Artykuł metodologiczny

Hybrydowy system analizy komórek do oceny zmian strukturalnych i kurczliwych ludzkich kardiomiocytów pochodzących z iPSC do przedklinicznej oceny ryzyka kardiologicznego

DOI:

10.3791/64283

⸱

20 października 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1innoVitro GmbH, 2Nanion Technologies GmbH

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Analiza zmian w funkcji skurczowej i integralności komórkowej ludzkich kardiomiocytów pochodzących z iPSC ma ogromne znaczenie dla nieklinicznego rozwoju leków. Hybrydowy system analizy komórek z 96 dołkami analizuje oba parametry w czasie rzeczywistym i w sposób fizjologiczny, zapewniając wiarygodne wyniki istotne dla człowieka, niezbędne do bezpiecznego przejścia do etapów klinicznych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ocena kurczliwości serca ma ogromne znaczenie dla rozwoju nowych terapii i ich bezpiecznego przejścia do etapów klinicznych. Podczas gdy indukowane przez człowieka pluripotencjalne kardiomiocyty pochodzące z komórek macierzystych (hiPSC-CM) mogą służyć jako model istotny dla człowieka w przedklinicznych fazach odkrywania leków i farmakologii bezpieczeństwa, ich dojrzałość jest nadal kontrowersyjna w środowisku naukowym i jest stale rozwijana. Przedstawiamy hybrydową technologię kurczliwości i impedancji/potencjału pola zewnątrzkomórkowego (EFP), dodając znaczące funkcje pro-dojrzewania do standardowej w branży platformy 96-dołkowej.

System impedancji/EFP monitoruje funkcjonalność sieci komórkowej w czasie rzeczywistym. Oprócz szybkości dudnienia komórek kurczliwych, odczyty spektroskopii impedancji elektrycznej wykrywają zmiany morfologiczne wywołane związkiem, takie jak gęstość komórek i integralność monowarstwy komórkowej. W drugim komponencie hybrydowego systemu analizy komórek komórki są hodowane na błonach biozgodnych, które naśladują środowisko mechaniczne prawdziwej tkanki serca. To środowisko fizjologiczne wspomaga dojrzewanie hiPSC-CM in vitro, prowadząc do bardziej podobnych do dorosłych reakcji skurczowych, w tym pozytywnych efektów inotropowych po leczeniu izoproterenolem, S-Bay K8644 lub omecamtiv mecarbil. Parametry takie jak amplituda siły skurczu (mN/mm2) i czas trwania dudnienia ujawniają również dalsze działanie związków mających wpływ na właściwości elektrofizjologiczne i obsługę wapnia.

System hybrydowy stanowi idealne narzędzie do holistycznej analizy komórek, umożliwiając przedkliniczną ocenę ryzyka sercowo-naczyniowego poza obecnymi perspektywami testów komórkowych istotnych dla człowieka.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jednym z głównych celów rozwoju nowoczesnych leków jest poprawa wskaźnika sukcesu nowych terapii w procesie odkrywania nowych leków. Testy farmakologiczne bezpieczeństwa tych nowych leków często ujawniają działania niepożądane leków na układ sercowo-naczyniowy, które stanowią prawie jedną czwartą wskaźnika wyczerpania leków na etapach przedklinicznych1. Rozwój i integracja metodologii nowego podejścia (NAM) odgrywają kluczową rolę w modernizacji oceny przedklinicznej, w szczególności narządów rdzeniowych, takich jak serce. Ponieważ metodologie te są podejściem wolnym od zwierząt, wykorzystanie modeli komórek opartych na ludziach, takich jak kardiomiocyty (CM) pochodzenia indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC), stało się koniem pociągowym w ciągu ostatniej dekady dla nowoczesnej oceny bezpieczeństwa problemów farmakologicznych i toksykologicznych2. Powszechnie stosowanymi systemami testowymi do takich badań są matryce mikroelektrod (MEA) i podejścia eksperymentalne oparte na barwnikach wrażliwych na napięcie3.

Niemniej jednak, deklarowana fenotypowa i funkcjonalna niedojrzałość tego typu komórek stawia przeszkody na drodze do idealnego modelu komórkowego opartego na człowieku, z potencjałem do zmniejszenia luk translacyjnych między badaniami nieklinicznymi i klinicznymi4.

Przez lata prowadzono ogromne badania, aby zrozumieć przyczynę domniemanego niedojrzałego fenotypu i znaleźć sposoby na przyspieszenie procesu dojrzewania ludzkich iPSC-CM in vitro.

Brak wskazówek dojrzewania serca, takich jak wydłużony czas hodowli komórek, brak innych typów komórek w pobliżu, lub brak stymulacji hormonalnej wpływa na proces dojrzewania5. Również niefizjologiczne środowisko zwykłych płytek do hodowli komórkowych zostało zidentyfikowane jako istotna przyczyna utrudniająca dojrzewanie ludzkich iPSC-CM, ze względu na brak sztywności substratu fizjologicznego rodzimego ludzkiego serca5,6.

Aby rozwiązać ten problem, opracowano różne systemy testowe skupiające się na natywnych warunkach fizjologicznych, w tym systemy hodowli komórkowych 3D, w których komórki są ustawione trójwymiarowo, aby przypominały natywną architekturę serca, a nie typowe dwuwymiarowe hodowle komórek7. Chociaż lepsze dojrzewanie uzyskuje się za pomocą testów 3D, zapotrzebowanie na wykwalifikowaną siłę roboczą i niska przepustowość tych systemów utrudniają obfite wykorzystanie ich w procesie opracowywania leków, ponieważ czas i koszt odgrywają fundamentalną rolę w ocenie nowych terapii na poziomie finansowym8.

Ważne wnioski dla bezpieczeństwa farmakologicznej i toksykologicznej oceny nowych terapii to zmiany w funkcjonalnych i strukturalnych cechach ludzkich iPSC-CMs, ponieważ wywołane związkiem niepożądanym reakcje na leki układu sercowo-naczyniowego zwykle wpływają na jedną lub obie te właściwości1,9. Dobrze znanymi przykładami takich szerokich działań niepożądanych są leki przeciwnowotworowe z rodziny antracyklin. W tym przypadku niebezpieczne funkcjonalne i niekorzystne skutki strukturalne na układ sercowo-naczyniowy są szeroko zgłaszane w trakcie i po leczeniu raka u pacjentów, a także w testach komórkowych in vitro10,11.

W niniejszym badaniu opisujemy kompleksową metodologię oceny zarówno funkcjonalnych, jak i strukturalnych skutków ubocznych związków na hiPSC-CMs. Metodologia obejmuje analizę siły skurczu i impedancji kardiomiocytów/potencjału pola zewnątrzkomórkowego (EFP). Siła skurczu jest mierzona w fizjologicznych warunkach mechanicznych, a komórki są hodowane na miękkich (33 kPa) podłożach silikonowych, odzwierciedlających środowisko mechaniczne rodzimej tkanki ludzkiego serca.

System jest wyposażony w 96-dołkowe płytki do wysokoprzepustowej analizy ludzkich iPSC-CM do przedklinicznych badań farmakologicznych i toksykologicznych bezpieczeństwa serca, co daje przewagę obecnie stosowanym metodom 3D, takim jak serce Langendorffa lub plastry serca12,13.

Szczegółowo, system hybrydowy składa się z dwóch modułów, albo do oceny kurczliwości serca w warunkach fizjologicznych, albo do analizy strukturalnej toksyczności komórkowej w czasie rzeczywistym6,14. Oba moduły współpracują ze specjalistycznymi płytkami 96-dołkowymi o wysokiej przepustowości w celu szybkiego i ekonomicznego pozyskiwania danych.

Bez potrzeby tworzenia konstrukcji 3D, moduł kurczliwości wykorzystuje specjalne płytki, które zawierają elastyczne membrany silikonowe jako podłoże dla komórek, zamiast sztywnego szkła lub plastiku, z których zwykle składają się zwykłe płytki do hodowli komórkowych. Membrany odzwierciedlają typowe dla człowieka właściwości biomechaniczne serca i dlatego naśladują warunki in vivo w sposób wysokoprzepustowy. Podczas gdy ludzkie iPSC-CM często nie wykazują zachowania dorosłych kardiomiocytów w odniesieniu do dodatniej inottropii indukowanej związkiem w innych testach komórkowych14, reakcję bardziej podobną do dorosłej można ocenić, gdy komórki są hodowane na płytkach modułu kurczliwości. W poprzednich badaniach wykazano, że iPSC-CM wykazują pozytywne działanie inotropowe po leczeniu związkami takimi jak izoproterenol, S-Bay K8644 lub omecamtiv mecarbil6,15. W tym miejscu można ocenić wiele parametrów kurczliwości, takich jak parametry podstawowe, takie jak amplituda siły skurczu (mN/mm2), czas trwania dudnień i szybkość dudnień, a także drugorzędne parametry cyklu skurczu, takie jak obszar pod krzywą, nachylenia skurczu i relaksacji, zmiany szybkości dudnień i arytmie (rysunek uzupełniający 1)16. Wywołane lekiem zmiany wszystkich parametrów są oceniane nieinwazyjnie za pomocą pojemnościowego wykrywania odległości. Surowe dane są następnie analizowane przez specjalistyczne oprogramowanie.

Moduł toksyczności strukturalnej dodaje swoje unikalne parametry impedancji i EFP jako odczyt dla strukturalnej toksyczności komórkowej i analizy właściwości elektrofizjologicznych17,18. Technologia spektroskopii impedancji elektrycznej ujawnia wywołane przez związki zmiany w gęstości komórek lub integralności komórek i monowarstw monitorowane w czasie rzeczywistym, jak pokazano w przypadku ludzkich iPSC-CM traktowanych znanymi związkami kardiotoksycznymi13. Dzięki odczytom impedancji przy różnych częstotliwościach (1-100 kHz) możliwa jest dalsza analiza reakcji fizjologicznej, a tym samym ujawnienie zmian w topografii błony, połączeniach komórka-komórka lub komórka-macierz. Dodatkowy zapis EFP ludzkich iPSC-CM umożliwia dalszą analizę efektów elektrofizjologicznych wywołanych przez leczenie związkiem, jak wykazano w świetle badania17,19.

W obecnym badaniu, zastosowano ludzkie iPSC-CMs, leczone epirubicyną i doksorubicyną, oba dobrze opisane jako kardiotoksyczne antracykliny, oraz erlotynib, inhibitorem kinazy tyrozynowej (TKI) o raczej niskim ryzyku toksyczności sercowo-naczyniowej. Przewlekłą ocenę epirubicyny, doksorubicyny i erlotynibu prowadzono przez 5 dni. Wynik pokazuje niewielkie zmiany w kurczliwości i impedancji zasadowej, gdy komórki były traktowane erlotynibem, ale zależny od czasu i dawki toksyczny spadek amplitudy skurczu i impedancji zasady po leczeniu odpowiednio epirubicyną i doksorubicyną. Ostre pomiary przeprowadzono za pomocą blokera kanału wapniowego nifedypiny i wykazały spadek amplitudy skurczu, czasu trwania potencjału pola i impedancji zasady, wykazując kardiotoksyczne skutki uboczne tego związku na poziomie funkcjonalnym i strukturalnym.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Przebieg pracy dla pomiaru kurczliwości i impedancji/EFP jest podany na rysunku uzupełniającym 2.

1. Powłoka płyty

  1. Otwórz zamknięte próżniowo opakowanie i wyjmij płytkę 96-dołkową. Procedury postępowania z płytkami 96-dołkowymi obu modułów są takie same. Płytkę skurczową należy pozostawić przykrytą dodatkowo dostarczoną osłoną membranową do czasu pomiaru w module kurczliwości.
  2. Pokryj elastyczne 96-dołkowe płytki do wysiewu kardiomiocytów.
    1. Przygotować rozcieńczony roztwór do powlekania żelem EHS, przenosząc 2,75 ml gotowego do użycia roztworu żelu EHS w sterylnej probówce wirówkowej. Następnie dodaj 8,25 ml DPBS z Ca2+ i Mg2+. Dokładnie wymieszaj roztwór.
      UWAGA: Opcjonalnie fibronektyna może być również użyta do pokrycia studzienek: przygotuj 13 ml roztworu powlekającego fibronektynę w sterylnej probówce wirówkowej, rozcieńczając 650 μl roztworu podstawowego fibronektyny (1 μg/ml) w 13 ml DPBS z Ca2+ i Mg2+, co daje roztwór roboczy o stężeniu 50 μg/ml. Dokładnie wymieszaj roztwór.
  3. Przenieś roztwór powlekający do sterylnego zbiornika odczynnika umieszczonego w robocie automatyki laboratoryjnej.
  4. Dodać 100 μl roztworu powlekającego do każdego dołka za pomocą robota automatyki laboratoryjnej za pomocą programu "ADD100μL". Umieścić pokrywkę z powrotem na płytce 96-dołkowej i inkubować przez 3 godziny w temperaturze 37 °C.
    UWAGA: Program robota automatyki laboratoryjnej należy wcześniej ustawić ręcznie.

2. Wysiewanie ludzkich kardiomiocytów pochodzących z iPSC do elastycznych 96-dołkowych płytek (Dzień 0)

  1. Rozmrozić ogniwa zgodnie z wytycznymi producenta.
  2. Policz komórki za pomocą ręcznej komory liczącej i dostosuj komórki w zalecanym podłożu galwanicznym zgodnie z instrukcjami producenta ogniwa (np. 1 x 105 komórek/dołek), co daje 11 x 106 komórek/11 ml do wysiewu całej płytki 96-dołkowej.
  3. Usuń roztwór żelu EHS ze studzienek za pomocą robota automatyki laboratoryjnej za pomocą programu "REMOVE100μL". Wyjmij z robota zbiornik odczynnika zawierający dozowany roztwór powlekający.
  4. Przenieś zawiesinę komórek (łącznie 11 ml) do sterylnego zbiornika na odczynnik umieszczonego w robocie automatyki laboratoryjnej i zasiej komórki 100 μl/studzienkę za pomocą programu "CELLS_ADD100 μL".
  5. Natychmiast po wysianiu komórek przenieś elastyczną 96-dołkową płytkę do inkubatora (37 °C, 5% CO2 , kontrolowana wilgotność) i pozwól komórkom osiąść przez noc.

3. Wymiana medium elastycznych płytek 96-dołkowych (Dzień 1)

  1. Podgrzać co najmniej 22 ml pożywki podtrzymującej kardiomiocyty na płytkę do temperatury 37 °C w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml po wysianiu płytek, 18-24 godziny po wysianiu płytek.
  2. Przenieś świeżą pożywkę (co najmniej 22 ml) do sterylnego zbiornika na odczynnik i pozostaw ją tuż obok robota automatyzującego laboratorium. Umieść pusty zbiornik odczynnika w robocie i wykonaj usuwanie medium za pomocą programu "REMOVE100μL". Następnie należy wymienić zbiornik odczynnika zawierający pożywkę odpadową na zbiornik odczynnika zawierający świeżą pożywkę i dozować 200 μl świeżego podłoża na studzienkę za pomocą programu "ADD100μL". Wykonaj ten krok dwukrotnie, aby osiągnąć 200 μl/studzienkę.
  3. Natychmiast po wymianie pożywki przenieść płytkę z powrotem do inkubatora.
  4. Przeprowadzać wymianę pożywki (200 μl/studzienkę) co drugi dzień, aż do dodania mieszanki.

4. Końcowa wymiana podłoża przed dodaniem mieszanki (Dzień 5-7)

  1. Wykonać końcową wymianę podłoża 4-6 godzin przed dodaniem mieszanki.
  2. Ogrzać co najmniej 22 ml buforu do oznaczania na jedną elastyczną płytkę 96-dołkową. Bufor do oznaczania składa się z pożywki podtrzymującej lub jej pochodnych (np. pożywki o niskim lub zerowym poziomie surowicy, pożywki wolne od czerwieni fenolowej lub inne izotoniczne).
  3. Przenieś świeżą pożywkę do sterylnego zbiornika na odczynniki i pozostaw ją tuż obok robota automatyki laboratoryjnej. Umieść pusty zbiornik odczynnika w robocie i wykonaj usuwanie pożywki. Następnie wymień zbiornik odczynnika zawierający pożywkę odpadową na zbiornik odczynnika zawierający świeże podłoże i dozuj 200 μl/studzienkę świeżego podłoża.
  4. Natychmiast po wymianie pożywki przenieść elastyczną płytkę z powrotem do inkubatora.

5. Dodawanie związków i zapis danych (Dzień 5-7)

UWAGA: Przykładowy plan pomiarowy dla eksperymentu znajduje się na rysunku uzupełniającym 3.

  1. Przygotować roztwór roboczy na związek o stężeniu 4x w okapie z przepływem laminarnym za pomocą sterylnej płytki dołkowej o głębokości 96. Roztwór złożony jest oparty na buforze testowym użytym w kroku 4. Przenieść płytkę dołka o głębokości 96 cm, zawierającą roztwór związku, na co najmniej 1 godzinę do inkubatora, aby dostosować ją do tego samego stanu, co płytka elastyczna.
    UWAGA: Stężenie 1x każdego leku użytego w każdym eksperymencie jest podane na rysunkach i legendach.
  2. Przenieść płytkę do odpowiedniego urządzenia pomiarowego na 1 godzinę przed wykonaniem pomiaru podstawowego.
  3. Otwórz Edit Protocol w oprogramowaniu sterującym (część hybrydowego systemu analizy komórek) i wybierz odpowiedni tryb pomiaru: kurczliwość lub impedancję/EFP.
  4. Określ czas trwania przemiatania (długość jednego pomiaru, np. 30 s) i interwał powtórzeń (czas między pomiarami; np. 5 min) i zapisz numer protokołu.
  5. Wybierz opcję Rozpocznij protokół > Kontynuuj i wypełnij wymagane pola.
  6. Na koniec wybierz opcję Rozpocznij pomiar. Wykonaj co najmniej trzy pomiary podstawowe (przemiatanie) w odstępach 5-minutowych na krótko przed dodaniem mieszanki.
    UWAGA: Przykładowe dane dotyczące pomiaru linii bazowej kurczliwości przy użyciu modułu kurczliwości przed dodaniem związku przedstawiono na rysunku uzupełniającym 4
  7. Usunąć 50 μl buforu testowego z każdej studzienki bez wyjmowania elastycznej płytki 96-dołkowej z urządzenia pomiarowego.
  8. Dodać 50 μl 4x stężonego roztworu związku do każdego dołka płytki, zgodnie z planem pomiarów.
  9. Wybierz opcję Dodaj znacznik regionu i zdefiniuj układ blachy złożonej oraz objętość roztworu złożonego po dodaniu składnika.
  10. Na koniec wybierz opcję Kontynuuj pomiar standardowy lub Kontynuuj serię pomiarów zgodnie z planem eksperymentu.

6. Analiza danych

  1. Za pomocą oprogramowania do nagrywania mierz przebiegi, których długość i interwał powtórzeń są definiowane przez użytkownika.
  2. Dzięki oprogramowaniu analitycznemu uchwyć kształt sygnału, automatycznie odczytując parametry, takie jak amplituda, szybkość dudnienia, szerokość impulsu i tak dalej.
    UWAGA: Uśredniony sygnał z uwzględnieniem odchylenia standardowego, tzw. średniego uderzenia, jest automatycznie obliczany na podstawie danych z jednego przebiegu. Użytkownik może zdefiniować parametry kurczliwości/IMP/EFP, które oprogramowanie oblicza i wyświetla.
  3. Za pomocą oprogramowania analitycznego oblicz krzywą dawka-odpowiedź i IC50/EC50 dla każdego związku.
    UWAGA: Surowe dane i wyniki analizy wygenerowane za pomocą oprogramowania analitycznego można łatwo wyeksportować w różnych formatach. Na koniec raporty danych są generowane automatycznie w celu podsumowania i zarchiwizowania wyników eksperymentu. Wyczerpujący opis tego, co i jak mierzy sygnał EFP, znajduje się w 17.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wpływ inhibitora kinazy, erlotynibu, na kurczliwość hiPSC-CMs, jest pokazany w Rysunek 1. Komórki traktowano stężeniami w zakresie od 10 nM do 10 μM przez 5 dni, a parametry uderzenia rejestrowano codziennie. Erlotynib, inhibitor EGFR (receptora naskórkowego czynnika wzrostu) i kinazy tyrozynowej o porównywalnie niskim ryzyku kardiotoksyczności, miał niewielki wpływ zależny od dawki i czasu na hiPSC-CM tylko w stężeniach w zakresie mikromolowym. Przy najmniejszym stężeniu (10 nM) erlotynib p...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hybrydowy system impedancji/EFP/kurczliwości jest kompleksową metodologią wysokoprzepustowej, bezpiecznej, farmakologicznej i toksykologicznej oceny obciążeń serca na potrzeby przedklinicznego opracowywania leków. Zapewnia nowoczesne podejście do przedklinicznych badań bezpieczeństwa bez użycia modeli zwierzęcych, ale z większą przepustowością, która znacznie skraca czas i koszty. System ten może być wykorzystany jako podejście uzupełniające dla Langendorff Heart i innych modeli zwierzęcych do przedklinicznej oceny toksy...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

B.L., M.Go. i P.L. są zatrudnieni w innoVitro GmbH, producencie płyt elastycznych. U.T., E.D., M.L., M.Ge., N.F. i S.S. są zatrudnieni w firmie Nanion Technologies GmbH, producencie urządzenia hybrydowego.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez granty z niemieckiego Federalnego Ministerstwa Spraw Gospodarczych i Działań na rzecz Klimatu (ZIM) oraz z niemieckiego Federalnego Ministerstwa Edukacji i Badań (KMUinnovativ). Dziękujemy firmie FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc (Madison, WI, USA) za uprzejme udostępnienie kardiomiocytów oraz Ncardia B.V. (Leiden, Holandia) za uprzejme dostarczenie kardiomiocytów wykorzystanych w tym badaniu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Komercyjne kardiomiocyty ludzkie pochodzące z iPSC Wirówka Fujifilm Cellular Dynamics International (FCDI)R1059
(probówki 50 ml)Thermo Fisher Scientific
(100-1250 μ L)Integra Biosciences4634
DPBS z Ca2+ i Mg2+GE Healthcare HyCloneSH304264.01
96płytka głębinowa Thermo Fisher ScientificA43075
EHS żelŻel do macierzy zewnątrzkomórkowej
FLEXcyte 96/CardioExcyte urządzenie hybrydoweNanion Technologies 19 1004 1005Hybrydowy system analizy komórek 
FLX-96 FLEXcyte Płytki sensoryczneNanion Technologies20 1010
  Roztwór podstawowy fibronektyny (opcjonalnie dla Geltrex)Sigma AldrichF1141
Geltrex hESC-Qualified, gotowy do użycia, o obniżonym czynniku wzrostu Podstawna membranaThermoFischer ScientificA1569601
Pożywka do powlekania i konserwacji ludzkich kardiomiocytów pochodzących z iPSCFCDIR1059
(37 ° C, 5% CO2)Thermo Fisher Scientific51023121
Kaptur z przepływem laminarnymThermo Fisher Scientific51032678
NSP-96 CardioExcyte 96 Płytki sensoryczne 2,0 mm przezroczysteNanion Technologies20 1011
Końcówki do pipet (1250µ L)Integra Biosciences94420813
Zbiornik odczynnikówIntegra Biosciences8096-11
Pipeta serologiczna (np. 25 ml)Thermo Fisher Scientific16440901
Jednokanałowa pipeta regulowana (np. 100-1000 μ L)Eppendorf3123000063
System zasysania próżniThermo Fisher Scientific15567479
Opcjonalnie: VIAFLO ASSISTIntegra Biosciences4500Automatyzacja laboratoryjna Robot
Kąpiel wodna (37 ° c)Thermo Fisher15365877
12-kanałowa regulowana pipeta 15878722 membranowa Inkubator Naukowy

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Weaver, R. J., Valentin, J. -P. Today's challenges to de-risk and predict drug safety in human "mind-the-gap". Toxicological Sciences. 167 (2), 307-321 (2019).
  2. Burnett, S. D., Blanchette, A. D., Chiu, W. A., Rusyn, I. Human induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived cardiomyocytes as an in vitro model in toxicology: strengths and weaknesses for hazard identification and risk characterization. Expert Opinion on Drug Metabolism Toxicology. 17 (8), 887-902 (2021).
  3. Gintant, G., et al. Repolarization studies using human stem cell-derived cardiomyocytes: Validation studies and best practice recommendations. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 117, 104756(2020).
  4. Pang, L. Toxicity testing in the era of induced pluripotent stem cells: A perspective regarding the use of patient-specific induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for cardiac safety evaluation. Current Opinion in Toxicology. 23, 50-55 (2020).
  5. Ahmed, R. E., Anzai, T., Chanthra, N., Uosaki, H. A brief review of current maturation methods for human induced pluripotent stem cells-derived cardiomyocytes. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 178(2020).
  6. Gossmann, M., et al. Integration of mechanical conditioning into a high throughput contractility assay for cardiac safety assessment. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 105, 106892(2020).
  7. Hansen, A., et al. Development of a drug screening platform based on engineered heart tissue. New Methods in Cardiovascular Biology. 107 (1), 35-44 (2010).
  8. Zuppinger, C. 3D Cardiac cell culture: a critical review of current technologies and applications. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 6, 87(2019).
  9. Laverty, H. G., et al. How can we improve our understanding of cardiovascular safety liabilities to develop safer medicines. British Journal of Pharmacology. 163 (4), 675-693 (2011).
  10. Volkova, M., Russel, R. Anthracycline cardiotoxicity: prevalence, pathogenesis and treatment. Current Cardiology Reviews. 7 (4), 214-220 (2011).
  11. Bozza, W., et al. Anthracycline-induced cardiotoxicity: molecular insights obtained from human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs). The AAPS Journal. 23 (2), (2021).
  12. Sutherland, F. J., Hearse, D. J. The isolated blood and perfusion fluid perfused heart. Pharmacological Research. 41 (6), 613-627 (2000).
  13. Brown, G. E., Khetani, S. R. Microfabrication of liver and heart tissues for drug development. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 373 (1750), 20170225(2018).
  14. Scott, C. W., et al. An impedance-based cellular assay using human iPSC-derived cardiomyocytes to quantify modulators of cardiac contractility. Toxicological Sciences. 142 (2), 313-338 (2014).
  15. Gossmann, M., et al. Mechano-pharmacological characterization of cardiomyocytes derived from human induced pluripotent stem cells. Cellular Physiology and Biochemistry. 38 (3), 1182-1198 (2016).
  16. Rappaz, B., et al. Automated multi-parameter measurement of cardiomyocytes dynamics with digital holographic microscopy. Optics Express. 23 (10), 13333-13347 (2015).
  17. Doerr, L., et al. New easy-to-use hybrid system for extracellular potential and impedance recordings. Journal of Laboratory Automation. 20 (2), 175-188 (2014).
  18. Obergrussberger, A., et al. Safety pharmacology studies using EFP and impedance. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 81, 223-232 (2016).
  19. Bot, C., et al. Cross-site comparison of excitation-contraction coupling using impedance and field potential recordings in hiPSC cardiomyocytes. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 93, 46-58 (2018).
  20. Pang, L., et al. Workshop report: FDA workshop on improving cardiotoxicity assessment with human-relevant platforms. Circulation Research. 125 (9), 855-867 (2019).
  21. Edwards, S. L., et al. A multiwell cardiac µGMEA platform for action potential recordings from human iPSC-derived cardiomyocyte constructs. Stem Cell Reports. 11 (2), 522-536 (2018).
  22. Zlochiver, V., Kroboth, S., Beal, C. R., Cook, J. A., Joshi-Mukherjee, R. R.Human iPSC-derived cardiomyocyte networks on multiwell micro-electrode arrays for recurrent action potential recordings. Journal of Visualized Experiments. (149), e59906(2019).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Hybrid Cell AnalysisCardiac Contractility AssessmentHuman iPSC CardiomyocytesPreclinical Cardiac RiskImpedance SpectroscopyExtracellular Field PotentialContractile Force MeasurementDrug Safety Pharmacology96 Well PlatformCardiomyocyte Maturation

Powiązane artykuły