Method Article

Techniczne zastosowania nagrań matrycy mikroelektrod i patch clamp na indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych kardiomiocytach pochodzących z komórek macierzystych

DOI:

10.3791/64265

⸱

August 4th, 2022

 ,  ,  ,  , 
1Stanford Cardiovascular Institute, Stanford University School of Medicine, 2Division of Cardiovascular Medicine, Department of Medicine, Stanford University School of Medicine, 3Department of Radiology, Stanford University School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ludzkie indukowane pluripotencjalne kardiomiocyty pochodzące z komórek macierzystych (hiPSC-CMs) okazały się obiecującym modelem in vitro do badań przesiewowych kardiotoksyczności indukowanej lekami i modelowania chorób. W tym miejscu szczegółowo opisujemy protokół pomiaru kurczliwości i elektrofizjologii hiPSC-CM.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kardiotoksyczność wywołana lekami jest główną przyczyną wycofywania leków z rynku. W związku z tym stosowanie odpowiednich przedklinicznych modeli oceny bezpieczeństwa kardiologicznego jest kluczowym krokiem podczas opracowywania leku. Obecnie ocena bezpieczeństwa kardiologicznego jest nadal w dużym stopniu uzależniona od badań na zwierzętach. Jednak modele zwierzęce są nękane słabą specyficznością translacyjną dla ludzi ze względu na różnice specyficzne dla gatunku, szczególnie pod względem cech elektrofizjologicznych serca. W związku z tym istnieje pilna potrzeba opracowania wiarygodnego, wydajnego i opartego na człowieku modelu przedklinicznej oceny bezpieczeństwa kardiologicznego. Indukowane przez człowieka pluripotencjalne kardiomiocyty pochodzące z komórek macierzystych (hiPSC-CM) okazały się nieocenionym modelem in vitro do badań przesiewowych kardiotoksyczności indukowanej lekami i modelowania chorób. hiPSC-CM można uzyskać od osób o różnym pochodzeniu genetycznym i różnych stanach chorobowych, co czyni je idealnym substytutem do indywidualnej oceny kardiotoksyczności wywołanej lekiem. W związku z tym należy ustanowić metodologie kompleksowego badania charakterystyki funkcjonalnej hiPSC-CM. W tym protokole szczegółowo opisujemy różne testy funkcjonalne, które można ocenić na hiPSC-CM, w tym pomiar kurczliwości, potencjału pola, potencjału czynnościowego i obchodzenia się z wapniem. Ogólnie rzecz biorąc, włączenie hiPSC-CM do przedklinicznej oceny bezpieczeństwa kardiologicznego może zrewolucjonizować opracowywanie leków.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rozwój leków to długi i kosztowny proces. Badanie nowych leków terapeutycznych zatwierdzonych przez amerykańską Agencję ds. Żywności i Leków (FDA) w latach 2009-2018 wykazało, że szacowany średni koszt skapitalizowanych badań i prób klinicznych wyniósł 985 milionów dolarów na produkt1. Kardiotoksyczność wywołana przez lek jest główną przyczyną wyczerpania leków i wycofywania ich z rynku2. Warto zauważyć, że kardiotoksyczność jest zgłaszana w wielu klasach leków terapeutycznych3. W związku z tym ocena bezpieczeństwa kardiologicznego jest kluczowym elementem procesu opracowywania leku. Obecny parady....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie pożywek i roztworów

  1. Przygotować pożywkę podtrzymującą hiPSC-CM, mieszając 10 ml butelkę 50x suplement B27 i 500 ml pożywki RPMI 1640. Przechowywać podłoże w temperaturze 4 °C i zużyć w ciągu miesiąca. Przed użyciem należy zrównoważyć medium do temperatury pokojowej (RT).
  2. Przygotować pożywkę wysiewającą hiPSC-CM, mieszając 20 ml substytutu surowicy i 180 ml pożywki podtrzymującej hiPSC-CM (rozcieńczenie 10%, v/v). Preferowane jest świeżo przygotowane podłoże siewne, ale można je przechowywać w temperaturze 4 °C nie dłużej niż 2 tygodnie. Przed użyciem zrównoważyć podłoże do RT.
  3. Przygotować roztwór powlek....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje, jak mierzyć ruch skurczowy, potencjał pola, potencjał czynnościowy i stan przejściowy Ca2+ hiPSC-CMs. Schemat ideowy obejmujący trawienie enzymatyczne, wysiewanie komórek, utrzymanie i przeprowadzanie testów funkcjonalnych jest pokazany na Rysunek 1. Tworzenie monowarstwy hiPSC-CM jest niezbędne do pomiaru ruchu skurczowego (Rysunek 2B). Reprezentatywny ślad ruchu kurczliwo-relaksacyjnego hiPSC-CM pokazano na Rysunek 2C.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Technologia ludzkiego iPSC stała się potężną platformą do modelowania chorób i badań przesiewowych leków. W tym miejscu opisujemy szczegółowy protokół pomiaru kurczliwości hiPSC-CM, potencjału pola, potencjału czynnościowego i stanu przejściowego Ca2+. Protokół ten zapewnia kompleksową charakterystykę kurczliwości i elektrofizjologii hiPSC-CM. Te testy funkcjonalne zostały zastosowane w wielu publikacjach z naszej grupy 12,13,18,24,25,26,27........

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

J.C.W. jest współzałożycielem Greenstone Biosciences, ale nie ma konkurencyjnych interesów, ponieważ prezentowane tu prace są całkowicie niezależne. Pozostali autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Blake'owi Wu za korektę rękopisu. Prace te były wspierane przez National Institutes of Health (NIH) R01 HL113006, R01 HL141371, R01 HL163680, R01 HL141851, U01FD005978 oraz NASA NNX16A069A (JCW) i AHA Postdoctoral Fellowship 872244 (GMP).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Szklana dzienka 35 mm ze szklanym dnem 20 mm mikro-studzienka #1,5 szklana osłonaCellvisD35-20-1.5-NZacisk krosowy
50x B27 suplementyLife Technologies17504-044hiPSC-CM pożywka hodowlana
6-dołkowa płytkahodowlana E & K ScientificEK-27160kultura hiPSC-CM
96-dołkowe płaskie przezroczyste dno z czarnego polistyrenu Mikropłytki poddane TCCorning3603Pomiar ruchu skurczowego
AccutaseSigma-AldrichA6964Dysocjacja enzymatyczna
Zintegrowane Studio Axion (AxIS)Oprogramowanie nawigacyjneAxion Biosystems
Kapilary ze szkła borokrzemianowegoAparat HarvardaBF 100-50-10,zacisk krosowy
CaCl2 1 M w H2OSigma-Aldrich21115Tyrode' s rozwiązanie
Szkiełka komory do liczenia komórekThermoFisher ScientificC10228Zliczanie komórek
CytoView 48-dołkowe płytki MEAAxion BiosystemsM768-tMEA-48BMEA
DMEM/F12Gibco/Life Technologies12634028Podłoże do macierzy zewnątrzkomórkowej
DPBS, bez wapnia, bez magnezuFisher Scientific14-190-250
EGTASigma-AldrichE3889Płyn do pipet wewnątrzkomórkowych
EPC 10 USB  wzmacniacz patch clampWarner Instruments89-5000Patch clamp
Fura-2, AM, permeant cell permeantThermoFisher ScientificF1221Ca2+ pomiar stanów nieustalonych
GlukozaSigma-AldrichG8270Tyrode' s rozwiązanie
HEPESSigma-AldrichH3375Tyrode' s rozwiązanie
hiPSCStanford Instytut Sercowo-Naczyniowy iPSC Biobank
KClSigma-Aldrich529552Tyrode" s roztwór
KnockOut Serum ReplacementThermoFisher Scientific10828-028hiPSC-CM podłoże wysiewające
KOH 8  MSigma-AldrichP4494Wewnątrzkomórkowy roztwór do pipet
Lambda DG 4Sutter Instrument CompanyCa2+ pomiar stanów nieustalonych; ultraszybkie źródło światła przełączające długość fali
Luna-FL automatyczny licznik komórek fluorescencyjnychWISBIOMEDLB-L20001Liczenie komórek
Maestro Pro  System MEAAxion BiosystemsMEA
Matrigel Czynnik wzrostu o obniżonym współczynniku wzrostu (GFR) Macierz błony podstawnejCorning356231Podłoże macierzy zewnątrzkomórkowej
MgATPSigma-AldrichA9187Wewnątrzkomórkowy roztwór do pipet
MgCl2Sigma-AldrichM8266Tyrode" s roztwór
NaClSigma-AldrichS9888Tyrode' s roztwór
NaOH 10  MSigma-Aldrich72068Tyrode' s
rozwiązanie NIS Elements AR
Pluronic F-127 (20% roztwór w DMSO)ThermoFisher ScientificP3000MPCa2+ pomiar stanów nieustalonych
RPMI 1640 średniLife Technologies11875-119pożywka hodowlana hiPSC-CM
System obrazowania ruchu komórek Sony SI8000 System obrazowania ruchuSony BiotechnologyPomiar ruchu skurczowego
Ściągacz do mikropipetSutter InstrumentsP-97Zacisk krosowy
Trypan niebieska plamaLife TechnologiesT10282Liczenie komórek
komórkowego

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wouters, O. J., McKee, M., Luyten, J. Estimated research and development investment needed to bring a new medicine to market, 2009-2018. Journal of the American Medical Association. 323 (9), 844-853 (2020).
  2. Pang, L., et al.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Microelectrode ArrayPatch Clamp RecordingHuman iPSC CardiomyocytesCardiac Safety AssessmentDrug Induced CardiotoxicityCalcium Transient MeasurementField Potential RecordingAction Potential RecordingWhole Cell RecordingCardiac Electrophysiology

Related Articles