Method Article

Mapowanie bezwzględnej gęstości DNA w jądrach komórkowych za pomocą mikroskopii lokalizacyjnej pojedyncząsteczki

DOI:

10.3791/64268

⸱

November 11th, 2025

 , 
1Institute of Molecular Biology (IMB), 2Max Planck Institute for Polymer Research

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niniejszy protokół opisuje metodę pomiaru bezwzględnej gęstości DNA w jądrach komórek przylegających przy użyciu tesselacji Voronoi danych z mikroskopii lokalizacyjnej pojedynczej cząsteczki, znanej objętości, rozmiaru genomu oraz etapu cyklu komórkowego.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W jądrze komórkowym geny ciche zazwyczaj znajdują się w obszarach o wysokiej gęstości chromatyny zwanych heterochromatyną, podczas gdy aktywne geny można znaleźć głównie na styku chromatyny z przestrzenią interchromatyną zwaną euchromatyną. Obecnie charakterystyka eu- i heterochromatyny opiera się głównie na epigenetycznych modyfikacjach białek histonowych w sekwencji DNA, podczas gdy niewiele wiadomo o bezwzględnych gęstościach DNA w jądrze komórkowym i ich funkcjonalnych implikacjach. Modele jądra oparte wyłącznie na danych biochemicznych i założeniach dotyczących natury chromatyny jako polimeru nadal zasadniczo różnią się od danych obrazowych uzyskanych w mikroskopii wysokiej rozdzielczości. Wskazuje to, że wciąż brakuje ważnych informacji istotnych strukturalnie. Uważamy, że ograniczenia przestrzenne mogą mieć wpływ na regulację genów, dlatego opracowaliśmy metodę umożliwiającą pomiar bezwzględnej gęstości DNA w jądrach komórek ssaków poprzez przekształcanie danych lokalizacji superrozdzielczości w dokładne w skali mapy gęstości za pomocą tesselacji Voronoi.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Od początków biologii komórki jądro komórkowe – będące siedzibą informacji genetycznej – fascynowało biologów. Po zastosowaniu samodzielnie opracowanych metod barwienia cytologicznego, Emil Heitz w 1928 roku odkrył w 1928 roku inne, intensywnie barwione obszary wewnątrz jądra komórki1. Obszary o silniejszym barwieniu, gęstości nazywał "heterochromatyną", natomiast mniej mocno barwione, mniej gęste obszary nazwał "euchromatyną". Z czasem okazało się, że aktywne geny znajdują się głównie w euchromatynie, podczas gdy gęstsze obszary były bogate w powtarzalne pierwiastki i geny ciche. Terminy heterochromatyna i euchromatyna przetrwały do dziś, choć ich definicja zmieniła się z właściwości strukturalnych na molekularne (patrz niżej). Dziś wiemy, że jądro komórkowe dzieli się na dwie główne fazy. Jedna ciecz (komora interchromatyna), w której znajdują się ciała jądrowe, komora splicingowa i nukleoplazma, oraz druga stała, hydrożelowa domena chromatyna, obejmująca terytoria chromosomów i nukleoli2. Na granicy przestrzeni interchromatyny chromatyna jest mniej gęsta, i to właśnie tam zachodzą głównie procesy genetycznie aktywne, takie jak transkrypcja, replikacja i naprawa, 3,4,5, natomiast sąsiadujące z warstwą, wokół jąderka i w pobliżu centromerów, chromatyna wykazuje wysoki poziom zagęszczenia i jest ogólnie dość nieaktywna transkrypcyjnie6.

Na poziomie molekularnym chromatyna powstaje z DNA owiniętego wokół nukleosomów (oktamera białek histonowych rdzeniowych). Histony posiadają wewnętrznie nieuporządkowane domeny ogonowe, które można modyfikować po translacji, dodając kilka grup chemicznych (metylo-, acetyl, fosfor-, biotyna), aminokwasów (arginina), a nawet białek (SUMO, Ubiquitin)7. Te modyfikacje mogą być odczytywane i przyciągać inne białka (np. remodelator chromatyny, HP1, białka naprawcze, RNA), a tym samym definiować stan fizjologiczny sekwencji DNA (transkrypcjonalnie permisywny/restrykcyjny), bez bezpośredniej zmiany jej sekwencji (stąd "epi"genetycznej)7. Typ i liczba modyfikacji wokół konkretnej sekwencji mogą się znacznie różnić między typami komórek, są odwracalne i mogą się zmieniać w trakcie rozwoju, starzenia się i choroby 8,9,10. Istnieją modyfikacje ogonów histonowych, które są bardziej widoczne w silnie transkrybowanych obszarach, oraz modyfikacje dominujące w regionach genomu o niewielkiej lub żadnej aktywności transkrypcyjnej.

Na przykład obszary silnie transkrybowane bogate w modyfikacje H3K4 lub których ogonki histonowe są acetylowane, zwykle określane są jako euchromatyna, natomiast obszary bogate w represyjne modyfikacje histonowe (H3K9me3, H3K27me3 lub H4K20me3) określane są jako heterochromatyna, która dzieli się dalej na heterochromatynę konstytutywną (transkrypcyjną nieaktywną we wszystkich komórkach) (np. H4K20me3) oraz heterochromatynę fakultatywną (chromatynę wyciszaną w zależności od typu komórki, np. H3K27me3)6. Chociaż metody biochemiczne i molekularno-biologiczne są bardzo dobre do pomiaru zmian chemicznych na poziomie sekwencji, znacznie trudniej jest ich używać do formułowania stwierdzeń dotyczących właściwości przestrzennych w mezoskali za pomocą tych metod.

Na przykład podjęto próby rekonstrukcji modeli przestrzennych genomu11, wykorzystując informacje o bliskości z eksperymentów Hi-C, które wykrywają i mapują bliskość DNA pomiędzy regionami sekwencji. Jednak bezpośrednie porównanie z wysokorozdzielczymi obrazami z mikroskopii świetlnej i elektronowej pokazuje, że jest to możliwe tylko w ograniczonym stopniu (Rysunek 1). Chociaż metody takie jakHi-C 12 potrafią prawidłowo wykrywać terytoria chromosomów w komórkach międzyfazowych jako odrębne jednostki, modele te są raczej "krótkowzroczne", ponieważ same bliskości sekwencji DNA są ślepe, by odzwierciedlać relacje przestrzenne między dalszymi częściami genomu, a zatem nie są zbyt dobrze przystosowane do prawidłowej rekonstrukcji genomu 3D. Dlatego różnice gęstości nie mogą być właściwie odzwierciedlone przez informacje o częstotliwości kontaktu. Prowadzi to do "spaghettified" reprezentacji genomu w jądrze (patrz Rysunek 1B), które wydają się występować w kuli wełnianych, łatwo dostępnych pętli.

Aby utorować drogę do integracyjnego, bardziej realistycznego obrazu jądra łączącego informacje biochemiczne z danymi biofizycznymi i strukturalnymi, należy opracować metody pozwalające generować dane na różne aspekty organizacji jądrowej. Do niedawna trudno było również określić bezwzględne gęstości DNA w jądrach komórkowych na podstawie danych obrazowych. Powodem tego były ograniczone rozdzielczość konwencjonalnych mikroskopów świetlnych, problemy w mikroskopii elektronowej z precyzyjnym barwieniem DNA oraz niewielkie objętości obserwacyjne w mikroskopii elektronowej.

Rozdzielczość konwencjonalnych mikroskopów fluorescencyjnych jest ograniczona przez dyfrakcję światła. Obraz punktowego źródła światła jest rozproszony ze względu na granicę dyfrakcyjną i można go opisać za pomocą funkcji rozproszenia punktowego (PSF). Według PSF obraz fluoroforu, który można w dobrym przybliżeniu uznać za punktowe źródło światła, zajmuje objętość o określonym rozmiarze wokół źródła (fluoroforu)13. Gdy wiele fluoroforów, znajdujących się znacznie bliżej siebie niż ich obrazy ograniczone dyfrakcją, jest wzbudzanych jednocześnie, rozkłady intensywności na obrazach są nakładane, a lokalizacja pojedynczych fluoroforów nie może zostać rozróżniona. Sekwencyjna, stochastyczna emisja światła z fluoroforów () pozwala na optyczną izolację pojedynczych cząsteczek, a tym samym na znalezienie ich dokładnych lokalizacji poprzez określenie centrum intensywności i grawitacji ich sygnałów.

Może to być wykorzystywane do rekonstrukcji informacji strukturalnych próbek poprzez gromadzenie danych lokalizacyjnych fluoroforów z wielu zarejestrowanych obrazów. Metoda ta jest zazwyczaj określana jako mikroskopia lokalizacyjna pojedynczych cząsteczek (SMLM) (więcej informacji wartykule 14). Im więcej fotonów fluorofor emituje podczas swojego "włączenia", tym dokładniej można określić centra grawitacji intensywności. Soczewki astygmatyczne w ścieżce wiązki przekształcają sygnały fluoroforów powyżej lub poniżej optycznej płaszczyzny ogniskowej w elipsy, które mogą służyć do określenia ich położenia wzdłuż osi optycznej. Długie osie elips, pochodzące z sygnałów fluorescencjowych poniżej płaszczyzny ogniskowej, są obracane o 90° w porównaniu do osi elips pochodzących z fluoroforów powyżej ogniskowej. Ponadto stosunek osi tych elipsów pozwala określić położenie cząsteczki wzdłuż osi optycznej względem płaszczyzny ogniskowej w zakresie ±300 nm15.

Jakość obrazów o superrozdzielczości generowanych przez rekonstrukcję stochastycznych zdarzeń mrugania zależy silnie od gęstości etykietowania oraz liczby zdarzeń mrugania. Te ostatnie zależą od fotostabilności fluoroforów oraz liczby zdarzeń mrugania przed ich ostateczną awarią (liczba cykli włączania/wyłączania). Metoda opisana tutaj do uzyskania superrozdzielczych obrazów rozkładu DNA wewnątrzjądrowego nazywana jest fBALM (DNA structure fluctuating-assisted binding-activated localization microscopy). Opiera się na fluoroforach, które przemijają się w kwasy nukleinowe i fluorescencją dopiero po związaniu się zDNA16,17. Ze względu na naładowane reszty szkieletu fosforowo-diesterowego, DNA jest polimerem o silnym ładunku ujemnym. Stabilizacja komplementarnych nici DNA w żywych komórkach wymaga neutralizacji przez białka o dodatnim ładunku (np. histony) i jony. Obniżając pH, stabilność komplementarnego parowania zasad jest zmniejszana, co pozwala barwnikom wstawionym na dyfundację wchodzić i wychodzić16,17.

W zależności od barwnika fluorescencyjnego wtrącającego, ten stan może być osiągnięty w określonym zakresie pH. Fluorescencyjne barwniki, takie jak YoYo-1 i SYTOX Orange, fluorescencją są widoczne tylko wtedy, gdy są związane z DNA, a ponieważ barwniki wstawające (w przeciwieństwie do barwników wiążących drobny rowek DNA, takich jak Hoechst i 4',6-diamidino-2-fenylindole [DAPI]) zwykle wiążą się niezależnie od sekwencji, są dobrze przystosowane do mapowania rozkładu DNA w jądrach komórkowych za pomocą mikroskopii lokalizacyjnej.

Tesselacja Voronoi to metoda matematyczna pozwalająca na podział przestrzeni na różne podziały w zależności od położenia punktów. W przestrzeni 2D rozmiar powstałych kafelków odzwierciedla odwrotność gęstości punktów18. Ponieważ mikroskopia lokalizacyjna rekonstruuje obrazy jako zbiór punktów reprezentujących położenie fluoroforów, tesselacja Voronoi może pomóc w określeniu gęstości sygnałów lokalizacyjnych (Rysunek 2). Dlatego użycie barwnika specyficznego dla DNA jako fluoroforu pozwala na pomiar gęstości DNA.

A priori znajomość zawartości DNA (liczby par zasad) oraz wymiaru przestrzennego jądra pozwala na przekształcenie względnych gęstości DNA w bezwzględne gęstości DNA. Poniższy protokół pokazuje mapowanie bezwzględnych gęstości DNA w komórkach przylegających przy użyciu SMLM w bardzo wysokiej rozdzielczości i pokazuje, że te gęstości podlegają dużym zmianom.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Rysunek 3 przedstawia przegląd workflow opisany w tej sekcji. Zobacz Tabelę materiałów , aby poznać szczegóły dotyczące odczynników, materiałów, sprzętu i oprogramowania używanego w tym protokole. Kod użyty do tej publikacji można zobaczyć i pobrać tutaj: https://github.com/irradiator/Mapping-absolute-DNA-density-in-cell-nuclei-using-SMLM-microscopy.

1. Hodowla komórkowa

  1. Hodować C3H10T1/2, HFB i komórki HeLa w DMEM, uzupełnione o 10% surowicy płodowej bydła w temperaturze 37 °C w nawilżonej atmosferze, z dodatkiem 5%CO2. Gdy komórki są bliskie zbiórki, podhoduj je poprzez rozszczepienie odpowiednio 1:3 (C3H10T1/2, HFB) i 1:10 (HeLa).
  2. Dzień przed pomiarami nasiewaj komórki z wykładniczo rosnących hodowli na misku o średnicy 35 mm na kratownicy. Upewnij się, że talerze obserwacyjne zapewniają doskonałą jakość optyczną do mikroskopii fluorescencyjnej (szklane dno o grubości 170 μm, #1,5) oraz posiadają siatkę umożliwiającą jednoznaczne lokalizowanie komórek. Upewnij się również, że komórki znajdują się w zawiesie pojedynczej komórki, a cała powierzchnia naczynia jest pokryta jednorodnie komórkami.
    UWAGA: Zaleca się używanie naczyń z nadrukowaną siatką, aby ponownie znaleźć dokładne komórki przypisane do danego etapu cyklu komórkowego.
  3. Jeśli wymaga tego eksperyment, należy dodać 100 nM trychostatyny A (TSA) do pożywki hodowli komórkowej i inkubować komórki w warunkach opisanych wcześniej w kroku 1.1.

2. Przygotowanie próbki

  1. W dniu pomiaru umyj komórki raz 1x DPBS, a następnie utrwal je przez 30 minut w 4% paradehydzie (PFA) w 1x DPBS.
    UWAGA: Aby uzyskać powtarzalne wyniki, upewnij się, że za każdym razem przygotowuje się świeży roztwór PFA i zwracaj szczególną uwagę na dokładność stężenia PFA.
  2. Po usunięciu utrwalacza należy ponownie przemyć komórki 2 razy 1 DPBS przed permeabilizacją przez 20 minut w 1 DPBS zawierającym 0,4% Triton X-100.
  3. Usuń bufor permeabilizacyjny pipetą i wykonaj dodatkowy krok mycia 1x DPBS przed użyciem koktajlu RNaz (rozcieńczenie 1:1 000 w 1x DPBS). Umieść komórki w inkubatorze na 30 minut w nawilżonej komorze w 37 °C.
  4. Przygotuj roztwór barwiący przez rozcieńczenie roztworu SYTOX Orange zdolnego do fBALM (5 mM w 1x DPBS przy rozcieńczeniu 1:10 000).
  5. Usuń bufor RNase pipetą i zastosuj dodatkowy krok mycia 1x DPBS przed dodaniem roztworu barwiącego. Inkubuj komórki w temperaturze pokojowej w nawilżonej komorze przez 5 minut.
  6. Usuń roztwór barwiący SYTOX Orange z komórek pipetą, umyj 1x DPBS i przechowuj komórki w 1x DPBS, chronionym przed intensywnym światłem.

3. Cytometryczne wyznaczanie cyklu komórkowego

UWAGA: W tym etapie użyto odwróconego mikroskopu przesiewowego o wysokiej wartości, ale można użyć dowolnego zautomatyzowanego, odwrotnie szerokiego mikroskopu fluorescencyjnego. Intensywność całego jądra jest miarą jego zawartości DNA; Dlatego upewnij się, że otwórek jest całkowicie otwarty, jeśli używasz układu konfokalnego. Soczewki z niską aperturą numeryczną (NA) są lepsze niż obiektywy immersyjne olejowe.

  1. Umieść talerz z komórkami na odwróconym mikroskopie fluorescencyjnym wyposażonym w zmotoryzowany podaż oraz oprogramowanie umożliwiające rekonstrukcję dużych obszarów próbki poprzez łączenie automatycznie nagrywanych obrazów.
  2. Wybierz obiektyw umożliwiający rejestrację wystarczającej liczby komórek w jednym polu widzenia (co najmniej 900 pojedynczych jąder łącznie [szczegóły patrz Roukos i in.19]), aby akwizycja obrazu do ustalenia cyklu komórkowego mogła zostać przeprowadzona w rozsądnym czasie. Używaj soczewki, która nie pokazuje dużych różnic w intensywności między środkiem a krawędziami. Jeśli taki obiektyw nie jest dostępny, należy zastosować korekcję płaskiego pola na obrazach (patrz krok 7). Aby stosować ten protokół, użyj szerokokątnego mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w soczewkę 20x NA 0,4 o głębokości ostrości = 8 μm.
  3. Podczas akwizycji obrazu pokryj centralną część talerza odpowiednimi filtrami dla użytego fluoroforu. Rób zdjęcia w jasnym polu w trybie światła przepuszczonego.
    UWAGA: Obrazy w jasnym polu są ważne dla przelokowania komórek na siatce w kroku 4.6.
  4. Włóż naczynie z komórkami do lodówki w temperaturze 4 °C do kroku 4.4.
  5. Odtworz zeskanowany obszar z pojedynczych obrazów, łącząc zarejestrowane pojedyncze obrazy.
  6. Przenieś dane obrazowe fluorescencyjnego barwienia DNA na komputer z otwartym oprogramowaniem CellProfiler4.2.120.
  7. Jeśli konieczna jest korekta zdjęć fluorescencyjnych w polu płaskim, wygeneruj obraz referencyjny użytego mikroskopu na podstawie zarejestrowanych zdjęć. Otwórz pipeline Illumination Correction.cpproj (zawarty jako Plik Uzupełniający 1); Zwróć uwagę, że potok pojawia się na ekranie jako sekwencja, w której można klikać różne kroki. Przeciągnij i upuść obrazy do wyznaczonego pola w pierwszym kroku w potoku potoku.
    UWAGA: Upewnij się, że wykluczysz wszystkie dane niebędące obrazem w wymienionych plikach, korzystając z opcji filtrowania w dolnej części okna.
  8. W ostatnim etapie procesu korekcji iluminacji kliknij na Zapisz obrazy , aby zdefiniować miejsce, gdzie będą przechowywane obrazy referencyjne, a następnie kliknij przycisk Analizuj obrazy .
  9. Otwórz pipeline CellCycleAnalysis.cpproj (dołączony jako Plik Uzupełniający 2). Przeciągnij i upuść obrazy zarejestrowane w kroku 3.3 (patrz Rysunek 4A jako przykład), w tym obraz referencyjny (krok 3.8), do wyznaczonego pola w pierwszym kroku Obrazy potoku.
    UWAGA: Upewnij się, że wykluczysz wszystkie dane niebędące obrazem w wymienionych plikach, korzystając z opcji filtrowania w dolnej części okna.
  10. W kroku CorrectIlluminationApply w potoku wybierz obraz referencyjny w menu rozwijanym, wybierając funkcję Wybierz Illumination.
  11. W ostatnim etapie analizy cyklu komórkowego zdefiniuj miejsce, w którym obraz referencyjny był przechowywany, w kroku 3.7 i kliknij przycisk Analizuj obrazy , aby rozpocząć masowe pomiary zintegrowanych intensywności fluorescencji wszystkich jąder w obrazach zarejestrowanych w kroku 3.3.
    UWAGA: CellProfiler4.2.1 wygeneruje plik tekstowy "CellCycleAnalysis_Nuclei.txt", który zawiera dane każdego mierzonego jądra (Obraz, ObjectID, zintegrowana intensywność fluorescencji, współrzędne obrazu) w formacie CSV.
  12. Upewnij się, że element DisplayHistogram w pipeline jest oznaczony jako aktywny.
  13. Zwróć uwagę na zintegrowane intensywności fluorescencji w histogramie dla szczytów G1 i G2 (patrz Rysunek 4B jako przykład) i wprowadź otaczające je interwały do elementów FilteredObjects w potoku. Aktywuj elementy pipeline, klikając pola zaznaczenia.
  14. Aktywuj odpowiednie elementy potoku DisplayDataOnImage , aby wygenerować obraz podświetlający komórki w fazie G1 lubG 2 i uruchom potok ponownie (patrz Rysunek 4C jako przykład).
  15. Wybierz do pięciu komórek reprezentujących pożądaną fazę cyklu komórkowego na podstawie wygenerowanego obrazu w oznaczonym obszarze komory obserwacyjnej i spróbuj przenieść komórki na mikroskopie SMLM.
    UWAGA: Ponieważ użyto tutaj dwóch linii komórkowych o nieznanym rozmiarze genomu, rozmiary genomu zostały określone poprzez porównanie pików G1 ludzkiej linii fibroblastowej z pikami G1 komórek HeLa i C3H10T1/2. Histogramy oraz proporcjonalne zależności między ich rozmiarami genomów można zobaczyć na Rysunku Uzupełniającym S1.

4. SMLM-fBALM

UWAGA: Chociaż suma netto tlenu w tych połączonych reakcjach biochemicznych wynosi zero, zaleca się przeprowadzenie reakcji w naczyniu niezamkniętym, ponieważ ograniczone stężenia tlenu mogą spowolnić produkcję D-glukono-1,5-laktonu. Wzrost stężenia D-glukono-1,5-laktonu stopniowo obniża pH, co jest konieczne, ponieważ natychmiastowe obniżenie pH zmienia ultrastrukturę próbki.

  1. Przygotuj 1 mL buforu obrazowania, mieszając następujące składniki: 900 μL glukozy (1 g/mL glukozy w 1x DPBS), 50 μL oksydazy glukozy (0,5 mg/mL w 1x DPBS) oraz 50 μL katalazy (40 μg/mL w 1x DPBS).
  2. Usuń 1x DPBS z próbki za pomocą pipety i dodaj 1 mL bufora obrazującego do naczynia zawierającego komórki.
  3. Zamontuj antenę na scenie mikroskopu obsługującego SMLM. Używaj obiektywu o wysokiej wartości NA i wysokiego powiększenia optycznego.
  4. Zlokalizuj jedno z wybranych jąder (z kroku 3.15) za pomocą układu współrzędnych anteny i wyśrodkowaj je w polu widzenia kamery.
    UWAGA: Reakcja enzymatyczna trwa ~60-180 minut, aż osiągnie się odpowiednie pH dla metody fBALM i ułatwi odpowiednie mruganie. Zaleca się jak najszybsze zamontowanie anteny obserwacyjnej, aby dać próbce wystarczająco dużo czasu na przystosowanie się do temperatury instrumentu, ponieważ zmiany temperatury mogą prowadzić do dryfu osiowego. Upewnij się, że temperatura w pomieszczeniu, w którym znajduje się mikroskop SMLM, jest stabilna przez cały czas pomiaru.
  5. Określ wysokość jądra, zmieniając ostrość za pomocą napędu z mikroskopu i rejestrując pozycję górnej i dolnej granicy.
  6. W różnych punktach czasowych sprawdź prawidłowe wytwarzane przez proces fBALM, zwiększając moc lasera. Gdy próbka wykazuje prawidłowe stochastyczne mruganie, rozpocznij pobieranie serii obrazów potrzebnych do rekonstrukcji superrozdzielczego SMLM.
    UWAGA: Mikroskop używany w fBALM powinien być wyposażony w lasery wzbudzające, odpowiednie do wzbudzania użytego fluoroforu i zdolne do generowania wystarczająco wysokiej gęstości fotonów, aby zapewnić wystarczającą liczbę fotonów na klatkę. Przetestuj to w eksperymentze pilotażowym przed wszystkimi innymi.
  7. Gdy prawidłowe mruganie procesu fBALM zostanie zapewnione, rozpocznij akwizycję serii obrazów z czasem naświetlania 50 ms, co daje liczbę klatek na sekundę ~20 fps.
  8. Weź stos z przez jądro (około środkowej części) z odstępami krokowymi 200 nm i tylko 500 klatek na lekki przekrój optyczny. W środkowej części wykonaj serię zdjęć 50 000 klatek, aby zebrać wystarczającą liczbę zdarzeń i uzyskać dobrą rekonstrukcję szczegółów strukturalnych z dużą precyzją lokalizacji (zajmie to ~45 minut).
    UWAGA: Stos z jest ważny do określenia ułamku sygnału DNA w środkowej części względem całego jądra. Upewnij się, że efektywny rozmiar piksela jest dobrze dopasowany do SMLM22 i że sygnał z aparatu nie nasyca sensora.
  9. Upewnij się, że spełnione są następujące wymagania
    1. Upewnij się, że komputer do akwizycji zawiera wystarczającą ilość miejsca na dysku, ponieważ w zależności od liczby i rozmiaru obrazów 16-bitowych, rozmiary plików stosów obrazów mogą być bardzo duże.
    2. Upewnij się, że komputer uruchamiający oprogramowanie do akwizycji potrafi obsługiwać system plików na używanym urządzeniu zdolnym do obsługi dużych rozmiarów plików (>4 GB) oraz że szybkość transferu do urządzenia jest wystarczająco wysoka, aby zapisywać pliki w czasie rzeczywistym podczas bezpośredniego zapisu danych obrazowych do urządzenia pamięci.
    3. Podczas zapisywania danych po przejęciu obrazu upewnij się, że komputer ma odpowiednią ilość pamięci RAM (np. 64 GB).

5. Przygotowanie i zapisywanie talerza z kulkami fluorescencyjnymi do kalibracji z mikroskopu SMLM

UWAGA: Aby prawidłowo kalibrować osiowo astygmatyczne soczewki mikroskopu, aby przypisać właściwe położenie wzdłuż osi optycznej, należy rozważyć rejestrację stosów z kulkami fluorescencyjnymi o średnicy 100 nm.

  1. Rozcieńczaj kulki 1:10 000 w 1x DPBS i nasiewaj kulki 100 nm na ten sam typ naczynia, co do pomiarów SMLM.
    UWAGA: Używaj wyłącznie najlepszych optycznych i specyfikacji, takich jak pokrywki #1.5.
  2. Zamontuj antenę kalibracyjną na mikroskopie; Rejestruj stosy obrazów w płaszczyźnie ogniskowej koralików (~1,5 μm łącznie; tutaj użyte 10 nm kroków)15.
  3. Przekaż dane do komputera do analizy danych.
    UWAGA: Nie przechowuj i nie używaj slajdów kalibracyjnych przez długi czas.

6. Przetwarzanie danych SMLM

UWAGA: Wtyczka ImageJ23 "ThunderSTORM"24 była używana do rejestracji lokalizacji (np. konwersji plam w stosie obrazu na listę zawierającą współrzędne lokalizacyjne, numer klatki itp.). ImageJ lub Fiji25 działa na wszystkich głównych systemach desktopowych (Linux/Windows/macOS) i można go pobrać oraz używać bezpłatnie.

  1. Aby korzystać z ThunderSTORM na FijI, koniecznie dodaj stronę aktualizacji Hohlbein Lab w sekcji HELP | Aktualizacja | Zarządzaj Aktualizacjami Stron, zaznacz pole wyboru dla laboratorium Hohlbeina i zrestartuj Fidżi. Upewnij się, że program ma dostęp do wystarczającej ilości pamięci.
    UWAGA: Dane obrazowe muszą być w formacie pliku, który może być odczytany przez ImageJ/Fiji. Podczas zapisywania danych na standardowym systemie komercyjnym otwórz je bezpośrednio za pomocą wtyczki Bio-Formats dla ImageJ (która automatycznie jest dostępna z Fiji). W tym przypadku użyto skryptu MATLAB h52tif.m (udostępnionego na stronie GitHub wspomnianej na początku protokołu), który konwertował dane zarejestrowane przez nasz niestandardowy zestaw z formatu hdf5 na format TIFF.
    1. W zależności od ilości dostępnej pamięci w systemie oraz liczby klatek do zapisu, podziel dane na kilka podstosów, aby uniknąć wyczerpania pamięci.
      UWAGA: W poniższym miejscu wykorzystane są ustawienia użyte do wyodrębniania danych pokazanych w sekcji wyników. Aby uzyskać bardziej szczegółowe wyjaśnienie ustawień ThunderSTORM, zapoznaj się z tutorialami ThunderSTORM, które można znaleźć online.
  2. Optymalizuj ustawienia wykrywania sygnałów, dostosowując ustawienia ThunderSTORM do pożądanych warunków nagrywania. Kliknij na ThunderSTORM | Uruchom analizę, wybierz Ustawienie kamery i wprowadź właściwy rozmiar pikseli danych obrazu, liczbę A/D, efektywność kwantową użytej kamery, poziom bazowy oraz wzmocnienie elektromagnetyczne (dla tego zestawu rozmiar piksela: 65 nm, liczba A/D: 0,64, efektywność kwantowa: 0,8).
  3. Następnie wybierz algorytm, który określi współrzędne lokalizacyjne poprzez dopasowanie sygnałów. W sekcji Filtrowanie obrazów użyj filtra falkowego (B-Spline) z B-Spline rzędu 3 i skalą B-Spline 2.0. W pozostałych ustawieniach ustaw metodę przybliżonej lokalizacji cząsteczek na maksimum lokalne, próg intensywności szczytowej na 2*std(Wave.F1) oraz łączność na ośmiokątne sąsiedztwo. W sekcji lokalizacji cząsteczek subpikselowych wybierz PSF: Zintegrowany Gauss, Promień dopasowania [px]: 3, Metoda dopasowania: Maksymalne prawdopodobieństwo oraz początkowa sigma [px]: 1.6.
  4. Uruchom wtyczkę, aby utworzyć tabelę zawierającą wpis dla każdej wykrytej lokalizacji oraz jej właściwości. Zapisz stół na dysku twardym.
  5. Jeśli trzeba przeanalizować wiele stosów obrazów lub podzielić je na kilka stosów (np. aby umożliwić analizę dużych zbiorów danych lub jeśli w komputerze do analizy danych jest niewiele pamięci), zautomatyzuj wykrywanie lokalizacji poprzez uruchomienie makra.
  6. Jeśli dane akwizycyjne musiały być podzielone na wiele stosów obrazów, łącz tabele lokalizacyjne w ThunderSTORM, importując jeden plik po drugim. Upewnij się, że opcja Dodaj do bieżącej tabeli w menu Import jest aktywowana oraz że użyto poprawnej liczby początkowej, aby uniknąć nadpisywania lokalizacji w tabeli.
  7. Po wygenerowaniu kompletnej tabeli lokalizacji sprawdź wynik, rekonstruując obraz z lokalizacji w tabeli wyników. Naciśnij przycisk Wizualizacja w oknie wyników ThunderSTORM i poczekaj na pojawienie się zrekonstruowanego obrazu (np. histogramu lokalizacji).
  8. Sprawdź zrekonstruowane zdjęcie pod kątem problemów takich jak dryf boczny i inne artefakty obrazujące. Zmierz i skoryguj dryf w podmenu Dryf , określając korelację krzyżową sumowanych podsekcji stosu danych (używanych tutaj) lub używając markerów fiducialnych w próbce. Po naciśnięciu menu >> wpisz 5 pojemników oraz współczynnik powiększenia (6,5 w tym protokole). Poczekaj, aż pojawi się okno pokazujące dryf x- i y.
    UWAGA: Pierwsze obrazy po nagraniu mogą nadal cierpieć na silną fluorescencję tła (podczas przenoszenia fluoroforów w stan ciemności); dlatego może być konieczne wykluczenie pierwszych kilkuset obrazów z analizy (np. wpisać "frame >500" do pola filtra w głównym oknie ThunderSTORM).
  9. Aby uniknąć nadmiernego przeliczania sygnałów widocznych na kilku kolejnych klatkach, należy zastosować łączenie danych lokalizacyjnych z uwzględnieniem promienia uwzględniającego średnią precyzję lokalizacji (tutaj 20 nm ), 1 ciemną klatkę i 0 maksymalnych klatek (bez ograniczeń maksymalnego czasu włączenia cząsteczki).
  10. Jeśli należy analizować tylko cienki, optyczny ultracienki przekrój, należy wykluczyć wszystkie lokalizacje powyżej i poniżej płaszczyzny ogniskowej ze zbioru danych. Najpierw znajdź punkt w z, który zawiera największą lokalizację, naciskając Plot Histogram w oknie zawierającym tabelę wyników, a następnie odrzuć lokalizacje 50 nm powyżej i poniżej tego punktu, używając polecenia filtrowania:
    Z > "Szczyt Histogramu" - 50 & Z < "Szczyt histogramu" + 50
  11. Aby określić ułamek DNA w zarejestrowanym przekroju, określ lokalizacje w każdej płaszczyźnie stosu obrazów (grubość 200 nm; 100 nm z każdej strony) zarejestrowanych w kroku 4.7.1. Otwórz pierwszą tabelę wyników lokalizacji stosu, wybierając wtyczki | ThunderSTORM | Import/Eksport | Importuj wyniki i filtruj każdy zarejestrowany fragment do 200 nm. Aby to zrobić, kliknij Apply po wpisaniu pola filtra:
    z > -100 & z < 100
  12. Kliknij na Wizualizację i wybierz opcję Histogramów , aby wygenerować obraz każdego fragmentu. Zapisz powstały obraz w folderze w formacie TIFF. Zamknij wszystkie otwarte obrazy. Powtórz to dla wszystkich obrazowych płaszczyzn.
  13. Otwórz wszystkie fragmenty i połącz je za pomocą Image | Stosy | Obrazki do stosu. Wybierz obraz | Stosy | Z-Project i wybierz opcję Sum . Otwórz menedżera ROI w ImageJ (Analizuj | Narzędzia | ROI-Manager); następnie wybierz narzędzie wyboru wielokątów z paska narzędzi ImageJ w głównym oknie ImageJ i zarysuj jądro. Kliknij Dodaj w menedżerze ROI.
    1. Kliknij na Analizuj | Ustaw pomiary i wybierz Gęstość zintegrowaną. Kliknij na Analizuj | Zmierz. W ThunderSTORM otwórz tabelę wyników płaszczyzny środkowej, jak opisano powyżej, i przefiltruj ją do grubości 100 nm , używając następującego polecenia w polu filtra:
      z > -50 & z < 50
  14. Wygeneruj histogram filtrowanych lokalizacji, jak opisano powyżej, aktywuj zdefiniowany ROI, wybierając go w Menedżerze ROI i klikając Analizuj | Zmierz.
  15. Określ ułamek lokalizacji w środkowej części o grubości 100 nm względem całkowitej liczby lokalizacji, dzieląc zmierzone gęstości zintegrowane – współczynnik konwersji potrzebny w kroku 8.2 do obliczania bezwzględnych gęstości DNA.
    UWAGA: Zawartość DNA jest proporcjonalna do liczby lokalizacji. Aby oszacować ułamek DNA na obrazowanym obrazie superrozdzielczym (przekroj środkowy), wystarczy określić łączną liczbę lokalizacji w całej objętości jądra oraz określić łączną liczbę lokalizacji w interesującym przekroju. Można to osiągnąć poprzez generowanie 2D histogramów lokalizacji.

7. Kalibracja Z mikroskopu SMLM

  1. Otwórz stosy obrazów zarejestrowane w sekcji 5 na Fidżi.
  2. W menu wtyczek ThunderSTORM wybierz podmenu kalibracji 3D | Kalibracja cylindrycznego soczewki.
  3. Wprowadź rozmiar kroku użyty do zapisu danych kalibracyjnych (10 nm) i określ obszar stosu obrazów , który będzie używany do kalibracji.
  4. Określ lokalizację do zapisu pliku kalibracyjnego.
  5. Użyj danych kalibracyjnych w oknie dialogowym Run Analysis , wybierając PSF: Elliptical Gaussian (3D Astygmatyzm) w panelu lokalizacji subpikseli cząsteczek i dostosowując ścieżkę pliku do pliku kalibracyjnego utworzonego w sekcji 5.

8. Tesselacja Voronoi

UWAGA: Po wygenerowaniu i przygotowaniu tabeli lokalizacji przejdź do ostatniego etapu analizy obrazu – tesselacji Voronoi. Do tego kroku użyj MATLAB 2021; skrypty MATLAB są częścią pakietu oprogramowania "Localization Analyzer for Nanoscale Distributions" (LAND) i można je pobrać z linków w Tabeli Materiałów. Podobnie jak przy zapisywaniu danych i generowaniu tabeli lokalizacji, ważne jest korzystanie z systemu dobrze wyposażonego w pamięć i moc obliczeniową. System używany do generowania obrazów do tej publikacji był wyposażony w 128 GB RAM oraz 9-rdzeniowy procesor Intel i9.

  1. Przekonwertuj tabelę lokalizacji ThunderSTORM z formatu .csv na format Orte , uruchamiając skrypt MATLAB "TS2Orte.m", który przekształca tabelę lokalizacyjną w macierz MATLAB i zapisuje ją w formacie ".mat".
  2. Gdy dane są w odpowiednim formacie, rozpocznij przygotowania do teselacji Voronoi i obliczenia gęstości DNA. Oblicz współczynnik konwersji, dzieląc liczbę par zasad w jądrze przez względną liczbę lokalizacji w obrazowanej sekcji względem objętości (patrz krok 6.15). Wejdź do folderu LAND-Voronoi oraz do podfolderu /coreAlgorithm , otwórz plik voronoiCluster.m i dostosuj współczynnik konwersji dla obliczeń gęstości bezwzględnej na linii 13.
    UWAGA: Zobacz Rysunek 5 , aby zobaczyć przykład jądra G1 HeLa; zmierzono współczynnik konwersji 265.
  3. Edytuj skrypt, który rozpoczyna analizę, "VonoRoi.m". Dostosuj ścieżkę do danych lokalizacji Orte oraz folderu wyjściowego dla plików wyników. W liście współrzędnych określ współrzędne definiujące obszar, w którym należy wykonać tesselację. Ponieważ tesselacja Voronoi może zająć dużo czasu (w zależności od specyfikacji użytej maszyny), zdefiniuj wiele obszarów do obliczenia w tym samym zbiorze danych wejściowych.
  4. Po uruchomieniu skryptu poszukaj obrazu pokazującego bezwzględne gęstości DNA wraz z innymi plikami zawierającymi wykresy pokazujące histogram rozkładu obszaru oraz plik "densities.mat" zawierający gęstości każdej pojedynczej obliczonej komórki Voronoi w folderze wyjściowym.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jądro HeLa pokazane na Rysunku 5 zostało wybrane na podstawie tabeli wygenerowanej przez CellProfiler4.2.1 w sekcji 3, aby mieć zintegrowaną intensywność fluorescencji zbliżoną do pierwszego piku na histogramie pokazanym na Rysunku 5 , który reprezentuje jądra w fazie G1 . Ze względu na niewielki rozmiar i wyraźną strukturę wewnętrzną, prawdopodobnie jest to wczesne jądroG1 , które wciąż jest w trakcie dekondensacji chromatyny po mitozie. B...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Artykuł ten opisuje, jak mierzyć bezwzględne gęstości DNA w jądrach komórek ssaków za pomocą SMLM. Ponadto pokazaliśmy, jak określić etap cyklu komórkowego hodowanych komórek oraz jak wykorzystać te informacje do oszacowania ilości DNA obecnej w lekkim, optycznym ultracienkim przekroju. Szczegółowo opisano także przygotowanie komórek przylegających do mikroskopii fBALM SMLM oraz sposób przetwarzania danych SMLM w celu uzyskania superrozdzielczych mikroskopowych obrazów DNA genomowego w jądrach komórkowych. Na koniec prot...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają żadnych konfliktów interesów do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy dr Sandrze Ritz za umożliwienie korzystania z IMB Imaging Core Facility, dr Shih-Ya Chen za możliwość korzystania z jej specjalnie zbudowanego mikroskopu SMLM, dr Leonardowi Kubbenowi (IMB) za dostarczenie ludzkich fibroblastów, dr Christofowi Niehrsowi (IMB) za dostarczenie linii komórkowej C3H10T1/2 oraz dr Jan Neumann za zmodyfikowany przez nas MATLAB-Script do tej pracy. Chcemy również podziękować dr Marion Cremer, dr Thomasowi Cremerowi oraz dr Christophowi Cremerowi za owocne dyskusje.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
hodowla komórek
&mikro - Naczynie 35 mm, wysoka siatka – dno szklane 500Ibidi81168
C3H 10T1/2IMB (Laboratorium Niehrsa)
DMEMThermoFisher12320032
dPBSThermoFisher14190144
FBSTechnologie życia16000-044
HelaObiekt Rdzenia Mikroskopii (IMB)
HFBIMB (Kubben Lab)
L-GlutaminaSigma-AldrichG7513
Aminokwasy nieniezbędne i witaminy na HFB
Pirowęglan soduS8636
Przygotowanie do próbek
KatalazyMerck2593710
GlukozaThermoFisher241922500
GlukozoksydazaMerck49180
ParaformaldehydSigma-Aldrich158127
Koktajl RNaseThermoFisherAM2286
SYTOX OrangeThermoFisherS11368
Zestaw próbek fluorescencyjnych mikrosfer TetraSpeckThermoFisherT7284
Triton X-100ThermoFisher327372500
Oprogramowanie
BioFormatyOpenMicroscopy.orgOprogramowanie open source https://www.openmicroscopy.org/bio-formats/
CellProfiler v4.2.1CellProfiler.orgOprogramowanie open source https://cellprofiler.org
Fidżinih.govOprogramowanie open source https://imagej.net/software/fiji/?Downloads
LĄDnih.govOprogramowanie open source https://github.com/Jan-NM/LAND
MatLab 2021Matematykaoprogramowanie komercyjne – wymaga "Image Processing Toolbox"
R v.4.. 0.3r-project.orgOprogramowanie open source https://www.r-project.org
ThunderSTORM v1.3Oprogramowanie open source https://zitmen.github.io/thunderstorm/
mikroskopy:
AF 7000Leica
Leica GSDLeica
Mikroskop SMLMLaboratorium Cremerna zamówienie zbudowany przez dr. S-Y. Chen

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Passarge, E. Emil Heitz and the concept of heterochromatin: longitudinal chromosome differentiation was recognized fifty years ago. American Journal of Human Genetics. 31 (2), 106-115 (1979).
  2. Cremer, T., Cremer, M. Chromosome territories. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2 (3), 003889(2010).
  3. Vecchio, L., Solimando, L., Biggiogera, M., Fakan, S. Use of halogenated precursors for simultaneous DNA and RNA detection by means of immunoelectron and immunofluorescence microscopy. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (1), 45-55 (2008).
  4. Solimando, L., et al. Spatial organization of nucleotide excision repair proteins after UV-induced DNA damage in the human cell nucleus. Journal of Cell Science. 122, 83-91 (2009).
  5. Niedojadlo, J., et al. Transcribed DNA is preferentially located in the perichromatin region of mammalian cell nuclei. Experimental Cell Research. 317 (4), 433-444 (2011).
  6. Padeken, J., Heun, P. Nucleolus and nuclear periphery: velcro for heterochromatin. Current Opinion in Cell Biology. 28, 54-60 (2014).
  7. Zhang, Y., et al. Overview of histone modification. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1283, 1-16 (2021).
  8. Ilango, S., Paital, B., Jayachandran, P., Padma, P. R., Nirmaladevi, R. Epigenetic alterations in cancer. Frontiers in Bioscience (Landmark Ed). 25 (6), 1058-1109 (2020).
  9. Saul, D., Kosinsky, R. L. Epigenetics of aging and aging-associated diseases). International Journal of Molecular Sciences. 22 (1), 401(2021).
  10. Eckersley-Maslin, M. A., Alda-Catalinas, C., Reik, W. Dynamics of the epigenetic landscape during the maternal-to-zygotic transition. Nature Reviews, Molecular Cell Biology. 19 (7), 436-450 (2018).
  11. Stevens, T. J., et al. 3D structures of individual mammalian genomes studied by single-cell Hi-C. Nature. 544 (7648), 59-64 (2017).
  12. Lieberman-Aiden, E., et al. Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome. Science. 326 (5950), 289-293 (2009).
  13. Cremer, C., Masters, B. R. Resolution enhancement techniques in microscopy. The European Physical Journal H. 38 (3), 281-344 (2013).
  14. Lelek, M., et al. Single-molecule localization microscopy. Nature Reviews Methods Primers. 1 (1), 39(2021).
  15. Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy. Science. 319 (5864), 810-813 (2008).
  16. Szczurek, A., et al. Super-resolution binding activated localization microscopy through reversible change of DNA conformation. Nucleus. 9 (1), 182-189 (2018).
  17. Szczurek, A., et al. Imaging chromatin nanostructure with binding-activated localization microscopy based on DNA structure fluctuations. Nucleic Acids Research. 45 (8), 56(2017).
  18. Levet, F., et al. SR-Tesseler: a method to segment and quantify localization-based super-resolution microscopy data. Nature Methods. 12 (11), 1065-1071 (2015).
  19. Roukos, V., Pegoraro, G., Voss, T. C., Misteli, T. Cell cycle staging of individual cells by fluorescence microscopy. Nature Protocols. 10 (2), 334-348 (2015).
  20. Stirling, D. R., et al. CellProfiler 4: improvements in speed, utility and usability. BMC Bioinformatics. 22 (1), 433(2021).
  21. Team, R. C. R: A Language and Environment for Statistical Computing. , (2016).
  22. Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes. Biophysical Journal. 82 (5), 2775-2783 (2002).
  23. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  24. Ovesny, M., Krizek, P., Borkovec, J., Svindrych, Z., Hagen, G. M. ThunderSTORM: a comprehensive ImageJ plug-in for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging. Bioinformatics. 30 (16), 2389-2390 (2014).
  25. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  26. Maeshima, K., et al. The physical size of transcription factors is key to transcriptional regulation in chromatin domains. Journal of Physics. Condensed Matter. 27 (6), 064116(2015).
  27. Itoh, Y., Woods, E. J., Minami, K., Maeshima, K., Collepardo-Guevara, R. Liquid-like chromatin in the cell: What can we learn from imaging and computational modeling. Current Opinion in Structural Biology. 71, 123-135 (2021).
  28. Strickfaden, H., Xu, Z. Z., Hendzel, M. J. Visualization of miniSOG tagged DNA repair proteins in combination with Electron Spectroscopic Imaging (ESI). Journal of Visualized Experiments. (103), e52893(2015).
  29. Xie, L., et al. BRD2 compartmentalizes the accessible genome. Nature Genetics. 54 (4), 481-491 (2022).
  30. Heo, S. J., et al. Nuclear softening expedites interstitial cell migration in fibrous networks and dense connective tissues. Science Advances. 6 (25), (2020).
  31. Gelléri, M., et al. True-to-scale DNA-density maps correlate with major accessibility differences between active and inactive chromatin. bioRxiv. , (2022).
  32. Derenzini, M., Olins, A. L., Olins, D. E. Chromatin structure in situ: the contribution of DNA ultrastructural cytochemistry. European Journal of Histochemistry. 58 (1), 2307(2014).
  33. Cremer, T., et al. The 4D nucleome: Evidence for a dynamic nuclear landscape based on co-aligned active and inactive nuclear compartments. FEBS Letters. 589, 2931-2943 (2015).
  34. Shah, F. A., Johansson, B. R., Thomsen, P., Palmquist, A. Ultrastructural evaluation of shrinkage artefacts induced by fixatives and embedding resins on osteocyte processes and pericellular space dimensions. Journal of Biomedical Materials Research A. 103 (4), 1565-1576 (2015).
  35. Gavelis, G. S., et al. Dinoflagellate nucleus contains an extensive endomembrane network, the nuclear net. Scientific Reports. 9 (1), 839(2019).
  36. Rouquette, J., et al. Revealing the high-resolution three-dimensional network of chromatin and interchromatin space: a novel electron-microscopic approach to reconstructing nuclear architecture. Chromosome Research. 17 (6), 801-810 (2009).
  37. Gorisch, S. M., Richter, K., Scheuermann, M. O., Herrmann, H., Lichter, P. Diffusion-limited compartmentalization of mammalian cell nuclei assessed by microinjected macromolecules. Experimental Cell Research. 289 (2), 282-294 (2003).
  38. Lenart, P., et al. Nuclear envelope breakdown in starfish oocytes proceeds by partial NPC disassembly followed by a rapidly spreading fenestration of nuclear membranes. The Journal of Cell Biology. 160 (7), 1055-1068 (2003).
  39. Verschure, P. J., et al. Condensed chromatin domains in the mammalian nucleus are accessible to large macromolecules. EMBO Reports. 4 (9), 861-866 (2003).
  40. Strickfaden, H., et al. Condensed chromatin behaves like a solid on the mesoscale in vitro and in living cells. Cell. 183 (7), 1772-1784 (2020).
  41. Lin, Y. R., et al. M33 condenses chromatin through nuclear body formation and methylation of both histone H3 lysine 9 and lysine 27. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular Cell Research. 1868 (11), 119100(2021).
  42. Strickfaden, H., Sharma, A. K., Hendzel, M. J. A charge-dependent phase transition determines interphase chromatin organization. bioRxiv. , (2019).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

DNA Density MappingCell NucleiSingle Molecule LocalizationSuper Resolution MicroscopyChromatin StructureVoronoi TessellationFPALM ImagingEpigenetic ModificationsCell Cycle StagesHeterochromatin Euchromatin

Related Articles