Artykuł metodologiczny

Ilościowy pomiar migracji i inwazji komórek nowotworowych w czasie rzeczywistym po transfekcji syntetycznego mRNA

DOI:

10.3791/64274

⸱

23 czerwca 2023

 , 
1Children’s Mercy Research Institute, Children’s Mercy Kansas City, 2Department of Pediatrics, University of Missouri-Kansas City School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wiele genów o podwyższonej regulacji stymuluje migrację i inwazję komórek nowotworowych, co prowadzi do złych rokowań. Określenie, które geny regulują migrację i inwazję komórek nowotworowych, ma kluczowe znaczenie. Protokół ten przedstawia metodę badania wpływu zwiększonej ekspresji genu na migrację i inwazję komórek nowotworowych w czasie rzeczywistym.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórki nowotworowe są bardzo ruchliwe i inwazyjne oraz wykazują zmienione wzorce ekspresji genów. Wiedza o tym, w jaki sposób zmiany w ekspresji genów regulują migrację i inwazję komórek nowotworowych, jest niezbędna do zrozumienia mechanizmów infiltracji komórek nowotworowych do sąsiednich zdrowych tkanek i przerzutów. Wcześniej wykazano, że knockdown genów, a następnie oparty na impedancji pomiar w czasie rzeczywistym migracji i inwazji komórek nowotworowych umożliwia identyfikację genów wymaganych do migracji i inwazji komórek nowotworowych. W ostatnim czasie szczepionki mRNA przeciwko SARS-CoV-2 zwiększyły zainteresowanie wykorzystaniem syntetycznego mRNA do celów terapeutycznych. W tym przypadku metoda wykorzystująca syntetyczne mRNA została zmieniona w celu zbadania wpływu nadekspresji genów na migrację i inwazję komórek nowotworowych. Badanie to pokazuje, że zwiększona ekspresja genów za pomocą syntetycznej transfekcji mRNA, a następnie pomiar w czasie rzeczywistym oparty na impedancji, może pomóc w identyfikacji genów, które stymulują migrację i inwazję komórek nowotworowych. Niniejsza praca metodyczna zawiera ważne szczegóły dotyczące procedur badania wpływu zmienionej ekspresji genów na migrację i inwazję komórek nowotworowych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ruchliwość komórek nowotworowych odgrywa kluczową rolę w przerzutach1,2. Rozprzestrzenianie się komórek nowotworowych do sąsiednich i odległych zdrowych tkanek utrudnia leczenie raka i przyczynia się do nawrotów3,4. Dlatego tak ważne jest zrozumienie mechanizmów ruchliwości komórek nowotworowych i opracowanie odpowiednich strategii terapeutycznych. Ponieważ wiele komórek nowotworowych ma zmienione profile ekspresji genów, ważne jest, aby zrozumieć, które zmiany w profilu ekspresji genów prowadzą do zmienionej ruchliwości komórek nowotworowych5,6.

Opracowano kilka testów do pomiaru migracji komórek in vitro. Niektóre testy dostarczają tylko ograniczonych informacji, ponieważ pozwalają na pomiary tylko w określonych punktach czasowych, podczas gdy inne oferują wyczerpujące informacje na temat ruchliwości komórek nowotworowych w czasie rzeczywistym7. Chociaż wiele z tych testów ruchliwości komórek może dostarczyć wyników ilościowych w danym czasie lub punkcie końcowym, nie dostarczają one wystarczająco szczegółowych informacji na temat dynamicznych zmian w tempie migracji komórek w okresie eksperymentalnym. Ponadto badanie potencjalnych zmian w szybkości migracji komórek może być trudne w zależności od projektu eksperymentalnego, typów komórek i liczby komórek. Co więcej, efekty nieskomplikowanych zabiegów mogą być badane za pomocą prostej kwantyfikacji tradycyjnych testów ruchliwości, ale bardziej wyrafinowana kwantyfikacja może być wymagana do badania złożonych efektów różnych terapii skojarzonych8.

Opracowano przyrząd do monitorowania prądu elektrycznego na dnie płytki mikromiareczkowej pokrytej mikroelektrodami9. Przyleganie komórek do powierzchni studzienki utrudnia przepływ elektronów, a impedancja koreluje z ilościowym i jakościowym wiązaniem komórek. Obecność mikroelektrod na dnie studni pozwala na pomiar adhezji, rozprzestrzeniania się i proliferacji komórek. Obecność mikroelektrod pod mikroporowatą membraną górnej komory pozwala na pomiar migracji komórek i inwazji do dolnej komory, przy czym górna komora jest pokryta białkami macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM), aby umożliwić inwazję10.

Poprzednio wykazano, że oparte na impedancji pomiary migracji i inwazji komórek nowotworowych w czasie rzeczywistym dostarczają danych w czasie rzeczywistym podczas całego eksperymentu, a także natychmiastowych porównań i kwantyfikacji w różnych warunkach eksperymentalnych11. W artykule dotyczącym tej metody wywołano knockdown genów w celu zbadania roli białek będących przedmiotem zainteresowania w migracji i inwazji komórek nowotworowych. Ponieważ pełnoobjawowy efekt knockdown genu w testowanych warunkach eksperymentalnych trwał 3-4 dni po elektroporacji z małymi interferującymi RNA (siRNA)8, komórki zostały ponownie posiane po elektroporacji i ponownie zebrane 3 dni później w celu opartego na impedancji pomiaru migracji i inwazji komórek nowotworowych w czasie rzeczywistym.

CT10 regulator kinazy (Crk) i Crk-like (CrkL) to białka adaptorowe, które pośredniczą w interakcjach białko-białko poniżej różnych szlaków kinazy receptorowej czynnika wzrostu i niereceptorowej kinazy tyrozynowej 12. Podwyższony poziom białek Crk i CrkL przyczynia się do złego rokowania w kilku nowotworach u ludzi, w tym glejaku13. Nie jest jednak jasne, w jaki sposób podwyższony poziom białek Crk i CrkL prowadzi do złego rokowania. Dlatego ważne jest, aby określić wpływ nadekspresji Crk i CrkL na funkcje komórek nowotworowych. Wcześniej przeprowadzono badanie nokaucji genów, aby wykazać, że endogenne poziomy białek Crk i CrkL są wymagane do migracji i inwazji komórek glejaka8. W tym przypadku opracowano zmodyfikowany system testów, aby zająć się wpływem nadekspresji Crk i CrkL na migrację i inwazję komórek nowotworowych.

Ostatnio, synteza mRNA in vitro i jej zastosowania terapeutyczne przyciągnęły ponownie uwagę ze względu na rozwój szczepionek mRNA przeciwko SARS-CoV-2 (recenzowane przez Verbeke et al.14). Ponadto poczyniono niezwykłe postępy w stosowaniu syntetycznego mRNA w leczeniu nowotworów i innych chorób15,16. Elektroporacja komórek jest skuteczną metodą dostarczania syntetycznego mRNA i indukowania przejściowych modyfikacji genetycznych (przejrzane przez Campillo-Davo i wsp.17), a zastosowanie syntetycznego mRNA umożliwia szybką i wydajną ekspresję genów w unieśmiertelnionych fibroblastach18. W tym artykule metodycznym połączono nadekspresję genów przy użyciu syntetycznego mRNA z analizami komórek w czasie rzeczywistym w celu zbadania migracji i inwazji komórek nowotworowych. Jednak schemat eksperymentalny stosowany dla siRNA nie działa z syntetyczną transfekcją mRNA, ponieważ poziom białek egzogennych gwałtownie wzrasta i stopniowo spada po transfekcji syntetycznego mRNA18. W związku z tym metoda została zmodyfikowana w celu przeprowadzenia analizy migracji i inwazji komórek w czasie rzeczywistym zaraz po transfekcji bez dodatkowej hodowli komórek.

Ten artykuł o metodzie pokazuje, że połączenie pomiarów w czasie rzeczywistym opartych na impedancji z transfekcją komórek nowotworowych za pomocą syntetycznych mRNA zapewnia szybką i wszechstronną analizę wpływu regulacji w górę genów na migrację i inwazję komórek nowotworowych. W artykule opisano szczegółowe procedury pomiaru, w jaki sposób nadekspresja Crk i CrkL wpływa na migrację i inwazję komórek glejaka. Badając zależny od stężenia wpływ syntetycznego mRNA na migrację komórek nowotworowych, artykuł jasno opisuje, w jaki sposób wzrost poziomu białka stymuluje migrację komórek nowotworowych. Ponadto przedstawiono podejście polegające na różnicowaniu stężenia żelu ECM w celu oceny wpływu zmian w ekspresji genów na inwazję komórek nowotworowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Synteza mRNA

UWAGA: Do syntezy mRNA, wszystkie odczynniki i sprzęt muszą być specjalnie poddane obróbce, aby dezaktywować RNazy przed użyciem. Szczegółowe informacje na temat wszystkich materiałów, przyrządów i odczynników użytych w tym protokole można znaleźć w Tabeli Materiałów.

  1. Linearyzacja DNA
    UWAGA: Mysie cDNA CrkI i CrkL zostały sklonowane do wektora ekspresyjnego pFLAG-CMV-5a w celu dodania znacznika epitopu FLAG na C-końcu i subklonowane do wektora pcDNA3.1/myc-His w celu włączenia promotora T7, jak wcześniej opisano18,19.
    1. Dodać 10 μl 10x buforu reakcyjnego, 1,5 μl PmeI (10 000 jednostek/ml) i 10 μg plazmidowego DNA do probówki mikrowirówkowej, aby zlinearyzować plazmidowe DNA enzymem restrykcyjnym. Dodać wodę wolną od nukleaz, aby doprowadzić objętość reakcji do 100 μl.
    2. Wymieszać przez stukanie, odwirować w dół i inkubować mieszaninę reakcyjną w temperaturze 37 °C przez noc.
    3. Odwirować i dodać 5 μl 10% dodecylosiarczanu sodu (SDS) i 1 μl proteinazy K (20 mg/ml, stopień RNA) do mieszaniny reakcyjnej. Mieszać przez stukanie, odwirować i inkubować w temperaturze 50 °C przez 30 minut.
    4. Pod wyciągiem dodać 100 μl dolnej fazy fenolu:chloroformu:alkoholu izoamylowego do mieszaniny reakcji plazmidowej w celu ekstrakcji. Wirować, a następnie odwirowywać przy 18 800 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Przenieś górną fazę do nowej rurki.
    5. Powtórzyć krok 1.1.4 z chloroformem: alkoholem izoamylowym w stosunku 24:1.
    6. W nowej probówce doprowadzić objętość reakcji do 300 μl, dodając 200 μl wody wolnej od nukleaz, a następnie dodać 30 μl 3 M octanu sodu i 600 μl 100% etanolu.
    7. Wymieszać przez wirowanie, a następnie umieścić w temperaturze -20 °C na 30-60 minut w celu wytrącenia etanolu DNA.
    8. Wirować przy 18 800 × g przez 20 minut w temperaturze 4 °C, odrzucić sklarowany osad i przepłukać osad 1 ml 70% etanolu. Powtarzać wirowanie przez 10 minut, a następnie całkowicie usunąć supernatant.
    9. Suszyć z otwartą nakrętką przez 2 minuty, dodać 30 μl wody wolnej od nukleaz i ponownie zawiesić osad DNA.
    10. Oznaczyć stężenie DNA za pomocą spektrofotometru.
    11. Sprawdź rozmiar i ilość zlinearyzowanego DNA za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym.
  2. Synteza RNA z wykorzystaniem polimerazy RNA T7
    1. Dodaj po 2 μl 10-krotnego buforu transkrypcyjnego, ATP, GTP, UTP, CTP i T7 oraz 1 μg zlinearyzowanego DNA do probówki mikrowirówkowej. Dodaj wodę wolną od nukleaz, aby doprowadzić objętość reakcji do 20 μl.
    2. Mieszać przez stukanie, odwirować i inkubować mieszaninę reakcyjną w temperaturze 37 °C przez 2 godziny w celu syntezy RNA.
    3. Odwirować, dodać 1 μl DNazy (2 U/μL) i inkubować w temperaturze 37 °C przez 15 minut w celu usunięcia matrycy DNA.
  3. Wytrącanie RNA chlorkiem litu
    1. Dodać 10 μl chlorku litu (7,5 M) do mieszaniny reakcyjnej. Mieszaninę reakcyjną mieszać przez stukanie, odwirować i inkubować w temperaturze -20 °C przez 30 minut.
    2. Odwirować przy 18 800 × g przez 20 minut w temperaturze 4 °C, odrzucić supernatant i przepłukać osad 500 μl 70% etanolu. Powtarzać wirowanie przez 10 minut, a następnie całkowicie usunąć supernatant.
    3. Wysuszyć z otwartą nakrętką przez 2 minuty, dodać 30 μl wody wolnej od nukleaz i ponownie zawiesić osad RNA.
  4. Ograniczenie
    1. Podgrzewać próbkę RNA w temperaturze 65 °C przez 10 minut, a następnie umieścić ją na lodzie w celu schłodzenia.
    2. Dodaj po 5 μl 10x buforu zamykającego, 10 mM GTP i 1 mM (10x) S-adenozylometioniny (SAM), po 2 μl mieszaniny enzymów cappingujących i mieszaniny enzymów O-metylotransferazy oraz 1,25 μl inhibitora RNazy. Wymieszać przez stukanie, odwirować i inkubować mieszaninę reakcyjną w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
  5. Ogony z poli(A)
    1. Odwiruj próbkę, a następnie dodaj 6 μl wody wolnej od nukleaz, 20 μl 5x buforu E-PAP, 10 μl 25 mM MnCl2, 10 μl 10 mM ATP i 4 μl enzymu ogonowego poli(A) E-PAP. Mieszać przez stukanie, odwirować i inkubować mieszaninę reakcyjną w temperaturze 37 °C przez 2 godziny.
  6. Wytrącanie chlorku litu i oznaczanie ilościowe syntetycznego mRNA
    1. Dodać 50 μl chlorku litu (7,5 M) i przeprowadzić wytrącanie chlorku litu zgodnie z opisem w krokach 1.3.1-1.3.3.
    2. Zmierz stężenie mRNA za pomocą spektrofotometru.
    3. Sprawdź wielkość i ilość mRNA za pomocą elektroforezy żelowej z formaldehydem (1%-2%), agarozą (1%).

2. Żelowa powłoka macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) na płytkach inwazji i migracji komórek (CIM)

UWAGA: Płytka do inwazji i migracji komórek (CIM) to komercyjnie produkowana 16-dołkowa płytka do analizy komórek w czasie rzeczywistym opartej na impedancji. W teście inwazji komórkowej pokryj płytki CIM żelem ECM, jak opisano wcześniej, ale z pewnymi modyfikacjami11.

  1. Wyjąć z zamrażarki porcję bulionu żelowego ECM i przechowywać go na lodzie.
  2. Rozcieńczyć żel ECM (10 mg/ml) do stężenia roboczego (100 μg/ml) przez zmieszanie 990 μl zmodyfikowanego podłoża Eagle (DMEM) firmy Dulbecco (bez surowicy i antybiotyków) z 10 μl żelu ECM w probówce do mikrowirówki. Wymieszać delikatnie pipetując.
  3. Dodać 60 μl rozcieńczonego żelu ECM do każdego z 16 dołków górnej komory płytki CIM. Zastosuj metodę odwrotnego pipetowania, unikając pęcherzyków powietrza20,21.
    UWAGA: Zoptymalizuj stężenie żelu ECM dla każdej linii komórkowej. W przypadku linii komórkowych glejaka do optymalizacji użyto żelu ECM od 0,1 μg/μL do 1 μg/μL.
  4. Umieścić górną komorę płytki CIM ze zdjętą pokrywą płytki na ochronnym arkuszu z tworzywa sztucznego wewnątrz inkubatora CO2 na około 4 godziny, aby utworzyć warstwę żelu.
    UWAGA: Podczas powlekania płytki CIM żelem ECM, elektrody górnej komory płytki CIM nie powinny mieć bezpośredniego kontaktu z rękami eksperymentatora ani z powierzchniami sprzętu, w tym z komorą bezpieczeństwa biologicznego lub inkubatorem CO2 .

3. Przygotowanie komórek nowotworowych

UWAGA: Wszystkie materiały do hodowli komórkowych muszą być sterylne. Zbierz i poddaj elektroporację komórkom nowotworowym w komorze bezpieczeństwa biologicznego przy użyciu odpowiedniego sprzętu ochrony osobistej (PPE), jak opisano wcześniej, ale z pewnymi modyfikacjami11.

  1. Hodowla komórek nowotworowych
    1. Hodowla komórek U-118MG w 10 ml DMEM zawierającego 5% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 1% antybiotyków na naczynie do hodowli tkanek polistyrenowych o wymiarach 100 mm x 20 mm w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 (warunek hodowli).
  2. Zubożenie komórek nowotworowych w surowicy
    UWAGA: Narażenie komórek na chemoatraktanty obecne w FBS musi być zminimalizowane przed testami migracji i inwazji komórek poprzez zastosowanie wysokiego stężenia FBS.
    1. Usuń starą pożywkę i dodaj 10 ml wstępnie podgrzanego DMEM zawierającego 0,5% FBS i 1% antybiotyków na miskę (pożywka o niskiej surowicy).
    2. Powtórz krok 3.2.1.
    3. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5% CO2 przez 4 godziny lub dłużej.
  3. Pobieranie komórek nowotworowych
    1. Usuń starą pożywkę, dodaj 8 ml wstępnie podgrzanej soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (DPBS) Dulbecco na naczynie, wyjmij DPBS, dodaj podgrzaną 0,05% trypsynę-EDTA (2 ml / miskę), aby pokryć powierzchnię i inkubować w inkubatorze CO2 przez 30 s.
    2. Ostrożnie odessać trypsynę-EDTA, dodać pożywkę o niskiej surowicy (7 ml / talerz), a następnie zebrać komórki do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml lub 15 ml.
    3. Podziel niewielką objętość komórek i użyj ręcznego automatycznego licznika komórek do zliczenia komórek.
    4. Oblicz całkowitą liczbę komórek i wymaganą objętość dla 10 000 komórek/μl.
    5. Odwirować komórki, odwirowując je w stężeniu 100 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej, odessać supernatant, dodać obliczoną objętość DMEM zawierającą 0,5% FBS (bez antybiotyków) i delikatnie zawiesić osad komórkowy.
    6. Przenieść 110 μl zawiesiny komórkowej, zawierającej 1,1 miliona komórek, do probówki mikrowirówkowej dla każdego zabiegu.
    7. Powtórzyć krok 3.3.6, aby przenieść komórki do czterech probówek do mikrowirówek w celu przeprowadzenia czterech różnych zabiegów.
      UWAGA: Płytka CIM ma w sumie 16 dołków. Zaprojektuj cztery różne zabiegi do porównania, tak aby do każdego zabiegu można było przypisać cztery dołki płytki CIM. Wykorzystaj elektroporowane komórki do następujących eksperymentów: analizy western blot (0,3 miliona komórek na 35 mm naczynie do hodowli tkankowej), cztery dołki testów migracji komórek w czasie rzeczywistym (0,1 miliona komórek / studzienkę) i cztery dołki testów inwazji komórek w czasie rzeczywistym (0,1 miliona komórek / studzienkę) dla każdego zabiegu. Dostosuj liczbę ogniw, które muszą zostać poddane elektroporacji, jeśli zmieni się projekt eksperymentu.

4. Elektroporacja komórek nowotworowych

  1. Aby usunąć pożywkę, dodać 1 ml DPBS do zawiesiny komórek w każdej probówce, odwirować zawiesinę komórek trzy razy przez 10 s za każdym razem, obracając probówkę o 180° co 10 s za pomocą mini wirówki i usunąć supernatant za pomocą mikropipety.
    UWAGA: Ważne jest, aby uformować zwartą, ale łatwą do ponownego zawieszenia osadę komórkową.
  2. Dodać 110 μl buforu do respensji R do osadu komórkowego, aby uzyskać 0,1 miliona komórek w 10 μl.
  3. Dodaj syntetyczne mRNA do osadu komórkowego, aby uzyskać stężenie 0,2-20 ng / μl w zależności od pożądanego poziomu ekspresji. Delikatnie wymieszać i ponownie zawiesić osad komórkowy, stukając lub delikatnie pipetując.
    UWAGA: Użyj różnych stężeń syntetycznego mRNA, zbadaj ekspresję białka za pomocą analizy western blot i określ stężenie syntetycznego mRNA, które prowadzi do pożądanego poziomu ekspresji, w celu zbadania specyficznej korelacji między ekspresją białka a efektami biologicznymi.
  4. Elektroporować 10 μl zawiesiny ogniwa za pomocą systemu elektroporacji pod napięciem 1 350 V przez 10 ms za każdym razem trzema impulsami.
  5. Przenieś elektroporowane ogniwa do nowej probówki mikrowirówkowej z 1,1 ml DMEM zawierającego 0,5% FBS.
  6. Powtarzaj elektroporację, aż reszta zawiesiny ogniwa zostanie poddana elektroporacji. Połącz elektroporowane ogniwa w probówce mikrowirówkowej, aby uzyskać 1,1 miliona komórek w 1,1 ml.
    UWAGA: Zarówno końcówki do elektroporacji 100 μl, jak i 10 μl mogą być używane do elektroporacji dużej objętości ogniw, ale końcówki do elektroporacji dla 10 μl i 100 μl są zawarte w dwóch oddzielnych zestawach i należy je zakupić osobno. W obu zestawach znajduje się bufor do ponownego zawieszenia R.
  7. Po wykonaniu wszystkich odpowiednich elektroporacji delikatnie ponownie zawiesić połączone ogniwa.
  8. Umieść 0,3 miliona komórek w naczyniu do hodowli tkankowej z polistyrenu o wymiarach 35 mm x 10 mm z 2 ml DMEM zawierającego 5% FBS i hoduj komórki przez 1 dzień w warunkach hodowli w celu przygotowania całkowitego lizatu komórkowego i analiz western blot.
  9. Pozostałe elektroporowane ogniwa należy przechowywać w temperaturze pokojowej do czasu, aż system analizy ogniw w czasie rzeczywistym będzie gotowy.

5. Konfiguracja analizatora komórek w czasie rzeczywistym, programu i płytek CIM

UWAGA: Przygotuj analizator komórek w czasie rzeczywistym i dwie płytki CIM, jak wcześniej opisano11.

  1. Równoważenie analizatora komórek w czasie rzeczywistym
    1. Przenieś analizator komórek w czasie rzeczywistym do inkubatora CO2 na kilka godzin przed użyciem, aby zrównoważyć system w warunkach hodowli.
  2. Konfiguracja programu analitycznego
    1. Otwórz program do analizy, klikając dwukrotnie ikonę oprogramowania do analizy komórek w czasie rzeczywistym na pulpicie.
    2. Po otwarciu opcji Default Experiment Pattern Setup (Ustawienia domyślnego wzorca eksperymentu) wybierz opcję uruchamiania trzech eksperymentów oddzielnie.
      UWAGA: Każda kołyska ma osobne okienko. Istnieją różne zakładki, w których można ustawić interwał i czas trwania pomiaru, analizę danych i inne warunki eksperymentalne.
    3. Otwórz każdą kołyskę, klikając zakładkę Numer.
    4. Kliknij kartę Notatki z eksperymentu, wybierz folder, w którym zostaną zapisane dane, a następnie wprowadź nazwę eksperymentu.
    5. Kliknij kartę Układ, ustaw poczwórne studzienki dla każdego warunku uzdatniania, wybierając cztery studzienki jednocześnie i wprowadzając informacje o próbce, a następnie kliknij Zastosuj.
    6. Kliknij zakładkę Harmonogram | Dodaj krok, aby skonfigurować dwuetapowy tryb pomiarów impedancji ogniwa. Następnie kliknij Zastosuj, aby skonfigurować pierwszy krok.
    7. Kliknij ponownie Dodaj krok, wprowadź 10 minut jako interwał i 48 godzin jako czas trwania migracji i inwazji, a następnie kliknij Zastosuj, aby skonfigurować drugi krok.
      UWAGA: Pierwszy krok polega na jednorazowym pomiarze bazowym (jedno przemiatanie w odstępie 1 minuty). Drugi etap mierzy impedancję ogniwa na potrzeby eksperymentu (na przykład 289 przemiatania w 10-minutowym odstępie przez 48 godzin) w kołysce. Dostosuj interwał i czas trwania w zależności od projektu eksperymentalnego.
    8. Przejdź do następnej stacji dokującej i skonfiguruj ją, powtarzając kroki 5.2.3-5.2.7.
  3. Przygotowanie płyt CIM
    1. Na godzinę przed rozpoczęciem pomiaru impedancji ogniwa napełnij studzienki dolnej komory płytki CIM 160 μl DMEM zawierającego 10% surowicy lub innych chemoatraktantów.
    2. Górną komorę, w której znajdują się studzienki pokryte żelem ECM (do inwazji) lub studzienki niepowlekane (do migracji), należy połączyć z dolną komorą.
    3. Dodać 50 μl pożywki o niskiej surowicy do studzienek górnej komory płytki CIM w celu przeprowadzenia testu migracji komórek i umieścić płytkę CIM w kołysce systemu.
    4. Kliknij kartę Wiadomość i upewnij się, że wyświetlany jest komunikat Połączenia ok. Płyta CIM jest teraz gotowa do eksperymentu.
    5. Zmontowaną płytkę CIM należy wstępnie inkubować w inkubatorze CO2 przez 30-60 minut przed analizą komórek w czasie rzeczywistym, aby zaaklimatyzować płytkę CIM do warunków hodowli.

6. Analiza komórek w czasie rzeczywistym i eksport danych

UWAGA: Wykonaj odczyt linii bazowej, rozsiewanie komórek, pomiar impedancji komórek i eksport danych zgodnie z wcześniejszym opisem11.

  1. Odczyt bazowy
    UWAGA: Linię bazową należy odczytać po zaaklimatyzowaniu płytki CIM i przed dodaniem komórek do studzienek górnej komory.
    1. Kliknij przycisk Start dla każdej kołyski. Gdy pojawi się okno Zapisz jako, zapisz plik eksperymentalny, aby wykonać odczyt linii bazowej.
  2. Wysiewanie komórek
    1. Wyjmij płytkę CIM z kołyski i umieść ją w szafie bezpieczeństwa biologicznego na uchwycie płytki.
    2. Dodaj 100 μl (zawierających 100 000 ogniw) elektroporowanych ogniw do studzienek górnej komory płytki CIM zgodnie z programem w jednostce sterującej. Zastosuj metodę odwróconego pipetowania, unikając pęcherzyków powietrza.
    3. Pozostaw płytkę CIM pod szafą bezpieczeństwa biologicznego na 30 minut w temperaturze pokojowej, aby upewnić się, że komórki równomiernie rozprowadzają się na dnie studzienki.
  3. Pomiar impedancji ogniwa
    1. Przenieś w pełni zmontowaną płytkę CIM z powrotem do odpowiedniej kołyski. Kliknij przycisk Start podstawki, aby rozpocząć pomiar impedancji ogniwa w drugim kroku.
    2. Kliknij kartę Wykres, a następnie kliknij przycisk Dodaj wszystko i zaznacz pola Średnia i STD DEV, aby wizualizować dane w czasie rzeczywistym.
      UWAGA: Domyślną opcją kreślenia jest Czas dla osi x i Indeks komórki dla osi y. Sekcja Wybór wykresu umożliwia użytkownikowi wybranie alternatywnych opcji dla osi y: Znormalizowany indeks komórki lub Indeks komórki delta. Po wykonaniu ostatniego zamiatania eksperyment zostaje zakończony, a wyniki są automatycznie zapisywane.
  4. Eksport danych do analizy
    1. Kliknij zakładkę Wykres i zaznacz pola Średnia i STD DEV, aby skopiować dane dla każdego dołka z osobna.
    2. Kliknij prawym przyciskiem myszy obszar kreślenia i wybierz polecenie Kopiuj dane w formacie listy.
    3. Otwórz pusty plik arkusza kalkulacyjnego, wklej dane, a następnie zapisz plik.
    4. Wróć do programu analitycznego, kliknij zakładkę Płyta dla każdej kołyski i wybierz opcję Zwolnij, aby zamknąć eksperyment dla kołyski.
    5. Wróć do pliku arkusza kalkulacyjnego i dostosuj czas nieprzetworzonych danych tak, aby czas rozpoczęcia w drugim kroku stał się rzeczywistym czasem rozpoczęcia pomiaru.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Białka Crk i CrkL odgrywają ważną rolę w ruchliwości wielu typów komórek, w tym neuronów22, limfocyty T23, fibroblasts18,19 oraz różne komórki nowotworowe13. Ponieważ donoszono, że białka Crk i CrkL są podwyższone w glejaku24,25,26, w tej pracy badano wpływ nadekspresji CrkI, wariantu splicingu Crk, ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Migracja i inwazja są ważnymi cechami komórek nowotworowych. Pomiar ruchliwości komórek nowotworowych i zrozumienie podstawowego mechanizmu, który kontroluje ruchliwość komórek nowotworowych, dostarcza krytycznych informacji na temat interwencji terapeutycznych 2,27. Opracowano kilka metod badania migracji komórek7. Test gojenia się ran za pomocą zadrapań lub wkładek hodowlanych jest prostą i często stosowaną metodą, która zapewnia kontras...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują Medical Writing Center w Children's Mercy Kansas City za edycję tego rękopisu. Praca ta była wspierana przez Natalie's A.R.T. Foundation (do T.P.) oraz przez grant MCA Partners Advisory Board z Children's Mercy Hospital (CMH) i University of Kansas Cancer Center (KUCC) (dla T.P.).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
AlphaImager HPProteinSimple92-13823-00System obrazowania w żelu agarozowym
&przeciwciało alfa-tubulinySigmaT9026Służy do wykrywania białka alfa-tubuliny (rozcieńczenie 1:3,000)
Płytka CIM 16Agilent Technologies, Inc5665825001Płytki do inwazji i migracji komórek
Przeciwciało CrkBD Biosciences610035Służy do wykrywania białek CrkI i CrkII (rozcieńczenie 1:1,500)
Przeciwciało CrkLSanta Cruzsc-319Służy do wykrywania białka CrkL (rozcieńczenie 1:1,500)
Dulbecco' s Zmodyfikowany Orzeł" s Pożywka (DMEM)ATCC302002Pożywka do hodowli komórkowych
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami Dulbecco (DPBS)Corning21-031-CVBufor stosowany do mycia komórek
Surowica bydlęca płodu (FBS)HyklonSH30910.03Suplement pożywki hodowlanej
Inkubator CO2 Heracell VIOS 160i Inkubator CO2Thermo Scientific51030285
IRDye 800CW koza przeciwciało drugorzędowe anty-mysie IgGLi-Cor926-32210Przeciwciało drugorzędowe do analizy Western blot (rozcieńczenie 1:10 000)
IRDye 800CW kozie przeciwciało anty-królicze IgG drugorzędoweLi-Cor926-32211Przeciwciało drugorzędowe do analizy Western blot  (Rozcieńczenie 1:10 000)
Chlorek litu InvitrogenAM9480Używany do wytrącania RNA
Matrigel Matrigel MatrixCorning354234Żel macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM)
Zestaw do transkrypcji MEGAscript T7InvitrogenAM1334Używany do syntezy RNA
Markery Millennium RNAInvitrogenAM7150Używany do elektroforezy w żelu agarozowym formaldehydowym
Mini wirówkaISC BioExpressC1301P-ISCSłuży do rozkręcania komórek
Mózg myszy QUICK-Clone cDNATaKaRa637301Źródło genów (insertów) do klonowania
NanoQuantTecanM200PROSystem kwantyfikacji kwasów nukleinowych
System elektroporacji neonowej  ThermoFisher ScientificMPK5000System do elektroporacji1
System transfekcji neonowej 10 µ Zestaw LThermoFisher ScientificMPK1025Zestaw do elektroporacji
System transfekcji neonowej 100 µ Zestaw LThermoFisher ScientificMPK10096Zestaw do elektroporacji
NorthernMax bufor żelowy denaturującyInvitrogenAM8676Używany do elektroforezy w żelu agarozowym formaldehydowym
NorthernMax Barwnik obciążeniowyformaldehydowy InvitrogenAM8552Używany do elektroforezy w żelu agarozowym formaldehydowym
Bufor biegowy NorthernMaxInvitrogenAM8671Używany do elektroforezy w żelu agarozowym formaldehydowym
Woda wolna od nukleazTeknovaW3331Używany do różnych reakcji podczas syntezy mRNA
Odyssey CLx ImagerLi-CorImager do analizy Western blot
pcDNA3.1/myc-HisInvitrogenV80020Wektor, do którego sklonowano inserty (mysie cDNA CrkI i CrkL)
pFLAG-CMV-5aMillipore SigmaE7523Źródło znacznika epitopu LGR
Fenol:chloroform:alkohol izoamylowy SigmaP2069Używany do ekstrakcji DNA
PmeINew England BioLabsR0560LUżywany do linearyzacji plazmidów do syntezy mRNA
Zestaw do ogonów poli(A)InvitrogenAM1350Używany do reakcji ogona poli(A)
Naczynie do hodowli tkankowej z polistyrenu (styl 100 x 20 mm)Corning353003Używany do hodowli komórek przed transfekcją
Polistyrenowe naczynie do hodowli tkanek (35 x 10 mm)Corning353001Służy do hodowli transfekowanych komórek
Proteinaza KInvitrogen25530049Służy do usuwania białka w mieszaninie reakcyjnej
Oczyszczacz Axiom Klasa II, typ C1Labconco Corporation304410001Komora bezpieczeństwa biologicznego do sterylnego obchodzenia się z komórkami
Bufor do ponownego zawieszania RThermoFisher ScientificBufor wchodzący w skład zestawów do elektroporacji, MPK1025 i MPK10096. Bufor służy do regeneracji ogniw przed elektroporacją, a jego skład jest informacją zastrzeżoną.
RNaseZapInvitrogenAM9780Roztwór do dekontaminacji RNA
BerłoMilliporeC85360Ręczny automatyczny licznik komórek 
Zestaw 2'-O-metylotransferazyScriptCap CellscriptC-SCMT0625Używany do reakcji cappingu
System capCap m7GCellscriptC-SCCE0625Służy do reakcji capping
Roztwór dodecylosiarczanu soduInvitrogen15553-035Detergent stosowany w reakcji proteinazy K
Wirówka Sorvall Legend XTThermo Scientific75004532Wirówka stołowa do odwirowania komórek
Trypsin-EDTAGibco25300-054Służy do dysocjacji komórek
U-118MG ATCCHTB15Adherentna linia komórkowa pochodząca od ludzkiego pacjenta z glejakiem
Przeciwciało WinkulinySigmaV9131Służy do wykrywania białka winkuliny (rozcieńczenie 1:100 000)
xCELLigence RTCA DPAgilent Technologies, Inc380601050Instrument używany do analizy
komórek w czasie rzeczywistym1Parametry elektroporacji oraz inne powiązane informacje dla różnych linii komórkowych są dostępne na stronie internetowej producenta (https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cell-culture/transfection/neon-transfection-system/neon-transfection-system-cell-line-data.html?).

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Palmer, T. D., Ashby, W. J., Lewis, J. D., Zijlstra, A. Targeting tumor cell motility to prevent metastasis. Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (8), 568-581 (2011).
  2. Eccles, S. A., Box, C., Court, W. Cell migration/invasion assays and their application in cancer drug discovery. Biotechnology Annual Review. 11, 391-421 (2005).
  3. Kluiver, T. A., Alieva, M., van Vuurden, D. G., Wehrens, E. J., Rios, A. C. Invaders exposed: Understanding and targeting tumor cell invasion in diffuse intrinsic pontine glioma. Frontiers in Oncology. 10, 92(2020).
  4. Xie, Q., Mittal, S., Berens, M. E. Targeting adaptive glioblastoma: An overview of proliferation and invasion. Neuro-Oncology. 16 (12), 1575-1584 (2014).
  5. Wee, Y., Wang, T., Liu, Y., Li, X., Zhao, M. A pan-cancer study of copy number gain and up-regulation in human oncogenes. Life Sciences. 211, 206-214 (2018).
  6. Zhao, M., Liu, Y., Qu, H. Expression of epithelial-mesenchymal transition-related genes increases with copy number in multiple cancer types. Oncotarget. 7 (17), 24688-24699 (2016).
  7. Pijuan, J., et al. In vitro cell migration, invasion, and adhesion assays: From cell imaging to data analysis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 107(2019).
  8. Park, T., Large, N., Curran, T. Quantitative assessment of glioblastoma phenotypes in vitro establishes cell migration as a robust readout of Crk and CrkL activity. The Journal of Biological Chemistry. 296, 100390(2021).
  9. Urcan, E., et al. Real-time xCELLigence impedance analysis of the cytotoxicity of dental composite components on human gingival fibroblasts. Dental Materials. 26 (1), 51-58 (2010).
  10. Limame, R., et al. Comparative analysis of dynamic cell viability, migration and invasion assessments by novel real-time technology and classic endpoint assays. PLoS One. 7 (10), e46536(2012).
  11. Mudduluru, G., Large, N., Park, T. Impedance-based real-time measurement of cancer cell migration and invasion. Journal of Visualized Experiments. (158), e60997(2020).
  12. Feller, S. M. Crk family adaptors-signalling complex formation and biological roles. Oncogene. 20 (44), 6348-6371 (2001).
  13. Park, T. Crk and CrkL as therapeutic targets for cancer treatment. Cells. 10 (4), 739(2021).
  14. Verbeke, R., Lentacker, I., De Smedt, S. C., Dewitte, H. The dawn of mRNA vaccines: The COVID-19 case. Journal of Controlled Release. 333, 511-520 (2021).
  15. Heine, A., Juranek, S., Brossart, P. Clinical and immunological effects of mRNA vaccines in malignant diseases. Molecular Cancer. 20 (1), 52(2021).
  16. Kwon, H., et al. Emergence of synthetic mRNA: In vitro synthesis of mRNA and its applications in regenerative medicine. Biomaterials. 156, 172-193 (2018).
  17. Campillo-Davo, D., et al. The ins and outs of messenger RNA electroporation for physical gene delivery in immune cell-based therapy. Pharmaceutics. 13 (3), 396(2021).
  18. Park, T., Koptyra, M., Curran, T. Fibroblast growth requires CT10 regulator of kinase (Crk) and Crk-like (CrkL). The Journal of Biological Chemistry. 291 (51), 26273-26290 (2016).
  19. Park, T. J., Curran, T. Essential roles of Crk and CrkL in fibroblast structure and motility. Oncogene. 33 (43), 5121-5132 (2014).
  20. Chou, P. P., Jaynes, P. K., King, B. P., Chapman, E., Bailey, J. L. Precision comparison between conventional (method-I) and reverse (method-Ii) pipetting. Clinical Chemistry. 30 (6), 958(1984).
  21. Pushparaj, P. N. Revisiting the micropipetting techniques in biomedical sciences: A fundamental prerequisite in good laboratory practice. Bioinformation. 16 (1), 8-12 (2020).
  22. Park, T. J., Curran, T. Crk and Crk-like play essential overlapping roles downstream of disabled-1 in the Reelin pathway. The Journal of Neuroscience. 28 (50), 13551-13562 (2008).
  23. Huang, Y., et al. CRK proteins selectively regulate T cell migration into inflamed tissues. The Journal of Clinical Investigation. 125 (3), 1019-1032 (2015).
  24. Wang, L., et al. Signaling adaptor protein Crk is indispensable for malignant feature of glioblastoma cell line KMG4. Biochemical and Biophysical Research Communications. 362 (4), 976-981 (2007).
  25. Kumar, S., et al. Reciprocal regulation of Abl kinase by Crk Y251 and Abi1 controls invasive phenotypes in glioblastoma. Oncotarget. 6 (35), 37792-37807 (2015).
  26. Kumar, S., et al. Crk tyrosine phosphorylation regulates PDGF-BB-inducible Src activation and breast tumorigenicity and metastasis. Molecular Cancer Research. 16 (1), 173-183 (2018).
  27. Raudenska, M., et al. Engine shutdown: Migrastatic strategies and prevention of metastases. Trends in Cancer. 9 (4), 293-308 (2023).
  28. Decaestecker, C., Debeir, O., Van Ham, P., Kiss, R. Can anti-migratory drugs be screened in vitro? A review of 2D and 3D assays for the quantitative analysis of cell migration. Medicinal Research Reviews. 27 (2), 149-176 (2007).
  29. Farasani, A., Darbre, P. D. Long-term exposure to triclosan increases migration and invasion of human breast epithelial cells in vitro. Journal of Applied Toxicology. 41 (7), 1115-1126 (2021).
  30. Hanusova, V., Skalova, L., Kralova, V., Matouskova, P. The effect of flubendazole on adhesion and migration in SW480 and SW620 colon cancer cells. Anti-Cancer Agents in Medicinal Chemistry. 18 (6), 837-846 (2018).
  31. Lago-Baameiro, N., et al. PARK7/DJ-1 inhibition decreases invasion and proliferation of uveal melanoma cells. Tumori. 109 (1), 47-53 (2023).
  32. Escalona, R. M., et al. Knock down of TIMP-2 by siRNA and CRISPR/Cas9 mediates diverse cellular reprogramming of metastasis and chemosensitivity in ovarian cancer. Cancer Cell International. 22 (1), 422(2022).
  33. Mosca, L., et al. Effects of S-adenosyl-L-methionine on the invasion and migration of head and neck squamous cancer cells and analysis of the underlying mechanisms. International Journal of Oncology. 56 (5), 1212-1224 (2020).
  34. Zhao, Q., et al. VEGI174 protein and its functional domain peptides exert antitumour effects on renal cell carcinoma. International Journal of Oncology. 54 (1), 390-398 (2019).
  35. Witte, D., et al. TGF-beta1-induced cell migration in pancreatic carcinoma cells is RAC1 and NOX4-dependent and requires RAC1 and NOX4-dependent activation of p38 MAPK. Oncology Reports. 38 (6), 3693-3701 (2017).
  36. Bui, L. C., et al. Regulation of aquaporin 3 expression by the AhR pathway is critical to cell migration. Toxicological Sciences. 149 (1), 158-166 (2016).
  37. Tsuji, K., et al. Effects of different cell-detaching methods on the viability and cell surface antigen expression of synovial mesenchymal stem cells. Cell Transplantation. 26 (6), 1089-1102 (2017).
  38. Frandsen, S. K., McNeil, A. K., Novak, I., McNeil, P. L., Gehl, J. Difference in membrane repair capacity between cancer cell lines and a normal cell line. The Journal of Membrane Biology. 249 (4), 569-576 (2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Inwazja kom rekanaliza kom rkowa w czasie rzeczywistympomiar impedancjielektroporacjanadekspresja genutest z elem ECMkom rki glejaka wielopostaciowegotest migracji kom rek

Powiązane artykuły