Method Article

Techniczne zastosowania nagrań matrycy mikroelektrod i patch clamp na indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych kardiomiocytach pochodzących z komórek macierzystych

DOI:

10.3791/64265

⸱

August 4th, 2022

 ,  ,  ,  , 
1Stanford Cardiovascular Institute, Stanford University School of Medicine, 2Division of Cardiovascular Medicine, Department of Medicine, Stanford University School of Medicine, 3Department of Radiology, Stanford University School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ludzkie indukowane pluripotencjalne kardiomiocyty pochodzące z komórek macierzystych (hiPSC-CMs) okazały się obiecującym modelem in vitro do badań przesiewowych kardiotoksyczności indukowanej lekami i modelowania chorób. W tym miejscu szczegółowo opisujemy protokół pomiaru kurczliwości i elektrofizjologii hiPSC-CM.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kardiotoksyczność wywołana lekami jest główną przyczyną wycofywania leków z rynku. W związku z tym stosowanie odpowiednich przedklinicznych modeli oceny bezpieczeństwa kardiologicznego jest kluczowym krokiem podczas opracowywania leku. Obecnie ocena bezpieczeństwa kardiologicznego jest nadal w dużym stopniu uzależniona od badań na zwierzętach. Jednak modele zwierzęce są nękane słabą specyficznością translacyjną dla ludzi ze względu na różnice specyficzne dla gatunku, szczególnie pod względem cech elektrofizjologicznych serca. W związku z tym istnieje pilna potrzeba opracowania wiarygodnego, wydajnego i opartego na człowieku modelu przedklinicznej oceny bezpieczeństwa kardiologicznego. Indukowane przez człowieka pluripotencjalne kardiomiocyty pochodzące z komórek macierzystych (hiPSC-CM) okazały się nieocenionym modelem in vitro do badań przesiewowych kardiotoksyczności indukowanej lekami i modelowania chorób. hiPSC-CM można uzyskać od osób o różnym pochodzeniu genetycznym i różnych stanach chorobowych, co czyni je idealnym substytutem do indywidualnej oceny kardiotoksyczności wywołanej lekiem. W związku z tym należy ustanowić metodologie kompleksowego badania charakterystyki funkcjonalnej hiPSC-CM. W tym protokole szczegółowo opisujemy różne testy funkcjonalne, które można ocenić na hiPSC-CM, w tym pomiar kurczliwości, potencjału pola, potencjału czynnościowego i obchodzenia się z wapniem. Ogólnie rzecz biorąc, włączenie hiPSC-CM do przedklinicznej oceny bezpieczeństwa kardiologicznego może zrewolucjonizować opracowywanie leków.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rozwój leków to długi i kosztowny proces. Badanie nowych leków terapeutycznych zatwierdzonych przez amerykańską Agencję ds. Żywności i Leków (FDA) w latach 2009-2018 wykazało, że szacowany średni koszt skapitalizowanych badań i prób klinicznych wyniósł 985 milionów dolarów na produkt1. Kardiotoksyczność wywołana przez lek jest główną przyczyną wyczerpania leków i wycofywania ich z rynku2. Warto zauważyć, że kardiotoksyczność jest zgłaszana w wielu klasach leków terapeutycznych3. W związku z tym ocena bezpieczeństwa kardiologicznego jest kluczowym elementem procesu opracowywania leku. Obecny paradygmat oceny bezpieczeństwa kardiologicznego jest nadal w dużym stopniu zależny od modeli zwierzęcych. Jednak różnice gatunkowe wynikające z zastosowania modeli zwierzęcych są coraz częściej uznawane za główną przyczynę niedokładnych prognoz kardiotoksyczności wywołanej lekami u ludzi4. Na przykład morfologia potencjału czynnościowego serca różni się znacznie między ludźmi i myszami ze względu na udział różnych prądów repolaryzacyjnych5. Ponadto zróżnicowane izoformy miozyny sercowej i kolistych RNA, które mogą wpływać na fizjologię serca, zostały dobrze udokumentowane wśród gatunków6,7. Aby wypełnić te luki, konieczne jest ustanowienie wiarygodnego, wydajnego i opartego na człowieku modelu przedklinicznej oceny bezpieczeństwa kardiologicznego.

Przełomowy wynalazek technologii indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) stworzył bezprecedensowe platformy do badań przesiewowych leków i modelowania chorób. W ciągu ostatniej dekady metody generowania indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych (hiPSC-CM) stały się dobrze znane8,9. hiPSC-CM cieszą się dużym zainteresowaniem ze względu na ich potencjalne zastosowania w modelowaniu chorób, badaniach przesiewowych kardiotoksyczności indukowanej lekami i medycynie precyzyjnej. Na przykład hiPSC-CM zostały wykorzystane do modelowania patologicznych fenotypów chorób serca spowodowanych dziedziczeniem genetycznym, takich jak zespół długiego odstępu QT10, kardiomiopatia przerostowa11,12 i kardiomiopatia rozstrzeniowa13,14,15. W związku z tym zidentyfikowano kluczowe szlaki sygnałowe zaangażowane w patogenezę chorób serca, które mogą rzucić światło na potencjalne strategie terapeutyczne skutecznego leczenia. Co więcej, hiPSC-CM zostały wykorzystane do badań przesiewowych kardiotoksyczności wywołanej lekami związanych ze środkami przeciwnowotworowymi, w tym doksorubicyną, trastuzumabem i inhibitorami kinazy tyrozynowej16,17,18; Strategie mające na celu złagodzenie wynikającej z tego kardiotoksyczności są obecnie badane. Wreszcie, informacja genetyczna zachowana w hiPSC-CM pozwala na badanie przesiewowe i przewidywanie kardiotoksyczności wywołanej lekiem zarówno na poziomie indywidualnym, jak i populacyjnym19,20. Reasumując, hiPSC-CM okazały się nieocenionym narzędziem do spersonalizowanego przewidywania bezpieczeństwa kardiologicznego.

Ogólnym celem tego protokołu jest ustanowienie metodologii kompleksowego i efektywnego badania funkcjonalnych cech hiPSC-CMs, które mają ogromne znaczenie w zastosowaniu hiPSC-CM do modelowania chorób, badań przesiewowych kardiotoksyczności indukowanej lekami i medycyny precyzyjnej. W tym miejscu szczegółowo opisujemy szereg testów funkcjonalnych do oceny właściwości funkcjonalnych hiPSC-CM, w tym pomiar kurczliwości, potencjału pola, potencjału czynnościowego i obchodzenia się z wapniem (Ca2+) (Rysunek 1).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie pożywek i roztworów

  1. Przygotować pożywkę podtrzymującą hiPSC-CM, mieszając 10 ml butelkę 50x suplement B27 i 500 ml pożywki RPMI 1640. Przechowywać podłoże w temperaturze 4 °C i zużyć w ciągu miesiąca. Przed użyciem należy zrównoważyć medium do temperatury pokojowej (RT).
  2. Przygotować pożywkę wysiewającą hiPSC-CM, mieszając 20 ml substytutu surowicy i 180 ml pożywki podtrzymującej hiPSC-CM (rozcieńczenie 10%, v/v). Preferowane jest świeżo przygotowane podłoże siewne, ale można je przechowywać w temperaturze 4 °C nie dłużej niż 2 tygodnie. Przed użyciem zrównoważyć podłoże do RT.
  3. Przygotować roztwór powlekający macierz zewnątrzkomórkową, rozmrażając jedną butelkę (10 ml) macierzy błony podstawnej w temperaturze 4 °C przez noc i rozdzielając 500 μl matrycy błony podstawnej w sterylnych probówkach o pojemności 1,5 ml. Przechowywać w temperaturze -20 °C do dalszego wykorzystania. Zmieszać 500 μl matrycy błony podstawnej i 100 ml lodowatego podłoża DMEM/F12 (rozcieńczenie 1:200, v/v), aby uzyskać roztwór do powlekania macierzy membrany podstawnej.
  4. Przygotuj 50 ml roztworu Tyrode'a zawierającego 135 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1,8 mM CaCl2, 5 mM glukozy i 10 mM HEPES. Dostosuj pH do 7,4 za pomocą NaOH. Przygotuj świeży roztwór Tyrode'a w dniu eksperymentu.
  5. Przygotować 50 ml wewnątrzkomórkowego roztworu pipet zawierających 120 mM KCl, 1 mM MgCl2, 10 mM EGTA i 10 mM HEPES. Dostosuj pH do 7,2 za pomocą KOH. Podwielokrotność roztworu pipety wewnątrzkomórkowej umieścić w sterylnych probówkach o pojemności 5 ml i przechowywać w temperaturze -20 °C. W dniu eksperymentu świeżo dodać MgATP do roztworu, aby osiągnąć końcowe stężenie 3 mM.
  6. Przygotuj 1 ml roztworu nasycającego Fura-2 AM zawierającego 2 μM Fura-2 AM i 0,1% Pluronic F-127. Przygotuj świeży roztwór ładujący w dniu eksperymentu i chroń go przed światłem.

2. Pomiar ruchu skurczowego hiPSC-CM

  1. Przygotować płytki pokryte matrycą błony podstawnej, dodając 100 μl roztworu do powlekania macierzy zewnątrzkomórkowej do każdej studzienki 96-dołkowych płytek. Inkubować 96-dołkowe płytki w nawilżanym inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez noc.
  2. Enzymatyczna dysocjacja hiPSC-CM
    1. Zamów hiPSC w Stanford Cardiovascular Institute iPSC Biobank (http://med.stanford.edu/scvibiobank.html). Generuj hiPSC-CM zgodnie z poprzednimi publikacjami8,9. Obserwuj hiPSC-CM hodowane na płytkach sześciodołkowych pod mikroskopem przy 10-krotnym powiększeniu.
      UWAGA: Nie należy rozdzielać komórek, gdy są one nadal proliferacyjne. W przeciwnym razie komórki przerosną na studzienkach po ponownym posiewie i doprowadzą do niedokładnych wyników testów funkcjonalnych. Zwykle hiPSC-CM zatrzymują proliferację w dniach 18-23.
    2. Upewnij się, że hiPSC-CM mocno biją i mają czystość ponad 95%. Oceń czystość poprzez barwienie immunologiczne troponiny sercowej T, specyficznego markera kardiomiocytów8,9.
    3. Odessać pożywkę konserwacyjną i dwukrotnie przemyć komórki 1x DPBS. Dodać 1 ml roztworu do oddzielania komórek do każdego dołka z sześciodołkowych płytek i inkubować przez 10 minut w temperaturze 37 °C.
      UWAGA: Czas trwania inkubacji powinien być regularnie monitorowany. Upewnij się, że nie trawisz nadmiernie komórek, ponieważ zmniejszy to ich żywotność.
    4. Delikatnie pipetować hiPSC-CM w górę i w dół kilka razy za pomocą pipety o pojemności 5 ml, aby wytworzyć zawiesinę jednokomórkową. Dodać równą objętość pożywki wysiewającej hiPSC-CMs, aby zneutralizować roztwór do odrywania komórek.
    5. Odwirować hiPSC-CM przy 300 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 1-2 ml pożywki wysiewającej hiPSC-CM.
    6. Określić ilościowo gęstość i żywotność komórek, stosując metodę wykluczania błękitu trypanowego. Krótko zmieszaj 10 μl zawiesiny komórek z równą objętością błękitu trypanowego, przenieś na szkiełko do liczenia komórek, a następnie policz za pomocą licznika komórek, jak opisano wcześniej21.
  3. Wysiewanie hiPSC-CM
    1. Usunąć roztwór powlekający macierz zewnątrzkomórkową z płytek 96-dołkowych.
    2. Wysiewać 50 000 komórek na studzienkę w 100 μl pożywki wysiewającej hiPSC-CM i umieścić 96-dołkowe płytki w wilgotnym inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez noc.
    3. Zastąp podłoże wysiewające hiPSC-CM 100 μl pożywki konserwacyjnej hiPSC-CM 1 dzień po posiewie. Zmieniaj pożywkę konserwacyjną hiPSC-CM co 2 dni, aż do momentu nagrania.
  4. Akwizycja danych
    1. Zmierz ruch skurczowy hiPSC-CM co najmniej 10 dni po posadzeniu (zalecane).
    2. Włącz regulator temperatury i ustaw 37 °C jako preferowaną temperaturę. Włącz mikroskop, kamerę i zasilanie CO2 .
    3. Napełnij płaszcz wodny uchwytu talerza odpowiednią ilością sterylnej wody dejonizowanej (Rysunek 2A). Umieścić 96-dołkową płytkę na uchwycie płytki i pozwolić komórkom zaaklimatyzować się przez co najmniej 5 minut.
    4. Otwórz oprogramowanie widoku, ustaw liczbę klatek na sekundę kamery na 75 klatek na sekundę (fps), a rozdzielczość wideo/obrazu na 1024 × 1024 piksele. Zastosuj funkcje automatycznego ustawiania ostrości i automatycznej jasności. Nagrywanie filmów i obrazów hiPSC-CMs.
      UWAGA: Unikaj wibracji stołu mikroskopu podczas nagrywania.
    5. Otwórz oprogramowanie analizatora do automatycznej analizy.

3. Pomiar potencjału pola hiPSC-CM

  1. Przygotowanie płyt pokrytych matrycą membrany podstawnej
    1. Ostrożnie umieścić kroplę 8 μl roztworu do powlekania macierzy zewnątrzkomórkowej na obszarze elektrody rejestrującej każdej studzienki z 48-dołkową matrycą mikroelektrod (MEA). Zobacz Rysunek 3A, aby zobaczyć odpowiedni obszar elektrody do umieszczenia kropel. Ten krok ma kluczowe znaczenie dla utrzymania koncentracji monowarstwy hiPSC-CM na elektrodach. Pod żadnym pozorem nie dotykaj elektrod.
    2. Dodaj 3 ml sterylnej wody dejonizowanej do obszaru otaczającego studzienki (Rysunek 3A) 48-dołkowych płytek MEA, aby zapobiec parowaniu roztworu powlekającego. Inkubować 48-dołkowe płytki MEA w wilgotnym inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 45-60 min.
      UWAGA: Nie inkubować zbyt długo, aby zapobiec wyschnięciu matrycy błony podstawnej.
  2. Przeprowadzić dysocjację enzymatyczną hiPSC-CM zgodnie z opisem w kroku 2.2.
  3. Wysiewanie hiPSC-CM
    1. Usunąć większość pożywki z matrycy zewnątrzkomórkowej z powierzchni studzienki bez dotykania elektrod za pomocą końcówki pipety o pojemności 200 μl w tym samym pojedynczym rzędzie lub kolumnie.
    2. Zasiać 50 000 komórek na studzienkę w kropli 8 μl pożywki wysiewającej hiPSC-CM na obszarze elektrody rejestrującej każdego dołka w tym samym rzędzie lub kolumnie.
    3. Powtarzaj ostatnie dwa kroki, aż wszystkie studzienki zostaną pokryte komórkami. Sprawdź pod mikroskopem, czy wszystkie studzienki mają zawieszenie hiPSC-CM. Aby uzyskać żądaną gęstość, zobacz Rysunek 3B.
      UWAGA: Przyczepianie hiPSC-CM będzie zagrożone, jeśli matryca błony podstawnej zostanie całkowicie wysuszona, co sprawi, że przyłączenie komórek będzie nieoptymalne.
    4. Inkubować 48-dołkowe płytki MEA w wilgotnym inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 60 minut.
    5. Powoli i delikatnie dodać 150 μl pożywki wysiewającej hiPSC-CM do każdego dołka z 48-dołkowych płytek MEA. Aby dodać pożywkę bez rozpraszania wcześniej wysianych hiPSC-CMs, przytrzymaj płytkę pod kątem 45°, oprzyj końcówkę pipety o ściankę każdej studzienki i powoli uwalniaj pożywkę.
      UWAGA: Zbyt szybkie dodanie pożywki lub pod wysokim ciśnieniem spowoduje usunięcie przylegających kardiomiocytów. Należy unikać bezpośredniego kontaktu z zawiesiną kroplową hiPSC-CM.
    6. Inkubować 48-dołkowe płytki MEA w wilgotnym inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez noc.
    7. Odświeżyć podłoże wysiewające hiPSC-CM za pomocą 300 μl pożywki pielęgnacyjnej hiPSC-CM 1 dzień po posianiu. Wymieniaj pożywkę konserwacyjną hiPSC-CM co 2 dni przed nagrywaniem.
  4. Akwizycja danych
    1. Pomiar MEA należy wykonać co najmniej 10 dni po poszyciu (zalecane). W 10 dniu po posiewie sprawdź gęstość spontanicznie dudniącej monowarstwy hiPSC-CM pod mikroskopem przy 10-krotnym powiększeniu, która powinna być taka, jak pokazano na Rysunek 3C.
    2. Umieść 48-dołkową płytkę MEA w przyrządzie rejestrującym. Ekran dotykowy umożliwia obserwację temperatury (37 °C) i stanu CO2 (5%).
    3. Otwórz oprogramowanie nawigatora. W oknie ustawień eksperymentalnych wybierz opcję Cardiac Real-time Configuration (Konfiguracja serca w czasie rzeczywistym) i Field Potential Recordings (Zapisy potencjału pola). Stosuj konfiguracje dudnienia spontanicznego lub w tempie.
    4. W parametrach wykrywania dudnień ustaw próg wykrywania na 300 μV, minimalny okres dudnienia na 250 ms, a maksymalny okres dudnienia na 5 s. Wybierz Regresję wielomianową do obliczenia czasu trwania potencjału pola (FPD).
    5. Sprawdź, czy podstawowy sygnał aktywności elektrycznej jest dojrzały i stabilny.
      UWAGA: Dojrzałe przebiegi zarejestrowane przez każdą elektrodę z wielodołkowej płytki MEA muszą odzwierciedlać potencjał pola sercowego o łatwo identyfikowalnych cechach zbiegających się ze skokiem depolaryzacji serca i fazą repolaryzacji, jak pokazano na Rysunek 3D-F.
    6. Uzyskuj wyjściową aktywność serca przez 1-3 minuty. Jeśli konieczne jest leczenie farmakologiczne, dodaj związki do studzienek po zarejestrowaniu linii podstawowej. Umieścić płytkę w inkubatorze na co najmniej 30 minut przed kolejnym nagraniem.

4. Pomiar potencjału czynnościowego hiPSC-CM

  1. Przygotuj naczynia pokryte matrycą błony podstawnej, umieszczając 500 μl roztworu do powlekania macierzy zewnątrzkomórkowej na szklanej dolnej części szalek o średnicy 35 mm (Rysunek 4A). Inkubować szalki o średnicy 35 mm w wilgotnym inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez noc.
  2. Przeprowadzić dysocjację enzymatyczną hiPSC-CM zgodnie z opisem w kroku 2.2.
  3. Wysiewanie hiPSC-CM
    1. Usunąć roztwór powlekający macierz zewnątrzkomórkową z szalek o średnicy 35 mm. Wysiewać 50 000 komórek na studzienkę w 500 μl podłoża wysiewającego hiPSC-CM na szklanej dolnej części szalek o średnicy 35 mm.
    2. Inkubować szalki o średnicy 35 mm w wilgotnym inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez noc. Usuń pożywkę wysiewającą hiPSC-CM i dodaj 2 ml pożywki konserwacyjnej hiPSC-CM do szalek o średnicy 35 mm.
      UWAGA: Zaleca się nałożenie niefiltrowanej końcówki o pojemności 200 μl na pipetę aspiracyjną o pojemności 2 ml w celu usunięcia zużytego podłoża i uniknięcia dotykania komórek.
    3. Zmieniaj pożywkę hodowlaną hiPSC-CM co 2 dni przed rejestracją.
  4. Akwizycja danych
    1. Pomiar potencjału czynnościowego należy wykonać co najmniej 10 dni po posadzeniu (zalecane). Przygotuj świeży roztwór Tyrode'a zgodnie z opisem w kroku 1.4. Rozmrozić jedną podwielokrotność wewnątrzkomórkowego roztworu pipety i świeżo dodać MgATP do końcowego stężenia 3 mM.
    2. Wyciągnij mikropipety z kapilar ze szkła borokrzemianowego za pomocą ściągacza do mikropipet.
      UWAGA: Preferowana jest rezystancja mikropipet na poziomie 2-5 MΩ.
    3. Zastąp pożywkę konserwacyjną hiPSC-CM roztworem Tyrode'a i pozwól komórkom zaaklimatyzować się w roztworze Tyrode'a przez 15 minut (Rysunek 4C). Włóż czujniki temperatury do komory, umieść naczynie 35 mm w komorze, jak pokazano na Rysunek 4C, i ustaw temperaturę na 37 °C (Rysunek 4D).
    4. Napełnij mikropipety roztworem wewnątrzkomórkowym i włóż je do uchwytu podłączonego do stopnia głównego wzmacniacza z zaciskiem krosowym (Rysunek 4E). Otwórz oprogramowanie do stymulacji/akwizycji, załaduj protokół zapisu potencjału czynnościowego i wybierz konfigurację cęgów napięcia.
    5. Włożyć mikropipetę do roztworu kąpieli, wybrać odpowiednie pojedyncze hiPSC-CM, a następnie wyregulować i opuścić pozycję mikropipety obok wybranej komórki za pomocą mikromanipulatora. Po włożeniu końcówki pipety do roztworu kąpieli sprawdź rezystancję pipety, którą można zaobserwować na monitorze oscyloskopu.
    6. Umieść pipetę blisko celi, a impulsy prądu nieznacznie się zmniejszą, aby odzwierciedlić rosnący opór uszczelnienia. Zastosuj delikatne ssanie z podciśnieniem, aby zwiększyć opór, który utworzy gigaseal. Zastosuj funkcję Seal (Uszczelnienie).
    7. Zastosuj dodatkowe ssanie, aby przerwać membranę, aby uzyskać konfigurację nagrywania całej komórki. Gdy część błony w obszarze pipety zostanie rozerwana przez zasysanie, roztwór wewnętrzny jest w równowadze z cytoplazmą komórki. W tym momencie przełącz się z trybu cęgów napięciowych (V-clamp) na tryb cęgów prądowych lub brak wtrysku prądu (C-Clamp) za pomocą okna dialogowego wzmacniacza. Naciśnij przycisk nagrywania, aby wygenerować i zapisać nagranie potencjału czynnościowego files.
      UWAGA: Zmiana trybu zapewnia ciągłą rejestrację spontanicznych potencjałów czynnościowych hiPSC-CM za pośrednictwem protokołu nagrywania bez wyzwalania i bez stymulacji, który można monitorować na wyjściu V-mon wzmacniacza patch-clamp.

5. Pomiar stanu przejściowego hiPSC-CM Ca2+

  1. Zapoznaj się z poprzednim protokołem, aby przygotować niestandardowe komory komórkowe do obrazowania Ca2+21. W celu przygotowania komory komórkowej pokrytej matrycą błony podstawnej, należy umieścić 200 μl roztworu powlekającego macierz zewnątrzkomórkową w komorach komórkowych. Inkubować komory komórkowe w wilgotnym inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez noc.
  2. Przeprowadzić dysocjację enzymatyczną hiPSC-CM zgodnie z opisem w kroku 2.2.
  3. Wysiewanie hiPSC-CM
    1. Usunąć roztwór powlekający macierz zewnątrzkomórkową z komór komórkowych. Wysiewaj 20 000 komórek na studzienkę w 200 μl podłoża wysiewającego hiPSC-CM.
    2. Zastąp podłoże wysiewające hiPSC-CM 200 μl pożywki pielęgnacyjnej hiPSC-CM 1 dzień po posiewie. Wymieniaj pożywkę konserwacyjną hiPSC-CM co 2 dni przed nagrywaniem.
  4. Akwizycja danych
    1. Wykonaj pomiar stanu nieustalonego Ca2+ co najmniej 10 dni po posadzeniu (zalecane). Przygotuj świeży roztwór Tyrode'a zgodnie z opisem w kroku 1.4. Przygotuj świeży roztwór ładujący Fura-2 AM zgodnie z opisem w kroku 1.6.
    2. Odessać pożywkę konserwacyjną hiPSC-CM i dwukrotnie przemyć roztworem Tyrode'a. Zastosować 100 μl roztworu nasycającego Fura-2 AM i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
    3. Zastąp roztwór ładujący Fura-2 AM roztworem Tyrode i odczekaj co najmniej 5 minut na całkowitą deestryfikację Fura-2 AM.
    4. Dodaj kroplę olejku immersyjnego na 40-krotny obiektyw odwróconego mikroskopu epifluorescencyjnego wyposażonego w 40-krotny obiektyw immersyjny z olejkiem (0,95 NA). Umieść komorę celi w stage adapter mikroskopu (Rysunek 5A).
    5. Zamontuj przewody regulatora temperatury w komorze kąpieli i ustaw ją na 37 °C. Zamontuj elektrody stymulujące pole elektryczne i ustaw impulsy na 0,5 Hz o czasie trwania 20 ms.
    6. Włącz źródło światła o bardzo dużej prędkości przełączania długości fali i ustaw je na tryb szybkiego przełączania 340 nm i 380 nm zgodnie z instrukcjami przyrządu.
    7. Zastosuj czas naświetlania 20 ms dla obu długości fal i czas nagrywania 20 s w oprogramowaniu. Nagraj wideo odzwierciedlające zmiany w czasie rzeczywistym stanu nieustalonego Ca2+ w hiPSC-CM. Wyeksportuj dane do arkusza kalkulacyjnego i przeanalizuj je zgodnie z wcześniejszym opisem23.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje, jak mierzyć ruch skurczowy, potencjał pola, potencjał czynnościowy i stan przejściowy Ca2+ hiPSC-CMs. Schemat ideowy obejmujący trawienie enzymatyczne, wysiewanie komórek, utrzymanie i przeprowadzanie testów funkcjonalnych jest pokazany na Rysunek 1. Tworzenie monowarstwy hiPSC-CM jest niezbędne do pomiaru ruchu skurczowego (Rysunek 2B). Reprezentatywny ślad ruchu kurczliwo-relaksacyjnego hiPSC-CM pokazano na Rysunek 2C...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Technologia ludzkiego iPSC stała się potężną platformą do modelowania chorób i badań przesiewowych leków. W tym miejscu opisujemy szczegółowy protokół pomiaru kurczliwości hiPSC-CM, potencjału pola, potencjału czynnościowego i stanu przejściowego Ca2+. Protokół ten zapewnia kompleksową charakterystykę kurczliwości i elektrofizjologii hiPSC-CM. Te testy funkcjonalne zostały zastosowane w wielu publikacjach z naszej grupy 12,13,18,24,25,26,27....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

J.C.W. jest współzałożycielem Greenstone Biosciences, ale nie ma konkurencyjnych interesów, ponieważ prezentowane tu prace są całkowicie niezależne. Pozostali autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Blake'owi Wu za korektę rękopisu. Prace te były wspierane przez National Institutes of Health (NIH) R01 HL113006, R01 HL141371, R01 HL163680, R01 HL141851, U01FD005978 oraz NASA NNX16A069A (JCW) i AHA Postdoctoral Fellowship 872244 (GMP).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Szklana dzienka 35 mm ze szklanym dnem 20 mm mikro-studzienka #1,5 szklana osłonaCellvisD35-20-1.5-NZacisk krosowy
50x B27 suplementyLife Technologies17504-044hiPSC-CM pożywka hodowlana
6-dołkowa płytkahodowlana E & K ScientificEK-27160kultura hiPSC-CM
96-dołkowe płaskie przezroczyste dno z czarnego polistyrenu Mikropłytki poddane TCCorning3603Pomiar ruchu skurczowego
AccutaseSigma-AldrichA6964Dysocjacja enzymatyczna
Zintegrowane Studio Axion (AxIS)Oprogramowanie nawigacyjneAxion Biosystems
Kapilary ze szkła borokrzemianowegoAparat HarvardaBF 100-50-10,zacisk krosowy
CaCl2 1 M w H2OSigma-Aldrich21115Tyrode' s rozwiązanie
Szkiełka komory do liczenia komórekThermoFisher ScientificC10228Zliczanie komórek
CytoView 48-dołkowe płytki MEAAxion BiosystemsM768-tMEA-48BMEA
DMEM/F12Gibco/Life Technologies12634028Podłoże do macierzy zewnątrzkomórkowej
DPBS, bez wapnia, bez magnezuFisher Scientific14-190-250
EGTASigma-AldrichE3889Płyn do pipet wewnątrzkomórkowych
EPC 10 USB  wzmacniacz patch clampWarner Instruments89-5000Patch clamp
Fura-2, AM, permeant cell permeantThermoFisher ScientificF1221Ca2+ pomiar stanów nieustalonych
GlukozaSigma-AldrichG8270Tyrode' s rozwiązanie
HEPESSigma-AldrichH3375Tyrode' s rozwiązanie
hiPSCStanford Instytut Sercowo-Naczyniowy iPSC Biobank
KClSigma-Aldrich529552Tyrode" s roztwór
KnockOut Serum ReplacementThermoFisher Scientific10828-028hiPSC-CM podłoże wysiewające
KOH 8  MSigma-AldrichP4494Wewnątrzkomórkowy roztwór do pipet
Lambda DG 4Sutter Instrument CompanyCa2+ pomiar stanów nieustalonych; ultraszybkie źródło światła przełączające długość fali
Luna-FL automatyczny licznik komórek fluorescencyjnychWISBIOMEDLB-L20001Liczenie komórek
Maestro Pro  System MEAAxion BiosystemsMEA
Matrigel Czynnik wzrostu o obniżonym współczynniku wzrostu (GFR) Macierz błony podstawnejCorning356231Podłoże macierzy zewnątrzkomórkowej
MgATPSigma-AldrichA9187Wewnątrzkomórkowy roztwór do pipet
MgCl2Sigma-AldrichM8266Tyrode" s roztwór
NaClSigma-AldrichS9888Tyrode' s roztwór
NaOH 10  MSigma-Aldrich72068Tyrode' s
rozwiązanie NIS Elements AR
Pluronic F-127 (20% roztwór w DMSO)ThermoFisher ScientificP3000MPCa2+ pomiar stanów nieustalonych
RPMI 1640 średniLife Technologies11875-119pożywka hodowlana hiPSC-CM
System obrazowania ruchu komórek Sony SI8000 System obrazowania ruchuSony BiotechnologyPomiar ruchu skurczowego
Ściągacz do mikropipetSutter InstrumentsP-97Zacisk krosowy
Trypan niebieska plamaLife TechnologiesT10282Liczenie komórek
komórkowego

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wouters, O. J., McKee, M., Luyten, J. Estimated research and development investment needed to bring a new medicine to market, 2009-2018. Journal of the American Medical Association. 323 (9), 844-853 (2020).
  2. Pang, L., et al. Workshop report: FDA workshop on improving cardiotoxicity assessment with human-relevant platforms. Circulation Research. 125 (9), 855-867 (2019).
  3. Mamoshina, P., Rodriguez, B., Bueno-Orovio, A. Toward a broader view of mechanisms of drug cardiotoxicity. Cell Reports Medicine. 2 (3), 100216(2021).
  4. Paik, D. T., Chandy, M., Wu, J. C. Patient and disease-specific induced pluripotent stem cells for discovery of personalized cardiovascular drugs and therapeutics. Pharmacological Reviews. 72 (1), 320-342 (2020).
  5. Kaese, S., Verheule, S. Cardiac electrophysiology in mice: a matter of size. Frontiers in Physiology. 3, 345(2012).
  6. Clark, W. A., Chizzonite, R. A., Everett, A. W., Rabinowitz, M., Zak, R. Species correlations between cardiac isomyosins. A comparison of electrophoretic and immunological properties. Journal of Biological Chemistry. 257 (10), 5449-5454 (1982).
  7. Werfel, S., et al. Characterization of circular RNAs in human, mouse, and rat hearts. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 98, 103-107 (2016).
  8. Burridge, P. W., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
  9. Sharma, A., et al. Derivation of highly purified cardiomyocytes from human induced pluripotent stem cells using small molecule-modulated differentiation and subsequent glucose starvation. Journal of Visualized Experiments. (97), e52628(2015).
  10. Itzhaki, I., et al. Modelling the long QT syndrome with induced pluripotent stem cells. Nature. 471 (7337), 225-229 (2011).
  11. Lan, F., et al. Abnormal calcium handling properties underlie familial hypertrophic cardiomyopathy pathology in patient-specific induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 12 (1), 101-113 (2013).
  12. Wu, H., et al. Modelling diastolic dysfunction in induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes from hypertrophic cardiomyopathy patients. European Heart Journal. 40 (45), 3685-3695 (2019).
  13. Lee, J., et al. Activation of PDGF pathway links LMNA mutation to dilated cardiomyopathy. Nature. 572 (7769), 335-340 (2019).
  14. Sun, N., et al. Patient-specific induced pluripotent stem cells as a model for familial dilated cardiomyopathy. Science Translational Medicine. 4 (130), (2012).
  15. Chen, S. N., et al. Activation of PDGFRA signaling contributes to filamin C-related arrhythmogenic cardiomyopathy. Science Advances. 8 (8), (2022).
  16. Sharma, A., et al. High-throughput screening of tyrosine kinase inhibitor cardiotoxicity with human induced pluripotent stem cells. Science Translational Medicine. 9 (377), (2017).
  17. Burridge, P. W., et al. Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes recapitulate the predilection of breast cancer patients to doxorubicin-induced cardiotoxicity. Nature Medicine. 22 (5), 547-556 (2016).
  18. Kitani, T., et al. Human-induced pluripotent stem cell model of trastuzumab-induced cardiac dysfunction in patients with breast cancer. Circulation. 139 (21), 2451-2465 (2019).
  19. Matsa, E., et al. Transcriptome profiling of patient-specific human iPSC-cardiomyocytes predicts individual drug safety and efficacy responses in vitro. Cell Stem Cell. 19 (3), 311-325 (2016).
  20. Stillitano, F., et al. Modeling susceptibility to drug-induced long QT with a panel of subject-specific induced pluripotent stem cells. Elife. 6, (2017).
  21. Zhang, J. Z., et al. Protocol to measure contraction, calcium, and action potential in human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. STAR Protocols. 2 (4), 100859(2021).
  22. Blinova, K., et al. International multisite study of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for drug proarrhythmic potential assessment. Cell Reports. 24 (13), 3582-3592 (2018).
  23. Greensmith, D. J. Ca analysis: an Excel based program for the analysis of intracellular calcium transients including multiple, simultaneous regression analysis. Computer Methods and Programs in Biomedicine. 113 (1), 241-250 (2014).
  24. Ma, N., et al. Determining the pathogenicity of a genomic variant of uncertain significance using CRISPR/Cas9 and human-induced pluripotent stem cells. Circulation. 138 (23), 2666-2681 (2018).
  25. Lam, C. K., et al. Identifying the transcriptome signatures of calcium channel blockers in human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Circulation Research. 125 (2), 212-222 (2019).
  26. Seeger, T., et al. A premature termination codon mutation in MYBPC3 causes hypertrophic cardiomyopathy via chronic activation of nonsense-mediated decay. Circulation. 139 (6), 799-811 (2019).
  27. Zhang, J. Z., et al. Effects of cryopreservation on human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for assessing drug safety response profiles. Stem Cell Reports. 16 (1), 168-181 (2021).
  28. Yu, B., Zhao, S. R., Yan, C. D., Zhang, M., Wu, J. C. Deconvoluting the cells of the human heart with iPSC technology: cell types, protocols, and uses. Current Cardiology Reports. 24 (5), 487-496 (2022).
  29. Thomas, D., Cunningham, N. J., Shenoy, S., Wu, J. C. Human-induced pluripotent stem cells in cardiovascular research: current approaches in cardiac differentiation, maturation strategies, and scalable production. Cardiovascular Research. 118 (1), 20-36 (2022).
  30. Zhu, R., et al. Physical developmental cues for the maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cell Research & Therapy. 5 (5), 117(2014).
  31. Feyen, D. A. M., et al. Metabolic maturation media improve physiological function of human iPSC-derived cardiomyocytes. Cell Reports. 32 (3), 107925(2020).
  32. Gintant, G., et al. Use of human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes in preclinical cancer drug cardiotoxicity testing: a scientific statement from the American Heart Association. Circulation Research. 125 (10), 75-92 (2019).
  33. Kussauer, S., David, R., Lemcke, H. hiPSCs Derived cardiac cells for drug and toxicity screening and disease modeling: what micro- electrode-array analyses can tell us. Cells. 8 (11), (2019).
  34. Ng, C. A., et al. High-throughput phenotyping of heteromeric human ether-a-go-go-related gene potassium channel variants can discriminate pathogenic from rare benign variants. Heart Rhythm. 17 (3), 492-500 (2020).
  35. Obergrussberger, A., Friis, S., Bruggemann, A., Fertig, N. Automated patch clamp in drug discovery: major breakthroughs and innovation in the last decade. Expert Opinion on Drug Discovery. 16 (1), 1-5 (2021).
  36. Kozek, K. A., et al. High-throughput discovery of trafficking-deficient variants in the cardiac potassium channel KV11.1. Heart Rhythm. 17 (12), 2180-2189 (2020).
  37. Heyne, H. O., et al. Predicting functional effects of missense variants in voltage-gated sodium and calcium channels. Science Translational Medicine. 12 (556), (2020).
  38. Li, W., et al. Establishment of an automated patch-clamp platform for electrophysiological and pharmacological evaluation of hiPSC-CMs. Stem Cell Research. 41, 101662(2019).
  39. Li, W., Luo, X., Ulbricht, Y., Guan, K. Blebbistatin protects iPSC-CMs from hypercontraction and facilitates automated patch-clamp based electrophysiological study. Stem Cell Research. 56, 102565(2021).
  40. Milligan, C. J., Möller, C. Ion Channels: Methods and Protocols. Gamper, N. , Humana Press. 171-187 (2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Microelectrode ArrayPatch Clamp RecordingHuman iPSC CardiomyocytesCardiac Safety AssessmentDrug Induced CardiotoxicityCalcium Transient MeasurementField Potential RecordingAction Potential RecordingWhole Cell RecordingCardiac Electrophysiology

Related Articles