Ilościowy pomiar migracji i inwazji komórek nowotworowych w czasie rzeczywistym po transfekcji syntetycznego mRNA

Ruchliwość komórek nowotworowych odgrywa kluczową rolę w przerzutach^1,2. Rozprzestrzenianie się komórek nowotworowych do sąsiednich i odległych zdrowych tkanek utrudnia leczenie raka i przyczynia się do nawrotów^3,4. Dlatego tak ważne jest zrozumienie mechanizmów ruchliwości komórek nowotworowych i opracowanie odpowiednich strategii terapeutycznych. Ponieważ wiele komórek nowotworowych ma zmienione profile ekspresji genów, ważne jest, aby zrozumieć, które zmiany w profilu ekspresji genów prowadzą do zmienionej ruchliwości komórek nowotworowych^5,6.

Opracowano kilka testów do pomiaru migracji komórek in vitro. Niektóre testy dostarczają tylko ograniczonych informacji, ponieważ pozwalają na pomiary tylko w określonych punktach czasowych, podczas gdy inne oferują wyczerpujące informacje na temat ruchliwości komórek nowotworowych w czasie rzeczywistym⁷. Chociaż wiele z tych testów ruchliwości komórek może dostarczyć wyników ilościowych w danym czasie lub punkcie końcowym, nie dostarczają one wystarczająco szczegółowych informacji na temat dynamicznych zmian w tempie migracji komórek w okresie eksperymentalnym. Ponadto badanie potencjalnych zmian w szybkości migracji komórek może być trudne w zależności od projektu eksperymentalnego, typów komórek i liczby komórek. Co więcej, efekty nieskomplikowanych zabiegów mogą być badane za pomocą prostej kwantyfikacji tradycyjnych testów ruchliwości, ale bardziej wyrafinowana kwantyfikacja może być wymagana do badania złożonych efektów różnych terapii skojarzonych⁸.

Opracowano przyrząd do monitorowania prądu elektrycznego na dnie płytki mikromiareczkowej pokrytej mikroelektrodami⁹. Przyleganie komórek do powierzchni studzienki utrudnia przepływ elektronów, a impedancja koreluje z ilościowym i jakościowym wiązaniem komórek. Obecność mikroelektrod na dnie studni pozwala na pomiar adhezji, rozprzestrzeniania się i proliferacji komórek. Obecność mikroelektrod pod mikroporowatą membraną górnej komory pozwala na pomiar migracji komórek i inwazji do dolnej komory, przy czym górna komora jest pokryta białkami macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM), aby umożliwić inwazję¹⁰.

Poprzednio wykazano, że oparte na impedancji pomiary migracji i inwazji komórek nowotworowych w czasie rzeczywistym dostarczają danych w czasie rzeczywistym podczas całego eksperymentu, a także natychmiastowych porównań i kwantyfikacji w różnych warunkach eksperymentalnych¹¹. W artykule dotyczącym tej metody wywołano knockdown genów w celu zbadania roli białek będących przedmiotem zainteresowania w migracji i inwazji komórek nowotworowych. Ponieważ pełnoobjawowy efekt knockdown genu w testowanych warunkach eksperymentalnych trwał 3-4 dni po elektroporacji z małymi interferującymi RNA (siRNA)⁸, komórki zostały ponownie posiane po elektroporacji i ponownie zebrane 3 dni później w celu opartego na impedancji pomiaru migracji i inwazji komórek nowotworowych w czasie rzeczywistym.

CT10 regulator kinazy (Crk) i Crk-like (CrkL) to białka adaptorowe, które pośredniczą w interakcjach białko-białko poniżej różnych szlaków kinazy receptorowej czynnika wzrostu i niereceptorowej kinazy tyrozynowej ¹². Podwyższony poziom białek Crk i CrkL przyczynia się do złego rokowania w kilku nowotworach u ludzi, w tym glejaku¹³. Nie jest jednak jasne, w jaki sposób podwyższony poziom białek Crk i CrkL prowadzi do złego rokowania. Dlatego ważne jest, aby określić wpływ nadekspresji Crk i CrkL na funkcje komórek nowotworowych. Wcześniej przeprowadzono badanie nokaucji genów, aby wykazać, że endogenne poziomy białek Crk i CrkL są wymagane do migracji i inwazji komórek glejaka⁸. W tym przypadku opracowano zmodyfikowany system testów, aby zająć się wpływem nadekspresji Crk i CrkL na migrację i inwazję komórek nowotworowych.

Ostatnio, synteza mRNA in vitro i jej zastosowania terapeutyczne przyciągnęły ponownie uwagę ze względu na rozwój szczepionek mRNA przeciwko SARS-CoV-2 (recenzowane przez Verbeke et al.¹⁴). Ponadto poczyniono niezwykłe postępy w stosowaniu syntetycznego mRNA w leczeniu nowotworów i innych chorób^15,16. Elektroporacja komórek jest skuteczną metodą dostarczania syntetycznego mRNA i indukowania przejściowych modyfikacji genetycznych (przejrzane przez Campillo-Davo i wsp.¹⁷), a zastosowanie syntetycznego mRNA umożliwia szybką i wydajną ekspresję genów w unieśmiertelnionych fibroblastach¹⁸. W tym artykule metodycznym połączono nadekspresję genów przy użyciu syntetycznego mRNA z analizami komórek w czasie rzeczywistym w celu zbadania migracji i inwazji komórek nowotworowych. Jednak schemat eksperymentalny stosowany dla siRNA nie działa z syntetyczną transfekcją mRNA, ponieważ poziom białek egzogennych gwałtownie wzrasta i stopniowo spada po transfekcji syntetycznego mRNA¹⁸. W związku z tym metoda została zmodyfikowana w celu przeprowadzenia analizy migracji i inwazji komórek w czasie rzeczywistym zaraz po transfekcji bez dodatkowej hodowli komórek.

Ten artykuł o metodzie pokazuje, że połączenie pomiarów w czasie rzeczywistym opartych na impedancji z transfekcją komórek nowotworowych za pomocą syntetycznych mRNA zapewnia szybką i wszechstronną analizę wpływu regulacji w górę genów na migrację i inwazję komórek nowotworowych. W artykule opisano szczegółowe procedury pomiaru, w jaki sposób nadekspresja Crk i CrkL wpływa na migrację i inwazję komórek glejaka. Badając zależny od stężenia wpływ syntetycznego mRNA na migrację komórek nowotworowych, artykuł jasno opisuje, w jaki sposób wzrost poziomu białka stymuluje migrację komórek nowotworowych. Ponadto przedstawiono podejście polegające na różnicowaniu stężenia żelu ECM w celu oceny wpływu zmian w ekspresji genów na inwazję komórek nowotworowych.

1. Synteza mRNA

UWAGA: Do syntezy mRNA, wszystkie odczynniki i sprzęt muszą być specjalnie poddane obróbce, aby dezaktywować RNazy przed użyciem. Szczegółowe informacje na temat wszystkich materiałów, przyrządów i odczynników użytych w tym protokole można znaleźć w Tabeli Materiałów.

1. Linearyzacja DNA
   UWAGA: Mysie cDNA CrkI i CrkL zostały sklonowane do wektora ekspresyjnego pFLAG-CMV-5a w celu dodania znacznika epitopu FLAG na C-końcu i subklonowane do wektora pcDNA3.1/myc-His w celu włączenia promotora T7, jak wcześniej opisano^18,19.
   1. Dodać 10 μl 10x buforu reakcyjnego, 1,5 μl PmeI (10 000 jednostek/ml) i 10 μg plazmidowego DNA do probówki mikrowirówkowej, aby zlinearyzować plazmidowe DNA enzymem restrykcyjnym. Dodać wodę wolną od nukleaz, aby doprowadzić objętość reakcji do 100 μl.
   2. Wymieszać przez stukanie, odwirować w dół i inkubować mieszaninę reakcyjną w temperaturze 37 °C przez noc.
   3. Odwirować i dodać 5 μl 10% dodecylosiarczanu sodu (SDS) i 1 μl proteinazy K (20 mg/ml, stopień RNA) do mieszaniny reakcyjnej. Mieszać przez stukanie, odwirować i inkubować w temperaturze 50 °C przez 30 minut.
   4. Pod wyciągiem dodać 100 μl dolnej fazy fenolu:chloroformu:alkoholu izoamylowego do mieszaniny reakcji plazmidowej w celu ekstrakcji. Wirować, a następnie odwirowywać przy 18 800 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Przenieś górną fazę do nowej rurki.
   5. Powtórzyć krok 1.1.4 z chloroformem: alkoholem izoamylowym w stosunku 24:1.
   6. W nowej probówce doprowadzić objętość reakcji do 300 μl, dodając 200 μl wody wolnej od nukleaz, a następnie dodać 30 μl 3 M octanu sodu i 600 μl 100% etanolu.
   7. Wymieszać przez wirowanie, a następnie umieścić w temperaturze -20 °C na 30-60 minut w celu wytrącenia etanolu DNA.
   8. Wirować przy 18 800 × g przez 20 minut w temperaturze 4 °C, odrzucić sklarowany osad i przepłukać osad 1 ml 70% etanolu. Powtarzać wirowanie przez 10 minut, a następnie całkowicie usunąć supernatant.
   9. Suszyć z otwartą nakrętką przez 2 minuty, dodać 30 μl wody wolnej od nukleaz i ponownie zawiesić osad DNA.
   10. Oznaczyć stężenie DNA za pomocą spektrofotometru.
   11. Sprawdź rozmiar i ilość zlinearyzowanego DNA za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym.
2. Synteza RNA z wykorzystaniem polimerazy RNA T7
   1. Dodaj po 2 μl 10-krotnego buforu transkrypcyjnego, ATP, GTP, UTP, CTP i T7 oraz 1 μg zlinearyzowanego DNA do probówki mikrowirówkowej. Dodaj wodę wolną od nukleaz, aby doprowadzić objętość reakcji do 20 μl.
   2. Mieszać przez stukanie, odwirować i inkubować mieszaninę reakcyjną w temperaturze 37 °C przez 2 godziny w celu syntezy RNA.
   3. Odwirować, dodać 1 μl DNazy (2 U/μL) i inkubować w temperaturze 37 °C przez 15 minut w celu usunięcia matrycy DNA.
3. Wytrącanie RNA chlorkiem litu
   1. Dodać 10 μl chlorku litu (7,5 M) do mieszaniny reakcyjnej. Mieszaninę reakcyjną mieszać przez stukanie, odwirować i inkubować w temperaturze -20 °C przez 30 minut.
   2. Odwirować przy 18 800 × g przez 20 minut w temperaturze 4 °C, odrzucić supernatant i przepłukać osad 500 μl 70% etanolu. Powtarzać wirowanie przez 10 minut, a następnie całkowicie usunąć supernatant.
   3. Wysuszyć z otwartą nakrętką przez 2 minuty, dodać 30 μl wody wolnej od nukleaz i ponownie zawiesić osad RNA.
4. Ograniczenie
   1. Podgrzewać próbkę RNA w temperaturze 65 °C przez 10 minut, a następnie umieścić ją na lodzie w celu schłodzenia.
   2. Dodaj po 5 μl 10x buforu zamykającego, 10 mM GTP i 1 mM (10x) S-adenozylometioniny (SAM), po 2 μl mieszaniny enzymów cappingujących i mieszaniny enzymów O-metylotransferazy oraz 1,25 μl inhibitora RNazy. Wymieszać przez stukanie, odwirować i inkubować mieszaninę reakcyjną w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
5. Ogony z poli(A)
   1. Odwiruj próbkę, a następnie dodaj 6 μl wody wolnej od nukleaz, 20 μl 5x buforu E-PAP, 10 μl 25 mM MnCl₂, 10 μl 10 mM ATP i 4 μl enzymu ogonowego poli(A) E-PAP. Mieszać przez stukanie, odwirować i inkubować mieszaninę reakcyjną w temperaturze 37 °C przez 2 godziny.
6. Wytrącanie chlorku litu i oznaczanie ilościowe syntetycznego mRNA
   1. Dodać 50 μl chlorku litu (7,5 M) i przeprowadzić wytrącanie chlorku litu zgodnie z opisem w krokach 1.3.1-1.3.3.
   2. Zmierz stężenie mRNA za pomocą spektrofotometru.
   3. Sprawdź wielkość i ilość mRNA za pomocą elektroforezy żelowej z formaldehydem (1%-2%), agarozą (1%).

2. Żelowa powłoka macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) na płytkach inwazji i migracji komórek (CIM)

UWAGA: Płytka do inwazji i migracji komórek (CIM) to komercyjnie produkowana 16-dołkowa płytka do analizy komórek w czasie rzeczywistym opartej na impedancji. W teście inwazji komórkowej pokryj płytki CIM żelem ECM, jak opisano wcześniej, ale z pewnymi modyfikacjami¹¹.

1. Wyjąć z zamrażarki porcję bulionu żelowego ECM i przechowywać go na lodzie.
2. Rozcieńczyć żel ECM (10 mg/ml) do stężenia roboczego (100 μg/ml) przez zmieszanie 990 μl zmodyfikowanego podłoża Eagle (DMEM) firmy Dulbecco (bez surowicy i antybiotyków) z 10 μl żelu ECM w probówce do mikrowirówki. Wymieszać delikatnie pipetując.
3. Dodać 60 μl rozcieńczonego żelu ECM do każdego z 16 dołków górnej komory płytki CIM. Zastosuj metodę odwrotnego pipetowania, unikając pęcherzyków powietrza^20,21.
   UWAGA: Zoptymalizuj stężenie żelu ECM dla każdej linii komórkowej. W przypadku linii komórkowych glejaka do optymalizacji użyto żelu ECM od 0,1 μg/μL do 1 μg/μL.
4. Umieścić górną komorę płytki CIM ze zdjętą pokrywą płytki na ochronnym arkuszu z tworzywa sztucznego wewnątrz inkubatora CO₂ na około 4 godziny, aby utworzyć warstwę żelu.
   UWAGA: Podczas powlekania płytki CIM żelem ECM, elektrody górnej komory płytki CIM nie powinny mieć bezpośredniego kontaktu z rękami eksperymentatora ani z powierzchniami sprzętu, w tym z komorą bezpieczeństwa biologicznego lub inkubatorem CO₂ .

3. Przygotowanie komórek nowotworowych

UWAGA: Wszystkie materiały do hodowli komórkowych muszą być sterylne. Zbierz i poddaj elektroporację komórkom nowotworowym w komorze bezpieczeństwa biologicznego przy użyciu odpowiedniego sprzętu ochrony osobistej (PPE), jak opisano wcześniej, ale z pewnymi modyfikacjami¹¹.

1. Hodowla komórek nowotworowych
   1. Hodowla komórek U-118MG w 10 ml DMEM zawierającego 5% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 1% antybiotyków na naczynie do hodowli tkanek polistyrenowych o wymiarach 100 mm x 20 mm w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO_{2 (}warunek hodowli).
2. Zubożenie komórek nowotworowych w surowicy
   UWAGA: Narażenie komórek na chemoatraktanty obecne w FBS musi być zminimalizowane przed testami migracji i inwazji komórek poprzez zastosowanie wysokiego stężenia FBS.
   1. Usuń starą pożywkę i dodaj 10 ml wstępnie podgrzanego DMEM zawierającego 0,5% FBS i 1% antybiotyków na miskę (pożywka o niskiej surowicy).
   2. Powtórz krok 3.2.1.
   3. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5% CO_{2 przez} 4 godziny lub dłużej.
3. Pobieranie komórek nowotworowych
   1. Usuń starą pożywkę, dodaj 8 ml wstępnie podgrzanej soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (DPBS) Dulbecco na naczynie, wyjmij DPBS, dodaj podgrzaną 0,05% trypsynę-EDTA (2 ml / miskę), aby pokryć powierzchnię i inkubować w inkubatorze CO₂ przez 30 s.
   2. Ostrożnie odessać trypsynę-EDTA, dodać pożywkę o niskiej surowicy (7 ml / talerz), a następnie zebrać komórki do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml lub 15 ml.
   3. Podziel niewielką objętość komórek i użyj ręcznego automatycznego licznika komórek do zliczenia komórek.
   4. Oblicz całkowitą liczbę komórek i wymaganą objętość dla 10 000 komórek/μl.
   5. Odwirować komórki, odwirowując je w stężeniu 100 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej, odessać supernatant, dodać obliczoną objętość DMEM zawierającą 0,5% FBS (bez antybiotyków) i delikatnie zawiesić osad komórkowy.
   6. Przenieść 110 μl zawiesiny komórkowej, zawierającej 1,1 miliona komórek, do probówki mikrowirówkowej dla każdego zabiegu.
   7. Powtórzyć krok 3.3.6, aby przenieść komórki do czterech probówek do mikrowirówek w celu przeprowadzenia czterech różnych zabiegów.
      UWAGA: Płytka CIM ma w sumie 16 dołków. Zaprojektuj cztery różne zabiegi do porównania, tak aby do każdego zabiegu można było przypisać cztery dołki płytki CIM. Wykorzystaj elektroporowane komórki do następujących eksperymentów: analizy western blot (0,3 miliona komórek na 35 mm naczynie do hodowli tkankowej), cztery dołki testów migracji komórek w czasie rzeczywistym (0,1 miliona komórek / studzienkę) i cztery dołki testów inwazji komórek w czasie rzeczywistym (0,1 miliona komórek / studzienkę) dla każdego zabiegu. Dostosuj liczbę ogniw, które muszą zostać poddane elektroporacji, jeśli zmieni się projekt eksperymentu.

4. Elektroporacja komórek nowotworowych

1. Aby usunąć pożywkę, dodać 1 ml DPBS do zawiesiny komórek w każdej probówce, odwirować zawiesinę komórek trzy razy przez 10 s za każdym razem, obracając probówkę o 180° co 10 s za pomocą mini wirówki i usunąć supernatant za pomocą mikropipety.
   UWAGA: Ważne jest, aby uformować zwartą, ale łatwą do ponownego zawieszenia osadę komórkową.
2. Dodać 110 μl buforu do respensji R do osadu komórkowego, aby uzyskać 0,1 miliona komórek w 10 μl.
3. Dodaj syntetyczne mRNA do osadu komórkowego, aby uzyskać stężenie 0,2-20 ng / μl w zależności od pożądanego poziomu ekspresji. Delikatnie wymieszać i ponownie zawiesić osad komórkowy, stukając lub delikatnie pipetując.
   UWAGA: Użyj różnych stężeń syntetycznego mRNA, zbadaj ekspresję białka za pomocą analizy western blot i określ stężenie syntetycznego mRNA, które prowadzi do pożądanego poziomu ekspresji, w celu zbadania specyficznej korelacji między ekspresją białka a efektami biologicznymi.
4. Elektroporować 10 μl zawiesiny ogniwa za pomocą systemu elektroporacji pod napięciem 1 350 V przez 10 ms za każdym razem trzema impulsami.
5. Przenieś elektroporowane ogniwa do nowej probówki mikrowirówkowej z 1,1 ml DMEM zawierającego 0,5% FBS.
6. Powtarzaj elektroporację, aż reszta zawiesiny ogniwa zostanie poddana elektroporacji. Połącz elektroporowane ogniwa w probówce mikrowirówkowej, aby uzyskać 1,1 miliona komórek w 1,1 ml.
   UWAGA: Zarówno końcówki do elektroporacji 100 μl, jak i 10 μl mogą być używane do elektroporacji dużej objętości ogniw, ale końcówki do elektroporacji dla 10 μl i 100 μl są zawarte w dwóch oddzielnych zestawach i należy je zakupić osobno. W obu zestawach znajduje się bufor do ponownego zawieszenia R.
7. Po wykonaniu wszystkich odpowiednich elektroporacji delikatnie ponownie zawiesić połączone ogniwa.
8. Umieść 0,3 miliona komórek w naczyniu do hodowli tkankowej z polistyrenu o wymiarach 35 mm x 10 mm z 2 ml DMEM zawierającego 5% FBS i hoduj komórki przez 1 dzień w warunkach hodowli w celu przygotowania całkowitego lizatu komórkowego i analiz western blot.
9. Pozostałe elektroporowane ogniwa należy przechowywać w temperaturze pokojowej do czasu, aż system analizy ogniw w czasie rzeczywistym będzie gotowy.

5. Konfiguracja analizatora komórek w czasie rzeczywistym, programu i płytek CIM

UWAGA: Przygotuj analizator komórek w czasie rzeczywistym i dwie płytki CIM, jak wcześniej opisano¹¹.

1. Równoważenie analizatora komórek w czasie rzeczywistym
   1. Przenieś analizator komórek w czasie rzeczywistym do inkubatora CO₂ na kilka godzin przed użyciem, aby zrównoważyć system w warunkach hodowli.
2. Konfiguracja programu analitycznego
   1. Otwórz program do analizy, klikając dwukrotnie ikonę oprogramowania do analizy komórek w czasie rzeczywistym na pulpicie.
   2. Po otwarciu opcji Default Experiment Pattern Setup (Ustawienia domyślnego wzorca eksperymentu) wybierz opcję uruchamiania trzech eksperymentów oddzielnie.
      UWAGA: Każda kołyska ma osobne okienko. Istnieją różne zakładki, w których można ustawić interwał i czas trwania pomiaru, analizę danych i inne warunki eksperymentalne.
   3. Otwórz każdą kołyskę, klikając zakładkę Numer.
   4. Kliknij kartę Notatki z eksperymentu, wybierz folder, w którym zostaną zapisane dane, a następnie wprowadź nazwę eksperymentu.
   5. Kliknij kartę Układ, ustaw poczwórne studzienki dla każdego warunku uzdatniania, wybierając cztery studzienki jednocześnie i wprowadzając informacje o próbce, a następnie kliknij Zastosuj.
   6. Kliknij zakładkę Harmonogram | Dodaj krok, aby skonfigurować dwuetapowy tryb pomiarów impedancji ogniwa. Następnie kliknij Zastosuj, aby skonfigurować pierwszy krok.
   7. Kliknij ponownie Dodaj krok, wprowadź 10 minut jako interwał i 48 godzin jako czas trwania migracji i inwazji, a następnie kliknij Zastosuj, aby skonfigurować drugi krok.
      UWAGA: Pierwszy krok polega na jednorazowym pomiarze bazowym (jedno przemiatanie w odstępie 1 minuty). Drugi etap mierzy impedancję ogniwa na potrzeby eksperymentu (na przykład 289 przemiatania w 10-minutowym odstępie przez 48 godzin) w kołysce. Dostosuj interwał i czas trwania w zależności od projektu eksperymentalnego.
   8. Przejdź do następnej stacji dokującej i skonfiguruj ją, powtarzając kroki 5.2.3-5.2.7.
3. Przygotowanie płyt CIM
   1. Na godzinę przed rozpoczęciem pomiaru impedancji ogniwa napełnij studzienki dolnej komory płytki CIM 160 μl DMEM zawierającego 10% surowicy lub innych chemoatraktantów.
   2. Górną komorę, w której znajdują się studzienki pokryte żelem ECM (do inwazji) lub studzienki niepowlekane (do migracji), należy połączyć z dolną komorą.
   3. Dodać 50 μl pożywki o niskiej surowicy do studzienek górnej komory płytki CIM w celu przeprowadzenia testu migracji komórek i umieścić płytkę CIM w kołysce systemu.
   4. Kliknij kartę Wiadomość i upewnij się, że wyświetlany jest komunikat Połączenia ok. Płyta CIM jest teraz gotowa do eksperymentu.
   5. Zmontowaną płytkę CIM należy wstępnie inkubować w inkubatorze CO₂ przez 30-60 minut przed analizą komórek w czasie rzeczywistym, aby zaaklimatyzować płytkę CIM do warunków hodowli.

6. Analiza komórek w czasie rzeczywistym i eksport danych

UWAGA: Wykonaj odczyt linii bazowej, rozsiewanie komórek, pomiar impedancji komórek i eksport danych zgodnie z wcześniejszym opisem¹¹.

1. Odczyt bazowy
   UWAGA: Linię bazową należy odczytać po zaaklimatyzowaniu płytki CIM i przed dodaniem komórek do studzienek górnej komory.
   1. Kliknij przycisk Start dla każdej kołyski. Gdy pojawi się okno Zapisz jako, zapisz plik eksperymentalny, aby wykonać odczyt linii bazowej.
2. Wysiewanie komórek
   1. Wyjmij płytkę CIM z kołyski i umieść ją w szafie bezpieczeństwa biologicznego na uchwycie płytki.
   2. Dodaj 100 μl (zawierających 100 000 ogniw) elektroporowanych ogniw do studzienek górnej komory płytki CIM zgodnie z programem w jednostce sterującej. Zastosuj metodę odwróconego pipetowania, unikając pęcherzyków powietrza.
   3. Pozostaw płytkę CIM pod szafą bezpieczeństwa biologicznego na 30 minut w temperaturze pokojowej, aby upewnić się, że komórki równomiernie rozprowadzają się na dnie studzienki.
3. Pomiar impedancji ogniwa
   1. Przenieś w pełni zmontowaną płytkę CIM z powrotem do odpowiedniej kołyski. Kliknij przycisk Start podstawki, aby rozpocząć pomiar impedancji ogniwa w drugim kroku.
   2. Kliknij kartę Wykres, a następnie kliknij przycisk Dodaj wszystko i zaznacz pola Średnia i STD DEV, aby wizualizować dane w czasie rzeczywistym.
      UWAGA: Domyślną opcją kreślenia jest Czas dla osi x i Indeks komórki dla osi y. Sekcja Wybór wykresu umożliwia użytkownikowi wybranie alternatywnych opcji dla osi y: Znormalizowany indeks komórki lub Indeks komórki delta. Po wykonaniu ostatniego zamiatania eksperyment zostaje zakończony, a wyniki są automatycznie zapisywane.
4. Eksport danych do analizy
   1. Kliknij zakładkę Wykres i zaznacz pola Średnia i STD DEV, aby skopiować dane dla każdego dołka z osobna.
   2. Kliknij prawym przyciskiem myszy obszar kreślenia i wybierz polecenie Kopiuj dane w formacie listy.
   3. Otwórz pusty plik arkusza kalkulacyjnego, wklej dane, a następnie zapisz plik.
   4. Wróć do programu analitycznego, kliknij zakładkę Płyta dla każdej kołyski i wybierz opcję Zwolnij, aby zamknąć eksperyment dla kołyski.
   5. Wróć do pliku arkusza kalkulacyjnego i dostosuj czas nieprzetworzonych danych tak, aby czas rozpoczęcia w drugim kroku stał się rzeczywistym czasem rozpoczęcia pomiaru.

Białka Crk i CrkL odgrywają ważną rolę w ruchliwości wielu typów komórek, w tym neuronów22, limfocyty T23, fibroblasts18,19 oraz różne komórki nowotworowe13. Ponieważ donoszono, że białka Crk i CrkL są podwyższone w glejaku24,25,26, w tej pracy badano wpływ nadekspresji CrkI, wariantu splicingu Crk, na migrację komórek glejaka. Komórki U-118MG poddano elektroporacji różnymi stężeniami syntetycznego mRNA CrkI i przeanalizowano pod kątem poziomu białek i migracji komórek. Elektroporacja komórek glejaka U-118MG o różnych stężeniach syntetycznego mRNA CrkI spowodowała zależny od stężenia wzrost białka CrkI znakowanego FLAG 1 dzień po transfekcji (Figura 1A). Podczas gdy mRNA 0,2 ng/μL i 2 ng/μL prowadziło do niewykrywalnej lub umiarkowanej ekspresji egzogennego białka CrkI, mRNA 20 ng/μL skutkowało znacznie wyższym poziomem ekspresji niż endogenne białko CrkI.

Wyniki testu migracji komórek przy użyciu systemu analizy komórek w czasie rzeczywistym wykazały, że elektroporacja z mRNA CrkI 0,2 ng/μL lub 2 ng/μL nie wpłynęła znacząco na migrację komórek. Jednak elektroporacja mRNA CrkI o stężeniu 20 ng / μl doprowadziła do wyraźnej stymulacji migracji komórek, przy czym więcej komórek migrowało między 2 godzinami a 13 godzinami (Figura 1B). Porównanie poziomu białka CrkI z migracją komórek wykazało, że migracja komórek glejaka była stymulowana przez wzrost poziomu białka CrkI. Wydaje się, że poziom białka CrkI powinien być wyższy niż pewien próg, aby spowodować znaczną stymulację migracji komórek. Gdyby migracja komórek była mierzona na różne sposoby w celu zliczenia lub obserwacji migrowanych komórek w określonych punktach czasowych, można by włożyć znacznie więcej wysiłku w zidentyfikowanie tego rodzaju zmian w migracji komórek.

Aby zbadać, jak nadekspresja CrkL wpływa na inwazję komórek glejaka przez warstwy żelu ECM o różnych stężeniach białek ECM, komórki U-118MG zostały poddane elektroporacji syntetycznym mRNA CrkL i przeanalizowane pod kątem poziomu białka i inwazji komórek przez warstwę żelu ECM. Elektroporacja komórek glejaka U-118MG syntetycznym mRNA CrkL doprowadziła do silnej ekspresji białka CrkL znakowanego FLAG 1 dzień po transfekcji (Figura 2A). Wraz ze wzrostem stężenia białek ECM, inwazja komórek kontrolnych uległa spowolnieniu (Ryc. 2B). Komórki z nadekspresją CrkL wykazały również zależny od stężenia żelu ECM spadek inwazji komórek (Rysunek 2C). Porównanie między komórkami kontrolnymi i z nadekspresją CrkL przy różnych stężeniach żelu ECM wykazało, że nadekspresja CrkL generalnie stymulowała inwazję komórek przez warstwę żelu ECM (Rysunek 2D-G). Jednak różnica między tymi dwiema populacjami komórek stała się oczywista w różnych punktach czasowych w zależności od stężenia żelu ECM.

Dla żelu ECM 0,1 μg/μL, stymulacja inwazji komórek za pośrednictwem nadekspresji CrkL była widoczna między 8 a 20 godzinami (Rysunek 2D), ale różnica w inwazji komórek była znikoma po 32 godzinach. W przypadku żelu ECM 0,2 μg/μL różnica w inwazji komórek z nadekspresją CrkL i bez niej była minimalna przez cały czas (Rysunek 2E). W przypadku żelu ECM o stężeniu 0,5 μg/μl różnica w inwazji komórek była widoczna między 24 godzinami a 36 godzinami (Rysunek 2F). W przypadku żelu ECM 1 μg/μL efekt nadekspresji CrkL na inwazję komórek stał się nieznacznie widoczny po 48 godzinach (Rysunek 2G). Wyniki sugerują, że okno do wykrycia różnicy między komórkami kontrolnymi a komórkami z nadekspresją CrkL przesuwa się na późniejsze czasy wraz ze wzrostem stężenia żelu ECM. Wyniki sugerują również, że na obie populacje komórek w różny sposób wpłynął wzrost stężenia żelu ECM w różnych punktach czasowych. Na przykład po 12 godzinach komórki z nadekspresją CrkL wykazywały znacznie wyższą inwazję tylko przy 0,1 μg / μL żelu ECM (Rysunek 2H). Jednak po 24 godzinach komórki z nadekspresją CrkL wykazały nieco wyższą lub podobną inwazję przy testowanych stężeniach żelu ECM (Rysunek 2I). Dlatego ważne jest, aby zbadać zarówno zależne od czasu, jak i zależne od stężenia żelu ECM różnice w inwazji komórek, aby uzyskać kompleksowy obraz różnic między dwiema populacjami komórek z nadekspresją CrkL i bez niej. Wyniki te pokazują, że połączenie przejściowej nadekspresji przy użyciu syntetycznego mRNA z analizami komórek w czasie rzeczywistym opartymi na impedancji stanowi potężne narzędzie do analizy potencjalnej korelacji między nadekspresją genów a migracją i inwazją komórek nowotworowych. Zbadanie wpływu zmian stężeń w syntetycznym mRNA i żelu ECM dostarczyłoby dokładniejszych i bardziej szczegółowych informacji.

Rysunek 1: Wpływ nadekspresji CrkI na migrację komórek glejaka. Komórki U-118MG poddano elektroporacji ze wskazanymi stężeniami (ng / μL) mRNA CrkI znakowanego FLAG. (A) W przypadku analiz western blot elektroporowane komórki hodowano przez 1 dzień przed przygotowaniem całkowitego lizatu komórkowego. Porównano poziomy białka po transfekcji z syntetycznym mRNA CrkI. Przeciwciała anty-Crk i anty-CrkL wykorzystano do wykrycia zarówno białek endogennych, jak i białek znakowanych flagą oraz do porównania stosunku białek endogennych do białek znakowanych flagą. Winkulina i α-tubulina były używane jako kontrole obciążenia. (B) Do analiz migracji komórek, elektroporowane ogniwa zostały posiane na płytce CIM bez dalszej hodowli. Wartości indeksu komórek uzyskano z czterech studzienek dla każdej próbki i pokazano ich średnie wartości ± SD. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Wpływ nadekspresji CrkL na inwazję komórek glejaka. Komórki U-118MG poddano elektroporacji mRNA CrkL bez nukleazyH2Olub 20 ng / μL FLAG. (A) W przypadku analiz western blot elektroporowane komórki hodowano przez 1 dzień przed przygotowaniem całkowitego lizatu komórkowego. Porównano poziomy białka po transfekcji z syntetycznym mRNA CrkL. Przeciwciała anty-Crk i anty-CrkL wykorzystano do wykrycia zarówno białek endogennych, jak i białek znakowanych flagą oraz do porównania stosunku białek endogennych do białek znakowanych flagą. Winkulina i α-tubulina były używane jako kontrole obciążenia. (B-G) W celu analizy inwazji komórek, elektroporowane ogniwa zostały posiane na płytce CIM z powłoką żelową ECM bez dalszej hodowli. Wartości indeksu komórek uzyskano z czterech studzienek dla każdej próbki i pokazano ich średnie wartości ± SD. (B) Porównano dane dotyczące inwazji komórek z komórek kontrolnych o różnych stężeniach żelu ECM. (C) Porównano dane dotyczące inwazji komórek z nadekspresją CrkL o różnych stężeniach żelu ECM. (D-G) Dane dotyczące inwazji komórek między komórkami kontrolnymi i komórkami z nadekspresją CrkL porównano dla wskazanego stężenia żelu ECM. (H) Porównanie inwazji komórek po 12 godzinach między komórkami kontrolnymi i komórkami z nadekspresją CrkL. (I) Porównanie inwazji komórek w ciągu 24 godzin między komórkami kontrolnymi i komórkami z nadekspresją CrkL. Skróty: ECM = macierz zewnątrzkomórkowa; CIM = inwazja i migracja komórek. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Schematy schematyczne procedur eksperymentalnych po knockdownie lub nadekspresji genu. (A) Eksperymentalna procedura analizy komórek w czasie rzeczywistym po transfekcji siRNA. Ponieważ w warunkach eksperymentalnych potrzeba 3-4 dni na wywołanie całkowitego knockdownu genu po transfekcji siRNA, komórki ponownie platerowano i hodowano przez 3 dni po elektroporacji, zanim były gotowe do analiz komórkowych w czasie rzeczywistym. (B) Procedura doświadczalna analizy komórek w czasie rzeczywistym po transfekcji syntetycznego mRNA. Ponieważ ekspresja białka z transfekcji syntetycznego mRNA jest szybka, elektroporowane komórki wykorzystano do analiz komórek w czasie rzeczywistym tego samego dnia. Zwróć uwagę na różnicę między tymi dwiema procedurami eksperymentalnymi; Podczas gdy analizę komórek w czasie rzeczywistym przeprowadzono 3 dni po elektroporacji w celu knockdownu genu przy użyciu siRNA, analizę komórek w czasie rzeczywistym przeprowadzono zaraz po elektroporacji pod kątem nadekspresji genów za pomocą syntetycznego mRNA. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.