Artykuł metodologiczny

Formowanie, ograniczanie i obserwacja aktywnych nematyk opartych na mikrotubulach

DOI:

10.3791/64287

⸱

13 stycznia 2023

 ,  ,  , 
1Department of Physics, University of California

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawione tutaj są metody przygotowania aktywnych nematyków z mikrotubul i silników kinezynowych, w tym przygotowanie i budowa białek oraz wykorzystanie studni do aktywnego uwięzienia nematycznego.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tworzenie aktywnych faz na bazie biopolimerów stało się ważną techniką dla badaczy zainteresowanych badaniem powstającej dziedziny aktywnych ciekłych kryształów i ich możliwych ról w biologii komórki. Te nowatorskie systemy składają się z samonapędzających się podjednostek, które zużywają energię lokalnie, wytwarzając niezrównoważony płyn dynamiczny. Aby utworzyć aktywną fazę ciekłokrystaliczną opisaną w tym raporcie, oczyszczone składniki białkowe, w tym biopolimery i silniki molekularne, są łączone, a aktywna faza nematyczna spontanicznie tworzy się w obecności adenozynotrójfosforanu (ATP). Aby zaobserwować stan nematyczny, materiał musi być zamknięty w odpowiedniej geometrii do mikroskopii o wystarczająco dużej gęstości. W artykule opisano dwie różne metody tworzenia aktywnej fazy nematycznej za pomocą mikrotubul i silników kinezynowych: montaż dwuwymiarowej warstwy aktywnej na granicy faz oleju i wody oraz montaż pod warstwą oleju za pomocą studzienki elastomerowej. Opisano również techniki wprowadzania materiału aktywnego do małych studzienek o różnych kształtach.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aktywne płyny składają się z napędzanych energią cząstek lub pierwiastków, które czerpią paliwo ze swojego lokalnego środowiska. W odpowiednich warunkach te ruchliwe elementy aktywne mogą działać wspólnie, tworząc wyłaniającą się dynamikę płynów w długich skalach. W literaturze istnieje wiele przykładów takiego zachowania fazowego poza równowagą, a fazy aktywne można znaleźć w całym spektrum systemów żywych. Niektóre godne uwagi przykłady to kolonie bakterii1, arkusze komórek2,3, oraz stado lub rój organizmów4,5. Fazy aktywne były również szeroko badane w skondensowanych fazach włókien cytoszkieletu, zarówno jako część cell6, jak i w systemach syntetycznych zaprojektowanych do wykorzystania biologicznie ekstrahowanych składników7,8,9. Uporządkowanie ciekłokrystaliczne i powstawanie defektów topologicznych zarówno w systemach występujących naturalnie, jak i syntetycznych składanych z ekstraktów biologicznych jest przedmiotem szczególnego zainteresowania społeczności naukowej. W ostatnich latach grupy badawcze badały takie systemy, ich podstawowe właściwości fizyczne i ich znaczenie dla biologii2,3,10,11.

Ten artykuł skupia się na tworzeniu aktywnego stanu nematycznego z połączenia mikrotubul i białek motorycznych kinezyny. Tradycyjny nematyczny ciekły kryształ jest fazą równowagi materii, w której cząsteczki składowe wykazują uporządkowanie orientacyjne. Na przykład płyn składający się ze stosunkowo sztywnych cząsteczek przypominających pręty może wykazywać zarówno fazę nematyczną, jak i, w wyższych temperaturach, niezorientowaną izotropową fazę płynu12. Pierwszy eksperymentalny przykład aktywnej fazy nematycznej został opracowany przez Sancheza i wsp.13, adaptując wcześniejszy eksperyment in vitro14, w którym klastry białek motorycznych zostały użyte do wytworzenia ruchu ścinającego między sąsiednimi wiązkami mikrotubul. Kiedy ten system mikrotubul został ograniczony do cienkiej warstwy, pojawiło się spontaniczne uporządkowanie nematyczne. W ostatnich latach aktywny stan nematyczny był intensywnie badany przez kilka eksperymentalnych15,16 i theoretical17,18 grup badawczych, koncentrujących się na zjawiskach takich jak aktywna turbulencja — stan, w którym płyn wytwarza samonapędzające się przepływy chaotyczne19— i ruchomych wad topologicznych. W artykule opisano metody otrzymywania i tworzenia aktywnego stanu nematycznego z mikrotubul i silników kinezynowych w różnych geometriach eksperymentalnych. W pierwszej kolejności opisano metody przygotowania różnych roztworów składowych, a następnie metody tworzenia aktywnej nematyki przy użyciu dwóch różnych geometrii komory przepływowej. Przedstawiono typowe wyniki obrazowania. Na koniec opisano metody ograniczania aktywnej nematyki w studniach i kanałach.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie materiału aktywnego

UWAGA: Aktywny nematyka 2D jest montowany w trzyetapowym procesie. Najpierw przygotowuje się dwa oddzielne roztwory: a) spolimeryzowane, stabilizowane mikrotubule i b) MIX (roztwór zawierający silniki kinezynowe). Są one łączone, a aktywność rozpoczyna się po dodaniu trifosforanu adenozyny (ATP). Materiał jest następnie zamykany w odpowiedniej geometrii, tak aby jego gęstość była wystarczająco wysoka, aby wyłonił się porządek nematyczny. Dołączone są protokoły dotyczące przygotowania wszystkich niezbędnych komponentów i sposobu montażu fazy aktywnej.

  1. Przygotowanie klastra białek motorycznych kinezyny
    1. Ekspresja i oczyszczanie rekombinowanych białek motorycznych K401-BIO (silników K401) z Escherichia coli zgodnie z protokołem Edgara C. Younga20.
      UWAGA: Białka motoryczne K401-BIO są dimeryczne i składają się z dwóch główek połączonych spiralną łodygą. Silniki zostały dostarczone przez Brandeis Biomaterials Facility i używane zgodnie z wcześniejszymi doniesieniami16. W celu utworzenia aktywnego nematyki, cząsteczki kinezyny są biotynylowane, a następnie łączone za pomocą wiązania streptawidyny, tworząc klastry kinezyny składające się z maksymalnie czterech silników13,15,21,22. Pomocne jest wyrażanie kinezyny za pomocą znacznika białka zielonej fluorescencji (GFP).
    2. Po oczyszczeniu i inkubacji streptawidyny i silników na lodzie przez 40 minut, błyskawicznie zamrozić silniki K401 w ciekłym azocie w podwielokrotnościach 5 μl o końcowym stężeniu 0,7 mg/ml i przechowywać w temperaturze -80 °C.
      UWAGA: W tym miejscu eksperyment można wstrzymać. W razie potrzeby delikatnie rozmrozić kinezynę i nie zamrażać ponownie.
    3. Przygotować klastry kinezyny znakowanej biotyną (KSA) przez zmieszanie 24% obj. silników K401 0,7 mg/mL, 27% obj. 0,325 mg/ml streptawidyny i 3% obj. 5 mM ditiotreitolu (DTT) (w celu zapobieżenia agregacji) w temperaturze 4 °C w buforze M2B o stężeniu 46 mM (80 mM RURY [kwas 1,4-piperazynodienosulfonowy, pH 6,8], 2 mM MgCl2 i 1 mM EGTA [eter bis(β-aminoetylowy)-N, Kwas N,N′,N′-tetraoctowy]). Pozwól KSA inkubować na lodzie przez 40 minut.
  2. Przygotowanie roztworu mikrotubul
    UWAGA: Trifosforan guanozyno-5'-[(α,β)-metyleno]trifosforan (GMPCPP) jest wolno hydrolizowalnym analogiem trifosforanu guanozyny (GTP), a mikrotubule powstałe w obecności GMPCPP są trzykrotnie sztywniejsze niż mikrotubule GTP23 i krótsze. Zastosowanie krótkich, sztywnych mikrotubul jest korzystne dla tworzenia aktywnej fazy nematycznej, ponieważ czynniki te łączą się, aby promować uporządkowanie ciekłokrystaliczne.
    1. Polimeryzować nieznakowaną tubulinę cykliczną (99%, patrz tabela materiałów) przy użyciu 0,6 mM GMPCPP przy stężeniu tubuliny 6 mg/mL.
      UWAGA: Wysokiej jakości tubulinę można również oczyścić z mózgu bydlęcego lub świńskiego zgodnie z ustalonymi protokołami lub uzyskać z innego wiarygodnego źródła, takiego jak Brandeis Biomaterials Facility, gdzie materiały mogą być wysyłane zamrożone, aby zapobiec uszkodzeniom. Aby uzyskać informacje na temat oczyszczania tubuliny z mózgu bydła, zapoznaj się z opublikowanym protokołem Bate et al.24. Aby uzyskać informacje na temat oczyszczania tubuliny z mózgu świni, zapoznaj się z opublikowanymi protokołami z Castoldi et al.25 i Tayar et al.26.
    2. Przygotowując się do polimeryzacji, przygotować łaźnię cieplną w temperaturze 37 °C i wstępnie schłodzić wirówkę do temperatury 4 °C. Połączyć nieznakowany roztwór tubuliny w buforze M2B (krok 1.1.3) w probówce ultrawirówki o pojemności 500 μl z tubuliną znakowaną rodaminą o stężeniu 4% molowym (patrz tabela materiałów), aby po polimeryzacji otrzymać 4% znakowane mikrotubule.
    3. Sprawdź stężenie tubuliny za pomocą testu Bradforda27. Całkowite stężenie tubuliny w probówce wirówkowej powinno wynosić 6,5-6,9 mg/ml.
    4. Inkubować mieszaninę tubuliny na lodzie przez 10 minut i ultrawirować przez 10 minut w temperaturze 352,700 x g w temperaturze 4 °C. Ten krok usuwa dysfunkcyjną tubulinę, która będzie znajdować się w granulce.
    5. Za pomocą pipety ostrożnie wyekstrahować supernatant zawierający funkcjonalną tubulinę do probówki do mikrowirówki. Dodać GMPCPP do końcowego stężenia 0,6 mM w celu indukowania polimeryzacji tubuliny i DTT do końcowego stężenia 1 mM, aby zapobiec agregacji białek.
    6. Mieszaninę inkubować w łaźni grzewczej w temperaturze 37 °C przez 30 minut, a następnie ponownie odwirowywać przez 10 minut przy 14 000 x g w temperaturze pokojowej. Usunąć supernatant, a następnie rozcieńczyć osad buforem M2B, aby osiągnąć końcowe stężenie mikrotubul 6 mg/ml.
      UWAGA: Roztwór ten można przechowywać w temperaturze pokojowej przez co najmniej 4 godziny przed użyciem.
    7. Aby sprawdzić, czy mikrotubule pomyślnie spolimeryzowały, rozcieńczyć 1 μl roztworu mikrotubul w stosunku 100:1 buforem M2B i pipetą na szkiełku mikroskopowym. Okładka z szkiełkiem nakrywkowym do obrazowania za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego (patrz tabela materiałów) z soczewką obiektywową 40x.
      UWAGA: Długości fal wzbudzenia i emisji są dobierane zgodnie z oznaczeniem fluorescencyjnym stosowanym na mikrotubulach. W tym protokole stosuje się znakowanie rodaminą (patrz krok 1.2.2), więc obrazowanie odbywa się przy użyciu pasma wzbudzenia 515-560 nm i filtra długoprzepustowego 590 nm. Rysunek 1 pokazuje reprezentatywny przykład.
    8. Po zakończeniu polimeryzacji mikrotubule należy zamrozić kroplowo w postaci 2 μl podwielokrotności w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C (jeśli jest to wymagane).
  3. Przygotowanie MIX
    UWAGA: MIX jest roztworem wodnym, który zawiera klastry kinezyna-streptawidyna (KSA). Przygotowany MIX należy przechowywać w temperaturze -80 °C w 4 μl porcji przed rozpoczęciem doświadczenia. Gdy MIX jest połączony z ATP i roztworem mikrotubul opisanym w kroku 1.2 w temperaturze pokojowej, rozpoczyna się aktywność. MIX przygotowuje się w następujący sposób13,19.
    1. Przygotować roztwór zapobiegający blaknięciu fluorescencji (ANTIFADE), mieszając dwa roztwory przeciwutleniaczy. Połącz AO1 (250 mM DTT, 65 mM katalazy) i AO2 (750 μM katalazy, 3 mM oksydazy glukozowej) w stosunku objętościowym 1:1. Zawiera 20 mM Trolox, inny przeciwutleniacz stosowany w celu zmniejszenia uszkodzeń spowodowanych mikroskopią fluorescencyjną.
    2. Przygotować MIX, sporządzając roztwór KSA (opisany w kroku 1.1.3), który zawiera 6 % wag. 20 kDa glikolu polietylenowego (PEG) w celu wywołania wiązania mikrotubul, 3% obj. ANTIFADE i 5% obj. kinazy pirogronianowej/dehydrogenazy mlekowej (PKLDH) w stężeniu 70 mg/ml do regeneracji ATP.

2. Tworzenie aktywnego nematyka

UWAGA: Aktywność w materiale jest inicjowana przez dodanie ATP. Sieć aktywna jest przygotowywana na świeżo dla każdego eksperymentu poprzez dodanie ATP w stężeniu wystarczająco wysokim, aby wywołać aktywność motoryczną. Aby utworzyć jednolitą, w pełni rozwiniętą aktywną fazę nematyczną, mikrotubule muszą mieć wystarczająco dużą gęstość. Można to osiągnąć poprzez zamknięcie mikrotubul pomiędzy dwoma niemieszającymi się płynami w celu utworzenia dwuwymiarowej (2D) aktywnej warstwy nematycznej. Metoda ta została pierwotnie opracowana na Uniwersytecie Brandeis13 i pozostaje popularną techniką wytwarzania jednorodnej, wysokiej jakości, aktywnej fazy nematycznej.

  1. Metoda komórkowa przepływowa do aktywnego tworzenia nematycznego
    1. Przygotuj hydrofilowe szkiełka nakrywkowe z powłoką akrylową.
      1. Dokładnie wyczyść szkiełka nakrywkowe wodą z mydłem, etanolem i 0,1 M NaOH z naprzemiennym płukaniem wodą nanoczystą. Po spłukaniu pokryj szkiełka nakrywkowe roztworem silanu złożonym ze 100 ml etanolu, 1 ml kwasu octowego i 500 μl 3-(trimetoksysililo)metakrylanu propylu przez 15 minut, a następnie spłukuj wodą nanoczystą.
      2. Przygotować roztwór akrylamidu z 95 ml wody nanoczystej i 5 ml 40% wag. akrylamidu, a następnie odgazowywać roztwór przez 30 minut w piecu próżniowym.
      3. Dodać 35 μl tetrametyloetylenodiaminy (TEMED) do uzyskania końcowego stężenia 2,3 mM, a następnie 0,07 g nadsiarczanu amonu. Wlać roztwór akrylamidu na szkiełka nakrywkowe stroną zadrukowaną do góry i inkubować przez noc w temperaturze pokojowej.
    2. Przygotuj hydrofobowe szkiełka mikroskopowe. Pobrać pipetą 100 μl roztworu hydrofobowego (patrz tabela materiałów) na czyste szklane szkiełko mikroskopowe, a następnie umieścić na nim kolejne czyste szkiełko podstawowe. Zapewnia to równomierne pokrycie roztworu hydrofobowego na powierzchni, na której się znajduje, przez 2 minuty. Po 2 minutach zdejmij drugie szkiełko i dokładnie spłucz pierwsze szkiełko nanoczystą wodą, a następnie osusz gazowym azotem. Delikatnie wyczyść obszar, w którym taśma zostanie umieszczona (wokół wzoru) acetonem, aby upewnić się, że roztwór hydrofobowy nie zapobiega przyleganiu do szkła.
    3. Przygotować mieszaninę oleju inżynieryjnego, która zawiera 1,8% (v/v) 008-FluoroSurfaktant (patrz Tabela Materiałów).
    4. Zamontuj szkiełko podstawowe i szkiełko nakrywkowe z hydrofobowym szkiełkiem podstawowym na spodzie komory przepływowej i hydrofilowym szkiełkiem nakrywkowym jako górną powierzchnią w geometrii warstwowej za pomocą dwustronnych przekładek klejących 40 μm. Umieść przekładki w odległości 1.5 mm od siebie na szkiełku mikroskopu hydrofobowego. Następnie umieść szkiełko nakrywkowe pokryte akrylamidem na podkładkach dystansowych stroną do dołu, aby przylegało. Upewnij się, że przyczepność jest pełna przy nacisku przedmiotu.
      UWAGA: Celem jest zmontowanie komory przepływowej z płaskim interfejsem olej/woda wewnątrz (Rysunek 2A,B). W tym miejscu utworzy się warstwa aktywna. Alternatywne taśmy dystansowe i folie mogą być również używane do produkcji o podobnej grubości komórek.
    5. Po zbudowaniu komory przepływowej należy natychmiast odpipetować mieszaninę oleju do komory przepływowej, wypełniając zamkniętą przestrzeń.
    6. Za pomocą pipety, w osobnej fiolce delikatnie wymieszaj 6 μl substancji aktywnej z 3,73 μl MIX, 1 μl roztworu mikrotubul, 0,6 μl roztworu ATP (stężenie można zmieniać w celu zmiany prędkości mikrotubul) i 0,67 μl buforu M2B.
    7. Odpipetować świeżo wymieszany materiał aktywny do jednego otwartego końca komory przepływowej, objętości będą się różnić, ale powinny przekraczać objętość komory przepływowej (około 3-6 μl). Część oleju zostanie wyparta przez roztwór wodny podczas wstrzykiwania go do kanału; może on zostać przesiąknięty na przeciwległym końcu kanału przepływowego za pomocą małego kawałka bibuły.
    8. Po napełnieniu uszczelnij obie strony komory przepływowej klejem epoksydowym (patrz tabela materiałów), który twardnieje pod wpływem światła UV przez 20 s.
      UWAGA: W tym momencie materiał aktywny tworzy sieć 3D, która pozostaje zawieszona w warstwie wody.
    9. Aby ograniczyć warstwę czynną między dwoma niemieszającymi się płynami w warstwie quasi-2D, umieść komórkę przepływową w wirówce kubełkowej wahadłowej (patrz Tabela materiałów) z fazą wodną na górze i gęstszą warstwą oleju pod spodem. Wirować przy 212 x g przez 10 min. Po zakończeniu tego kroku komórkę przepływową można przenieść do mikroskopu epifluorescencyjnego w celu obrazowania z obiektywem o powiększeniu 10x lub 20x. Rysunek 2C,D pokazuje typowe obrazy przed i po tym kroku.
  2. Odwrócona metoda aktywnego tworzenia nematyki
    UWAGA: Alternatywną metodą do opisanej w kroku 2.1 jest złożenie aktywnej warstwy nematycznej pod grubą warstwą oleju ograniczoną do głębokiego odwiertu PDMS28. Ta metoda daje podobne wyniki i jest nieco łatwiejsza do opanowania; Jednak jakość obrazu przy użyciu tej metody zwykle nie jest tak dobra, jak w przypadku metody z komórką przepływową.
    1. Przygotować polidimetylosiloksan (PDMS) przy użyciu utwardzacza elastomerowego i bazy elastomerowej (patrz tabela materiałów). Wymieszaj oba składniki w stosunku 1:10 za pomocą metalowej szpatułki. Podczas mieszania pojawiają się drobne bąbelki, które są trudne do usunięcia, a mieszanina wydaje się mleczna. Aby usunąć te pęcherzyki, umieść mieszaninę pod próżnią w celu odgazowania przez 1 godzinę, po czym nieutwardzony PDMS powinien wydawać się przezroczysty.
      UWAGA: PDMS jest teraz gotowy do formowania dowolnego kształtu za pomocą formy lub może utwardzić się w pojemniku, a następnie zostać wycięty lub wykrawany w żądany wzór.
    2. Wlać PDMS do odpowiedniej formy i pozostawić na noc do utwardzenia w temperaturze 60 °C.
      UWAGA: Nieobrobiona powierzchnia utwardzonego PDMS jest hydrofobowa, ale dzięki obróbce powierzchniowej może być hydrofilowa.
    3. Aby przygotować hydrofilową powierzchnię PDMS, pokryj PDMS szczotką z polimeru akrylowego29. Ten krok zapobiega również przywieraniu białek do powierzchni.
      1. Zacznij od czyszczenia PDMS przez 10 minut zarówno etanolem, jak i izopropanolem, a następnie dokładnie spłucz wodą dejonizowaną 3x i wysusz. Użyj myjki plazmowej przez 5 minut, aby wyczyścić suchy, utwardzony PDMS. Ten krok sprawia, że powierzchnia jest bardziej hydrofilowa.
      2. Następnie należy przygotować roztwór silanu (98,5% wag. etanolu, 1% wag. kwasu octowego i 0,5% wag. metakrylanu trimetoksysililopropylu) i zanurzyć podłoże w tym roztworze na 15 minut, aby przygotować się do powłoki akrylowej. Dokładnie spłukać podłoże wodą dejonizowaną i zanurzyć w roztworze akrylamidu (2% wag. roztwór akrylamidu/bis, 2,3 mM TEMED i 3 mM nadsiarczan amonu).
        UWAGA: Podłoża te mogą być przechowywane w temperaturze pokojowej pokrytej roztworem akrylamidu na szklanej szalce Petriego i powinny być zużyte w ciągu 2 tygodni.
    4. Gdy jest gotowy do użycia, spłucz powierzchnię wodą dejonizowaną i osusz azotem do natychmiastowego użycia. Dodać aktywną mieszaninę (opisaną w kroku 2.1.6) do studzienek i natychmiast dodać olej silikonowy na wierzch do grubości około 2 mm.
      UWAGA: Na tym etapie aktywna mieszanina zostanie umieszczona między olejem a powłoką hydrofilową na PDMS, ale nadal będzie nieco trójwymiarowa.
    5. Aby wepchnąć materiał głębiej w warstwę 2D, przyklej urządzenie PDMS do szkiełka podstawowego, umieść je w wirówce z wahadłowym wiadrem i wiruj przez 12 minut przy 212 x g. Urządzenie będzie musiało być ustawione w taki sposób, aby olej silikonowy znajdował się na wierzchu warstwy wodnej. Reprezentatywne wyniki przedstawiono na rysunku 3.

3. Przygotowanie aktywnych nematyków w ograniczonych geometriach

UWAGA: Aktywne nematyki, takie jak ten quasi-dwuwymiarowy system, mogą być trudne do ograniczenia do małych geometrii mikroprzepływowych, takich jak studnie lub kanały. W tym miejscu opisano niezawodną metodę ograniczania materiału do studzienek PDMS o różnych kształtach.

  1. Najpierw zaprojektuj główną formę dla PDMS. Można to osiągnąć poprzez drukowanie 3D filarów na podłożu. Po wydrukowaniu 3D formy głównej żywicy, oczyść ją izopropanolem, a następnie utwardź formę pod lampą UV przez 45 minut i w piekarniku w temperaturze 120 °C przez 2 godziny (Rysunek 4).
    UWAGA: Utwardzanie w promieniowaniu UV i termiczne utwardzanie poprawia jakość replikacji w PDMS poprzez usunięcie monomerów i pozostałości fotoinhibitorów z żywicy30.
  2. Użyj formy wzorcowej, aby utworzyć studnie z PDMS. Przygotuj PDMS zgodnie z opisem w kroku 2.2.1. Zanurz formę wzorcową w nieutwardzonym PDMS i utwardź przez noc w piekarniku w temperaturze 60 °C.
  3. Po zakończeniu utwardzania PDMS ostrożnie wyjmij formę wzorcową i przytnij PDMS zgodnie z potrzebami, aby pracować ze studzienkami (Rysunek 4). Powierzchnię PDMS należy traktować zgodnie z opisem w kroku 2.2.3. Przed eksperymentem powierzchnię można przymocować do szkiełka za pomocą kleju epoksydowego, aby ułatwić obrazowanie.
  4. Odpipetować 1 μl aktywnej mieszaniny opisanej w kroku 2.1.6 na podłoże PDMS i natychmiast dodać olej silikonowy o lepkości 100-1000 cSt 28 na kroplę aktywnej sieci. Aktywna sieć zostanie przeniesiona do studni; proces ten trwa do 60 minut (Rysunek 4). Jak opisano w kroku 2.2.5, sieć 2D można rozszerzyć, obracając dobrze PDMS w wirówce kubełkowej wahadłowej przez 12 minut przy 212 x g.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rysunek 1 przedstawia reprezentatywny obraz pojedynczych mikrotubul przygotowanych z tubuliny GMPCPP. Obraz przedstawia krótkie mikrotubule o podobnej długości (z pewną dyspersją). Wystarczające rozcieńczenie roztworu mikrotubul powinno dać obraz dobrze oddzielonych mikrotubul do weryfikacji długości. Poszczególne mikrotubule mogą być trudne do zobrazowania ze względu na ich mały rozmiar. W tym zastosowaniu najlepiej nadaje się kamera o wysokiej czułości przeznaczona do mikroskopii fluorescencyjnej. Rysunek 2 i Rysunek 3 pokazuje przykładowe obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej przedstawiające udane eksperymenty przeprowadzone przy użyciu metody komórek przepływowych (sekcja 2.1) i metody odwróconej (sekcja 2.2). Dobrze uformowana aktywna warstwa nematyczna ma jednorodną teksturę, bez znaczących obszarów pustych przestrzeni i ruchomych defektów topologicznych. Należy jednak pamiętać, że w uszkodzonych rdzeniach mogą występować dopuszczalne małe puste przestrzenie. Oprócz przykładów pokazanych w Rysunek 2 i Rysunek 3, dołączono trzy dodatkowe filmy (Film 1, Film 2 i Film 3), aby pokazać, jak aktywny nematyk powinien wyglądać w udanym eksperymencie. Wszystkie filmy pokazują płynny, ciągły ruch aktywnej fazy nematycznej. Nie są widoczne żadne zmiany w stężeniu mikrotubul po osiągnięciu przez materiał stanu ustalonego. Tak długo, jak w systemie obecna jest wystarczająca ilość ATP, materiał będzie nadal poruszał się równomiernie.

figure-results-1
Rysunek 1: Obraz mikrotubul GMPCPP z mikroskopu fluorescencyjnego. Mikrotubule GMPCPP znakowano w 4% tubuliną rodaminy i polimeryzowano przez 20 minut w temperaturze 37 °C. Obrazowanie przeprowadzono w temperaturze pokojowej. Podziałka = 10 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Nematyzacja mikrotubul w komórce przepływowej. (A) Schemat przekroju poprzecznego komory przepływowej, geometria 1 mm x 18 mm. (B) Schemat komory przepływowej w widoku z góry. (C) Obraz z mikroskopii fluorescencyjnej przedstawiający typowy wygląd roztworu aktywnego przed montażem na granicy faz olej/woda. (D) Obraz z mikroskopii fluorescencyjnej aktywnej fazy nematycznej zgromadzonej na granicy faz olej/woda wewnątrz komory przepływowej. Podziałka skali = 100 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Obraz z mikroskopu fluorescencyjnego przedstawiający aktywną nematykę przygotowaną metodą odwróconą. Podziałka = 200 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Diagram przepływu ilustrujący metodę aktywnego uwięzienia nematycznego w studni PDMS, w tym wytwarzanie form i obróbkę powierzchni. Podziałka skali na zdjęciu po prawej stronie (ograniczony materiał aktywny) = 200 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Film 1: Reprezentatywny wynik dla aktywnej nematyki przygotowany przy użyciu metody komórek przepływowych. Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Movie 2: Reprezentatywny wynik dla aktywnego nematyka przygotowany przy użyciu metody odwróconej. Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Film 3: Reprezentatywny wynik dla aktywnego nematyka przygotowany metodą odwróconą ograniczoną do eliptycznego dołka. Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W protokołach jest kilka punktów, w których eksperymentator może dokonać kilku ważnych kontroli. Przed napełnieniem któregokolwiek z urządzeń materiałem aktywnym należy zastosować mikroskopię fluorescencyjną (patrz rysunek 1) w celu sprawdzenia, czy mikrotubule są spolimeryzowane i najlepiej mają długość ~2-3 μm. Jeśli mikrotubule nie są widoczne pod mikroskopem, mogły ulec depolimeryzacji i nie utworzy się aktywna nematyka. Ponieważ pojedyncze mikrotubule są bardzo małe, obserwowanie ich bezpośrednio przez mikroskop może być trudne. W tym badaniu wykorzystano wysokiej jakości kamerę fluorescencyjną przeznaczoną do trudnych zastosowań przy słabym oświetleniu wraz z powiązanym oprogramowaniem w celu weryfikacji wzrostu filamentu. Na tym etapie nie powinno być obecnych znaczących agregatów fluorescencyjnych, ponieważ może to wskazywać na depolimeryzację lub obecność zdenaturowanego białka. Dobrym pomysłem jest również wykonanie prostego szkiełka testowego mikroskopu poprzez połączenie mikrotubul, MIX i ATP w tych samych proporcjach, jak opisano w protokołach. Aktywność powinna rozpocząć się od połączenia składników, a materiał powinien wyglądać podobnie do tego pokazanego na rysunku 2C , z obecnymi wiązkami i zauważalnymi ruchami włókien widocznymi w całym tekście.

W przypadku stosowania metody komory przepływowej czas wirowania i orientacja komory przepływowej są ważne dla utworzenia jednolitej warstwy aktywnej. Ten krok może wymagać pewnego dostrojenia w zależności od używanego typu wirówki. Odwirowanie komory przepływowej z aktywną płaszczyzną zorientowaną prostopadle do płaszczyzny obrotu daje najlepsze wyniki, ponieważ materiał może być równomiernie wpychany na granicę faz płynu. Dokładnie sprawdź, czy komórka przepływowa jest starannie uszczelniona przed odwirowaniem.

W przypadku stosowania metody odwróconej do wytwarzania ograniczonych aktywnych nematyków istnieje kilka kroków do optymalizacji. Po pierwsze, ważne jest, aby zastosować metodę druku 3D, która pozwala na tworzenie struktur o wysokiej rozdzielczości. Nierówne ścianki boczne mogą powodować wyłapywanie mikrotubul, co zakłóci przepływy. Studnie nie powinny być zbyt głębokie (w pracy wykorzystano studnie o głębokości 150-200 μm z warstwą ropy o grubości 2 mm). Eksperymentatorzy mogą być zmuszeni do niewielkiego dostosowania tych parametrów metodą prób i błędów, aby uzyskać najlepszy wynik.

Metoda komórek przepływowych i metoda odwrócona były używane przez różnych autorów do przyjrzenia się różnorodnym efektom, które wpływają na aktywne przepływy, w tym różnym olejom12 i zanurzonym strukturom13. Wybór metody zależy od celu eksperymentu. W przypadku metody komórek przepływowych obrazowanie optyczne znad warstwy aktywnej jest wyraźniejsze niż w przypadku metody odwróconej ze względu na różne płyny leżące powyżej. W metodzie z komórką przepływową obrazowanie odbywa się przez szklane szkiełko nakrywkowe i cienką warstwę wody, podczas gdy metoda odwrócona jest zaprojektowana tak, aby warstwa oleju znajdowała się na wierzchu. Oznacza to, że do metody odwróconej potrzebny jest obiektyw o dużej odległości roboczej, a jakość obrazu ulega pogorszeniu. Różnice w jakości obrazu można zobaczyć, porównując odpowiednio rysunek 2D (metoda z komórką przepływową) i rysunek 3 (metoda odwrócona) oraz film 1 i film 2. Do wykonania rysunku 3 wymagana była soczewka o mniejszym powiększeniu i większej odległości roboczej niż ta użyta na rysunku 2. Tych niedogodności związanych z obrazowaniem w przypadku metody odwróconej można uniknąć, jeśli dostępny jest odpowiedni mikroskop odwrócony w połączeniu z obiektywami o odpowiedniej odległości roboczej dla substratów szkiełek mikroskopowych. Cieńsze szkło może być używane jako podłoże, aby umożliwić stosowanie standardowych obiektywów o zasięgu roboczym.

Zaletą odwróconej geometrii jest to, że pozwala na stosowanie szerszego zakresu lepkości oleju, niekoniecznie wymaga wirowania w wiadrze wahadłowym (jeśli nie jest ono dostępne), a przygotowanie układu jest stosunkowo łatwiejsze po przygotowaniu formy. Jednak w przypadku zamknięcia w studniach przy użyciu metody odwróconej może być ważne odwirowanie, aby materiał znalazł się w dobrze zdefiniowanej warstwie 2D.

Metoda ogniw przepływowych jest ostatnio z powodzeniem stosowana w eksperymentach, w których wymagana jest ciągła warstwa aktywna. Nasze ostatnie prace dotyczyły dynamiki defektów topologicznych w warstwie aktywnej, w przypadku których ważna jest wysoka jakość obrazowania i analiza tekstury19. Ponadto metoda ogniw przepływowych została wykorzystana do zbadania wpływu mikrostruktur zanurzonych w ropie na przepływy aktywne16 oraz filary do wychwytywania defektów w przepływach aktywnych31. Ta metoda bardzo dobrze sprawdza się w tworzeniu ciągłej warstwy aktywnej, a jakość obrazu jest doskonała. Jednak etap wirowania stosowany do wytworzenia końcowej warstwy aktywnej 2D może być trudny do przeprowadzenia, a komórki przepływowe są podatne na wycieki i pęcherzyki powietrza. Metoda odwrócona jest bardzo przydatną alternatywą o wysokim wskaźniku sukcesu, jest łatwa do skonstruowania i może być stosowana do dowolnego wzoru lub geometrii podłoża, pod warunkiem, że można utworzyć drukowaną w 3D formę wzorcową o wysokiej rozdzielczości. Metoda ta jest również przydatna do badania wpływu ograniczenia geometrycznego na aktywną dynamikę nematykę, ponieważ sprawia, że napełnianie studni jest stosunkowo proste.

W artykule opisano dwa sposoby tworzenia aktywnej nematyki z mikrotubul i silników kinezynowych, a także technikę ograniczania materiałów w studniach. Prezentowany system stanowi najczystszy przykład aktywnej fazy nematycznej obecnie w literaturze i został odtworzony przez kilka grup na całym świecie. Znaczenie tego materiału polega nie tylko na biologicznym pochodzeniu jego składników, ale także na tym, że otwiera on zupełnie nowy kierunek w aktywnych uporządkowanych płynach. Pracując z tym systemem i wyjaśniając jego podstawowe właściwości, naukowcy mogą przejść do projektowania w pełni syntetycznych faz aktywnych.

Eksperymenty skoncentrowane na wpływie uwięzienia na aktywną nematykę mogą potencjalnie odpowiedzieć na fundamentalne pytania dotyczące zachowania aktywnych przepływów i dynamiki defektów topologicznych w zamknięciu topologicznym. Przedstawiona tutaj metoda pomoże w przeprowadzaniu różnorodnych eksperymentów skoncentrowanych na geometrii i ich analizie, w tym mikrofluidyki i aktywnego mieszania.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niektóre materiały użyte w tej pracy zostały dostarczone bezpłatnie przez Cytoskeleton Inc. (Denver, USA).

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy chcieliby podziękować Narodowej Fundacji Nauki (NSF) za hojne finansowanie. Projekt był również wspierany przez NSF za pośrednictwem Centrum Doskonałości Badawczej w Nauce i Technologii: Centrum Maszyn Komórkowych i Biomolekularnych na Uniwersytecie Kalifornijskim w Merced (HRD-1547848) oraz Centrum Badań Materiałowych i Inżynierii Brandeis Biomaterials Facility (DMR-2011846). Chcielibyśmy podziękować dr Bin Liu z Uniwersytetu Kalifornijskiego w Merced za pomoc w drukowaniu 3D formy oraz dr Jordi Ignes za porady naukowe podczas opracowywania metody eksperymentu odwróconego.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
20 kD PEG (glikol polietylenowy))Sigma Aldrich1419109Środek zubożający
Numer CAS: 125061-88-3
Metakrylan 3-(trimetoksysililo)propyluSigma AldrichM6514-50MLNumer CAS: 2530-85-0
Drukarka 3D i ŻywicaPhrozenUltradźwiękowa mini drukarka 3D 8K - Aqua Grey Żywica 8K
40% roztwór akryloamiduBIO-RAD1610140Numer CAS: 7732-18-5, 79-06-1
Kwas octowyFisherNumer CAS: 64-19-7
AcetonSigma AldrichNumer CAS: 67-64-1
Arkusze samoprzylepne (UWAGA: "Parafilm" jest alternatywą)Grace Bio-Labs620001SecureSeal
Nadsiarczan amonuSigma AldrichA3678Numer CAS: 7727-54-0
Aquapel (UWAGA: "RainX" jest alternatywą)Aquapel Glass Treatmenthydrofobowa obróbka szkła
ATP (trifosforan adenozyny)Sigma AldrichA1852Numer CAS: 34369-07-8
ZlewkiVWR
CatalaseSigma AldrichC9322Numer CAS: "9001-05-2"
EksykatorBel-art
Cyfrowa kamera CMOSHamamatsuORCA - Flash4.0 LT+
DTT (Dithiothreitol)Sigma AldrichD9779Numer CAS: "3483-12-3"
EGTA (kwas 3,12-bis(karboksymetylo)-6,9-dioksa-3,12-diazatetradekan-1,14-dioinowy)Sigma AldrichMFCD00004291Numer CAS: 67-42-5
EtanolSigma AldrichNumer CAS: 64-17-5
Mikroskop fluorescencyjnyLeicaDM 2500P
Szkiełka nakrywkowe szklaneVWR48368-040
SzkiełkaVWR16004-430
GlukozaSigma AldrichG7021Numer CAS: 50-99-7
Oksydaza glukozowaSigma Aldrich345386Numer CAS: 9001-37-0
GMPCPP (5'-&alfa,β-metylenodifosfonian guanylylu)Jena BioscienceNU-405SNumer CAS: 14997-54-7
HFE7500 Olej3M
Płyta grzejnaFisher ScientificThermix model płyty grzejnej 100M
Alkohol izopropylowyVWR
KCl (chlorek potasu)Sigma AldrichP5405Numer CAS: 7447-40-7
MetanolSigma AldrichNumer CAS: 67-56-1
MgCl2 (chlorek magnezu)Sigma Aldrich208337Numer CAS: 7786-30-3
Probówki do mikrowirówekEppendorf - Thermo Fisher1,5 ml
Nanoczysty oczyszczaczwodySartoriusarium mini
NaOH (wodorotlenek sodu)Sigma AldrichSX0603Numer CAS: 1310-73-2
Szalki PetriegoVWR
Thermo ScientistOrion 3 STAR
Fosfoenol-pirogronian (PEP)Sigma AldrichMFCD00044476Numer CAS: 4265-07-0
RURY (kwas 1,4-piperazynodietaniosulfonowy)Sigma AldrichNumer CAS: 5625-37-6
Pipety (0,2 - 1000 &mikro; l)VWR
Pluronic F-127Sigma Aldrich2594628
RAN Surfaktant (UWAGA: "FluoSurf" firmy Emulso jest alternatywą)Ran Biotechnologies008-FluoroSurfactant-2wtH-50G
(100mpa s-1000 mpa s)Sigma AldrichNumer CAS: 63148-52-7
StreptavidinThermofisherS888
Wirówka kubełkowa wahadłowaThermo ScientistSorvall legend RT+
Sylgard 184 Baza elastomerowaWorld Precision InstrumentsSYLG184
Sylgard 184 Elastomer UtwardzaczPrecision InstrumentsSYLG184
Wirówka stołowaEppendorfMiniSpin Plus
TEMED (Tetrametyloetylenodiamina)BIO-RAD1610800Numer CAS: 110-18-9
Trolox (kwas 6-hydroksy-2,5,7,8-tetrametylochroman-2-karboksylowy)Sigma AldrichMFCD00006846Numer CAS: 53188-07-1
CytoszkielettubulinowyT240-B
Tubulina (oznaczona rodaminą)CytoszkieletTL590M-A
UltrawirówkaBeckmanOptima Max-TL
Klej utwardzany promieniami UV UV Light RapidFix
Kąpiel wodnaThelco
Whatman Bibuła filtracyjnaSigmaAldrich WHA1001325
podstawowe Miernik pH Olej silikonowy World (UWAGA: "Norland NO81" jest alternatywą)RapidFix

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sokolov, A., Aranson, I. S., Kessler, J. O., Goldstein, R. E. Concentration dependence of the collective dynamics of swimming bacteria. Physics Review Letters. 98 (15), 158102(2007).
  2. Saw, T. B., et al. Topological defects in epithelia govern cell death and extrusion. Nature. 544 (7649), 212-216 (2017).
  3. Kawaguchi, K., Kageyama, R., Sano, M. Topological defects control collective dynamics in neural progenitor cell cultures. Nature. 545 (97654), 327-331 (2017).
  4. Toner, J., Tu, Y. Long-range order in a two-dimensional dynamical XY model: how birds fly together. Physics Review Letters. 75 (23), 4326-4329 (1995).
  5. Katz, Y., Tunstrøm, K., Ioannou, C. C., Huepe, C., Couzin, I. D. Inferring the structure and dynamics of interactions in schooling fish. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (46), 18720-18725 (2011).
  6. Needleman, D., Dogic, Z. Active matter at the interface between materials science and cell biology. Nature Reviews Materials. 2 (9), 17048(2017).
  7. Weirich, K., Dasbiswas, K., Witten, T. Self-organizing motors divide active liquid droplets. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (23), 11125-11130 (2019).
  8. Memarian, F. L., et al. Active nematic order and dynamic lane formation of microtubules driven by membrane-bound diffusing motors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (52), (2021).
  9. Bausch, A., Sciortino, A. R. Pattern formation and polarity sorting of driven actin filaments on lipid membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (6), (2021).
  10. Maroudas-Sacks, Y., et al. Topological defects in the nematic order of actin fibres as organization centres of Hydra morphogenesis. Nature Physics. 17 (2), 251-259 (2021).
  11. Liu, J., et al. Topological braiding and virtual particles on the cell membrane. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (34), (2021).
  12. Hirst, L. S. Fundamentals of Soft Matter Science 2nd ed. , CRC Press. (2019).
  13. Sanchez, T., Chen, D., DeCamp, S., Heymann, M., Dogic, Z. Spontaneous motion in hierarchically assembled active matter. Nature. 491 (7424), 431-434 (2012).
  14. Nedelec, F. J., Surrey, T., Maggs, A. C., Leibler, S. Self-organization of microtubules and motors. Nature. 389 (6648), 305-308 (1997).
  15. Guillamat, P., Ignés-Mullol, J., Sagués, F. Taming active turbulence with patterned soft interfaces. Nature Communications. 8, 564(2017).
  16. Thijssen, K., et al. Submersed micropatterned structures control active nematic flow, topology, and concentration. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (38), (2021).
  17. Shendruk, T. N., Doostmohammadi, A., Thijssen, K., Yeomans, J. M. Dancing disclinations in confined active nematics. Soft Matter. 13 (21), 3853-3862 (2017).
  18. Giomi, L. Geometry and topology of turbulence in active nematics. Physical Review X. 5 (3), 031003(2015).
  19. Tan, A. J., et al. Topological chaos in active nematics. Nature Physics. 15 (10), 1033-1039 (2019).
  20. Young, E. C., Berliner, E., Mahtani, H. K., Perez-Ramirez, B., Gelles, J. Subunit interactions in dimeric kinesin heavy chain derivatives that lack the kinesin rod. The Journal of Biological Chemistry. 270 (8), 3926-3931 (1995).
  21. Gilbert, S. P., Johnson, K. A. Expression, purification, and characterization of the Drosophila kinesin motor domain produced in Escherichia coli. Biochemistry. 32 (17), 4677-4684 (1993).
  22. Kuznetsov, S. A., Gelfand, V. I. Kinesin Protocol. Vernos, I. 164, Humana Press. NJ. (2001).
  23. Hawkins, T. L., Sept, D., Mogessie, B., Straube, A., Ross, J. L. Mechanical properties of doubly stabilized microtubule filaments. Biophysics Journal. 104 (7), 1517-1528 (2013).
  24. Bate, T. E., Jarvis, E. J., Varney, M. E., Wu, K. Controlling flow speeds of microtubule-based 3D active fluids using temperature. Journal of Visualized Experiments. (153), e60484(2019).
  25. Castoldi, M., Popov, A. V. Purification of brain tubulin through two cycles of polymerization-depolymerization in a high-molarity buffer. Protein Expression and Purification. 32 (1), 83-88 (2003).
  26. Tayar, A. M., Lemma, L. M., Dogic, Z. Assembling microtubule-based active matter.. Microtubules. , Humana. New York, NY. 151-183 (2022).
  27. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
  28. Guillamat, P., Ignés-Mullol, J., Shankar, S., Marchetti, M. C., Sagués, F. Probing the shear viscosity of an active nematic film. Physical Review E. 94 (6), 060602(2016).
  29. Rudy, A., et al. Lubricous hydrogel surface coatings on polydimethylsiloxane (PDMS). Tribology Letters. 65, 3(2017).
  30. Venzac, B., et al. PDMS curing inhibition on 3D-printed molds: Why? Also, how to avoid it. Analytical Chemistry. 93 (19), 7180-7187 (2021).
  31. Khaladj, D. A., Hirst, L. S. Using curved fluid boundaries to confine active nematic flows. Frontiers of Physics. 10, 880941(2022).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Nimatyki oparte na mikrotubulachaktywne kryszta y ciek emotory molekularnemonta mikrotubulmotory kinezynowemikroskopia fluorescencyjnaobr bka powierzchnistudzienki PDMSdefekty topologiczne

Powiązane artykuły