Generowanie mysiego modelu sztucznego decydualizacji z owariektomią do badań nad decydualizacją endometrium

Podsumowanie

Tutaj opisujemy metodę generowania sztucznego modelu decydualizacji za pomocą myszy z owariektomią, klasyczny eksperyment decydualizacji endometrium w dziedzinie badań nad decydualizacją endometrium.

Streszczenie

Dziesiątkowanie endometrium to unikalny proces różnicowania endometrium, ściśle związany z miesiączką i ciążą. Upośledzenie decydualizacji prowadzi do różnych zaburzeń endometrium, takich jak niepłodność, nawracające poronienia i przedwczesny poród. Opracowanie i wykorzystanie modelu decydualizacji endometrium w badaniach reprodukcyjnych od dawna stanowi ważne dla badaczy zajmujących się reprodukcją. Mysz była szeroko stosowana w badaniu reprodukcji i decydualizacji. Istnieją trzy dobrze ugruntowane modele mysie dotyczące decydualizacji, a mianowicie naturalna decydualizacja ciąży (NPD), sztuczna decydualizacja (AD) i decydualizacja in vitro (IVD). Wśród nich AD jest uważany za wiarygodny model decydualizacji myszy, który jest łatwy do wdrożenia i bliski NPD. Niniejsza praca koncentruje się na zmodyfikowanej metodzie generowania i stosowania mysiego modelu sztucznego decydualizacji z owariektomią w celu uniknięcia wpływu na jajniki, co pozwala uzyskać wysoce powtarzalne wyniki przy małych wariancjach w obrębie grupy. Metoda ta zapewnia dobry i wiarygodny model zwierzęcy do badania decydualizacji endometrium.

Wprowadzenie

Wraz z rozwojem technologii wspomaganego rozrodu, obecny wskaźnik ciąż klinicznych z transferem zarodków in vitro (IVF-ET) osiągnął lub nawet przewyższył ten z naturalnej ciąży. Mimo to wiele pacjentek w praktyce klinicznej wspomaganego rozrodu nadal poddaje się wielokrotnym transferom zarodków, ale nie udaje im się zajść w ciążę zgodnie z oczekiwaniami. Jednak jego specyficzny mechanizm molekularny jest nadal niejasny, więc interwencja kliniczna jest nieskuteczna, co jest jednym z istotnych wyzwań stojących przed medycyną reprodukcyjną^1,2.

Czynniki endometrium odpowiadają za około dwie trzecie przyczyn niepowodzeń in vitro³. Implantacja ludzkiego zarodka dzieli się na trzy etapy: pozycjonowanie, adhezja i inwazja^4,5,6. Błona śluzowa macicy matki przechodzi szereg zmian, aby sprostać pojawieniu się zarodka. Tworzenie "okresu okienkowego" implantacji zapewnia korzystne warunki do implantacji zarodka^7,8.

U większości ssaków, po tym jak blastocysta przylega do nabłonka światła macicy, komórki zrębu otaczające blastocystę szybko zaczynają się namnażać i różnicować, a szybka przebudowa mezenchymisty zmienia jej kształt i funkcję, prowadząc do implantacji zarodka5^,9,10. Szybki wzrost objętości i masy miejsca pozwala blastocyście zagnieździć się w zrębie macicy, w procesie znanym jako decydualizacja¹¹. Zrąb endometrium różnicuje się i przebudowuje w ramach przygotowań do ciąży, podczas gdy przejście komórek zrębu zapewnia przestrzeń i nowe połączenia sygnalizacyjne dla komórek dziesiętnych, aby mogły wykonywać swoje funkcje^12,13. Komórki zrębu przekształcają się w komórki dziesiętne i wydzielają wiele kultowych czynników, takich jak prolaktyna (PRL), białko wiążące insulinopodobny czynnik wzrostu 1 (Igfbp1) i tak dalej. Badania wykazały, że nieprawidłowa decydualizacja jest jedną z głównych przyczyn niepowodzenia implantacji zarodka, ale przyczyna nieprawidłowej decydualizacji jest nadal niejasna i wymaga dalszego wyjaśnienia^1,14.

Mysi model sztucznej decydualizacji jest niezbędny do badania procesu fizjologicznego i mechanizmów molekularnych leżących u podstaw decydualizacji. Sztuczne decydualizacja (AD) odnosi się głównie do procesu decydualizacji endometrium ustanowionego sztucznymi metodami w celu symulacji ciąży lub cyklu miesiączkowego. Jeśli chodzi o morfologię, ogólna różnica między decydualizacją ciąży a sztuczną decydualizacją jest niewielka^15,16. Gruczoły maciczne istnieją w błonie śluzowej macicy przed utworzeniem decydui i znikają po zdziesiątkowaniu. Jeśli chodzi o ekspresję genu, stwierdzono tylko niewielką różnicę między naturalną decydualizacją ciąży (NPD) a AD¹⁵. W związku z tym model sztucznej decydualizacji u myszy może symulować decydualizację ciąży w celu zbadania nieznanej patogenezy i nowego leczenia chorób rozrodczych u ludzi.

NPD, AD i decydualizacja in vitro (IVD) to trzy metody osiągania dziesiątkowania myszy. Model NPD zależy od naturalnej ciąży i jest najbliższy matczynemu stanowi fizjologicznemu, w tym efektom ze strony zarodków. Porównywanie różnic między miejscami implantacji i bez implantacji jest bardziej fizjologicznym i wygodnym podejściem do badania decydualizacji. Model AD został opracowany przy użyciu wewnątrzmacicznego wstrzyknięcia oleju sezamowego jako stymulanta w celu wywołania decydualizacji u pseudociężarnej samicy myszy skrzyżowanej z samcami po wazektomii, aby uniknąć wpływu zarodków. Zarówno model NPD, jak i AD odgrywają istotną rolę w różnych celach badawczych, ale nie mogą uniknąć niepowodzenia kojarzenia i różnic wewnątrz grupy spowodowanych różnymi czynnościami metabolizmu hormonów matczynych. IVD to metoda zależna od leczenia skojarzonym estrogenem i progesteronem na poziomie komórkowym, która wymaga bardziej rygorystycznych warunków eksperymentalnych i zdolności operacyjnej. Jednak model in vitro nie może w pełni symulować odpowiedzi dziesiętnej w warunkach fizjologicznych¹⁵. Dlatego proponujemy prostą i ulepszoną metodę indukcji, zmodyfikowaną w stosunku do tradycyjnej choroby Alzheimera, w celu zmniejszenia wpływu hormonów endogennych na decydualizację. Opierając się na zapewnieniu powodzenia indukcji decydualizacji, jest bliższa stanowi fizjologicznemu i bardziej odpowiednia do eksperymentów, które muszą wykluczyć czynniki zarodkowe.

Protokół

Wszystkie opisane eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Użytkowania i Opieki nad Zwierzętami (nr 20171202) Szpitala Drum Tower Hospital of Nanjing University Medical School. Wszystkie operacje są prowadzone zgodnie z odpowiednimi wytycznymi agencji ds. opieki nad zwierzętami i ich wykorzystania.

UWAGA: Myszy były hodowane w specyficznym środowisku wolnym od patogenów (SPF), o temperaturze 22 °C ± 1 °C, wilgotności względnej 50% ± 1%, cyklu światło/ciemność 12 godzin/12 godzin oraz swobodnym dostępie do jedzenia i wody.

1. Owariektomia myszy

1. Narzędzia chirurgiczne należy wysterylizować sterylizatorem wysokotemperaturowym i wysokociśnieniowym na 1 dzień przed operacją.
2. Zważ 8-tygodniowe myszy C57BL / 6 i dootrzewnowo (i.p) wstrzyknij odpowiednio 1% pentobarbitalu sodu, aby znieczulić myszy. Stosowana dawka to 40 mg/kg¹⁷. Dawka ta zapewnia 40-60 minut sedacji, co spełnia wymagania wycięcia jajników. W przypadku analgezji przedoperacyjnej należy wstrzyknąć myszom meloksykam (s.c) w dawce 5 mg/kg (s.c).
   UWAGA: Skuteczne znieczulenie u myszy może być wskazane przez zanik głębokich odruchów mięśniowych i jednostajny oddech. Oznaki udanego znieczulenia to brak mrugania podczas dotykania wewnętrznej kantu, brak połykania podczas ciągnięcia języka, brak zginania nóg podczas szczypania skóry między palcami i brak podskakiwania podczas nakłuwania ogona.
3. Nałóż ochronną maść na oczy na gałki oczne, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia.
4. Rozpocznij operację, gdy myszy są całkowicie znieczulone. Umieść i zamocuj myszy w pozycji leżącej na powierzchni operacyjnej i ogol włosy z tyłu po zwilżeniu ich wodą z mydłem. Po goleniu zdezynfekuj skórę 70% etanolem.
5. Znajdź miejsce nacięcia operacji na wysokości 0,5 cm (lub 1,0 cm poniżej żebra) na górnej krawędzi nasady uda obu kończyn tylnych równolegle do kręgosłupa (Rysunek 1A).
   UWAGA: Prawidłowe miejsce nacięcia jest niezbędne do szybkiej lokalizacji jajnika.
6. Weź miejsce nacięcia jako środek i zdezynfekuj obszar nacięcia jodoforem 3x, a następnie umieść serwetę chirurgiczną wokół obszaru nacięcia.
7. Wykonaj podłużne nacięcie około 0,5-1,0 cm za pomocą nożyczek. Przetnij powięź i biernie oddziel mięśnie pęsetą.
8. Znajdź kawałek białej poduszeczki tłuszczowej w polu nacięcia w pobliżu dolnego bieguna nerki przez cienką warstwę mięśniową (Rysunek 1B).
   UWAGA: Biała poduszeczka tłuszczowa jest najbardziej oczywistym wskaźnikiem lokalizacji jajnika.
9. Zacisnąć masę tłuszczową za pomocą klipsów hemostatycznych i wyciągnąć jajnik owinięty poduszką tłuszczową z nacięcia.
10. Zacisnąć połączenie jajnika i jajowodu za pomocą zakrzywionej pęsety i usunąć jajnik wzdłuż szypułki jajnika nożyczkami. Zatamować krwawienie za pomocą wstrzykiwacza do elektrokoagulacji lub igły strzykawki o pojemności 1 ml podgrzanej na lampie alkoholowej.
    UWAGA: Pamiętaj, aby zachować jajowód, który jest anatomicznym punktem orientacyjnym dla późniejszego wstrzyknięcia oleju sezamowego do rogów macicy.
11. Przepłucz nacięcie chirurgiczne zwykłą solą fizjologiczną, aby zapobiec zrostowi tkanek, użyj szwu 4-0, aby zszyć odpowiednio mięsień i skórę, a następnie ponownie zdezynfekuj nacięcie chirurgiczne jodoforem.
12. Umieść myszy w pozycji leżącej w klatce i reanimuj je w inkubatorze o temperaturze 25 °C wyposażonym w źródło światła i system wentylacji przez około 2 godziny.
13. Zwróć uwagę na myszy po operacji, umieść je z powrotem w pierwotnym miejscu karmienia, aż całkowicie wyzdrowieją, i daj im wystarczającą ilość wody i jedzenia.

2. Odpoczynek pooperacyjny a preparat estrogenu i progesteronu

1. Upewnij się, że myszy odpoczywają przez 2 tygodnie po wycięciu jajników.
2. W ultra czystej szafce dodaj estrogen (2 ng/μl) i progesteron (0,2 ng/μl) do oleju sezamowego w probówkach wirówkowych bez enzymów RNA.
3. Umieścić probówki wirówkowe w termostatycznej łaźni wodnej o temperaturze 37 °C i ciągle wstrząsać probówkami, aby przyspieszyć rozpuszczanie.
4. Po całkowitym rozpuszczeniu podziel roztwór oleju sezamowego na 100 μl aliqoutów dla wygody użycia. Przygotowane roztwory estrogenu i progesteronu przechowywać w lodówce w temperaturze 4 °C.

3. Sztuczny model decydualizacji indukowanej

1. Podskórnie (s.c) wstrzyknij 100 ng estrogenu w 50 μl oleju sezamowego każdej myszy przez 3 dni, a następnie 2 dni odpoczynku¹⁵.
   UWAGA: Upewnij się, że estrogen i progesteron zostały sformułowane i umieszczone w różnych miejscach. Każde zanieczyszczenie estrogenu progesteronem może prowadzić do niepowodzenia.
2. Wstrzyknij (s.c.) 1 mg progesteronu i 10 ng estrogenu w 50 μl oleju sezamowego każdej myszy przez kolejne 3 dni¹⁵.
3. Uruchom myszy, aby wywołać sztuczny model decydualizacji¹⁵ 6 godzin po trzecim połączonym wstrzyknięciu estrogenu i progesteronu.
4. Znajdź róg macicy na dolnym końcu jajowodu i powoli wstrzyknij 20 μl oleju sezamowego wraz z rogiem macicy, odepchnij tkankę do tyłu, zszyj nacięcie i pozwól myszy dojść do siebie. Podejście do operacji jest takie samo jak w przypadku wycięcia jajników u myszy¹⁵.
   UWAGA: Drugą operację należy przeprowadzić tylko w przypadku udanej wycięcia jajników (nacięcie skóry jest dobrze zagojone, jajnik jest całkowicie wycięty, a resztkowy koniec jajowodu nie przylega do otaczających tkanek).
   UWAGA: Do wywołania modelu AD odpowiednie jest 20 μl oleju sezamowego; ponad 20 μl oleju sezamowego z łatwością przeniknie na drugą stronę.
5. Wstrzyknij (s.c.) 50 μl oleju sezamowego zawierającego 1 mg progesteronu i 10 ng estrogenu (H.) przez kolejne 4 dni. Zobacz szczegóły w Rysunek 2^15,18.

4. Pobieranie próbek

1. Poddaj myszy eutanazji (n = 6) przez uduszenie dwutlenkiem węgla i zbierz macicę. Obserwuj kształt obustronnej macicy, rób zdjęcia i waż rogi macicy (Ryc. 3A, B).
2. Przymocuj 3-5 mm tkanki macicy za pomocą 10% formaliny, zanurz w parafinie i pokrój je. Wybarwić skrawki hematoksyliną i eozyną, aby zaobserwować zmiany morfologiczne¹⁹ (Rysunek 4A).
3. Zanurz kolejne 3-5 mm tkanki macicy w związku o optymalnej temperaturze cięcia (OCT), zamroź w ciekłym azocie i przechowuj w lodówce o temperaturze -80 °C. Zamrożone przecięcie tkanki do 10 μm i wykrycie aktywności fosfatazy alkalicznej w tkance macicy metodą sprzęgania azowego²⁰ (Rysunek 4B).
   UWAGA: Zadowalające wyniki można uzyskać przy użyciu skrawków zamrożonych do wykrywania zawartości ALP, a nie skrawków parafinowych.
Wyodrębnij całkowite RNA macicy za pomocą odczynnika Trizol i wykonaj ilościowy PCR w czasie rzeczywistym (qPCR) w systemie PCR w czasie rzeczywistym (Tabela materiałów) z główną mieszanką qPCR (Tabela materiałów) w celu wykrycia względnej ekspresji mRNA członka podrodziny prolaktyny 8 2 (Prl8a2), fosfatazy alkalicznej wątroby / kości / nerki (Alpl) i białka wiążącego insulinopodobny czynnik wzrostu 1 (Igfbp1) 15 poprzez normalizację do poziomów mRNA 18S (
4. Rysunek 4C-E). Postępuj zgodnie z warunkami PCR: Etap 1, 95 °C przez 30 s; Etap 2, 95 °C przez 10 s i 60 °C przez 30 s; Powtórz cykl 40 razy. Pełny wykaz sekwencji starterów znajduje się w tabeli 1.
5. Analizuj dane qPCR za pomocą metody ^2-ΔΔCT i metody testu t do analizy statystycznej w odpowiednim oprogramowaniu. W tym badaniu p < 0,05 uznano za statystycznie istotne.

Wyniki

Indeksy mysiego modelu decydualizacji obejmują ogólną morfologię macicy, stosunek mas macicy zdziesiątkowanej i niedecydualizowanej, histologiczną morfologię endometrium oraz poziom ekspresji cząsteczek markera decydualizacji. Ogólna morfologia sztucznej zdziesiątkowanej macicy myszy wywołanej olejem jest bliższa morfologii macicy w ciąży. Trzon macicy staje się gruby, a jama macicy staje się mniejsza niż strona nieindukowana. Objętość i waga indukowanego rogu macicy są znacznie wyższe niż w przypadku strony nieindukowan...

Dyskusja

Decydualizacja u myszy jest procesem spontanicznym zależnym od obecności zarodków, który różni się od ludzi. Stwierdzono jednak, że sztuczna stymulacja, taka jak wstrzyknięcie do macicy szklanych kulek i uszkodzenie macicy, może wywołać decydualizację endometrium zamiast zarodków. Ponadto naukowcy odkryli, że wiele czynników może indukować decydualizację lub uczestniczyć w decydualizacji, takich jak wstrzykiwanie hormonów steroidowych, prostaglandyn i czynników hamujących wzrost do jamy macicy²¹. ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Estrogen	Sigma	E2758	Suplement hormonalny
Progesteron	Sigma	P0130	Suplement hormonalny
Olej sezamowy	Sigma	S3547	Suplement hormonalny
Pentobarbital sodu	Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd.		Znieczulenie
Meloksykam do wstrzykiwań	Qilu Animal Health Products Co., Ltd		Analgezja
Alkaliczny zestaw barwników fosfatazowych (metoda łączenia Kaplowa / Azo)	Solarbio	G1480	Alkaliczna plama fosfatazowa
Eosin	Servicebio	G1005-2	HE Barwnik
Hematoksylina	Servicebio	G1005-1	Barwnik HE
ChamQ Uniwersalny SYBR qPCR Master Mix	Vazyme	Q711-02	qPCR
70% etanol	Lircon	ZH1120090	Dezynfekcja
Jodoforu	Runzekang	RZK-DF	Dezynfekcja
Erytromycyna Maść do oczu	Guangzhou Baiyunshan		Myszy Eyeball protect
4-0 szew	Ethicon	W329	Szew do nacięcia
10% formaliny	Yulu	L25010118	Tissue fix
Optymalna temperatura cięcia związek	Sakura	4583	Odczynnik Ssection
Trizol	Ambion	15596018	qPCR