Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ i znakowanie 5-etynylo-2'-deoksyurydyny komórek macierzystych w meduzie hydrozoan Cladonema pacificum

2.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64285

⸱

3 sierpnia 2022

 ,  ,  , 
1Graduate School of Life Sciences, Tohoku University, 2Graduate School of Pharmaceutical Sciences, The University of Tokyo

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj opisujemy protokół wizualizacji komórek proliferujących podobnych do macierzystych u meduzy Cladonema. Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ z pełnym montowaniem z markerem komórek macierzystych pozwala na wykrycie komórek macierzystych, a znakowanie 5-etynylo-2'-deoksyurydyną umożliwia identyfikację komórek proliferujących. Razem można wykryć aktywnie proliferujące komórki macierzyste.

Streszczenie

Cnidarians, w tym ukwiały, koralowce i meduzy, wykazują różnorodną morfologię i styl życia, który przejawia się w bezszypułkowych polipach i swobodnie pływających meduzach. Jak pokazano w uznanych modelach, takich jak Hydra i Nematostella, komórki macierzyste i/lub komórki proliferacyjne przyczyniają się do rozwoju i regeneracji polipów parzydełkowych. Jednak mechanizmy komórkowe leżące u podstaw większości meduz, szczególnie w stadium meduzy, są w dużej mierze niejasne, a zatem opracowanie solidnej metody identyfikacji określonych typów komórek ma kluczowe znaczenie. W artykule opisano protokół wizualizacji komórek proliferacyjnych podobnych do macierzystych w meduzie hydrozoan Cladonema pacificum. Cladonema meduzy posiadają rozgałęzione macki, które stale rosną i utrzymują zdolność regeneracyjną przez cały okres dorosłości, zapewniając unikalną platformę do badania mechanizmów komórkowych zaaranżowanych przez proliferujące i/lub podobne komórki macierzyste. Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH) w całości przy użyciu markera komórek macierzystych pozwala na wykrycie komórek macierzystych, podczas gdy znakowanie impulsowe za pomocą 5-etynylo-2'-deoksyurydyny (EdU), markera fazy S, umożliwia identyfikację komórek proliferujących. Łącząc znakowanie FISH i EdU, możemy wykryć aktywnie proliferujące komórki macierzyste na utrwalonych zwierzętach, a technika ta może być szeroko stosowana u innych zwierząt, w tym niemodelowych gatunków meduz.

Wprowadzenie

Cnidaria jest uważana za zasadniczo rozgałęziającą się gromadę metazoanów zawierającą zwierzęta z nerwami i mięśniami, co stawia je w unikalnej pozycji do zrozumienia ewolucji rozwoju i fizjologii zwierząt1,2. Parzydełkowców dzieli się na dwie główne grupy: Anthozoa (np. Ukwiały i koralowce) posiadają tylko larwy planuli i etapy polipów siedzących, podczas gdy Medusozoa (członkowie Hydrozoa, Staurozoa, Scyphozoa i Cubozoa) zazwyczaj przybierają postać swobodnie pływających meduz lub meduz, a także larw i polipów planuli. Parzydełkowców powszechnie wykazują wysokie zdolności regeneracyjne, a leżące u ich podstaw mechanizmy komórkowe, w szczególności posiadanie dorosłych komórek macierzystych i komórek proliferacyjnych, przyciągnęły wiele uwagi3,4. Początkowo zidentyfikowane w Hydra, hydrozoanowe komórki macierzyste znajdują się w przestrzeniach śródmiąższowych między komórkami nabłonka ektodermalnego i są powszechnie określane jako komórki śródmiąższowe lub i-komórki3.

Komórki Hydrozoan mają wspólne cechy, które obejmują multipotencję, ekspresję szeroko zachowanych markerów komórek macierzystych (np. Nanos, Piwi, Vasa) oraz potencjał migracji3,5,6,7,8. Jako funkcjonalne komórki macierzyste, komórki i-cell są w dużym stopniu zaangażowane w rozwój, fizjologię i reakcje środowiskowe zwierząt hydrozoan, co świadczy o ich wysokiej zdolności regeneracyjnej i plastyczności3. Podczas gdy komórki macierzyste, podobne do komórek i, nie zostały zidentyfikowane poza hydrozoansami, nawet u uznanego gatunku modelowego Nematostella, komórki proliferacyjne są nadal zaangażowane w utrzymanie i regenerację tkanki somatycznej, a także linii zarodkowej9. Ponieważ badania nad rozwojem i regeneracją parzydełkowców były prowadzone głównie na zwierzętach typu polip, takich jak Hydra, Hydractinia i Nematostella, dynamika komórkowa i funkcje komórek macierzystych u gatunków meduz pozostają w dużej mierze nierozwiązane.

Meduza hydrozoan Clytia hemisphaerica, kosmopolityczny gatunek meduzy o różnych siedliskach na całym świecie, w tym na Morzu Śródziemnym i w Ameryce Północnej, został wykorzystany jako eksperymentalne zwierzę modelowe w kilku badaniach rozwojowych i ewolucyjnych10. Dzięki niewielkim rozmiarom, łatwej obsłudze i dużym jajom, Clytia nadaje się do utrzymania w laboratorium, a także do wprowadzenia narzędzi genetycznych, takich jak niedawno opracowane metody transgenezy i nokautu11, otwierając możliwość szczegółowej analizy mechanizmów komórkowych i molekularnych leżących u podstaw biologii meduz. W macki Clytia medusa komórki I są zlokalizowane w obszarze proksymalnym, zwanym bańką, a komórki progenitorowe, takie jak nematoblasty, migrują do dystalnego końca, różnicując się w różne typy komórek, w tym nematocyty12.

Podczas regeneracji Clytia manubrium, jamy ustnej meduzy, komórki Nanos1+ obecne w gonadach migrują do regionu, w którym manubrium jest tracone w odpowiedzi na uszkodzenie i uczestniczą w regeneracji manubrium7. Odkrycia te potwierdzają tezę, że komórki I w Clytia zachowują się również jak funkcjonalne komórki macierzyste, które biorą udział w morfogenezie i regeneracji. Biorąc jednak pod uwagę, że właściwości komórek I różnią się między reprezentatywnymi zwierzętami typu polip, takimi jak Hydra i Hydractinia3, możliwe jest, że cechy i funkcje komórek macierzystych są zróżnicowane wśród gatunków meduz. Ponadto, z wyjątkiem Clytia, techniki eksperymentalne były ograniczone dla innych meduz, a szczegółowa dynamika komórek proliferacyjnych i komórek macierzystych jest nieznana13.

Meduza hydrozoan Cladonema pacificum to wyłaniający się organizm modelowy, który może być trzymany w środowisku laboratoryjnym bez pompy wodnej czy systemu filtracji. Cladonema medusa ma rozgałęzione macki, co jest powszechną cechą rodziny Cladonematidae, oraz narząd fotoreceptorowy zwany ocellus na warstwie ektodermalnej w pobliżu bańki14. Proces rozgałęziania się macki zachodzi w nowym miejscu rozgałęzienia, które pojawia się wzdłuż adaksjalnej strony macki. Z biegiem czasu macki nadal wydłużają się i rozgałęziają, a starsze gałęzie są wypychane w kierunku tip15. Ponadto macki Cladonema mogą zregenerować się w ciągu kilku dni po amputacji. Ostatnie badania sugerują rolę proliferujących komórek i komórek macierzystych w rozgałęzianiu i regeneracji macek w Cladonema16,17. Jednakże, podczas gdy konwencjonalna hybrydyzacja in situ (ISH) została wykorzystana do wizualizacji ekspresji genów w Cladonema, ze względu na jej niską rozdzielczość, obecnie trudno jest szczegółowo obserwować dynamikę komórek macierzystych na poziomie komórkowym.

Ten artykuł opisuje metodę wizualizacji komórek macierzystych podobnych do komórek macierzystych w Cladonema za pomocą FISH i współbarwienia z EdU, markerem proliferacji komórek18. Wizualizujemy wzorzec ekspresji Nanos1, markera komórek macierzystych5,17, za pomocą FISH, co pozwala na identyfikację dystrybucji komórek macierzystych na poziomie pojedynczej komórki. Ponadto jednoczesne barwienie ekspresji Nanos1 z znakowaniem EdU umożliwia odróżnienie aktywnie proliferujących komórek macierzystych. Ta metoda monitorowania zarówno komórek macierzystych, jak i komórek proliferacyjnych może być stosowana w szerokim zakresie obszarów badawczych, w tym rozgałęziania się macek, homeostazy tkanek i regeneracji narządów w Cladonema, a podobne podejście można zastosować do innych gatunków meduz.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

UWAGA: Zobacz Tabelę Materiałów, aby uzyskać szczegółowe informacje dotyczące wszystkich materiałów, odczynników i sprzętu użytego w tym protokole.

1. Synteza sondy

  1. Ekstrakcja RNA
    1. Umieść trzy żywe meduzy Cladonema hodowane w sztucznej wodzie morskiej (ASW) w probówce o pojemności 1,5 ml za pomocą pipety transferowej o pojemności 3,1 ml z odciętą końcówką i usuń jak najwięcej ASW.
      UWAGA: ASW przygotowuje się przez rozpuszczenie mieszaniny soli mineralnych w wodzie z kranu z neutralizatorem chloru; końcowy ciężar właściwy (SG) wynosi 1,018 lub części na tysiąc (ppt) wynosi ~27.
    2. Zamroź probówki o pojemności 1,5 ml w ciekłym azocie, aby zahamować aktywność RNazy. Dodać 30 μl buforu do lizy z całkowitego zestawu do izolacji RNA, do którego dodano 2-merkaptoetanol (1 μl/100 μl buforu do lizy) i homogenizować próbki w buforze do lizy za pomocą homogenizatora.
      UWAGA: Aby uniknąć przelania buforu i próbki z probówek, zaleca się homogenizację z niewielką ilością buforu do lizy.
    3. Dodaj 570 μl buforu do lizy i wyekstrahuj całkowity RNA zgodnie z protokołem zestawu do izolacji całkowitego RNA (Rysunek 1).
    4. Zmierzyć stężenie wyekstrahowanego RNA za pomocą spektrofotometru i przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu użycia.
  2. Synteza cDNA
    1. Korzystając z zestawu, zsyntetyzuj cDNA, używając całkowitego RNA wyekstrahowanego z meduz jako matrycy (Rysunek 1 i Tabela 1).
    2. Inkubować w temperaturze 65 °C przez 5 minut.
    3. Szybko schłodzić na lodzie.
    4. Przeprowadzić syntezę cDNA z mieszaniną z kroku 1.2.1 (Tabela 1). Dokładnie wymieszać pipetując i inkubować w temperaturze 42 °C przez 60 minut.
    5. Inkubować w temperaturze 95 °C przez 5 minut.
    6. Szybko schłodzić na lodzie.
    7. Zmierzyć stężenie zsyntetyzowanego cDNA za pomocą spektrofotometru i przechowywać w temperaturze -20 °C lub niższej do momentu użycia.
  3. Synteza produktu PCR
    1. Aby utworzyć szablon PCR, zaprojektuj konkretny podkład za pomocą Primer-BLAST. Sekwencję referencyjną należy pobrać z danych NCBI lub danych sekwencyjnych RNA.
      UWAGA: Zapoznaj się z tabelą materiałów, aby zapoznać się z podkładami stosowanymi w tym protokole.
    2. Aby wzmocnić sekwencję docelową, należy przeprowadzić klonowanie TA, które nie wymaga stosowania enzymów restrykcyjnych. Aby otrzymać produkt PCR, do którego adenina jest dodawana na końcu 3', należy zastosować następujące ustawienia: 98 °C przez 2 min; 35 cykli po 98 °C przez 10 s, 55-60 °C przez 30 s, 72 °C przez 1 min. Do reakcji należy użyć polimerazy DNA Taq (Tabela 1).
      UWAGA: Aby określić warunki PCR, postępuj zgodnie z protokołem dołączonym do polimerazy DNA, która ma być użyta, który ogólnie zapewnia zalecaną temperaturę wyżarzania i czas przedłużania.
    3. Przepuść produkt PCR przez 1% żel agarozowy i wytnij interesujący Cię pasek. Ekstrahuj produkty PCR z pociętych żeli za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu.
  4. Ligacji
    1. Związać produkt PCR do wektora z 3' zwisami tyminy, mieszając odczynniki (Tabela 1) i inkubując w temperaturze 37 °C przez 30 minut (Rysunek 1).
      UWAGA: Stosunek molekularny wektora:PCR powinien wynosić 1:>3. Rozmiar wektora pTA2 wynosi około 3 kb. Jeśli iloczynem (wkładką) PCR są A (kb) i B (ng/μL), objętość wkładki (X w tabeli 1), którą należy pobrać, można obliczyć według wzoru: ([50 ng wektora × A kb wkładki])/(3 kb wektora × [1/3]) = 50·A ng wkładki. Jeśli stężenie wkładki wynosi B ng / μL, to pobrana objętość wynosi 50·A/B μL wkładki.
  5. Transformacja i powlekanie
    1. W celu przekształcenia rozmrozić właściwe komórki na lodzie i rozmieścić je w podwielokrotnościach po 20 μl każdy. Dodać 1 μl plazmidów zawierających produkt PCR (mniej niż 5% właściwej objętości komórki) i wirować przez 1 s. Inkubować na lodzie przez 5 minut, a następnie inkubować w temperaturze 42 °C przez 45 s i wirować przez 1 s.
    2. Dodać 180 μl bulionu Super Optimal z pożywką do tłumienia katabolitów (SOC) (bogatą w składniki odżywcze pożywką do hodowli bakteryjnych) do właściwych komórek i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut. Po 30 minutach rozprowadzić właściwe komórki na płytce agarowej zawierającej ampicylinę, 5-bromo-4-chloro-3-indolilo-beta-D-galakto-piranozyd (X-gal) i izopropylo-β-d-1-tiogalaktopiranozyd (IPTG) i inkubować w temperaturze 37 °C przez 12-16 godzin (Rysunek 1).
      UWAGA: X-gal i IPTG służą do selekcji niebieskich i białych kolonii.
  6. Kultura płynna
    1. Wybierz białą kolonię spośród białych i niebieskich kolonii na talerzu. Dodać go do 3-5 ml pożywki LB z ampicyliną i inkubować na wytrząsarce przez 12-16 godzin w temperaturze 37 °C (Ryc. 1).
  7. Miniprep (Miniprep)
    1. Wyekstrahuj plazmid z pożywki LB za pomocą miniprepu plazmidu (Rysunek 1).
    2. Określić ilościowo stężenie plazmidu za pomocą spektrofotometru.
  8. Przeczytaj sekwencję.
    1. Aby odczytać sekwencję DNA plazmidu, wyślij plazmid do sekwencjonowania Sangera, a następnie użyj oprogramowania, aby dopasować go do sekwencji genomu/transkryptomu, aby potwierdzić, czy sekwencja docelowa jest prawidłowo zsyntetyzowana i ocenić, w którym kierunku sekwencja docelowa jest wprowadzana do plazmidu (5' do 3' lub 3' do 5').
      UWAGA: Jeśli sekwencja docelowa zostanie wprowadzona do plazmidu w kierunku od 5' do 3' od miejsca wiązania polimerazy RNA w pobliżu końca 3', można wygenerować sondę antysensowną przez transkrypcję in vitro. Jeśli sekwencja docelowa zostanie wprowadzona w odwrotnym kierunku od 3' do 5', można wygenerować sondę wykrywającą (kontrolę ujemną). W przypadku stosowania wektorów, takich jak pTA2, w zależności od celu można użyć dwóch miejsc wiązania transkrypcji.
  9. Transkrypcja in vitro
    1. Przygotuj matrycę DNA z utworzonego plazmidu, wykonując PCR przy użyciu starterów poza miejscem wiązania polimerazy RNA (np. Miejsca wiązania T7/T3) w plazmidzie (Figura 1).
      UWAGA: Uniwersalne startery, takie jak starter do przodu M13-20 i starter odwrotny M13, mogą być używane do przygotowania matrycy DNA, która zawiera miejsca wiązania polimerazy RNA.
    2. Oczyść matrycę po amplifikacji PCR za pomocą zestawu do ekstrakcji żelem/PCR.
    3. Wymieszaj odczynniki pokazane poniżej i przeprowadź reakcję transkrypcji w temperaturze 37 °C przez 3 godziny (Rysunek 1 i Tabela 1).
    4. Dodać 1,5 μl DNazy i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 min.
    5. Dodać 10 μl wody wolnej od RNaz i oczyścić sondę z roztworu reakcji transkrypcji za pomocą kolumny czyszczącej.
    6. Sprawdź wielkość zsyntetyzowanego RNA, ładując 1 μl na 1% żel agarozowy i oznacz stężenie za pomocą spektrofotometru.
      UWAGA: Zsyntetyzowane sondy RNA powinny mieć stężenie co najmniej 100 ng/μL.
    7. Dodać 30 μl formamidu do przechowywania w temperaturze -20 °C lub niższej.

2. Włączenie i utrwalenie EdU

  1. Umieścić Cladonema medusae (5-10 zwierząt w probówce) w probówkach o pojemności 1,5 ml za pomocą pipety transferowej o pojemności 3,5 ml i dodać ASW do całkowitej objętości 500 μl. Dodać 7,5 μl 10 mM roztworu podstawowego EdU i inkubować próbki przez 1 godzinę w temperaturze 22 °C (Rysunek 2). Stężenie końcowe EdU wynosi 150 μM.
    UWAGA: Użyj 5-7-dniowych meduz do monitorowania tworzenia się trzeciej gałęzi (Rysunek 3A). Dzień, w którym meduzy odłączają się od polipa, jest liczony jako dzień 1, a w dniu 5 meduzy zazwyczaj zaczynają wykazywać trzecią gałąź na swoich głównych mackach.
  2. Po upływie 1 godziny usunąć jak najwięcej ASW zawierającego EdU.
  3. Aby znieczulić meduzy, dodać 7% MgCl2 w H2O i inkubować przez 5 minut.
  4. Usunąć 7% MgCl2 w H2O i utrwalić meduzy na noc (O.N.) w temperaturze 4 °C z 4% paraformaldehydem (PFA) w ASW (Rysunek 2).
    UWAGA: Podczas wykonywania FISH bez inkorporacji EdU, próbki można utrwalić podobnie jak te poddane działaniu EdU po znieczuleniu (kroki 2.3-2.4).

3. Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ

  1. Leczenie proteinazą i po utrwaleniu
    1. Usunąć PFA i przemyć próbki PBS zawierającym 0,1% Tween-20 (PBST) przez 3 x 10 min. Użyj 300-500 μl PBST na pranie.
      UWAGA: Od tego etapu do końca hybrydyzacji eksperyment powinien być przeprowadzany w środowisku wolnym od RNaz, w rękawiczkach i masce. 1x PBS na tym etapie musi być wykonany z wody uzdatnionej DEPC. Po hybrydyzacji można zastosować 1x PBS wykonany z wodą bez obróbki DEPC. Niektóre protokoły ISH i FISH odwadniają próbki za pomocą etapów metanolu, co umożliwia zachowanie utrwalonych próbek w temperaturze -20 °C do momentu użycia. Aby uniknąć zbędnej pracy, proces odwadniania został pominięty w tym protokole, zwłaszcza że próbki mogą być przechowywane w PBST przez okres do kilku dni.
    2. Po utrwaleniu umieścić próbkę w probówkach o pojemności 1,5 ml na wytrząsarce, z wyjątkiem etapu inkubacji przeciwciała anty-DIG-POD O.N. (etap 3.4.2). Po umyciu dodać 10 mg/ml roztworu podstawowego proteinazy K w PBST i inkubować meduzy z proteinazą K (końcowe stężenie: 10 μg/ml) w temperaturze 37 °C przez 10 minut.
    3. Usunąć roztwór proteinazy K i przemywać próbki PBST przez 2 x 1 minutę.
    4. Aby postfiksować meduzy, dodaj 4% PFA do 1x PBS i inkubuj w temperaturze 37 °C przez 15 minut.
    5. Usunąć roztwór PFA i przemywać próbki przez 2 x 10 minut za pomocą PBST.
      UWAGA: Jeśli gen docelowy jest silnie eksprymowany przy niskim sygnale tła, kroki 3.1.2-3.1.5 można pominąć.
  2. krzyżowanie
    1. Usunąć PBST i dodać bufor hybrydyzacyjny (bufor HB, tabela 1). Próbki inkubować w buforze HB przez 15 minut w temperaturze pokojowej (RT). Użyj 300-400 μl buforu HB, który zapewnia wystarczającą objętość do udanej hybrydyzacji.
      UWAGA: HB Buffer, Wash Buffer 1 i Wash Buffer 2 są przygotowywane z 20x zapasu SSC. Bufor HB jest przechowywany w temperaturze -20 °C lub niższej i przed użyciem musi zostać doprowadzony do temperatury rynkowej
      2. .
    2. Usuń bufor HB i dodaj nowy bufor HB. Wstępnie hybrydyzować w temperaturze 55 °C przez co najmniej 2 godziny w inkubatorze do hybrydyzacji.
    3. Usunąć bufor HB i inkubować z buforem HB zawierającym sondy, które były przechowywane w kroku 1.9.7 (końcowe stężenie sondy: 0,5-1 ng/μL w buforze HB). Hybrydyzować w temperaturze 55 °C przez 18-24 godziny (Rysunek 2) w inkubatorze hybrydyzacji.
      UWAGA: Intensywność i swoistość sygnału FISH może się różnić w zależności od ekspresji genu docelowego, a także długości i swoistości sondy. Aby zwiększyć intensywność, można regulować takie parametry, jak czas hybrydyzacji (18-72 h) i temperatura (50-65 °C), a także testować różne sondy. Aby uniknąć niespecyficznych sygnałów, leczenie proteinazą K (stężenie i czas trwania) można zmodyfikować19.
  3. Demontaż sondy
    1. Usuń bufor HB zawierający sondy, a następnie dodaj bufor płuczący 1 (tabela 1). Przemywać próbki buforem do płukania 1 przez 2 x 15 minut w temperaturze 55 °C. Użyć 300-400 μl buforu do płukania.
      UWAGA: Bufor HB zawierający sondy mogą być używane wielokrotnie, do około dziesięciu razy. Zamiast wyrzucać, należy przechowywać zużyty bufor HB zawierający sondy w temperaturze -20 °C lub niższej. Przed użyciem podgrzej bufor do płukania 1, bufor do płukania 2, 2x SSC i PBST w temperaturze 55 °C.
    2. Usuń bufor płuczący 1, a następnie dodaj bufor płuczący 2 (tabela 1). Przemywać próbki buforem płuczącym 2 przez 2 x 15 minut w temperaturze 55 °C.
    3. Usuń bufor myjący 2, a następnie dodaj 2x SSC. Przemywać próbki 2 x SSC przez 2 x 15 minut w temperaturze 55 °C.
    4. Usuń 2x SSC, a następnie dodaj podgrzany PBST. Przemywać próbki przez 1 x 15 minut za pomocą PBST w temperaturze pokojowej.
  4. Inkubacja przeciwciał anty-DIG
    1. Usuń PBST, a następnie dodaj 1% bufor blokujący. Próbki należy inkubować przez co najmniej 1 godzinę w temperaturze pokojowej, powoli wstrząsając na kołysce.
      UWAGA: Przygotować 1% bufor blokujący na świeżo, rozcieńczając 5% zapas bufora blokującego (Tabela 1). Sprawdź próbki przed następną reakcją przeciwciał, ponieważ próbka ma tendencję do przyklejania się do tylnej części wieczka lub ścianki w wyniku potrząsania.
    2. Po zablokowaniu usuń 1% bufor blokujący, dodaj roztwór anty-DIG-POD (1:500, w 1% buforze blokującym) i inkubuj próbki O.N. w temperaturze 4 °C (Rysunek 2).
      UWAGA: Należy uważać, aby czas inkubacji mieścił się w granicach 12-16 godzin, aby zapobiec wykryciu sygnałów niespecyficznych.
  5. Wykrywanie sondy z oznaczeniem DIG
    1. Usuń roztwór anty-DIG-POD, a następnie dodaj bufor Tris-NaCl-Tween (TNT, Tabela 1). Przemywać próbki TNT przez 3 x 10 minut w temperaturze RT.
      UWAGA: Zastosowanie techniki wzmacniania sygnału tyramidu (TSA) zapewnia lepszą rozdzielczość obrazu w porównaniu z odczynnikami znakowanymi peroksydazą chrzanową (np. anty-DIG-POD).
    2. Rozcieńczony roztwór podstawowy tyramidu sprzężonego z barwnikiem fluorescencyjnym (Cy5-tyramide) (1:50) w buforze rozcieńczalnika do amplifikacji, aby uzyskać aktywny roztwór Cy5-tyramidu (Rysunek 2).
    3. Usuń jak najwięcej trotylu, a następnie dodaj aktywny roztwór Cy5-tyramide. Próbki należy inkubować przez 10 minut w ciemności.
    4. Próbki należy przemywać PBST przez 3 x 10 minut w ciemności.
  6. Wykrywanie EdU
    UWAGA: Zestaw EdU wykrywa wbudowane EdU jako sygnały fluorescencyjne (Rysunek 2).
    1. Aby przygotować koktajl detekcyjny EdU, wymieszaj składniki, jak pokazano w Tabeli 1. Użyj 100 μl koktajlu detekcyjnego EdU dla każdej próbki.
      UWAGA: Przygotuj 1x dodatek buforu reakcyjnego, rozcieńczając 10x dodatek buforu reakcyjnego ultraczystą wodą.
    2. Usuń PBST, a następnie dodaj koktajl detekcyjny EdU. Inkubować w ciemności przez 30 minut.
    3. Myć PBST przez 3 x 10 min w ciemności.
  7. Barwienie DNA
    1. Rozcieńczyć Hoechst 33342 (1:500) w PBST, aby przygotować roztwór Hoechsta. Usuń PBST, a następnie dodaj roztwór Hoechst. Inkubuj próbki przez 30 minut w ciemności (Rysunek 2).
    2. Próbki przemywać PBST przez 3-4 x 10 minut w ciemności.
  8. Montażu
    1. Zrób bank na szkiełku podstawowym, aby zapobiec zgnieceniu próbki. Nałóż taśmę winylową na szklane szkiełko i wydrąż środek.
    2. Przenieś meduzy do banku na szkiełku za pomocą pipety transferowej o pojemności 3,1 ml z odciętą końcówką.
      UWAGA: Uważaj, aby macki nie zachodziły na siebie.
    3. Usuń PBST za pomocą pipety P200, a następnie powoli dodaj 70% glicerolu jako pożywkę montażową (Rysunek 2).
      UWAGA: Zamiast 70% glicerolu można użyć środka montażowego zapobiegającego blaknięciu, aby zapobiec blaknięciu fluorescencji.
    4. Delikatnie umieść szkiełko nakrywkowe na meduzach za pomocą kleszczyków i uszczelnij bok szkiełka nakrywkowego przezroczystym lakierem do paznokci.
    5. Szkiełka należy przechowywać w temperaturze 4 °C w ciemności, jeśli nie należy natychmiast przeprowadzić obserwacji mikroskopowej.
  9. Obrazowania
    1. Użyj laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego, aby uzyskać obrazy. Aby uzyskać rozdzielczość jednokomórkową, użyj obiektywu olejowego 40x lub obiektywu o większym powiększeniu.
    2. Po pobraniu obrazu otwórz obrazy za pomocą oprogramowania ImageJ/FIJI i policz komórki, które są dodatnie dla EdU+ i/lub Nanos1+ za pomocą narzędzia wielopunktowego20.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Cladonema tentacles były wykorzystywane jako model do badania procesów komórkowych morfogenezy i regeneracji15,16,17. Struktura tentakla składa się z nabłonkowej rurki, w której komórki macierzyste (tzw. i-cells) znajdują się w regionie proksymalnym, zwanym cebulką tentakla, a nowe odgałęzienia są sekwencyjnie dodawane do tylnej części regionu dystalnego cebulki wzdłuż strony adaksjalnej (Rycyna 3A<...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Komórki proliferujące i komórki macierzyste są ważnymi źródłami komórkowymi w różnych procesach, takich jak morfogeneza, wzrost i regeneracja21,22. W artykule opisano metodę współbarwienia markera komórek macierzystych Nanos1 za pomocą znakowania FISH i EdU w Cladonema medusae. Wcześniejsze prace z użyciem znakowania EdU lub BrdU sugerowały, że komórki proliferacyjne lokalizują się w opuszkach macek16,17

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez AMED w ramach grantu o numerze JP22gm6110025 (dla Y.N.) oraz przez grant JSPS KAKENHI o numerze 22H02762 (dla Y.N.).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
2-merkaptoetanol Wako137-06862
Pipeta transferowa 3,1 mlThermo Scientific233-20S
5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galaktopiranozyd (X-Gal)Wako029-15043
anty-DIG-PODRoche11207733910
Cladonema pacificum Nanos1 starter5'- AAGAGACACAGTCATTATCAAGC
GA-3"
Cladonema pacificum Nanos1 starter5'-CGACGTCCAATTTTACGTGCT -3'
Cladonema pacificum Piwi starter5'- AAAAGAGCAGCGGCCAGAAAGA
AGGC -3'
Cladonema pacificum Piwi podkład5'- GCGGGTCGCATTGTTGGTA
CTGGC -3'
Zestaw do proliferacji komórek Click-iT EdU do obrazowania, barwnik Alexa Fluor 488Invitrogen C10337Zestaw EdU
Coroline offGEX Co. ltdN/Aneutralizator chloru
DIG Zestaw do wykrywania kwasów nukleinowych Odczynnik blokującyRoche11175041910bufor blokujący 
Mieszanka do znakowania DIG RNA Roche11277073910
naziemna telewizja cyfrowa PromegaP117B
ECOS kompetentna komórka DH5αNIPPON GENE316-06233kompetentna komórka
Zestaw do ekstrakcji żelu Fast gene / PCRZestaw do ekstrakcji żeluFast gene FG-91302
Szybki mini zestaw plazmidu genowegoSzybki genFG-90502miniprep plazmidu
FormamidWako 068-00426
Sól sodowa heparyny ze świńSIGMA-ALDRICH H3393-10KU
Izopropylo-β-D(-)-tiogalaktopiranozyd (IPTG)Wako096-05143
LB AgarInvitrogen22700-025płytka agarowa
LB Baza bulionowaInvitrogen12780-052LB średnia
Kwas maleinowyWako134-00495
mini Kolumny RNA o szybkim wirowaniuRoche11814427001kolumna czyszcząca
NaClWako 191-01665
Spektrofotometr UV-Vis NanoDrop OneC Microvolume z Wi-FiThermo ScientificSpektrofotometrND-ONEC-W
Polioksyetylen (20) Monolaurynian sorbitanu (Tween-20)Wako 166-21115
Złączki PowerMasher 2 891300homogenizator
Proteinaza KNacarai Tesque 29442-14
Inhibitor RNazyTaKaRa2313A
RNeasy Mini zestawQiagen 74004Kompletny zestaw do izolacji RNA
RQ1 Dnaza bez RNazPromegaM6101
Bufor soli cytrynianu sodu 20x proszek (20x SSC)TaKaRaT9172
SEA LIFEMarin TechN/Amieszanina soli mineralnych
T3 Polimeraza RNA 11031163001
T7 Roche10881767001
TAITEC HB-100TAITEC0040534-000Inkuvator do hybrydyzacji
TaKaRa Ex Taq TaKaRaRR001APolimeraza DNA Taq
TaKaRa PrimeScript 2 1st zestaw do syntezy cDNAZestaw do syntezy cDNATaKaRa6210A
Klon docelowyTOYOBO TAK101pTA2 Wektor
tRNARoche10109541001
TSA Plus Cyjanina 5AKOYA BiosciencesNEL745001KTtechnika wzmacniania sygnału tyramidowego (TSA)
Zeiss LSM 880ZEISSN/Alaserowy skaningowy mikroskop konfokalny
do przodu odwrócony forward odwrócony Polimeraza RNA Roche

Bibliografia

  1. Leclère, L., Röttinger, E. Diversity of cnidarian muscles: Function, anatomy, development and regeneration. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 157(2017).
  2. Bosch, T. C. G., et al. Back to the basics: Cnidarians start to fire. Trends in Neurosciences. 40 (2), 92-105 (2017).
  3. Gold, D. A., Jacobs, D. K. Stem cell dynamics in Cnidaria: Are there unifying principles. Development Genes and Evolution. 223 (1-2), 53-66 (2013).
  4. Technau, U., Steele, R. E. Evolutionary crossroads in developmental biology: Cnidaria. Development. 138 (8), 1447-1458 (2011).
  5. Leclère, L., et al. Maternally localized germ plasm mRNAs and germ cell/stem cell formation in the cnidarian Clytia. Developmental Biology. 364 (2), 236-248 (2012).
  6. Bradshaw, B., Thompson, K., Frank, U. Distinct mechanisms underlie oral vs aboral regeneration in the cnidarian Hydractinia echinata. eLife. 4, 05506(2015).
  7. Sinigaglia, C., et al. Pattern regulation in a regenerating jellyfish. eLife. 9, 54868(2020).
  8. David, C. N. Interstitial stem cells in Hydra: Multipotency and decision-making. The International Journal of Developmental Biology. 56 (6-7-8), 489-497 (2012).
  9. Röttinger, E. Nematostella vectensis, an emerging model for deciphering the molecular and cellular mechanisms underlying whole-body regeneration. Cells. 10 (10), 2692(2021).
  10. Houliston, E., Momose, T., Manuel, M. Clytia hemisphaerica: A jellyfish cousin joins the laboratory. Trends in Genetics. 26 (4), 159-167 (2010).
  11. Peron, S., Houliston, E., Leclère, L. The Marine Jellyfish Model, Clytia hemisphaerica. Handbook of Marine Model Organisms in Experimental Biology. Boutet, A., Shierwater, B. , CRC Press. Boca. Raton, FL. 129-147 (2021).
  12. Denker, E., Manuel, M., Leclère, L., Le Guyader, H., Rabet, N. Ordered progression of nematogenesis from stem cells through differentiation stages in the tentacle bulb of Clytia hemisphaerica (Hydrozoa, Cnidaria). Developmental Biology. 315 (1), 99-113 (2008).
  13. Fujita, S., Kuranaga, E., Nakajima, Y. Regeneration potential of jellyfish: Cellular mechanisms and molecular insights. Genes. 12 (5), 758(2021).
  14. Suga, H., et al. Flexibly deployed Pax genes in eye development at the early evolution of animals demonstrated by studies on a hydrozoan jellyfish. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (32), 14263-14268 (2010).
  15. Fujiki, A. Branching pattern and morphogenesis of medusa tentacles in the jellyfish Cladonema pacificum (Hydrozoa, Cnidaria). Zoological Letters. 5 (12), 13(2019).
  16. Fujita, S., Kuranaga, E., Nakajima, Y. Cell proliferation controls body size growth, tentacle morphogenesis, and regeneration in hydrozoan jellyfish Cladonema pacificum. PeerJ. 7, 7579(2019).
  17. Hou, S., Zhu, J., Shibata, S., Nakamoto, A., Kumano, G. Repetitive accumulation of interstitial cells generates the branched structure of Cladonema medusa tentacles. Development. 148 (23), (2021).
  18. Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (7), 2415-2420 (2008).
  19. Angerer, L. M., Angerer, R. C. Detection of poly A + RNA in sea urchin eggs and embryos by quantitative in situ hybridization. Nucleic Acids Research. 9 (12), 2819-2840 (1981).
  20. Rakotomamonjy, J., Guemez-Gamboa, A. Purkinje cell survival in organotypic cerebellar slice cultures. Journal of Visualized Experiments. (154), e60353(2019).
  21. Tanaka, E. M., Reddien, P. W. The cellular basis for animal regeneration. Developmental Cell. 21 (1), 172-185 (2011).
  22. Penzo-Méndez, A. I., Stanger, B. Z. Organ-size regulation in mammals. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (9), 019240(2015).
  23. Sinigaglia, C., Thiel, D., Hejnol, A., Houliston, E., Leclère, L. A safer, urea-based in situ hybridization method improves detection of gene expression in diverse animal species. Developmental Biology. 434 (1), 15-23 (2018).
  24. King, R. S., Newmark, P. A. In situ hybridization protocol for enhanced detection of gene expression in the planarian Schmidtea mediterranea. BMC Developmental Biology. 13 (1), 8(2013).
  25. Flici, H., et al. An evolutionarily conserved SoxB-Hdac2 crosstalk regulates neurogenesis in a cnidarian. Cell Reports. 18 (6), 1395-1409 (2017).
  26. He, S., et al. An axial Hox code controls tissue segmentation and body patterning in Nematostella vectensis. Science. 361 (6409), 1377-1380 (2018).
  27. Govindasamy, N., Murthy, S., Ghanekar, Y. Slow-cycling stem cells in hydra contribute to head regeneration. Biology Open. 3 (12), 1236-1244 (2014).
  28. Passamaneck, Y. J., Martindale, M. Q. Cell proliferation is necessary for the regeneration of oral structures in the anthozoan cnidarian Nematostella vectensis. BMC Developmental Biology. 12 (1), 34(2012).
  29. Gold, D. A., et al. Structural and developmental disparity in the tentacles of the moon jellyfish Aurelia sp.1. PLoS One. 10 (8), 0134741(2015).
  30. Gold, D. A., Nakanishi, N., Hensley, N. M., Hartenstein, V., Jacobs, D. K. Cell tracking supports secondary gastrulation in the moon jellyfish Aurelia. Development Genes and Evolution. 226 (6), 383-387 (2016).
  31. Cheng, L. -C., Alvarado, A. S. Whole-mount BrdU staining with fluorescence in situ hybridization in planarians. Planarian Regeneration. 1774, 423-434 (2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

znakowanie EdUmarker kom rek macierzystychkom rki proliferuj ceregeneracja macekekspresja Nanos1hybrydyzacja in situ FISH ca ego preparatu
Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ i znakowanie 5-etynylo-2'-deoksyurydyny komórek macierzystych w meduzie hydrozoan Cladonema pacificum
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.