Standaryzowane przetwarzanie kontroli immunohistochemicznych osadów komórkowych utrwalonych w formalinie, zatopionych w parafinie

Summary

Prezentowany tutaj jest protokół generowania kontrolnych osadów komórkowych z utrwalonymi w formalinie, zatopionymi w parafinie dla immunohistochemii.

Abstract

Pozytywne i negatywne kontrole o znanej ekspresji docelowych białek są niezbędne dla rozwoju testów immunohistochemicznych (IHC). Podczas gdy kontrola tkankowa jest korzystna dla dobrze scharakteryzowanych białek o zdefiniowanych wzorcach ekspresji tkankowej i komórkowej, jest mniej odpowiednia dla początkowego rozwoju testów IHC dla nowych, słabo scharakteryzowanych lub wszechobecnych białek. Alternatywnie, ze względu na ich znormalizowany charakter, granulki komórkowe, w tym linie komórek rakowych o określonych poziomach ekspresji białka lub transkryptu (np. Wysoka, średnia i niska ekspresja), transfekowane linie komórkowe z nadmierną ekspresją lub linie komórkowe z genami usuniętymi za pomocą technologii inżynierii komórkowej, takich jak CRISPR, mogą służyć jako cenne kontrole, szczególnie do wstępnej charakterystyki i selekcji przeciwciał. Aby te granulki komórkowe mogły być wykorzystane do opracowania testów IHC dla tkanek utrwalonych w formalinie, zatopionych w parafinie, muszą być przetworzone i osadzone w sposób, który podsumowuje procedury stosowane do przetwarzania tkanek. Protokół ten opisuje proces tworzenia i przetwarzania utrwalonych w formalinie, osadzonych w parafinie kontrolnych granulek komórkowych, które można wykorzystać do opracowania metody IHC.

Introduction

Immunohistochemia (IHC) jest jednym z najczęściej używanych testów w patologii śledczej i diagnostycznej. W zależności od kontekstu i testu, IHC jest używany do pomocy w diagnozowaniu raka^1,2, przewidywanie odpowiedzi na leczenie^3,4, identyfikowanie patogenów⁵, charakteryzowanie typów komórek w chorych tkankach⁶, oraz badanie szlaków biologicznych i odpowiedzi tkankowych^7,8. We wszystkich sytuacjach podstawową zasadą testu IHC jest to, że przeciwciało wiąże się specyficznie z celem zainteresowania, najczęściej białkiem, a to zdarzenie wiązania jest następnie wizualizowane w sekcji tkanki⁹. Jednak jednym z największych wyzwań każdego testu IHC jest upewnienie się, że przeciwciała specyficznie wykrywają cel będący przedmiotem zainteresowania¹⁰. Swoistość przeciwciał jest wyzwaniem w większości testów immunologicznych, ale immunohistochemia stanowi wyjątkowe wyzwanie, ponieważ nie ma drugorzędnych miar, takich jak masa cząsteczkowa, aby rozróżnić znakowanie swoiste i niespecyficzne. Jest to szczególnie kłopotliwe przy ocenie słabo scharakteryzowanych lub wszechobecnie wyrażonych celów, które nie mają dobrze zdefiniowanych wzorców lokalizacji komórkowej. W związku z tym solidne kontrole, które mogą pomóc w scharakteryzowaniu specyficzności wiązania, mają kluczowe znaczenie podczas opracowywania nowego testu IHC¹⁰.

Dla celów, które są dobrze zdefiniowane z charakterystycznymi wzorcami ekspresji komórkowej, kontrola tkanek jest często wykorzystywana w rozwoju metody IHC. Opierając się na bogactwie wcześniejszych danych, można określić, czy przeciwciało znakuje tkankę, komórkę i przedział subkomórkowy, w którym wiadomo, że ulega ekspresji, i czy nie znakuje składników tkanki tam, gdzie nie powinno być obecne¹¹. Jednak kontrola tkankowa ma ograniczone zastosowanie w przypadku słabo scharakteryzowanych, nowych celów bez znanych wzorców ekspresji lub białek, które są szeroko eksprymowane i nie mają wyraźnych wzorców ekspresji. W obu tych scenariuszach brak dobrze zdefiniowanego wzorca ekspresji uniemożliwia odróżnienie specyficznego od niespecyficznego znakowania w tkankach. W takich sytuacjach granulki komórkowe stanowią cenną alternatywę dla kontroli IHC. Kontrola osadów komórkowych może obejmować: raka lub inne linie komórkowe, które mają endogenne lub wewnętrzne/nieindukowane poziomy ekspresji białka będącego przedmiotem zainteresowania i których ekspresję białka można scharakteryzować za pomocą western blot, analiz cytometrycznych przepływowych lub ekstrapolować z profilowania transkrypcyjnego; zmodyfikowane linie komórkowe, które albo wykazują nadmierną ekspresję białka będącego przedmiotem zainteresowania, albo mają usunięty gen kodujący będący przedmiotem zainteresowania; lub komórki, które zostały poddane działaniu określonych warunków w celu wywołania ekspresji białka lub zdarzeń sygnalizacyjnych będących przedmiotem zainteresowania (np. fosforylacji)10^,12. Dobrze scharakteryzowane poziomy ekspresji białek w liniach komórkowych pozwalają również na ocenę czułości testu przy użyciu panelu linii komórkowych o wysokiej, średniej, niskiej i nieobecnej ekspresji białka. Dodatkowo, zmodyfikowane granulki komórkowe mogą być cennymi kontrolami specyficznymi dla gatunków weterynaryjnych, dla których może istnieć ograniczona charakterystyka lub dostępne kontrole tkankowe¹³. Chociaż granulki komórkowe mają swoje ograniczenia, takie jak ograniczony proteom obecny w liniach komórkowych, które nie będą odzwierciedlać zróżnicowanego proteomu w tkankach, służą one jako odpowiednie kontrole w celu potwierdzenia, że przeciwciało może wykryć cel zainteresowania, a także wykluczenie bezkrytycznego wiązania przez przeciwciało pierwszorzędowe, przeciwciało drugorzędowe lub inne regenty w teście10.

Większość tkanek w patologii diagnostycznej i badawczej jest utrwalana w neutralnym buforze formaliny, odwadniana w szeregu alkoholi, oczyszczana w ksylenie, a następnie przetwarzana i zatopiona w wosku parafinowym. Utrwalanie formaliny, sieciowanie białek i utrwalanie oraz każdy dodatkowy etap przetwarzania tkanek mogą bezpośrednio wpływać na białka i zdolność przeciwciał do ich wykrywania^9,14. Dlatego ważne jest, aby wszystkie kontrole stosowane w teście IHC były poddawane tym samym procedurom utrwalania, przetwarzania tkanek i zatapiania. W tym artykule opisano unikalne zagadnienia dotyczące przetwarzania i osadzania hodowanych komórek, które mają służyć jako kontrola do opracowywania testów IHC w tkankach zatopionych w parafinie utrwalonej w formalinie, przy czym metodologia koncentruje się przede wszystkim na obsłudze i przetwarzaniu osadu komórkowego w laboratorium histologicznym.

Protocol

1. Przygotowanie osadów komórkowych

1. W czterech do ośmiu kolbach 150 mm² lub ośmiu x T175 hoduj komórki w pożywce i warunkach zalecanych dla linii komórkowej do 80%-90% konfluencji. Na przykład, hoduj komórki 293T w zmodyfikowanym pożywce Dulbecco Eagle's Medium (DMEM) z 10% płodową surowicą bydlęcą i 2 mM L-glutaminy¹⁵.
   UWAGA: Komórki powinny być hodowane przy użyciu warunków i podłoża wymaganych dla interesującej nas linii komórek¹⁶. Warunki te mogą się różnić w zależności od linii komórkowej, ale dalsze metody granulowania powinny być możliwe do dostosowania do linii komórkowych niezależnie od warunków hodowli.
2. Gdy komórki znajdą się w pobliżu zbiegu (80%-90%), odessać pożywkę wzrostową za pomocą pipety próżniowej i przepłukać komórki w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).
3. Dodać 5 ml 5-10 mM EDTA do każdej kolby i inkubować kolby w temperaturze 37 °C przez 5-10 minut. Delikatnie postukać w bok kolby, aby usunąć komórki.
   UWAGA: Nie używaj trypsyny, ponieważ może to rozszczepić epitopy powierzchniowe, które niekorzystnie wpłynęłyby na niektóre antygeny.
   1. Po usunięciu komórek dodaj 5 ml pożywki wzrostowej używanej dla linii komórkowej (np. DMEM dla komórek 293T) do każdej kolby, a następnie przenieś komórki do stożkowych probówek o pojemności 50 ml.
4. Odwirować stożkowe probówki o stężeniu 930 x g w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Po odwirowaniu usunąć pożywkę i EDTA za pomocą aspiracji pipetą próżniową.
5. Umyj granulki komórek w 10-20 ml 1x PBS i, jeśli używa się wielu płytek lub kolb, połącz komórki z płytek lub kolb (około sześciu kolb T175 w eksperymencie przedstawionym w Rysunek 1) w pojedynczą stożkową probówkę o pojemności 50 ml.
6. Odwirować probówkę o sile 930 x g przez 5 minut. Po odwirowaniu odessać PBS za pomocą pipety próżniowej.
7. Trzymaj rurkę z granulkami komórkowymi na mokrym lodzie do czasu utrwalenia.
   UWAGA: Komórki są utrzymywane w chłodzie, aby ograniczyć aktywność enzymów degradacyjnych i zminimalizować autolizę komórek i związane z nią zmiany białek, w tym zmiany w lokalizacji białek.

2. Utrwalenie osadu komórkowego

1. Wykonaj utrwalanie, dodając 30 ml 10% neutralnej buforowanej formaliny do 3 ml osadu komórkowego, aby uzyskać stosunek utrwalacza do komórek 10:1 (vol:vol).
2. Kilkakrotnie odwróć szczelnie zakręconą probówkę o pojemności 50 ml, aż komórki całkowicie znajdą się w zawiesinie.
   UWAGA: Tworzenie się skondensowanego osadu komórkowego przed całkowitym utrwaleniem może powodować nierównomierne utrwalanie, co skutkuje artefaktami podczas późniejszych procedur barwienia i znakowania immunologicznego.
3. Pozostawić zawiesinę komórek na noc w temperaturze pokojowej, aby osiadła.
4. Następnego dnia ponownie odwróć probówkę, aby ponownie zawiesić komórki, zwiększając stosunek powierzchni do objętości, aby poprawić utrwalenie.
   UWAGA: Wirowanie osadu komórkowego nie jest wymagane ani zalecane, ponieważ może to spowodować uszkodzenie komórek.

3. Przycinanie i przetwarzanie granulatu komórkowego

1. Po 24 godzinach utrwalania odwirować probówkę stożkową o pojemności 50 ml przy 930 x g w temperaturze 5 °C przez 10-15 minut. Upewnij się, że probówki są szczelnie zamknięte, równomiernie rozmieszczone i zrównoważone w wirówce.
   UWAGA: Czasy utrwalania mogą być modyfikowane w celu odzwierciedlenia czasów utrwalania tkanek stosowanych przez laboratorium lub wymagań określonych warunków doświadczalnych.
2. Po odwirowaniu upewnij się, że komórki tworzą widoczną osadkę. Usunąć utrwalacz przez dekantację i/lub ostrożne zasysanie sterylną pipetą transferową.
3. Dodać stopiony (40-60 °C) żel na bazie agarozy hydroksyetylowej (patrz tabela materiałów) do osadu komórkowego w stosunku 1:4 (obj. objętości) żelu do osadu komórkowego.
4. Używając czystej sondy Sterlinga o średnicy 5 cali i średnicy 2 mm z okiem przepłukanym wodą z kranu, delikatnie wymieszaj stopiony żel z osadem o stałych komórkach, tworząc równomierną zawiesinę stałych komórek w stopionym żelu na dnie stożkowej rurki o pojemności 50 ml (Rysunek 1A).
5. Umieść zaślepioną stożkową probówkę o pojemności 50 ml ze stopionym żelem zmieszanym z osadkami o stałych komórkach na mokrym lodzie na 5-10 minut, aby zestalić zżelowane osady komórkowe.
6. Za pomocą czystej mikroszpatułki ostrożnie wyjmij granulkę ze stożkowej rurki, umieszczając szpatułkę wzdłuż boku rurki i delikatnie podważając granulkę, nie przebijając jej. Umieścić osad na bibułce biopsyjnej.
7. Za pomocą czystej mikroszpatułki przytnij osad komórkowy na plastry o grubości 4-5 mm, tak aby każdy plasterek mógł zmieścić się w kasecie na chusteczki o wymiarach 26 mm x 26 mm x 5 mm (Rysunek 1B).
8. Umieść pojedyncze plasterki żelu na środku kawałka bibuły do biopsji. Złóż dwa przeciwległe końce bibuły biopsyjnej na granulce, owijając ją. Umieść owinięte granulki w kasecie na chusteczki o wymiarach 26 mm x 26 mm x 5 mm. Zamknij pokrywę, zaciskając rozłożone boki folii biopsyjnej pokrywą kasety na tkanki (Rysunek 1C).
9. Umieść kasetę z przyciętymi komórkami w retorcie procesora tkanek wypełnionej 10% neutralną buforowaną formaliną i uruchom zgodnie z krótkim harmonogramem przetwarzania.
   UWAGA: Krótki harmonogram przetwarzania składa się z 30 minut w każdej retorcie, rozpoczynając od 10% neutralnej buforowanej formaliny, odwodnionej przez szereg coraz bardziej stopniowanych alkoholi, oczyszczonych w trzech przemianach ksylenów, a kończąc na infiltracji parafiny w dwóch przemianach stopionej infiltracji o temperaturze 60 °C/zatapianiu parafiny (temperatura topnienia 56 °C).

4. Osadzanie granulki komórkowej

1. Umieść przetworzone kasety w obszarze przechowywania centrum zatapiania.
2. Otwórz pokrywę kasety na chusteczki higieniczne i ostrożnie rozłóż bibułę biopsyjną.
3. Umieść granulki komórkowe w małej jednorazowej formie do zatapiania o wymiarach 15 mm x 15 mm, przeciętą stroną do dołu.
   UWAGA: Mała forma do zatapiania pozwala na zmieszczenie do trzech sekcji granulek komórkowych na jednym niebarwionym szkiełku tkankowym do testów IHC.
4. Delikatnie przytrzymując granulat komórkowy na dnie formy za pomocą kleszczy, dodaj infiltrację tkanek o temperaturze 62 °C / zatapianie parafiny w formie, pokrywając osad komórkowy.
5. Przenieś formę do zimnego bloku, aby rozpocząć krzepnięcie parafiny. Wyreguluj granulki komórek, gdy parafina krzepnie, aby zamocować je w odpowiedniej pozycji na dnie formy.
6. Zdejmij pokrywę z kasety. Umieść kasetę dnem do dołu na wierzchu formy do zatapiania i dodaj dodatkową stopioną parafinę, aby przykryć kasetę.
7. Gdy parafina zostanie napełniona kasetą na tkanki, włóż formę z powrotem do zimnego bloku w celu zestalenia^17,18.

5. Podział na sekcje granulki komórkowej

1. Za pomocą obrotowego mikrotomu ustawionego na grubość przekroju 20 μm należy przyciąć blok granulek komórkowych, aż cała powierzchnia bloku parafiny i osadu komórkowego zostanie ujęta we wstędze sekcji parafiny. Nazywa się to "przodem" do bloku.
2. Schłodź i namocz bloki peletu na tacy do kąpieli lodowej przez 5-15 minut, aby schłodzić i nawodnić blok przed cięciem.
   UWAGA: Gdy blok zostanie uwodniony, osad komórek będzie półprzezroczysty we wstążce parafinowej. Jeśli jest nieprzezroczysty, wymagane jest większe namaczanie i mogą być obecne artefakty.
3. Przeciąć wstęgę parafinową bloku granulek komórkowych na grubość 4 μm lub inną żądaną grubość w trybie ciągłego cięcia za pomocą obrotowego mikrotomu.
4. Umieścić wstęgi parafinowe w kąpieli pływającej nastawionej na 42 °C.
5. Skrawki parafiny przygotowane za pomocą mikrotomu rotacyjnego pobrać z kąpieli flotacyjnej na dodatnio naładowane szkiełka.
   1. Umieść pierwszą sekcję na górze szkiełka w obrębie szkiełka nakrywkowego i granicy barwienia, umieszczając drugą poniżej niej, a trzecią sekcję granulki komórkowej poniżej tego (Rysunek 1D).
   2. Po pokrojeniu na sekcje szkiełka suszyć w temperaturze pokojowej (około 23 °C) przez 24 godziny, a następnie w temperaturze 60 °C przez 30 min.
      UWAGA: Po wypaleniu szkiełek w temperaturze 60 °C, sekcje osadów komórkowych mogą być używane z dowolnym standardowym protokołem IHC, w tym protokołami wykorzystującymi indukowane ciepłem i oparte na enzymach pobieranie antygenów⁹.

Results

Po dodaniu żelu na bazie agarozy, osad komórkowy powinien utworzyć stałą galaretowatą masę nadającą się do obróbki (Rysunek 1B). Po osadzeniu osad będzie miał konsystencję podobną do tkanki stałej i powinien być stosunkowo łatwy do rutynowego cięcia na mikrotomie. Po osadzeniu osadzanych w komórkach można je stosować w eksperymentach histologicznych i IHC w identyczny sposób, jak tkanki utrwalone w formalinie, zatopione w parafinie. Obejmuje to wykorzystanie indukowanego ciepłem epitopu lub enzymatycznego odzyskiwania antygenu z pośrednimi metodami wykrywania chromogennego (np. przy użyciu drugorzędowego przeciwciała z peroksydazą chrzanową i wykrywaniem diaminobenzydyny, jak pokazano w Rysunek 2 i Rysunek 3) przy użyciu komercyjnych platform IHC⁹. Histologicznie komórki powinny być równomiernie rozproszone w całym przekroju z minimalnym zlepianiem komórek, chociaż komórki przylegające mogą utrzymywać swoje interakcje komórka-komórka w osadzie. Ta dyspersja pozwala na rozróżnienie między poszczególnymi komórkami, chociaż na to rozróżnienie znaczący wpływ będzie miała wielkość komórki i gęstość względna w pastylce żelu. Jądro, cytoplazma i błona komórkowa są bardziej wyraźne i łatwiejsze do wizualizacji po dyspersji (Rysunek 2). W Rysunek 2, trzy linie komórkowe są znakowane immunologicznie dla czynnika transkrypcyjnego TEAD. Znakowanie immunologiczne jest wizualizowane za pomocą brązowego chromogenu diaminobenzydyny (DAB). Linie komórkowe mają różne poziomy ekspresji czynnika transkrypcyjnego TEAD, od braku ekspresji (Rysunek 2A) do słabej ekspresji (Figura 2B), do silnej ekspresji (Rysunek 2C). W tym przykładzie etykietowanie jest obserwowane w jądrze, jak można by się spodziewać po czynniku transkrypcyjnym, i jest nieobecne w cytoplazmie i błonie komórkowej, które są widoczne, ale nie mają znakowania (Rysunek 2). Granulki komórkowe mogą być włączane do mikromacierzy granulek komórkowych (Rysunek 3) na standardowych prowadnicach 23 mm x 75 mm x 1 mm. Włączenie granulek komórkowych do mikromacierzy pozwala na ocenę kontroli o różnych poziomach ekspresji na tym samym szkiełku. W tym przykładzie mysie embrionalne komórki macierzyste z niedoborem PEG10 (po lewej) służą jako kontrola negatywna, a komórki 293T, które nadmiernie wyrażają PEG10 (po prawej, brązowe znakowanie immunologiczne) służą jako kontrola pozytywna w mikromacierzy (Rysunek 3). Nie ma różnic w procedurach tkankowych i osadzania dla osadzania granulek komórkowych, które zostaną włączone do mikromacierzy, a mikromacierze mogą być generowane przy użyciu metod podobnych do tych stosowanych w przypadku tkanek¹⁹.

Rysunek 1: Przetwarzanie granulek komórkowych. (A) Komórki są granulowane w stożkowych probówkach o pojemności 50 ml i mieszane z żelem. (B) Po zestaleniu granulki są szeregowo krojone w plastry, aby zmieściły się w kasecie na tkanki o wymiarach 26 mm x 26 mm x 5 mm. (C) Granulki komórek są zawijane w papier do biopsji przed umieszczeniem w procesorze tkankowym. (D) Na pojedynczym szkiełku histologicznym o wymiarach 25 mm x 75 mm można zbiorczo zebrać do trzech granulek komórkowych. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Granulki komórkowe o różnych poziomach ekspresji białka lub transkryptu mogą być użyte do oceny zakresu dynamiki testu. Granulki komórkowe są znakowane immunologicznie dla czynnika transkrypcyjnego TEAD i wykazują różne poziomy ekspresji TEAD. (A) Komórki DAUDI nie mają ekspresji TEAD i nie mają znakowania immunologicznego w cytoplazmie lub jądrze. Niebieska plama to barwnik przeciwstawny hematoksyliny jądra. (B) Komórki 293T wykazują słabe znakowanie jądrowe (chromogen brązowej diaminobenzydyny (DAB)) czynnika transkrypcyjnego TEAD. (C) Komórki Detroit 562 silnie eksprymują TEAD, o czym świadczy intensywne brązowe znakowanie w jądrze. Znakowanie w jądrze, ale nie w cytoplazmie (obszar od białawego do szarego wokół brązowego jądra), demonstruje odpowiednie znakowanie testu immunohistochemicznego. Należy zauważyć, że we wszystkich trzech liniach komórkowych komórki są rozproszone, co pozwala na wizualizację poszczególnych komórek, w tym ich morfologii jądrowej i cytoplazmatycznej. Podziałka = 25 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Mikromatryca z granulkami komórkowymi utworzona przy użyciu wielu granulek komórkowych o różnych poziomach ekspresji białek pozwala na jednoczesną ocenę kontroli na jednym slajdzie. Mysie embrionalne komórki macierzyste z niedoborem PEG10 (po lewej) i 293T z nadmierną ekspresją PEG10 (po prawej) są znakowane immunologicznie na obecność PEG10. Podczas gdy silne znakowanie (brązowy chromogen DAB) obserwuje się w komórkach 293T z nadmierną ekspresją PEG10, nie widać znakowania w komórkach z niedoborem PEG10. Niebieski reprezentuje przeciwbarwienie hematoksyliny. Podziałka = 200 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

Protokół ten opisuje metodologię generowania utrwalonych w formalinie, zatopionych w parafinie granulek komórkowych, które mogą być wykorzystane jako kontrole w dalszych badaniach immunohistochemicznych i hybrydyzacji in situ. Metodologie histologiczne opisane w tym protokole mają zastosowanie do różnorodnego zakresu nowotworów i pierwotnych linii komórkowych, a przede wszystkim dostosowują rutynowe techniki histologiczne do produkcji tych granulek^17,18. Po przetworzeniu i zatopieniu, granulki mogą być używane w podobny sposób jak tkanki. Obejmuje to stosowanie ich z indukowanymi ciepłem i enzymatycznymi protokołami pobierania antygenów w eksperymentach immunohistochemicznych. Jednym z celów metodologii zastosowanych w tym protokole jest zachowanie morfologii i antygenowości komórek w całym procesie. Dlatego EDTA, który jest stosunkowo łagodny pod względem zmian zarówno morfologii, jak i antygenowości, jest używany do odłączania komórek. Nie oznacza to, że inne podejścia, takie jak zakłócenia fizyczne, nie są wykonalne; Jednak każde podejście do odłączenia komórek powinno zapewnić, że komórki nie zostaną uszkodzone w tym procesie. Drugim celem tego protokołu jest utrwalenie i przetworzenie komórek w sposób podobny do tkanek, przy użyciu tego samego utrwalacza, proporcji utrwalania, harmonogramu przetwarzania (utrwalanie, odwadnianie, oczyszczanie i infiltracja parafiny) oraz technik osadzania, tak aby mogły służyć jako porównywalne kontrole dla dalszych testów. W związku z tym podejścia do utrwalania i przetwarzania stosowane do generowania osadów komórkowych powinny naśladować podejścia stosowane w przypadku tkanek.

Protokół opisany w tym raporcie nie jest przystosowany do postępowania z komórkami z czynnikami zakaźnymi, takimi jak komórki zakażone bakteriami chorobotwórczymi lub wirusami, ponieważ komórki są odłączane, zbierane i odwirowywane przed utrwaleniem. Badacze mogą rozważyć protokoły naprawy komórek przed odłączeniem, ale wymagałoby to dalszej optymalizacji, aby zebrać komórki bez zakłócania morfologii komórek. Ponadto czasy utrwalania i warunki postępowania z komórkami z czynnikami zakaźnymi wymagają dodatkowych rozważań w oparciu o czynnik zakaźny i związane z nim instytucjonalne protokoły bezpieczeństwa biologicznego.

Utrwalone formaliną, zatopione w parafinie granulki komórkowe są wyjątkowo korzystne, ponieważ mają dobrze zdefiniowane poziomy ekspresji białka¹⁰. Podczas gdy rak i endogenne linie komórkowe oferują wybór komórek o różnych poziomach ekspresji białek, technologie inżynierii genetycznej umożliwiają naukowcom modelowanie ekspresji białek poprzez nadmierną ekspresję białek będących przedmiotem zainteresowania i wykorzystanie technologii CRISPR do wycinania lub wstawiania genów kodujących interesujące nas^20,21. Wadą białek o nadmiernej ekspresji w liniach komórkowych jest to, że są one słabymi miarami czułości testu, ponieważ mogą nie reprezentować poziomów białek endogennych²². W przeciwieństwie do tego, zarówno endogenne linie komórkowe, jak i linie komórek rakowych mogą lepiej reprezentować endogenne poziomy ekspresji, a delecja genu kodującego w linii pokrewnej za pośrednictwem CRISPR może służyć jako odpowiednia kontrola negatywna. Ponadto endogenne linie komórkowe lub linie komórek nowotworowych o różnych poziomach ekspresji białka są idealne do eksperymentów miareczkowych w celu wybrania końcowych rozcieńczeń przeciwciał i najlepszego zrozumienia czułości testu (ryc. 2). Decyzja o tym, jakie linie komórkowe należy wykorzystać, powinna opierać się na indywidualnych potrzebach eksperymentalnych i często wykorzystywać kombinację podejść.

Oprócz oceny, czy przeciwciało może wykryć białko będące przedmiotem zainteresowania, panel linii komórkowych może być wykorzystany do zdefiniowania swoistości przeciwciała. Na przykład panel linii komórkowych, które indywidualnie wyrażają rodzinę blisko spokrewnionych białek, można wykorzystać do sprawdzenia, czy przeciwciało jest specyficzne dla pojedynczego białka, czy też wykrywa również inne blisko spokrewnione białka. Bardziej wyszukane kontrole mogą obejmować użycie linii komórkowych, które wyrażają, albo poprzez CRISPR knock-in, albo poprzez nadmierną ekspresję, białka z mutacjami punktowymi, które nie mogą ulegać określonym zdarciom sygnalizacyjnym, które są wykrywane (np. mutacja w określonych miejscach fosforylacji podczas oceny przeciwciała specyficznego dla fosfonu). Chociaż są to bardziej złożone podejścia, mogą być konieczne do potwierdzenia, że przeciwciało używane tylko do znakowania w określonych okolicznościach¹⁰.

Ważne jest, aby pamiętać, że manipulacje genetyczne linii komórkowych mogą nie generować jednorodnej populacji komórek. Na przykład skuteczność transfekcji w nadekspresji linii komórkowych zwykle nie wynosi 100%, a niektóre komórki mogą nie wykazywać nadmiernej ekspresji białka będącego przedmiotem zainteresowania. Włączenie flagi FLAG lub powiązanego znacznika do transfekcji, który można wykryć za pomocą standardowych metod, może być pomocne w ocenie skuteczności transfekcji linii komórkowej²³. Może to być pomocne zarówno w ustaleniu, czy transfekcja zakończyła się sukcesem i wykluczeniu braku wykrycia ze względu na ekspresję białka, jak i w celu posłużenia jako odniesienie dla oczekiwanej proporcji komórek, które powinny wyrażać białko będące przedmiotem zainteresowania.

Hybrydyzacja in situ (ISH) może być również korzystnym narzędziem do scharakteryzowania docelowej ekspresji genów w osadach komórkowych i informowania o rozwoju metody IHC¹⁰. Podczas badań przesiewowych przeciwciał pomocna może być informacja, kiedy można wykryć transkrypt, a tym samym potencjalne białko. Dodatkowo, badanie przesiewowe ISH granulek komórkowych może być korzystne dla rozwoju metody ISH. Chociaż swoistość rzadziej stanowi problem w przypadku testów ISH, nadal ważne jest, aby mieć odpowiednie kontrole i podobne względy dotyczące opracowywania i wykorzystywania kontroli, które można zastosować w badaniach ISH.

Mikromacierze tkankowe są tworzone poprzez usunięcie rdzeni z bloków dawczych i przeniesienie tych rdzeni, często w układzie siatki, do bloku parafiny biorcy. Ostatecznie blok biorczy zawiera spektrum próbek w jednym bloku, co pozwala na to, aby wszystkie próbki w bloku przeszły identyczne procedury IHC i pozwala na bezpośrednie porównanie wielu próbek na tym samym slajdzie^24,25. Ponieważ granulki komórkowe są stosunkowo jednorodnymi populacjami, mogą być dokładnie odwzorowane przez rdzenie o średnicy 1 mm, co czyni je idealnymi kandydatami do włączenia do podobnych tablic. Korzystając z macierzy osadów komórkowych, możliwe jest uwzględnienie na jednym szkiełku granulek komórkowych o różnych poziomach ekspresji, granulek komórkowych, które jednoznacznie wyrażają pokrewne białka, oraz granulek komórkowych, które wyrażają ortologi białka będącego przedmiotem zainteresowania z różnych gatunków na jednym slajdzie (ryc. 3). Pozwala to na jednoczesną ocenę wszystkich granulek komórek w jednolitych warunkach w szybki sposób, przy jednoczesnym zminimalizowaniu użycia odczynników²⁵.

W tym protokole zalecana jest minimalna początkowa objętość osadu komórkowego wynosząca 2 ml pobrana z ośmiu kolb T175. Objętość ta pozwala na produkcję i archiwizację wielokomórkowych bloków granulek, dzięki czemu kontrola granulek komórkowych może być ustandaryzowana w dłuższych okresach czasu i można utworzyć wiele układów granulek komórkowych z danej granulki. Mniejsze objętości osadów komórkowych mogą być stosowane w przypadku pierwotnych linii komórkowych pochodzących od pacjenta, wolno rosnących linii komórkowych lub gdy warunki ograniczają objętość próbki. Oczywiście, mniejsze objętości początkowe wzmocnią negatywny wpływ utraty komórek podczas utrwalania i przygotowania granulatu i ograniczą materiał dostępny dla dalszych procesów. Szczególnie ważne jest, aby zachować ostrożność podczas usuwania utrwalacza po odwirowaniu, aby zminimalizować wszelkie związane z tym straty. W przypadku mniejszych objętości próbek do granulowania komórek można użyć zakrytej probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml. Rury te można przeciąć wzdłużnie na pół za pomocą ostrza do obróbki.

Podobnie jak w przypadku utrwalania tkanek, utrwalenie komórek w tej pastylce ma kluczowe znaczenie dla dalszych ocen IHC. Aby osiągnąć całkowite utrwalenie, używamy co najmniej stosunku formaliny do komórki 10:1 i odwracamy stożkową rurkę, aby utrzymać komórki w zawiesinie. Jeśli komórki nie są w zawiesinie w momencie utrwalania, istnieje ryzyko niepełnego lub nieodpowiedniego utrwalenia, co wpłynie na dalsze znakowanie immunologiczne. Często objawia się to silnym etykietowaniem na obrzeżach i utratą etykietowania w środku granulki lub etykietowaniem o zmiennej intensywności na całej granulce.

Protokół ten wykorzystuje Histogel, który składa się głównie z hydroksyetyloagarozy, zarówno do wiązania osadu komórkowego, jak i umożliwienia równomiernego rozprowadzenia komórek w całej osadzie komórkowej. Bez niego komórki ulegają zagęszczeniu i tracą swoje szczegóły cytomorfologiczne. Te szczegóły cytomorfologiczne są często ważne podczas badań przesiewowych przeciwciał, ponieważ dostarczają dodatkowych informacji na temat tego, czy przeciwciało znakuje się w odpowiednim przedziale subkomórkowym (np. jądrze, cytoplazmie lub błonie plazmatycznej). W przeciwieństwie do tego, zbyt duża ilość żelu może skutkować niższą gęstością komórek w granulce, co prowadzi do szerokiego rozmieszczenia komórek i zmniejszenia liczby komórek na sekcję.

Protokół ten może być rutynowo stosowany do opracowywania mechanizmów kontrolnych IHC. Materiały potrzebne do stworzenia tych granulek są powszechne w laboratoriach biologii śledczej i histologii, a metody są proste i łatwe do dostosowania. Chociaż granulki komórkowe mają ograniczenia jako kontrole IHC, służą jako doskonałe narzędzia do wstępnych badań przesiewowych przeciwciał i uzupełniają inne kontrole tkanek.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% neutralna buforowana formalina	VWR	16004-128
50 ml stożkowa rurka	Becton Dickinson Labware	#0747-1886
70% etanol	Koptec	V1401
95% etanol	Koptec	V1101
Okłady biopsyjne	Surgipath Medical Industries, Inc	#01090
Costar Stripette serological pipeta 10 ml	Corning	CLS4101
Flex 100	Epredia	8101
Flex 95	Epredia	8201
Histogel	Thermo Scientific	#R904012
Leica Automatyczny mikrotom obrotowy	Leica	RM2255
Mikroszpatułka z zaokrąglonymi i stożkowymi końcami	Tedd Pella	#13510
NanoZoomer 2.0 HT Aparat do obrazowania całych slajdów	Hamamatsu
Paraplast Infiltracja/Osadzanie Parafina	Surgipath	39601006
Kontroler pipet	CAPP	PA-100
Odczynnik Alkohol	Epredia	9111
Sterling Probe 5 "Końcówka 2 mm z okiem	Roboz Surgical Instrument Co., Inc	#RS-9522
Dodatnio naładowane szkiełka mikroskopowe Superfrost Plus	Kasety Thermo Scientific	6776214
Tissue; Kaseta szczelinowa PrintMate	Epredia	B851120WH
TMA Tissue Grand Master	3DHistech LTD
Ksyleny	VWR	89370-088