (ID Code) do transpondera.
    1. Załóż cewkę wzmacniającą na głowicę czytnika — jest to specjalne akcesorium do modelu DAS 8027-IUS, które wspomaga procedurę programowania.
    2. Używając dłoni w rękawiczce, umieść transponder (w aplikatorze) w cewce wzmacniającej.
    3. Włącz urządzenie, naciskając przycisk SCAN , i poczekaj, aż wyświetlacz OLED się podświetli. Naciśnij i przytrzymaj przycisk BACK/MENU, aby przejść do ekranu menu .
    4. Za pomocą przycisku NEXT/ENTER przewijaj opcje, aż pojawi się WRITE TRANSPONDER ID. Następnie użyj strzałek w górę lub w dół, aby zmienić ustawienie na YES.
    5. Za pomocą przycisku NEXT/ENTER przejdź do opcji ENTER ID CODE.
    6. Użyj klawiszy strzałek w górę i w dół, aby przewijać cyfry i litery. Po wyborze każdego znaku naciśnij NEXT/ENTER, aby przejść do następnego znaku.
    7. Po wprowadzeniu pełnego kodu identyfikacyjnego naciśnij SCAN , aby zapisać dane w transponderze.
    8. Wyjmij transponder z cewki wzmacniającej i powtórz czynność w razie potrzeby. Sprawdź, czy transponder odczytuje zmiany temperatury, ogrzewając dołączone transpondery między dłońmi w rękawiczkach i dokonując pomiaru za pomocą skanera temperatury.
      ​UWAGA: Ustawienia AUTO MULTI WRITE oraz SEQUENTIAL COUNT można ustawić na ON , aby umożliwić programowanie wielu transponderów lub ich sekwencyjne programowanie podczas jednej sesji. Każdy transponder powinien zostać przetestowany podczas programowania.

3. Przygotowanie „piłek do klatki domowej”

  1. Umieścić bezzapachowy/kontrolny ręcznik o wymiarach 5 cm x 5 cm w kulce do herbaty.
  2. Umieścić te kulki w nowych klatkach domowych po operacji, aby rozpocząć habituację zwierzęcia do sposobu prezentacji bodźców kontekstowych podczas testowania. Wymieniać kulki w klatkach domowych co 2 tygodnie.

4. Operacja i opieka pooperacyjna

  1. Zważ i zanotuj masę ciała zwierząt przed operacją. Za pomocą komory indukcyjnej podaj zwierzęciu znieczulenie (np. 2-5% izofluranu).
  2. Za pomocą strzygarki elektrycznej całkowicie ogol kończynę tylną. Podaj lek przeciwbólowy (np. 5 mg/kg ketoprofenu, s.c.) zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi.
    UWAGA: Dodatkowe leki przeciwbólowe mogą być wymagane, jeśli procedura ta jest łączona z innymi metodami chirurgicznymi.
  3. Oczyść obszar 70% alkoholem (lub dostępnym w handlu sterylnym gazikiem nasączonym alkoholem) oraz roztworem powidonu z jodem (lub dostępnymi w handlu sterylnymi, pojedynczo zapakowanymi tamponami z betadyną), naprzemiennie co najmniej trzy razy, kończąc powidonem z jodem.
  4. Wróć zwierzę do komory indukcyjnej i znieczul je do poziomu chirurgicznego. Następnie załóż myszy maskę twarzową w celu dalszej ekspozycji na środek znieczulający. Na oczy zwierzęcia nałóż maść okulistyczną z neomycyną, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia.
    UWAGA: Procedura nie powinna zostać rozpoczęta, dopóki mysz nie przestanie wykazywać oznak odczuwania bólu (tj. odruchu rogówkowego, reakcji na uciśnięcie ogona, odruchu na uciśnięcie palca).
  5. Używając wyłącznie nożyczek chirurgicznych, wykonaj płytkie nacięcie skóry na prawej kończynie tylnej.
  6. Przesuwając się równolegle do mięśnia brzuchatego łydki, wprowadź ostrą krawędź zaprogramowanego i odsłoniętego sterylnego transpondera do nacięcia. Upewnij się, że zielony tłok jest skierowany do góry i jest widoczny. Kontynuuj wsuwanie aplikatora transpondera do nacięcia, aż otwór aplikatora przestanie być widoczny.
    UWAGA: Należy unikać przypadkowego naciśnięcia zielonego tłoka aplikatora transpondera podczas kroku 4.6. Przedwczesne uwolnienie transpondera doprowadzi do jego niewłaściwego umieszczenia.
  7. Obróć aplikator o 180°, tak aby zielony tłok był skierowany w dół w stronę kończyny myszy i nie był widoczny dla eksperymentatora. Wsuń aplikator transpondera w docelowe miejsce. Po osiągnięciu optymalnego położenia, przylegającego do mięśnia brzuchatego łydki lub częściowo w nim zamkniętego, naciśnij zielony tłok, pozwalając, aby nacisk aplikatora odsunął rękę badacza od myszy.
  8. Za pomocą pęsety zbliż brzegi naciętej skóry i zamknij ranę za pomocą sterylnego klipsa chirurgicznego lub sterylnej szwy. W razie potrzeby przed zastosowaniem sterylnego klipsa użyj szwów wchłanialnych, aby zamknąć warstwę powięzi. Za pomocą czytnika transponderów sprawdź temperaturę mięśnia myszy.
  9. Wybudź mysz z narkozy i umieść ją w czystej klatce domowej, ustawionej na wodnej macie grzewczej z ustawieniem low, w celu rekonwalescencji. Upewnij się, że w klatce domowej znajduje się kulka z herbatą z bezzapachowym ręcznikiem w celu rozpoczęcia habituacji.
    UWAGA: Mysz powinna obudzić się po operacji w ciągu 15 min. Pokarm można umieścić na dnie klatki, aby zapewnić łatwy dostęp w dniach rekonwalescencji.
  10. Opieka pooperacyjna
    1. Codziennie przez co najmniej 2 dni po operacji lub do momentu odzyskania bądź stabilizacji masy ciała myszy, zanotuj ich wagę i temperaturę za pomocą czytnika transponderów.
    2. Podawaj myszom nieopioidowe leki przeciwbólowe (np. 5 mg/kg ketoprofenu, s.c.) raz dziennie przez co najmniej 2 dni po operacji, podając dodatkowe dawki w razie potrzeby.
      UWAGA: Myszy i szczury powinny w pełni dojść do siebie w ciągu 5-8 dni od operacji, po czym mogą zostać poddane procedurom habituacji i testom.

5. Przygotowanie do testów - klatka domowa

  1. Konstrukcja podwyższeń
    UWAGA: Poniższy krok opiera się na klatkach dla myszy z filtrem o wymiarach 194 mm x 181 mm x 398 mm. W celu dopasowania większych klatek (np. domowej klatki dla szczura), należy skorygować szerokość.
    1. Przetnij rurę PVC przecinarką zapadkową do PVC na osiem sekcji i złóż je zgodnie z Rysunkiem 1C. Pozwoli to uzyskać otwartą strukturę blatu, która może pomieścić około czterech klatek. Wykonaj żądaną liczbę podwyższeń.
  2. Przygotowanie pomieszczenia
    1. Wyznacz miejsce dla każdego podwyższenia w pomieszczeniu testowym. Rozdziel podwyższenia przeznaczone do różnych bodźców kontekstowych (np. zapachów) o minimum 2 m, aby uniknąć zmiennych zakłócających.
      UWAGA: Każda mysz powinna mieć przypisane miejsce testowe w pomieszczeniu oraz na fizycznych podwyższeniach, w stopniu możliwym do osiągnięcia, aby uniknąć tworzenia skojarzeń między różnymi lokalizacjami a bodźcami termogenicznymi.
    2. Za pomocą pasków magnetycznych przymocuj prześcieradła chirurgiczne lub fartuchy do podwyższeń, tworząc barierę wizualną między badaczem a obiektami testowymi. Ustaw tę barierę tak, aby zminimalizować zmiany temperatury wynikające z aktywności myszy podczas obserwowania eksperymentatorów zbliżających się do klatki lub poruszających się po pomieszczeniu testowym.
    3. (Opcjonalnie) Umieść lustra na powierzchni pod podwyższeniami, aby ułatwić obserwację dna klatki podczas testów.
      UWAGA: Podwyższenia można sterylizować w systemie mycia klatek. Tkaniny lub prześcieradła chirurgiczne należy wyprać przed habituacją i testowaniem.
  3. Przygotowanie kulek do herbaty
    1. Przygotuj kulki do herbaty z ręcznikami kontrolnymi i PO (około 5 cm x 5 cm). Aby uniknąć zanieczyszczeń krzyżowych, przygotuj najpierw kulki z zapachem kontrolnym.
      UWAGA: Ręczniki z zapachem drapieżnika powinny zostać przebadane pod kątem patogenów przed użyciem. Ręczniki te powinny być również odseparowane, a materiały, które z nimi wchodzą w kontakt, należy natychmiast zdezynfekować (np. w myjce do klatek), aby zapobiec ekspozycji innych zwierząt na ten zapach.

6. Badanie temperatury - klatka domowa

UWAGA: Zwierzęta muszą zostać oswojone z całą procedurą testową, z wyłączeniem eksperymentalnych bodźców kontekstowych lub farmakologicznych. Powinno to zostać przeprowadzone minimum 4 razy przed rozpoczęciem testów.

  1. Przenieś zwierzęta do przygotowanego pomieszczenia badawczego . Umieść zwierzęta w przypisanym miejscu na regale. Lokalizacja ta powinna pozostawać niezmieniona podczas wszystkich procedur habituacji i testów.
  2. Wyjmij „piłeczkę domową” z klatki myszy i ponownie przykryj klatki tkaniną lub prześcieradłem chirurgicznym. Pozostaw myszy do aklimatyzacji w przestrzeni badawczej na 1-2 h.
  3. Po zakończeniu aklimatyzacji użyj skanera, aby zmierzyć i zarejestrować temperaturę bazową każdego obiektu. Unikaj manipulowania przy pokryciach z tkaniny podczas pomiarów.
    UWAGA: W tym miejscu można podać środki farmakologiczne. Przed rozpoczęciem testów można dodać czas oczekiwania po iniekcji lub aplikacji, jeśli jest to konieczne. Po podaniu środka farmakologicznego zaleca się rejestrację wtórnej temperatury bazowej bezpośrednio przed testem w celu monitorowania odpowiedzi na bodźce farmakologiczne. Jeśli reakcja na zapach nie jest badana, pomiary temperatury myszy można rozpocząć bezpośrednio po iniekcji. Podczas podawania wszelkich bodźców należy stosować randomizację.
  4. Odkryj klatkę i umieść piłeczkę z herbatą (kontrolną lub PO) na dnie klatki domowej. Nałóż pokrywę klatki i przykrycie z tkaniny.
  5. Uruchom stoper. Zmierz temperatury obiektów badawczych w tej samej kolejności, w jakiej umieszczano piłeczki z herbatą. Rejestruj temperatury oraz czas pomiarów zgodnie z wyznaczonymi punktami czasowymi.
  6. Po zakończeniu eksperymentu wyjmij piłeczkę z substancją leczniczą. Umieść myszy, które otrzymały PO, w nowej klatce domowej z oryginalną „piłeczką domową”. Zwróć „piłeczkę domową” do klatki myszy, które otrzymały zapach kontrolny. Przenieś myszy do miejsca zakwaterowania.
    ​UWAGA: Powyższą procedurę można przenieść na modele szczurze w klatkach o odpowiedniej wielkości. Może być wymagane wprowadzenie korekt do pomiarów zasugerowanych na Rysunku 1C, aby zapewnić lepszy dostęp do dna klatki domowej.

figure-protocol-1
Rycina 1: Testowanie transponderów i temperatury w klatce domowej. (A) Schemat jednostronnego umieszczenia transpondera w celu testowania temperatury w mięśniu brzuchlegaczym myszy. Po zaprogramowaniu i umieszczeniu, czytnik transponderów (DAS-8027-IUS, pokazany na rysunku) może być użyty do pomiaru temperatury. (B) Po lewej: zdjęcie otwartej sferycznej sitemka z nierdzewnej stali oraz ręcznika o wymiarach 5 cm x 5 cm. Po prawej: zamknięta sitemka, używana do trzymania ręczników do habituacji i zapachowych podczas testów w klatce domowej. (C) Schemat podstawek wykonanych z rur PVC do testów w klatkach domowych. (D) Schemat blokowy protokołu testowania w klatce domowej. (E) Zdjęcia z laboratorium przedstawiające obszar testowania w klatkach domowych. Po lewej: cztery klatki dla myszy na podstawce. Paski magnetyczne znajdują się na sąsiedniej ścianie, a magnesy i tkanina chirurgiczna leżą na stole. Po prawej: przykryte klatki dla myszy na podstawkach. (A), (C) i (D) zostały stworzone za pomocą Biorender.com. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

7. Badanie temperatury - chód na bieżni

  1. Przypisz każdemu zwierzęciu bieżnię jako wyznaczone miejsce do habituacji i procedur testowych.
  2. Przygotuj bieżnie do testów, upewniając się, że elementy rażące są sprawne.
    UWAGA: W przypadku chodzenia na bieżni, bieżnie powinny być ustawione na najniższą dostępną prędkość, która sprzyja ciągłemu ruchowi, ale nie biegowi, zarówno podczas habituacji, jak i testów. Dla modelu 1012M-2 Modular Enclosed Metabolic Treadmill jest to 5,2 m/min dla myszy i 7 m/min dla szczurów. Prędkość ta może wymagać korekty w zależności od stopnia otyłości obiektu. Elementy rażące należy ustawić na intensywność i częstotliwość powtórzeń 5,0.
  3. Habituacja
    1. Przenieś myszy do pomieszczenia testowego. Pozostaw myszy na 1-2 h w ich klatkach domowych, aby zaadaptowały się do zmiany pomieszczenia.
    2. Po aklimatyzacji wprowadź myszy do otworu przypisanej bieżni i zamknij ją. Uruchom pas, element rażący oraz stoper.
    3. Pozwól myszom chodzić na bieżniach przez 15 min, stosując stymulację prądem jako motywację do ruchu. Przerwij test natychmiast, jeśli zwierzę pozostaje na aktywnym elemencie rażącym przez dłuższy czas.
    4. Po zakończeniu testu wyjmij myszy i przenieś je z powrotem do klatek domowych.
    5. Wyczyść bieżnie, używając detergentu w płynie i wody.
  4. Testowanie
    1. Przenieś myszy do pomieszczenia testowego. Pozostaw myszy na 1-2 h w ich klatkach domowych, aby zaadaptowały się do zmiany pomieszczenia.
    2. Zmierz i zapisz temperaturę bazową przed przeniesieniem myszy na bieżnię.
      UWAGA: W przypadku testów z użyciem środków farmakologicznych, należy je podać lub wstrzyknąć na tym etapie, zgodnie ze schematem przedstawionym na Rysunku 2A. Przed umieszczeniem myszy na bieżni można dodać niezbędny czas oczekiwania po iniekcji. Przy podawaniu jakichkolwiek bodźców należy zastosować randomizację.
    3. Umieść kwadraty ręczników kontrolnych lub nasączonych PO o wymiarach 5 cm x 5 cm wewnątrz bieżni, jak najbliżej jej przodu. Przyklej ręczniki do sufitu bieżni lub pod spodem, aby ułatwić ich rozmieszczenie i usuwanie.
    4. Wprowadź myszy do przypisanych bieżni. Włącz pas bieżni oraz element rażący.
    5. Uruchom stoper. Wykonuj pomiary obiektów testowych w tej samej kolejności, w jakiej myszy zostały umieszczone w bieżniach. Zapisuj temperatury i czas pomiarów zgodnie z wyznaczonymi punktami czasowymi.
      UWAGA: Temperaturę można wiarygodnie mierzyć z zewnątrz zamkniętej bieżni, gdy mysz znajduje się wewnątrz podczas aktywności chodzenia. W przypadku szczurów, rozmiar bieżni i ograniczenia odległości czytnika transponderów mogą wymagać od eksperymentatora pozostawienia tyłu bieżni otwartym, aby wsunąć czytnik do wnętrza, bliżej obiektu.
    6. Po zakończeniu testu wyłącz elementy rażące i bieżnie; przenieś myszy do klatek domowych. Przenieś myszy do miejsca zakwaterowania.
    7. Wyczyść bieżnie, używając detergentu w płynie i wody, zwracając szczególną uwagę na usunięcie wszelkich pozostałości PO.
    8. Po zakończeniu eksperymentów przeprowadź eutanazję zwierząt (np. poprzez inhalację CO2) i wizualnie potwierdź lokalizację transpondera.

figure-protocol-2
Rysunek 2: Testy temperatury kontrolowanej przez aktywność. (A) Schemat testów temperatury kontrolowanej przez aktywność z zastosowaniem czynnika farmakologicznego podczas marszu na bieżni. (B) Zdjęcia aparatury bieżni. Po lewej obraz całego zestawu sprzętowego. Po prawej zbliżenie poszczególnych bieżni i elektrowstrząsów. (A) zostało stworzone za pomocą Biorender.com. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Transpondery wszczepiono jednostronnie w prawy mięsień brzuchaty łydki u dziesięciu myszy typu dzikiego (WT) w wieku 4-6 miesięcy, wyhodowanych z linii SF1-Cre (Tg(Nr5a1-cre)7Lowl/J, Strain #012462, tło genetyczne C57BL/6J i FVB; samice N = 5; samce N = 5). Po rekonwalescencji myszy poddano habituacji do procedury pomiaru temperatury w klatce domowej, która nie obejmowała bodźca kontekstowego (np. PO). Pomiary temperatury za pomocą czytnika transponderów rejestrowano w pomieszczeniu zwierzęcym oraz po przeniesieniu do mi...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Ten protokół badania temperatury zapewnia pole do bezpośredniego pomiaru termogenezy mięśni szkieletowych. Ma to kluczowe znaczenie, ponieważ badania zagłębiają się w identyfikację mechanizmów leżących u podstaw termogenezy mięśni33. Metoda zapewnia dwa opłacalne protokoły pomiaru termogenezy mięśni szkieletowych w warunkach kontekstowych i farmakologicznych. Protokół ten podkreśla znaczenie zarówno habituacji, jak i aklimatyzacji w ramach tych procedur. Habituacja służy do wielokrotnego wprowadza...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie pozostają w konflikcie interesów.

Podziękowania

Ta praca jest obsługiwana przez DK097644 R15 i DK108668 R15. Dziękujemy dr Chaitanyi K Gavini i dr Megan Rich za wcześniejszy wkład oraz dr Stanleyowi Dannemillerowi za zapewnienie zgodności z instytucjonalnymi wytycznymi dotyczącymi wykorzystywania zwierząt. Specjalne podziękowania dla dr Tima Bartnessa za dostarczenie podstawowych badań niezbędnych do zbudowania tej metody i powiązanych z nią badań. Rysunki 1A, C, D i Rysunek 2A zostały stworzone przy użyciu Biorender.com.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1012M-2 Modułowa zamknięta bieżnia metaboliczna dla myszy, 2 tory z ShockColumbus Instruments
1012R-2 Modułowa zamknięta bieżnia metaboliczna dla szczurów, 2 tory z ShockColumbus Instruments
1-1/4 cala. Nóż do PCV z grzechotkąBrassCraft
1 mL StrzykawkiFisher ScientificBD 309659
Waciki BetadineFisher Scientific19-898-945
Cewka wzmacniającaBioMedic Data SystemsTransponder Akcesorium
Elektryczne maszynki do strzyżeniaAndis40 Ultraedge Clipper Blade
Elastyczne arkusze lustrzaneAmazonSamoprzylepne nieszklane płytki lustrzane
KleszczeFisher Scientific89259-940
Komora indukcyjna
grzewczej
KetoprophenMed-Vet Intl.Paski magnetyczne RXKETO-50
MagnesyAmazonDIYMAG Haczyki magnetyczne 40lbs
26400
Neomycyna/Polimixyna/Bacytracyna z hydrokortyzonem Maść okulistyczna, 3,5 gMed-Vet Intl.RXNPB-HC
Oasis Wchłanialny szewMed-Vet Intl.MV-H821-V
Ręczniki zapachowe Predator (fretka)BioResources
Rura
Odblask do usuwania ranCellPoint Scientific
Odruchowy klips do ran, 7 mm (mysz)CellPoint Scientific
Odruchowy klips do ran, 9 mm (szczur)CellPoint Scientific
Srerile Autoclip, 7 mm (mysz)CellPoint ScientificWound Clip Applier (mysz)
Sitka ze stali nierdzewnej Przyprawy interwałowe Zaparzacz do herbatyAmazon
Sterylny Autoclip, 9 mm (szczur)CellPoint ScientificWound Clip Applier (szczur)
Sterylna sól fizjologicznaMed-Vet Intl.RX0.9NACL-10
Fisher Scientific08-951-5
Prześcieradła
Ręczniki (kontrola/przyzwyczajenie)Amazon100% bawełniane ręczniki, białe
TransponderyModele systemówIPTT-300
Modele systemów DAS-8027-IUS/ DAS-7007R
VersacleanFisher Scientific18-200-700płynny detergent
Webcol Alcohol PrepsCovidien22-246-073 
Elementy klinowe do rur
poduszki (izofluran)Kent Scientific VetFlo-0730 3.0 L Niskie koszty komory do tradycyjnych waporyzatorów Amazon Igły Med-Vet Intl. Marshall PVCNożyczki chirurgiczne chirurgiczne danych BioMedic: Czytnik transponderów danych BioMedic: PVC

Bibliografia

  1. Periasamy, M., Herrera, J. L., Reis, F. C. G. Skeletal muscle thermogenesis and its role in whole body energy metabolism. Diabetes Metabolism Journal. 41 (5), 327-336 (2017).
  2. Rowland, L. A., Bal, N. C., Periasamy, M. The role of skeletal-muscle-based thermogenic mechanisms in vertebrate endothermy. Biological Reviews of the Cambridge Philosophical Society. 90 (4), 1279-1297 (2015).
  3. Maurya, S. K., et al. Sarcolipin is a key determinant of the basal metabolic rate, and its overexpression enhances energy expenditure and resistance against diet-induced obesity. Journal of Biological Chemistry. 290 (17), 10840-10849 (2015).
  4. Grigg, G., et al. Whole-body endothermy: Ancient, homologous and widespread among the ancestors of mammals, birds and crocodylians. Biological Reviews of the Cambridge Philosophical Society. 97 (2), 766-801 (2022).
  5. Franck, J. P. C., Slight-Simcoe, E., Wegner, N. C. Endothermy in the smalleye opah (Lampris incognitus): A potential role for the uncoupling protein sarcolipin. Comparative Biochemistry and Physiology - Part A: Molecular & Integrative Physiology. 233, 48-52 (2019).
  6. Nowack, J., et al. Muscle nonshivering thermogenesis in a feral mammal. Scientific Reports. 9, 6378(2019).
  7. Oliver, S. R., Anderson, K. J., Hunstiger, M. M., Andrews, M. T. Turning down the heat: Down-regulation of sarcolipin in a hibernating mammal. Neuroscience Letters. 696, 13-19 (2019).
  8. Gorrell, E., et al. Skeletal muscle thermogenesis induction by exposure to predator odor. The Journal of Experimental Biology. 223, Pt 8 (2020).
  9. Gavini, C. K., et al. Leanness and heightened nonresting energy expenditure: Role of skeletal muscle activity thermogenesis. The American Journal of Physiology - Endocrinology and Metabolism. 306 (6), 635-647 (2014).
  10. Almundarij, T. I., Gavini, C. K., Novak, C. M. Suppressed sympathetic outflow to skeletal muscle, muscle thermogenesis, and activity energy expenditure with calorie restriction. Physiological Reports. 5 (4), 13171(2017).
  11. Harshaw, C., Lanzkowsky, J., Tran, A. D., Bradley, A. R., Jaime, M. Oxytocin and 'social hyperthermia': Interaction with beta3-adrenergic receptor-mediated thermogenesis and significance for the expression of social behavior in male and female mice. Hormones and Behavior. 131, 104981(2021).
  12. Caldwell, H. K. Oxytocin and vasopressin: Powerful regulators of social behavior. The Neuroscientist. 23 (5), 517-528 (2017).
  13. Harshaw, C., Leffel, J. K., Alberts, J. R. Oxytocin and the warm outer glow: Thermoregulatory deficits cause huddling abnormalities in oxytocin-deficient mouse pups. Hormones and Behavior. 98, 145-158 (2018).
  14. Gavini, C. K., Britton, S. L., Koch, L. G., Novak, C. M. Inherently lean rats have enhanced activity and skeletal muscle response to central melanocortin receptors. Obesity. 26 (5), 885-894 (2018).
  15. Gavini, C. K., Jones, W. C., Novak, C. M. Ventromedial hypothalamic melanocortin receptor activation: regulation of activity energy expenditure and skeletal muscle thermogenesis. The Journal of Physiology. 594 (18), 5285-5301 (2016).
  16. Zaretsky, D. V., Romanovsky, A. A., Zaretskaia, M. V., Molkov, Y. I. Tissue oxidative metabolism can increase the difference between local temperature and arterial blood temperature by up to 1.3(o)C: Implications for brain, brown adipose tissue, and muscle physiology. Temperature. 5 (1), 22-35 (2018).
  17. Yoo, Y., et al. Exercise activates compensatory thermoregulatory reaction in rats: A modeling study. Journal of Applied Physiology. 119 (12), 1400-1410 (2015).
  18. Langer, F., Fietz, J. Ways to measure body temperature in the field. Journal of Thermal Biology. 42, 46-51 (2014).
  19. Pence, S., et al. Central apolipoprotein A-IV stimulates thermogenesis in brown adipose tissue. International Journal of Molecular Sciences. 22 (3), 1221(2021).
  20. Li, D., et al. Homeostatic disturbance of thermoregulatory functions in rats with chronic fatigue. Journal of Neuroscience Research. 165, 45-50 (2021).
  21. Carlier, J., et al. Pharmacodynamic effects, pharmacokinetics, and metabolism of the synthetic cannabinoid AM-2201 in male rats. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 367 (3), 543-550 (2018).
  22. Pato, A. M., Romero, D. M., Sosa Holt, C. S., Nemirovsky, S. I., Wolansky, M. J. Use of subcutaneous transponders to monitor body temperature in laboratory rats. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 114, 107145(2022).
  23. Almeida, D. L., et al. Lean in one way, in obesity another: Effects of moderate exercise in brown adipose tissue of early overfed male Wistar rats. International Journal of Obesity. 46 (1), 137-143 (2022).
  24. Brito, M. N., Brito, N. A., Baro, D. J., Song, C. K., Bartness, T. J. Differential activation of the sympathetic innervation of adipose tissues by melanocortin receptor stimulation. Endocrinology. 148 (11), 5339-5347 (2007).
  25. Vaughan, C. H., Shrestha, Y. B., Bartness, T. J. Characterization of a novel melanocortin receptor-containing node in the SNS outflow circuitry to brown adipose tissue involved in thermogenesis. Brain Research. 1411, 17-27 (2011).
  26. Kort, W. J., Hekking-Weijma, J. M., TenKate, M. T., Sorm, V., VanStrik, R. A microchip implant system as a method to determine body temperature of terminally ill rats and mice. Laboratory Animals. 32 (3), 260-269 (1998).
  27. Mei, J., et al. Body temperature measurement in mice during acute illness: Implantable temperature transponder versus surface infrared thermometry. Scientific Reports. 8, 3526(2018).
  28. Warn, P. A., et al. Infrared body temperature measurement of mice as an early predictor of death in experimental fungal infections. Laboratory Animals. 37 (2), 126-131 (2003).
  29. Hargreaves, K., Dubner, R., Brown, F., Flores, C., Joris, J. A new and sensitive method for measuring thermal nociception in cutaneous hyperalgesia. Pain. 32 (1), 77-88 (1988).
  30. Fiebig, K., Jourdan, T., Kock, M. H., Merle, R., Thone-Reineke, C. Evaluation of infrared thermography for temperature measurement in adult male NMRI nude mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 57 (6), 715-724 (2018).
  31. Franco, N. H., Geros, A., Oliveira, L., Olsson, I. A. S., Aguiar, P. ThermoLabAnimal - A high-throughput analysis software for non-invasive thermal assessment of laboratory mice. Physiology & Behavior. 207, 113-121 (2019).
  32. Koganti, S. R., et al. Disruption of KATP channel expression in skeletal muscle by targeted oligonucleotide delivery promotes activity-linked thermogenesis. Molecular Therapy. 23 (4), 707-716 (2015).
  33. Bal, N. C., Periasamy, M. Uncoupling of sarcoendoplasmic reticulum calcium ATPase pump activity by sarcolipin as the basis for muscle non-shivering thermogenesis. Philosophical Transactions of the Royal Society B. 375 (1793), 20190135(2020).
  34. Hicks, C., et al. Body temperature and cardiac changes induced by peripherally administered oxytocin, vasopressin and the non-peptide oxytocin receptor agonist WAY 267,464: a biotelemetry study in rats. British Journal of Pharmacology. 171 (11), 2868-2887 (2014).
  35. Kasahara, Y., et al. Oxytocin receptor in the hypothalamus is sufficient to rescue normal thermoregulatory function in male oxytocin receptor knockout mice. Endocrinology. 154 (11), 4305-4315 (2013).
  36. Kasahara, Y., et al. Role of the oxytocin receptor expressed in the rostral medullary raphe in thermoregulation during cold conditions. Frontiers in Endocrinology. 6, 180(2015).
  37. Yuan, J., Zhang, R., Wu, R., Gu, Y., Lu, Y. The effects of oxytocin to rectify metabolic dysfunction in obese mice are associated with increased thermogenesis. Molecular and Cellular Endocrinology. 514, 110903(2020).
  38. Scholl, J. L., Afzal, A., Fox, L. C., Watt, M. J., Forster, G. L. Sex differences in anxiety-like behaviors in rats. Physiology & Behavior. 211, 112670(2019).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Pomiar temperatury mięśnitranspondery temperaturowetemperatura mięśni myszytemperatura mięśni szczurastymulacja farmakologicznabodziec w postaci zapachu drapieżnikaaktywność na bieżniukład współczulnykontrola termogenezy mięśniowej
Pomiar termogenezy mięśni szkieletowych u myszy i szczurów
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.