Artykuł metodologiczny

Oczyszczanie polisomów z guzków symbiotycznych soi

DOI:

10.3791/64269

⸱

1 lipca 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratorio de Bioquímica, Departamento de Biología Vegetal, Facultad de Agronomía, Universidad de la República, 2Departamento de Genómica, Instituto de Investigaciones Biológicas Clemente Estable, 3Department of Biology, University of Virginia, 4Departamento de Biología Celular y Molecular, Facultad de Ciencias, Universidad de la República

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje metodę oczyszczania eukariotycznych polisomów z nienaruszonych guzków soi. Po sekwencjonowaniu można wykorzystać standardowe potoki do analizy ekspresji genów do identyfikacji genów o zróżnicowanej ekspresji na poziomie transkryptomu i translatomiu.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Celem tego protokołu jest dostarczenie strategii badania translatomii eukariotycznej symbiotycznego guzka soi (Glycine max). W artykule opisano metody zoptymalizowane do izolowania polirybosomów pochodzenia roślinnego i związanych z nimi mRNA, które mają być analizowane przy użyciu sekwencjonowania RNA. Po pierwsze, lizaty cytoplazmatyczne uzyskuje się poprzez homogenizację w warunkach zachowania polisomów i RNA z całych, zamrożonych guzków soi. Następnie lizaty są oczyszczane przez wirowanie z niską prędkością, a 15% supernatantu jest używane do izolacji całkowitego RNA (TOTAL). Pozostały oczyszczony lizat służy do izolowania polisomów przez ultrawirowanie przez dwuwarstwową poduszkę sacharozową (12% i 33,5%). MRNA związane z polisomami (PAR) jest oczyszczane z granulek polissomalnych po ponownym wysiedleniu. Zarówno TOTAL, jak i PAR są oceniane za pomocą wysoce czułej elektroforezy kapilarnej, aby spełnić standardy jakości bibliotek sekwencjonowania dla sekwencjonowania RNA. Jako przykład dalszego zastosowania, po sekwencjonowaniu, można wykorzystać standardowe potoki do analizy ekspresji genów w celu uzyskania genów o zróżnicowanej ekspresji na poziomie transkryptomu i translatomiu. Podsumowując, metoda ta, w połączeniu z sekwencją RNA, pozwala na badanie translacyjnej regulacji eukariotycznych mRNA w złożonej tkance, takiej jak guzek symbiotyczny.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rośliny strączkowe, takie jak soja (Glycine max), mogą tworzyć symbiozę ze specyficznymi bakteriami glebowymi zwanymi rhizobia. Ten wzajemny związek powoduje powstawanie nowych organów, symbiotycznych guzków, na korzeniach roślin. Guzki są organami roślinnymi, w których znajdują się bakterie i składają się z komórek gospodarza, których cytoplazma jest skolonizowana wyspecjalizowaną formą ryzobii zwaną bakterioidami. Bakterioidy te katalizują redukcję azotu atmosferycznego (N2) do amoniaku, który jest przenoszony do rośliny w zamian za węglowodany1,2.

Chociaż ta symbioza wiązania azotu jest jedną z najlepiej zbadanych symbioz roślinno-mikrobowych, wiele aspektów pozostaje do lepszego zrozumienia, jak na przykład to, jak rośliny poddawane różnym warunkom stresu abiotycznego modulują swoją interakcję ze swoim symbiotycznym partnerem i jak to wpływa na metabolizm guzków. Procesy te można lepiej zrozumieć, analizując translatom guzkowy (tj. podzbiór informacyjnych RNA [mRNA] aktywnie ulegających translacji). Polirybosomy lub polisomy to kompleksy wielu rybosomów związanych z mRNA, powszechnie używane do badania translacji3. Metoda profilowania polisomów polega na analizie mRNA związanych z polisomami i jest z powodzeniem stosowana do badania mechanizmów potranskrypcyjnych kontrolujących ekspresję genów, które zachodzą w różnych procesach biologicznych4,5.

Historycznie rzecz biorąc, analiza ekspresji genomu skupiała się przede wszystkim na określaniu obfitości mRNA6,7,8,9. Nie ma jednak korelacji między poziomem transkryptu a poziomem białka ze względu na różne etapy potranskrypcyjnej regulacji ekspresji genów, w szczególności translację10,11,12. Co więcej, nie zaobserwowano zależności między zmianami na poziomie transkryptomu a tymi, które zachodzą na poziomie translatome13. Bezpośrednia analiza zestawu mRNA, które są poddawane translacji, pozwala na dokładniejszy i pełniejszy pomiar ekspresji genów komórki (którego punktem końcowym jest obfitość białka) niż ten, który otrzymuje, gdy analizowane są tylko poziomy mRNA14,15,16.

Ten protokół opisuje, jak polisomy pochodzenia roślinnego są oczyszczane z nienaruszonych guzków soi przez różnicowe wirowanie przez dwuwarstwową poduszkę sacharozową (Rysunek 1). Ponieważ jednak rybosomy pochodzące z bakterioidów są również obecne w guzkach, mieszanina rybosomów i gatunków RNA jest oczyszczana, mimo że te eukariotyczne stanowią główną frakcję (90%-95%). Opisano również późniejszą izolację RNA, kwantyfikację i kontrolę jakości (Rysunek 1). Protokół ten, w połączeniu z sekwencją RNA, powinien dostarczyć wyników eksperymentalnych dotyczących translacyjnej regulacji eukariotycznych mRNA w złożonej tkance, takiej jak symbiotyczny guzek.

figure-introduction-1
Rysunek 1: Schematyczny przegląd proponowanej metodologii oczyszczania eukariotycznych polisomów z guzków symbiotycznych. Schemat zawiera przegląd kroków wykonanych w protokole od (1) wzrostu roślin i (2) zbioru brodawek do (3) przygotowania ekstraktów cytozolowych, (3) uzyskania próbek TOTAL i (4) próbek PAR oraz (5) ekstrakcji RNA i kontroli jakości. Skróty: PEB = polysome extraction buffer; RB = bufor do ponownego zawieszenia; TOTAL = total RNA; PAR = mRNA związane z polisomami. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Wzrost roślin i inokulacja ryzobii

  1. Aby wytworzyć wymagane guzki, wysiewaj wybrane nasiona soi na wybranym podłożu w komorze wzrostowej w kontrolowanych warunkach.
    UWAGA: W tym protokole nasiona wysiano w plastikowej butelce o pojemności 0,5 litra wypełnionej mieszanką piasku i wermikulitu (1:1). W komorze wzrostowej ustawiono odpowiednio temperaturę cyklu dzień/noc 28 °C / 20 °C oraz fotoperiod światła / ciemności wynoszący odpowiednio 16 godzin / 8 godzin. Natężenie promieniowania czynnego fotosyntetycznie wynosiło 620 μmol·m−2·s−1.
  2. Przygotuj wcześniej płynną pożywkę z ekstraktem drożdżowym i mannitolem (YEM) (patrz tabela materiałów). Podłoże należy sterylizować w autoklawie.
  3. W tym samym dniu, w którym wysiewano nasiona, zaszczepić jedną kolbę zawierającą 100 ml YEM szczepem Bradyrhizobium elkanii U1302. Inkubować kolbę w temperaturze 28 °C na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 100 obr./min.
    1. Pozwól ryzobii rosnąć przez 2 dni i zaszczep sadzonki 2 ml kultury.

2. Usuwanie deficytu wody (opcjonalnie)

UWAGA: Ten protokół opisuje sposób leczenia niedoboru wody w roślinach soi. Ta część może być zmieniona lub całkowicie pominięta w zależności od danego pytania eksperymentalnego.

  1. Sadzonki soi należy uprawiać przez 19 dni (faza rozwojowa V2-3) bez ograniczeń wody. Utrzymuj podłoże na poziomie wydajności polowej za pomocą B&D-medium17 uzupełnionego 0,5 mM KNO3.
  2. W 20 dniu wycofaj podlewanie.
    UWAGA: W tym przypadku zawartość wody była mierzona codziennie za pomocą grawimetrii (zawartość grawimetryczna wody) w okresach wzrostu i deficytu wody.
  3. Za pomocą porometru, zgodnie z instrukcją producenta (patrz Tabela materiałów), mierzyć przewodność szparkową w trzech egzemplarzach na powierzchni liścia odbądźcowego (patrz Tabela Materiałów), od 20 dnia do końca okresu niedoboru wody.
    UWAGA: Koniec okresu deficytu wody określano indywidualnie dla każdej rośliny, gdy wartość przewodności szparkowej wynosiła około 50% wartości uzyskanej w 20 dniu od siewu.

3. Zbiór guzków

  1. Zbierz ciekły azot do czystego pojemnika i oznacz probówki o pojemności 15 ml (po jednej na każdą roślinę).
    UWAGA: Z ciekłym azotem należy obchodzić się w rękawicach kriogenicznych, osłonach twarzy i okularach ochronnych.
  2. Odzyskaj każdą roślinę z osobna. Wytnij i wyrzuć część nadziemną. Dokładnie umyj korzeń wodą, aby usunąć resztki podłoża.
  3. Odłącz każdy guzek od korzenia i zbierz je do schłodzonej probówki o pojemności 15 ml. Probówki należy zamrozić i przechowywać w temperaturze -80 °C.

4. Przygotowanie ekstraktów cytozolowych

UWAGA: Ostatecznym celem tego protokołu jest uzyskanie wysokiej jakości całkowitego RNA (TOTAL) i RNA związanego z polisomami (PAR). Dlatego należy pracować w warunkach, które zapobiegają degradacji RNA, zawsze utrzymując próbki w temperaturze 4 °C i używając sprzętu i roztworów laboratoryjnych wolnych od RNaz. O ile nie określono inaczej, wszystkie roztwory przygotowuje się ze sterylnej ultraczystej wody.

  1. Przygotowanie roztworów zapasów buforowych
    1. Przygotować nadające się do sterylizacji w autoklawie roztwory podstawowe wymienione w Tabeli 1, sterylizować w autoklawie przez 15 minut i przechowywać w temperaturze pokojowej.
    2. Przygotować nadające się do sterylizacji filtracyjnej roztwory podstawowe wymienione w tabeli 1, wysterylizować je metodą filtracyjną i przechowywać w temperaturze -20 °C.
  2. Przygotować bufor do ekstrakcji polisomów (PEB, patrz Tabela 1) i przechowywać go na lodzie.
    UWAGA: Podane objętości dotyczą sześciu próbek.
  3. Schłodzić wirówkę do temperatury 4 °C i umieścić 2 ml probówek mikrowirówek na lodzie.
  4. Odważyć około 0,2 g nienaruszonych guzków w naczyniu wagowym i przenieść je do wstępnie schłodzonej probówki o pojemności 2 ml.
    UWAGA: Wykonaj ten krok szybko, aby uniknąć rozmrożenia próbek. Alternatywnie można użyć szacowanej objętości guzka 0,4-0,5 ml zamiast 0,2 g.
  5. Dodać 1,2 ml PEB, pozostawić próbkę do rozmrożenia przez 2 minuty i homogenizować za pomocą młynka do tkanek, aż do całkowitego rozerwania i homogenizacji guzków.
    UWAGA: Pamiętaj, aby zmielić guzki po rozmrożeniu, ponieważ będą one na tyle miękkie, że można je łatwo rozbić młynkami do tkanek (patrz Tabela materiałów) w probówkach do mikrowirówek. Zamrożone guzki są trudne do zmielenia. Zaleca się również umieszczenie probówek w chłodziarce stołowej (0 °C) w celu prawidłowej homogenizacji przy jednoczesnym utrzymaniu próbek w niskiej temperaturze.
  6. Próbki należy inkubować na lodzie, delikatnie mieszając przez 10 minut lub do momentu, gdy wszystkie próbki zostaną przetworzone.
  7. Wirować przy 16 000 × g przez 15 minut w temperaturze 4 °C w celu osadzenia zanieczyszczeń. Odzyskać supernatant i powtórzyć etap wirowania.
  8. Ostrożnie odzyskać oczyszczony ekstrakt cytozolowy i przenieść 200 μl podwielokrotności do czystej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml w celu CAŁKOWITEJ izolacji (próbki CAŁKOWITE; patrz sekcja 7).

5. Przygotowanie poduszek z sacharozy

UWAGA: Ten protokół wykorzystuje dwuwarstwową poduszkę sacharozową (12% i 33,5%) w probówkach ultrawirówek o pojemności 13,2 ml (zobacz Tabelę Materiałów). Wszystkie roztwory przygotowywane są ze sterylnej ultraczystej wody.

  1. Przygotować roztwory podstawowe sacharozy i soli.
    1. Przygotować 100 ml 2 M roztworu sacharozy (68,5%, tabela 1).
    2. Przygotuj 10x roztwór soli (Tabela 1).
  2. Przygotować dwie warstwy poduszki z sacharozą, jak opisano w tabeli 2. Patrz Tabela 1 w celu zapoznania się ze składem roztworów podstawowych antybiotyków (CHX i CHL).
    UWAGA: Podane objętości dotyczą sześciu poduszek.
  3. Wlać 4,5 ml 33,5% warstwy sacharozy do probówek wirówkowych. Następnie ostrożnie i powoli dodaj 4,5 ml warstwy 12% za pomocą mikropipety P1000. Umieść probówki na lodzie do momentu dodania oczyszczonego ekstraktu cytozolowego.

6. Oczyszczanie polisomów

  1. Załadować 1 ml oczyszczonego ekstraktu cytozolowego (krok 4.8) na wierzch poduszki sacharozy, ostrożnie pipetując na ściankę boczną probówki.
  2. Przenieść probówki ultrawirówek do wstępnie schłodzonych wiader i odwirować przy ciśnieniu 217 874 × g (35 000 obr./min w referencyjnym wirniku [patrz tabela materiałów]) przez 2 godziny w temperaturze 4 °C.
  3. Odrzucić pozostały ekstrakt cytozolowy i poduszkę sacharozową, a następnie ponownie zawiesić osad polissomalny z 200 μl wstępnie schłodzonego RB (uprzednio przygotowanego zgodnie z tabelą 1).
  4. Inkubować przez 30 minut na lodzie, a następnie przenieść polisomalną zawiesinę do wstępnie schłodzonych probówek o pojemności 1,5 ml. Kontynuuj ekstrakcję RNA (próbki PAR).

7. Ekstrakcja RNA i kontrola jakości

UWAGA: Ten krok jest wykonywany dla próbek TOTAL (krok 4.8) i PAR (krok 6.4).

  1. Przygotować 75% EtOH sterylną ultraczystą wodą i schłodzić do temperatury -20 °C. Dodatkowo schłodzić chloroform i izopropanol do temperatury -20 °C.
  2. Homogenizować próbki z 750 μl odczynnika do izolacji RNA i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  3. Dodać 200 μl zimnego chloroformu i energicznie wstrząsać probówkami przez 15 s. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 min.
  4. Wirować przy 12 000 × g przez 15 minut w temperaturze 4 °C w celu separacji faz. Przenieść 500 μl górnej fazy wodnej do czystej probówki, nie naruszając różowej fazy organicznej, i dodać 375 μl zimnego izopropanolu i 0,5 μl glikogenu wolnego od RNaz (patrz tabela materiałów). Dokładnie wymieszać, pipetując w górę i w dół.
    UWAGA: Glikogen jest nośnikiem stosowanym jako współstrącacz w celu zwiększenia odzysku kwasów nukleinowych z wytrącania alkoholu.
  5. Inkubować mieszaninę przez 10 minut w temperaturze 4 °C i odwirowywać przy 12 000 × g przez 15 minut. Odrzucić supernatant.
  6. Przemyć osad RNA 1 ml zimnego 75% EtOH. Wymieszaj przez krótkie wirowanie.
    UWAGA: W tym momencie próbki można przechowywać w temperaturze -20 °C przez noc.
  7. Wirować przy 7 500 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C, ostrożnie usunąć supernatant za pomocą mikropipety i wysuszyć na powietrzu osad RNA.
  8. Rozpuścić osad w 50 μl wody wolnej od RNaz i inkubować w temperaturze 65 °C przez 5 minut.
  9. Oceń stężenie i integralność RNA za pomocą wysoce czułej elektroforezy kapilarnej18 (patrz Tabela Materiałów) i/lub elektroforezy na 2% wolnym od RNaz żelu agarozowym19 (patrz Tabela Materiałów).
    UWAGA: Jeśli próbki RNA nie zostaną natychmiast wykorzystane lub mają zostać wysłane do zakładu sekwencjonowania w celu przygotowania biblioteki sekwencjonowania RNA, zaleca się użycie EtOH do ich wytrącenia.

8. Wytrącanie RNA

  1. Schłodzić wirówkę i EtOH do temperatury 4 °C.
  2. Przygotować 3 M octan sodu.
  3. Przygotować 70% EtOH w sterylnej ultraczystej wodzie i schłodzić do temperatury -20 °C.
  4. Oszacuj objętość próbki. Dodać 0,1 objętości 3 M octanu sodu, 3 objętości zimnego EtOH i 0,5 μl glikogenu wolnego od RNaz. Dokładnie wymieszaj.
  5. Pozostawić w temperaturze -20 °C do momentu, gdy będzie potrzebny.
    UWAGA: Próbki wytrącone RNA mogą być przechowywane przez okres do 1 roku w temperaturze -80 °C.

9. Standardowy potok do analizy ekspresji genów

  1. Wykonuj średnio 40 mln odczytów sparowanych końców Illumina, z długością odczytu >100 bp, aby zapewnić pewną analizę danych transkryptomu i translatomu.
    UWAGA: Standardowa analiza danych sekwencyjnych RNA obejmuje następujące kroki 9.2-9.5.
  2. Przeprowadź kontrolę jakości odczytu za pomocą FastQC (https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/) lub wielopróbkowego MultiQC20.
  3. Usuń sekwencje adaptera i niskiej jakości, używając między innymi Trimmomatic21, BBDuk (http://jgi.doe.gov/data-and-tools/bb-tools/), cutadapt22, sickle23 lub Trim Galore (https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/).
  4. Jeśli genom referencyjny jest dostępny dla gatunku, przeprowadź mapowanie odczytu względem odniesienia, a następnie kwantyfikację liczebności, używając Bowtie224, TopHat225 lub Salmon26 i featureCounts27, oprócz innych narzędzi open source.
  5. Przeprowadź analizę statystyczną w celu identyfikacji genów o zróżnicowanej ekspresji, między innymi za pomocą edgeR28, DESeq229 lub limma30.
    UWAGA: To oprogramowanie typu open source może być używane lokalnie za pośrednictwem wiersza poleceń. Alternatywnie można je obsługiwać za pomocą przeglądarki internetowej na serwerze publicznym, takim jak Galaxy31 lub GEOexplorer32, które oferują graficzny interfejs użytkownika, dzięki czemu do ich użycia nie jest wymagana znajomość wiersza poleceń.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ocena ilości i jakości frakcji TOTAL i PAR oczyszczonych za pomocą wyżej wymienionej procedury jest kluczem do określenia jej sukcesu, ponieważ dla większości dalszych zastosowań, takich jak sekwencjonowanie RNA, wysokiej jakości próbki są podstawą do przygotowania biblioteki i sekwencjonowania. Co więcej, integralność cząsteczek RNA pozwala na uchwycenie migawki profilu ekspresji genów w momencie pobierania próbki18. W tym kontekście numer integralności RNA (RIN) uzyskuje się podczas wykonywania ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badanie regulacji ekspresji genów na poziomie translacyjnym ma kluczowe znaczenie dla lepszego zrozumienia różnych procesów biologicznych, ponieważ punktem końcowym ekspresji genów w komórce jest obfitość białek13,14. Można to ocenić, analizując translatomię tkanki lub organizmu będącego przedmiotem zainteresowania, dla którego frakcja polisomilna powinna zostać oczyszczona, a powiązane z nią mRNA przeanalizowane 3,4,34,35,36.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie zostało sfinansowane przez CSIC I+D 2020 grant nr 282, FVF 2017 grant nr 210 oraz PEDECIBA (María Martha Sainz).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Wzrost roślin i inokulacja ryzobii
Wytrząsarka orbitalnaDaihan ScientificModel SHO-1D
YEM-mediumAmrescoJ850 (ekstrakt drożdżowy) 0122 (mannitol)
Leczenie deficytu wody
KNO3Merck
PorometrUrządzenieModel SC-1
Skalpel
Przygotowanie ekstraktów cytozolowych
Brij L23Sigma-AldrichP1254
WirówkaSigmaModel 2K15
ChloranphenicolSigma-AldrichC0378
CykloheksymidSigma-AldrichC7698
DOCSigma-Aldrich30970
DTTSigma-AldrichD9779
EGTASigma-AldrichE3889
Igepal CA 360Sigma-AldrichI8896
KClMerck1.04936
MgCl2Sigma-AldrichM8266
Młynek do tkanek z tworzywa sztucznegoFisher Scientific12649595
PMSFSigma-AldrichP7626
PTESigma-AldrichP2393
TrisInvitrogen15504-020
Triton X-100Sigma-AldrichT8787
Tween 20Sigma-AldrichP1379
Naczynie wagowe Deltalab1911103
Przygotowanie poduszek sacharozowych
sacharozaInvitrogen15503022
SW 40 Ti rotorBeckman-Coulter Ultrawirówka Beckman-Coulter
Optima L-100K
Probówki do ultrawirówekBeckman-Coulter344059Probówki 13,2 ml
Ekstrakcja RNA i kontrola jakości
AgaroseThermo scientificR0492
BioanalizatorAgilentModel 2100. Test nano całkowitego RNA eukariontu
ChloroformDI41191
EtanolDorwilUN1170
IzopropanolMallinckrodt3032-06
GlikogenSigma10814-010
TRIzol LSAmbion102960028
Różne
Probówki Falcon 15 mlBiologix10-0152
Końcówki filtrujące 10 i mikro; LBioPointe Scientific321-4050
Końcówki filtrujące 1000 &mikro; LBioPointe Scientific361-1050
Końcówki filtrujące 20 i mikro; LBioPointe Scientific341-4050
Końcówki filtrujące 200 &mikro; LProbówki do mikrowirówek Tarsons528104
1,5 mlProbówki do mikrowirówek Tarsons500010-N
2,0 mlTarsons500020-N
Firma sekwencjonującaMacrogen
Sterylna kolba 250 mlMarienfeld4110207
221295 dekątne

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Limpens, E., et al. Cell- and tissue-specific transcriptome analyses of Medicago truncatula root nodules. PLoS ONE. 8 (5), 64377(2013).
  2. Masson-Boivin, C., Giraud, E., Perret, X., Batut, J. Establishing nitrogen-fixing symbiosis with legumes: How many rhizobium recipes. Trends in Microbiology. 17 (10), 458-466 (2009).
  3. King, H. A., Gerber, A. P. Translatome profiling: Methods for genome-scale analysis of mRNA translation. Briefings in Functional Genomics. 15 (1), 22-31 (2014).
  4. Chassé, H., Boulben, S., Costache, V., Cormier, P., Morales, J. Analysis of translation using polysome profiling. Nucleic Acids Research. 45 (3), 15(2017).
  5. Yángüez, E., Castro-Sanz, A. B., Fernández-Bautista, N., Oliveros, J. C., Castellano, M. M. Analysis of genome-wide changes in the translatome of Arabidopsis seedlings subjected to heat stress. PloS ONE. 8 (8), 71425(2013).
  6. Brown, P. O., Botstein, D. Exploring the new world of the genome with DNA microarrays. Nature Genetics. 21, 33-37 (1999).
  7. Krishnamurthy, A., Ferl, R. J., Paul, A. -L. Comparing RNA-Seq and microarray gene expression data in two zones of the Arabidopsis root apex relevant to spaceflight. Applications in Plant Sciences. 6 (11), 1197(2018).
  8. Shulse, C. N., et al. High-throughput single-cell transcriptome profiling of plant cell types. Cell Reports. 27 (7), 2241-2247 (2019).
  9. Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: A revolutionary tool for transcriptomics. Nature Reviews Genetics. 10 (1), 57-63 (2009).
  10. Kawaguchi, R., Girke, T., Bray, E. A., Bailey-Serres, J. Differential mRNA translation contributes to gene regulation under non-stress and dehydration stress conditions in Arabidopsis thaliana. The Plant Journal. 38 (5), 823-839 (2004).
  11. Larsson, O., Tian, B., Sonenberg, N. Toward a genome-wide landscape of translational control. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (1), 012302(2013).
  12. Vogel, C., Marcotte, E. M. Insights into regulation of protein abundance from proteomics and transcriptomis analyses. Nature Reviews Genetics. 13 (4), 227-232 (2013).
  13. Tebaldi, T., et al. Widespread uncoupling between transcriptome and translatome variations after a stimulus in mammalian cells. BMC Genomics. 13 (220), 1-15 (2012).
  14. Wang, T., et al. Translating mRNAs strongly correlate to proteins in a multivariate manner and their translation ratios are phenotype specific. Nucleic Acids Research. 41 (9), 4743-4754 (2013).
  15. Ingolia, N. T. Ribosome profiling: New views of translation, from single codons to genome scale. Nature Reviews Genetics. 15 (3), 205-213 (2014).
  16. Lukoszek, R., Feist, P., Ignatova, Z. Insights into the adaptive response of Arabidopsis thaliana to prolonged thermal stress by ribosomal profiling and RNA-Seq. BMC Plant Biology. 16 (1), 1-13 (2016).
  17. Broughton, W. J., Dilworth, M. J. Control of leghaemoglobin synthesis in snake beans. Biochemical Journal. 125 (4), 1075-1080 (1971).
  18. Schroeder, A., et al. The RIN: An RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Molecular Biology. 7, 1-14 (2006).
  19. Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. Nondenaturing agarose gel electrophoresis of RNA nondenaturing agarose gel electrophoresis of RNA. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (6), 1-3 (2012).
  20. Ewels, P., Magnusson, M., Lundin, S., Käller, M. MultiQC: Summarize analysis results for multiple tools and samples in a single report. Bioinformatics. 32 (19), 3047-3048 (2016).
  21. Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: A flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
  22. Marcel, M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet.journal. 17 (1), 10-12 (2011).
  23. Joshi, J., Fass, N. Sickle: A sliding-window, adaptive, quality-based trimming tool for FastQ files (Version 1.33). , Available from: https://github.com/najoshi/sickle (2011).
  24. Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
  25. Kim, D., et al. TopHat2: Accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions. Genome Biology. 14 (4), 1-13 (2013).
  26. Patro, R., Duggal, G., Love, M. I., Irizarry, R. A., Kingsford, C. Salmon provides fast and bias-aware quantification of transcript expression. Nature Methods. 14 (4), 417-419 (2017).
  27. Liao, Y., Smyth, G. K., Shi, W. featureCounts: An efficient general purpose program for assigning sequence reads to genomic features. Bioinformatics. 30 (7), 923-930 (2013).
  28. Robinson, M. D., McCarthy, D. J., Smyth, G. K. edgeR: A Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data. Bioinformatics. 26 (1), 139-140 (2010).
  29. Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biology. 15 (550), 1-21 (2014).
  30. Ritchie, M. E., et al. limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies. Nucleic Acids Research. 43 (7), 47(2015).
  31. Afgan, E., et al. The Galaxy platform for accessible, reproducible and collaborative biomedical analyses: 2018 update. Nucleic Acids Research. 46, 537-544 (2018).
  32. Hunt, G. P., et al. GEOexplorer: A webserver for gene expression analysis and visualisation. Nucleic Acids Research. , (2022).
  33. Imbeaud, S., et al. Towards standardization of RNA quality assessment using user-independent classifiers of microcapillary electrophoresis traces. Nucleic Acids Research. 33 (6), 1-12 (2005).
  34. Di Paolo, A., et al. PDCD4 regulates axonal growth by translational repression of neurite growth-related genes and is modulated during nerve injury responses. RNA. 26 (11), 1637-1653 (2020).
  35. Smircich, P., et al. Ribosome profiling reveals translation control as a key mechanism generating differential gene expression in Trypanosoma cruzi. BMC Genomics. 16 (1), 443(2015).
  36. Eastman, G., Sharlow, E. R., Lazo, J. S., Bloom, G. S., Sotelo-Silveira, J. R. Transcriptome and translatome regulation of pathogenesis in Alzheimer's disease model mice. Journal of Alzheimer's Disease. 86 (1), 365-386 (2022).
  37. Zanetti, M. E., Chang, I. -F., Gong, F., Galbraith, D. W., Bailey-Serres, J. Immunopurification of polyribosomal complexes of Arabidopsis for global analysis of gene expression. Plant physiology. 138 (2), 624-635 (2005).
  38. Mustroph, A., et al. Profiling translatomes of discrete cell populations resolves altered cellular priorities during hypoxia in Arabidopsis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (44), 18843-11848 (2009).
  39. Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R. S., Weissman, J. S. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 324 (5924), 218-223 (2009).
  40. Brar, G. A., Weissman, J. S. Ribosome profiling reveals the what, when, where and how of protein synthesis. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 16 (11), 651-664 (2015).
  41. Eastman, G., Smircich, P., Sotelo-Silveira, J. R. Following ribosome footprints to understand translation at a genome wide level. Computational and Structural Biotechnology Journal. 16, 167-176 (2018).
  42. Westermann, A. J., Gorski, S. A., Vogel, J. Dual RNA-seq of pathogen and host. Nature Reviews Microbiology. 10 (9), 618-630 (2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Brodawki sojoweizolacja polirybosom wsekwencjonowanie RNApoduszka sacharozowaultrawirowanieelektroforeza kapilarnaekspresja gen wregulacja translacyjnalizat cytoplazmatyczny

Powiązane artykuły