Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Zmodyfikowane warunki eksperymentalne dla ubytku słuchu wywołanego hałasem u myszy oraz ocena funkcji słuchu i uszkodzenia zewnętrznych komórek rzęsatych

3.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64286

⸱

10 lutego 2023

 ,  , 
1Department of Audiology and Speech-Language Pathology, MacKay Medical College, 2Institute of Biomedical Sciences, MacKay Medical College

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół dla mysiego modelu ubytku słuchu wywołanego hałasem (NIHL). Aby wywołać NIHL, opracowaliśmy nowe i proste urządzenie wykorzystujące tekturę falistą, klatkę pułapkę na szczury i głośnik. Odpowiedź słuchowa pnia mózgu i obrazowanie immunofluorescencyjne zostały wykorzystane do oceny odpowiednio funkcji słuchu i uszkodzenia zewnętrznych komórek rzęsatych.

Streszczenie

Zwierzęcy model utraty słuchu wywołanej hałasem (NIHL) jest przydatny dla patologów, terapeutów, farmakologów i badaczy słuchu, aby dokładnie zrozumieć mechanizm NIHL, a następnie zoptymalizować odpowiednie strategie leczenia. Badanie to ma na celu stworzenie ulepszonego protokołu rozwoju mysiego modelu NIHL. W tym badaniu wykorzystano samce myszy C57BL/6J. Nieznieczulone myszy były narażone na głośne dźwięki (1 i 6 kHz, prezentowane jednocześnie przy 115-125 dB SPL-A) nieprzerwanie przez 6 godzin dziennie przez 5 kolejnych dni. Funkcje słuchowe oceniano 1 dzień i 1 tydzień po ekspozycji na hałas, za pomocą słuchowej odpowiedzi pnia mózgu (ABR). Po pomiarze ABR myszy zostały złożone w ofierze, a ich narządy Cortiego zostały pobrane do barwienia immunofluorescencyjnego. Z pomiarów słuchowej odpowiedzi pnia mózgu (ABR) zaobserwowano znaczny ubytek słuchu 1 dzień po ekspozycji na hałas. Po 1 tygodniu progi słyszenia myszy eksperymentalnych spadły do ~80 dB SPL, co nadal było znacznie wyższym poziomem niż u myszy kontrolnych (~40 dB SPL). Wyniki obrazowania immunofluorescencyjnego wykazały, że zewnętrzne komórki rzęsate (OHC) są uszkodzone. Podsumowując, stworzyliśmy model NIHL przy użyciu samców myszy C57BL/6J. Opracowano i zastosowano nowe i proste urządzenie do generowania i dostarczania szumu o czystym tonie. Ilościowe pomiary progów słyszenia i morfologiczne potwierdzenie uszkodzenia OHC wykazały, że zastosowany hałas skutecznie wywołał oczekiwany ubytek słuchu.

Wprowadzenie

Około 1,3 miliarda ludzi na całym świecie cierpi na utratę słuchu z powodu ekspozycji na hałas1. W tym badaniu naszym celem było ustanowienie jasnego procesu krok po kroku w celu wywołania i potwierdzenia ubytku słuchu wywołanego hałasem (NIHL). NIHL wynika ze zwyrodnienia/zniszczenia komórek rzęsatych (HC) i neuronów zwojowych spiralnych (SGN), uszkodzenia stereocilii HC i/lub utraty synaps między wewnętrznymi HC ślimaka i SGN. Takie nieprawidłowości mogą również powodować szumy uszne i upośledzenie percepcji mowy (zwłaszcza w złożonym środowisku akustycznym) oprócz NIHL. Te braki fizjologiczne mogą kolejno wpływać na funkcje społeczne, psychologiczne i poznawcze2,3,4,5,6.

W badaniach przedklinicznych związanych z NIHL na myszach, najpopularniejszymi szczepami myszy są CBA/CaJ2,3,6,7 i C57BL/64,5,8. Myszy męskie3,4,7 myszy są częściej używane niż samice, ponieważ estrogen ma działanie ochronne na słuch. Dlatego w tym badaniu użyliśmy tylko samców myszy9. Po zapoznaniu się z literaturą wybraliśmy 1 kHz i 6 kHz jako częstotliwości zastosowanego szumu. Natężenie zastosowanego hałasu wynosiło od 115 dB SPL-A (wokół klatki) do 125 dB SPL-A (w środku klatki). Po wystawieniu myszy eksperymentalnych na hałas w sposób ciągły przez 6 godzin dziennie, przez 5 kolejnych dni, optymalny wzrost progu słyszenia wskazywał, że optymalny zakres NIHL został wygenerowany u myszy eksperymentalnych. Czynności związane z obchodzeniem się ze zwierzętami, budowaniem układu doświadczalnego i wywoływaniem hałasu są jasno opisane krok po kroku w dostarczonym protokole.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Eksperymenty na zwierzętach w tym badaniu zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami Mackay Medical College. Ośmiotygodniowe samce myszy C57BL/6J zakupiono w Narodowym Centrum Zwierząt Laboratoryjnych (Nowe Tajpej, Tajwan). Wszystkie myszy zostały wyhodowane i trzymane zgodnie ze standardowym protokołem dla zwierząt.

1. Indukcja NIHL u myszy

  1. Przygotuj klatkę dla myszy doświadczalnych
    1. W tym celu użyj klatki pułapki na szczury o wymiarach 14 cm × 17 cm × 24 cm. Wytnij cztery kawałki tektury falistej na odpowiednie rozmiary, tak aby zmieściły się w klatce (13 cm × 23 cm i 13 cm × 16 cm).
    2. Aby zapobiec przecięciu stóp myszy przez siatkę, umieść dwa kawałki odpowiednio na dole i z tyłu. Umieść pozostałe dwa elementy prostopadle do siebie, aby podzielić przestrzeń w klatce na ćwiartki.
  2. Przeprowadź to badanie w dźwiękoszczelnym pudełku. Umieść głośnik 8.5 cm przed klatką i umieść zarówno głośnik, jak i klatkę w dźwiękoszczelnym pudełku.
  3. Otwórz aplikację CLIO
  4. Przesuń kursor na ikonę głośnika, a następnie kliknij TwoSin. Wprowadź i zmień wartość Freq 1 na 1000 Hz, Freq 2 na 6000 Hz i kliknij OK, aby rozpocząć odtwarzanie dźwięku.
  5. Na karcie Leq zmień dBV na dBSPL. Po ustawieniu czasu w interfejsie oprogramowania kliknij przycisk zielonego trójkąta, aby odtworzyć dźwięk.
  6. Umieść mikrofon przed głośnikiem w odległości 8.5 cm, aby skalibrować poziom hałasu (patrz Plik uzupełniający 1). Dostosuj poziom hałasu do 125 dB SPL-A i stale monitoruj przez co najmniej 3 minuty, aby upewnić się, że poziom hałasu jest wystarczająco stabilny. Użyj generatora, analizatora i wzmacniacza, aby tworzyć i kontrolować hałas. (Rysunek 1)
    UWAGA: Wykonaj ten krok w dźwiękoszczelnym pudełku, aby uniknąć uszkodzenia słuchu operatora.
  7. Umieść cztery samce myszy C57BL/6J w klatce (po jednej na każdą ćwiartkę) w celu narażenia na hałas. Losowo przypisz myszy w każdej ćwiartce podczas ekspozycji na hałas. Umieść mikrofon na górze klatki, aby monitorować poziom hałasu podczas ekspozycji na hałas (Rysunek 2).
    UWAGA: Wykonaj ten krok w dźwiękoszczelnym pudełku, aby uniknąć uszkodzenia słuchu operatora.
  8. Wystawiaj myszy na działanie hałasu o częstotliwościach 1 kHz i 6 kHz nieprzerwanie przez 6 godzin dziennie przez 5 kolejnych dni.
  9. Zmierz progi słyszenia myszy 1 dzień po ekspozycji na hałas (tj. 6 dnia), mierząc ABR. Powtórz te pomiary ABR ponownie 1 tydzień po ekspozycji na hałas (tj. w 13dniu). Po pomiarach ABR poświęć wszystkie zaangażowane myszy i zbierz ich ślimaki (Ryc. 3).

2. Ocena progu słyszenia na podstawie słuchowej odpowiedzi pnia mózgu (ABR)

  1. Użyj komercyjnego systemu testowego ABR zaprojektowanego specjalnie dla małych zwierząt10.
  2. Dootrzewnowo wstrzyknąć mieszaninę tiletaminy i zolazepamu (40 mg/kg) oraz ksylazyny (9,3 mg/kg) myszom w celu znieczulenia ogólnego.
    UWAGA: Ocena ABR trwa ~2 godziny. Upewnij się, że zapewniasz wsparcie termiczne za pomocą poduszki grzewczej i nałóż maść do oczu, aby zapobiec wysuszeniu, gdy mysz jest pod narkozą.
  3. Zmierz ABR u myszy w znieczuleniu ogólnym. Umieść podskórne elektrody igłowe (12 mm) w wierzchołku, za małżowiną uszną lewego ucha i z powrotem w pobliżu ogona, aby zmierzyć próg słyszenia.
  4. Prezentuj bodźce akustyczne za pomocą głośnika umieszczonego w odległości 1 cm od lewego ucha zwierzęcia.
  5. Użyj oscyloskopu, aby kontrolować bodźce akustyczne. Wybierz Sinus Wave dla bodźców i 10 k dla skali okienkowej. Obróć pokrętło Częstotliwość, aby uzyskać żądaną częstotliwość bodźców akustycznych.
  6. Dostosuj intensywność bodźca, obracając pokrętło AMLP na generatorze funkcyjnym. Uzyskaj pożądaną intensywność bodźca, przekręcając pokrętło AMLP na odpowiednie napięcie, obliczone na podstawie kalibracji.
  7. Zbierz pomiary ABR przy serii intensywności bodźca, od 10 dB SPL do 100 dB SPL, z krokiem o rozmiarze 10 dB.
    UWAGA: Zmierz próg słyszenia w dźwiękoszczelnym pudełku. Za minimalny poziom intensywności bodźca, który mógł spowodować zauważalne V uderzenie fali w zebranym sygnale, przyjęto, że jest to próg ABR10,11 (Rysunek 4). Po ocenie ABR należy monitorować zwierzę do momentu wyzdrowienia ze znieczulenia (~1 h).

3. Badanie mikroskopowe

  1. Utrwalanie pobranej tkanki
    1. Po pomiarach ABR należy złożyć mysz w ofierze, wstrzykując dootrzewnowo mieszaninę tiletaminy i zolazepamu (100 mg/kg) i ksylazyny (23,25 mg/kg) do badania mikroskopowego.
    2. Pobrać ślimaki od myszy i natychmiast zanurzyć je w 10% formaldehydzie (FA) w celu utrwalenia (dwa ślimaki/ml) na co najmniej 8 godzin w temperaturze 4 °C.
    3. Po utrwaleniu roztwór FA zastąpić 10% roztworem kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) w celu odwapnienia przez 3-4 dni w temperaturze 4 °C. Następnie sprawdź każdy ślimak pęsetą, aby upewnić się, że ślimaki są wystarczająco zmiękczone.
    4. Umieść ślimaki na szalce Petriego wypełnionej solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) i pokrój spiralny narząd Cortiego (OC) (każdy odwapniony ślimak) na trzy sekcje - skręt podstawowy, skręt środkowy i skręt wierzchołkowy - do barwienia tkanek.
    5. Pod mikroskopem preparacyjnym (powiększenie: 8x-35x) należy usunąć struktury kostne (scala vestibuli, scala tympani, modiolus) odwapnionych ślimaków i uzyskać tkankę miękką, w tym OC (grubość: około 40 μm).
  2. Barwienie immunofluorescencyjne ślimaka
    1. Przygotowanie buforu blokującego: Przygotować 2% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) i 0,2% roztwory Triton X-100 w PBS.
    2. Przenieść tkankę do barwienia z płytki Petriego do probówki mikrowirówkowej i zanurzyć tkankę w 0,1 ml buforu blokującego na 2 godziny w temperaturze pokojowej (RT).
    3. Przygotowanie buforu przeciwciał pierwszorzędowych Myo7A: Rozcieńczyć przeciwciało pierwszorzędowe Myo7A w buforze blokującym w stosunku objętościowym 1:200.
    4. Traktować tkankę w probówce mikrowirówkowej 100 μl buforu przeciwciał pierwszorzędowych Myo7A przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.
    5. Opłucz chusteczkę trzy razy w PBS przez 5 minut każdy.
    6. Przygotowanie buforu przeciwciała drugorzędowego Myo7A (Myo7A-Rb-488) i przeciwciała falloidyny (falloidyny-594): Rozcieńczyć przeciwciało drugorzędowe Myo7A (1:400) i przeciwciało falloidyny (1:200) w buforze blokującym.
    7. Traktować tkankę 100 μl przeciwciała drugorzędowego Myo7A i buforu przeciwciała falloidyny przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.
    8. Po leczeniu przeciwciałem + przeciwciałem falloidyny przepłukać tkankę w PBS trzy razy, po 5 minut.
    9. Przenieść wypłukaną tkankę z probówki mikrowirówkowej na szalkę Petriego wypełnioną PBS za pomocą plastikowej pipety do przenoszenia o pojemności 1 ml z naciętą końcówką.
    10. Aby przygotować się do badania mikroskopowego, rozłóż tkankę, umieść ją na szkiełku podstawowym i dodaj 15 μl pożywki fluoromountowej 4',6-diamidino-2-fenyloindolu (DAPI) na tkankę, aby całkowicie ją pokryć. Delikatnie nałóż szklane szkiełko nakrywkowe na chusteczkę. Pozostaw szkiełko na noc w temperaturze pokojowej przed uszczelnieniem go lakierem do paznokci.
  3. Akwizycja obrazu
    1. Rejestruj obrazy 2D za pomocą pionowego mikroskopu fluorescencyjnego i oprogramowania do akwizycji obrazów.
    2. Przed wykonaniem badania mikroskopowego należy wyśrodkować tkankę w polu view i dostosować czułość do ISO 100. Najpierw dostosuj czas ekspozycji, klikając przycisk Tryb automatyczny w oprogramowaniu, a następnie dostosuj ręcznie, klikając przycisk Dostosuj, aby zoptymalizować stosunek sygnału do szumu.
    3. Dostosuj długość fali padającego światła, aby wzbudzić fluorofory, obracając kostkę fluorescencyjną. Pseudokolory użyto do oznaczenia emisji z różnych znaczników fluorescencyjnych (światło niebieskie: DAPI; światło zielone: Myo7A; światło czerwone: falloidyna).
    4. Skanując próbkę tkanki, wygeneruj i zgromadź dane obrazowania w postaci plików obrazów .tif i .jpg.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Zmiana progu słyszenia w badaniu ABR
Próg słyszenia u myszy mierzono za pomocą ABR z użyciem impulsów tonalnych (tone-burst) albo 1 dzień, albo 1 tydzień po ekspozycji na hałas. 1 dzień po ekspozycji na hałas (tj. w 6tym dniu) zaobserwowano istotny wzrost progu słyszenia dla wszystkich trzech badanych częstotliwości (12 kHz: 84,29 ± 2,77 dB SPL; 24 kHz: 91,43 ± 0,92 dB SPL; 32 kHz: 98,57 ± 1,43 dB SPL). Częściowa regeneracja słuchu nastąpiła 1 tydzień po ekspozycji na hałas (tj. w 13t...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

NIHL można podzielić na dwa rodzaje: NIHL tymczasowy, który pokazuje czasowe przesunięcie progu słyszenia, oraz NIHL stały, który charakteryzuje się trwałym przesunięciem progu słyszenia. Uważa się, że ubytek słuchu, który zaobserwowaliśmy6 dnia ( 1 dzień po ekspozycji na hałas) jest kombinacją tych dwóch typów. W takim przypadku próg słyszenia wykazywałby stopniową poprawę w czasie ze względu na czasowy składnik ubytku słuchu. W naszych wstępnych badaniach eksperymentalnych, wyniki uzyskane przy użyciu tej sa...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Brak konfliktu interesów do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy za granty z Ministerstwa Nauki i Technologii (MOST) rządu Tajwanu (MOST 110-2314-B-715-005, MOST 111-2314-B-715-009-MY3) oraz granty badawcze z Mackay Medical College (MMC-RD-110-1B-P030, MMC-RD-111-CF-G002-03).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
  Standardowy zestaw mikrofonowy 1/4" CCP w swobodnym poluGRAS428158Do ekspozycji na hałas
Moduł wejściowy wzmacniacza, AMI100DBIOPACDo słuchowej odpowiedzi pnia mózgu
Bio-wzmacniacz, BIO100CBIOPACDo słuchowej odpowiedzi pnia mózgu
Albumina surowicy bydlęcejSIGMAA9647Barwienie immunofluorescencyjne
OprogramowanieCellsensOlympus life scienceAkwizycja obrazu
Tektura
DAPI fluoromountSouthernBiotech0100-20Barwienie immunofluorescencyjne
Kwas etylenodiaminotetraoctowySIGMAE5134Wzmacniacz odpowiedzi odwapniającej
wywołanej, ERS100CBIOPACDo słuchowej odpowiedzi
pnia mózguFormaldehydAPLHAF030410Utrwalanie ślimaka
Wysokowydajny system gromadzenia danych, MP160BIOPACDo słuchowej odpowiedzi pnia mózgu
Modułowy przedłużacz, MEC110CBIOPACDo słuchowej odpowiedzi pnia mózgu
Przeciwciało pierwotne Myo7AProteus25-6790Barwienie immunofluorescencyjne
Przeciwciało wtórne Myo7AJackson immunoresearch711-545-152Elektroda igłowa do barwienia immunofluorescencyjnego
, Unipolarna 12 mmTp, EL452BIOPACDo słuchowej odpowiedzi pnia mózgu
przeciwciało falloidynoweAlexa FluorA12381Barwienie immunofluorescencyjne
sól fizjologiczna buforowana fosforanamiSIGMAP4417
Klatka14 cm x 17 cm x 24cm
ROMPUN- ksylazyna do wstrzykiwań, roztwór Bayer HealthCare, LLC
Wzmacniacz dźwięku, MT-1000unikaDo ekspozycji na hałas
Generator/analizator dźwięku/różne, FW-02CLIO620300719Do ekspozycji na hałas
Komora dźwiękoszczelnaIEA TechnologiaDo ekspozycji na hałas i głośnik ABR
 elektroakustyczna IEADo modułu
stymulatoraSTM100C BIOPACDo słuchowej odpowiedzi pnia mózgu
Triton X-100SIGMAT8787barwienia immunofluorescencyjnego
, OUT101BIOPACDo słuchowej odpowiedzi pnia mózgu
Mikroskop pionowy, BX53OlympusAkwizycja obrazu
ZoletilVirbac
falista pułapka na szczury elektroakustyczna Technologia ekspozycji na hałas, Zestaw tubofonów do

Bibliografia

  1. World Report on Hearing. World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/publications/i/item/9789240020481 (2021).
  2. Fernandez, K. A., et al. Noise-induced cochlear synaptopathy with and without sensory cell loss. Neuroscience. 427, 43-57 (2020).
  3. Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Adding insult to injury: cochlear nerve degeneration after "temporary" noise-induced hearing loss. The Journal of Neuroscience. 29 (45), 14077-14085 (2009).
  4. Wang, J., et al. Overexpression of X-linked inhibitor of apoptosis protein protects against noise-induced hearing loss in mice. Gene Therapy. 18 (6), 560-568 (2011).
  5. Takeda, S., Mannström, P., Dash-Wagh, S., Yoshida, T., Ulfendahl, M. Effects of aging and noise exposure on auditory brainstem responses and number of presynaptic ribbons in inner hair cells of C57BL/6J mice. Neurophysiology. 49 (5), 316-326 (2017).
  6. Rouse, S. L., Matthews, I. R., Li, J., Sherr, E. H., Chan, D. K. Integrated stress response inhibition provides sex-dependent protection against noise-induced cochlear synaptopathy. Scientific Reports. 10 (1), 18063(2020).
  7. Amanipour, R. M., et al. Noise-induced hearing loss in mice: Effects of high and low levels of noise trauma in CBA mice. Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. 2018, 1210-1213 (2018).
  8. Edderkaoui, B., Sargsyan, L., Hetrick, A., Li, H. Deficiency of duffy antigen receptor for chemokines ameliorated cochlear damage from noise exposure. Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 173(2018).
  9. Hultcrantz, M., Simonoska, R., Stenberg, A. E. Estrogen and hearing: a summary of recent investigations. Acta Oto-laryngologica. 126 (1), 10-14 (2006).
  10. Tsai, S. C. -S., et al. The intravenous administration of skin-derived mesenchymal stem cells ameliorates hearing loss and preserves cochlear hair cells in cisplatin-injected mice: SMSCs ameliorate hearing loss and preserve outer hair cells in mice. Hearing Research. 413, 108254(2022).
  11. Choi, M. Y., Yeo, S. W., Park, K. H. Hearing restoration in a deaf animal model with intravenous transplantation of mesenchymal stem cells derived from human umbilical cord blood. Biochemical and Biophysical Research Communications. 427 (3), 629-636 (2012).
  12. Yu, S. -K., et al. Morphological and functional evaluation of ribbon synapses at specific frequency regions of the mouse cochlea. Journal of Visualized Experiments. (147), e59189(2019).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Progi s yszalno ciodpowied s uchowa pnia m zgumysi model s uchuprotok ekspozycji na ha asbarwienie immunofluorescencyjnenarz d Cortiegokom rki rz sate limakawysokocz stotliwo ciowa utrata s uchu
Zmodyfikowane warunki eksperymentalne dla ubytku słuchu wywołanego hałasem u myszy oraz ocena funkcji słuchu i uszkodzenia zewnętrznych komórek rzęsatych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.