Artykuł metodologiczny

Wydajna transfekcja transkrybowanego mRNA in vitro w hodowanych komórkach przy użyciu nanocząstek peptydowo-poloksaminowych

DOI:

10.3791/64288

⸱

17 sierpnia 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1National Engineering Research Center of Immunological Products, Department of Microbiology and Biochemical Pharmacy, Third Military Medical University, 2Department of Pediatrics, Ludwig-Maximilians University of Munich, 3Department of Pharmacy, Southwest Hospital, Third Military Medical University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Samoorganizująca się nanocząstka peptydu-poloksaminy (PP-sNp) jest rozwijana przy użyciu mikroprzepływowego urządzenia mieszającego do kapsułkowania i dostarczania in vitro transkrybowanego informacyjnego RNA. Opisane mRNA/PP-sNp może skutecznie transfekować hodowane komórki in vitro.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Szczepionki z transkrybowanym informacyjnym RNA (mRNA) in vitro wykazały ogromny potencjał w walce z pandemią koronawirusa 2019 (COVID-19). Ze względu na delikatne właściwości mRNA szczepionki muszą być zawarte w wydajnych i bezpiecznych systemach dostarczania. Samoorganizujący się system dostarczania genów nanocząstek peptydowo-poloksaminowych (PP-sNp) został specjalnie zaprojektowany do dostarczania kwasów nukleinowych do płuc i wykazuje obiecujące możliwości w pośredniczeniu w udanej transfekcji mRNA. W tym miejscu opisano ulepszoną metodę przygotowania PP-sNp w celu wyjaśnienia, w jaki sposób PP-sNp otacza mRNA Metridia lucyferazy (MetLuc) i skutecznie transfekuje hodowane komórki. MetLuc-mRNA otrzymuje się w procesie transkrypcji in vitro z liniowej matrycy DNA. PP-sNp jest wytwarzany przez zmieszanie syntetycznego peptydu/poloksaminy z roztworem mRNA za pomocą mieszalnika mikroprzepływowego, co pozwala na samoorganizację PP-sNp. Ładunek PP-sNp jest następnie oceniany poprzez pomiar potencjału zeta. Tymczasem polidyspersyjność i rozmiar hydrodynamiczny nanocząstek PP-sNp są mierzone za pomocą dynamicznego rozpraszania światła. Nanocząstki mRNA/PP-sNp są transfekowane do hodowanych komórek, a supernatanty z hodowli komórkowej są oznaczane pod kątem aktywności lucyferazy. Reprezentatywne wyniki wskazują na ich zdolność do transfekcji in vitro. Protokół ten może rzucić światło na rozwój systemów dostarczania szczepionek mRNA nowej generacji.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Szczepienie zostało ogłoszone jako jedna z najskuteczniejszych interwencji medycznych mających na celu zmniejszenie zachorowalności i śmiertelności spowodowanej chorobami zakaźnymi1. Znaczenie szczepionek zostało udowodnione od czasu wybuchu epidemii choroby koronawirusowej w 2019 r. (COVID-19). W przeciwieństwie do tradycyjnej koncepcji wstrzykiwania inaktywowanych lub żywych, atenuowanych patogenów, najnowocześniejsze podejścia do szczepionek, takie jak szczepionki na bazie kwasów nukleinowych, koncentrują się na zachowaniu właściwości immunostymulujących docelowych patogenów przy jednoczesnym unikaniu potencjalnych problemów związanych z bezpieczeństwem związanych z konwencjonalnymi szczepionkami zawierającymi wirusa całego drobnoustroje lub szczepionkami na bazie bakterii. Zarówno szczepionki oparte na DNA, jak i RNA (tj. transkrybowanym in vitro informacyjnym RNA, mRNA IVT) wykazują potencjał profilaktyczny lub terapeutyczny przeciwko różnym chorobom, w tym chorobom zakaźnym i nowotworom2,3. Zasadniczo potencjał szczepionek opartych na kwasach nukleinowych odnosi się do ich produkcji, skuteczności i bezpieczeństwa4. Szczepionki te mogą być produkowane w sposób bezkomórkowy, co umożliwia opłacalną, skalowalną i szybką produkcję.

Pojedyncza szczepionka oparta na kwasie nukleinowym może kodować wiele antygenów, umożliwiając dotarcie do wielu wariantów wirusa lub bakterii przy zmniejszonej liczbie szczepień i wzmacniając odpowiedź immunologiczną przeciwko odpornym patogenom5,6. Poza tym, szczepionki oparte na kwasach nukleinowych mogą naśladować naturalny proces inwazji wirusa lub infekcji bakteryjnej, wywołując zarówno odpowiedź immunologiczną za pośrednictwem limfocytów B, jak i T. W przeciwieństwie do niektórych szczepionek opartych na wirusach lub DNA, szczepionki oparte na mRNA IVT oferują ogromną przewagę pod względem bezpieczeństwa. Mogą one szybko eksprymować pożądany antygen w cytozolu i nie są zintegrowane z genomem gospodarza, co eliminuje obawy związane z mutagenezą insercji7. IVT-mRNA ulega automatycznej degradacji po udanej translacji, dzięki czemu kinetykę ekspresji białka można łatwo kontrolować8,9. Wysiłki firm/instytucji na całym świecie, katalizowane przez pandemię koronawirusa zespołu ciężkiej ostrej niewydolności oddechowej 2 (SARS-CoV-2), umożliwiły wprowadzenie na rynek wielu rodzajów szczepionek. Technologia szczepionek opartych na mRNA IVT wykazuje ogromny potencjał i po raz pierwszy wykazała się wcześniej oczekiwanym sukcesem dzięki szybkiej konstrukcji i elastycznej zdolności do adaptacji do dowolnych docelowych antygenów w ciągu kilku miesięcy. Sukces szczepionek mRNA IVT przeciwko COVID-19 w zastosowaniach klinicznych nie tylko otworzył nową erę badań i rozwoju szczepionek mRNA IVT, ale także zgromadził cenne doświadczenie w szybkim rozwoju skutecznych szczepionek do radzenia sobie z ogniskami chorób zakaźnych10,11.

Pomimo obiecującego potencjału szczepionek mRNA IVT, skuteczne wewnątrzkomórkowe dostarczanie mRNA IVT do miejsca działania (tj. cytoplazmy) nadal stanowi główną przeszkodę12, szczególnie dla tych podawanych drogą powietrzną4. mRNA IVT jest z natury niestabilną cząsteczką o wyjątkowo krótkim okresie półtrwania (~7 h)13, co sprawia, że mRNA IVT jest wysoce podatne na degradację przez wszechobecną RNazę14. Limfocyty wrodzonego układu odpornościowego mają tendencję do pochłaniania rozpoznanego mRNA IVT w przypadku aplikacji in vivo. Co więcej, wysoka gęstość ładunku ujemnego i duża masa cząsteczkowa (1 x 104-1 x 106 Da) mRNA IVT upośledzają jego skuteczne przenikanie przez anionową dwuwarstwę lipidową błon komórkowych15. W związku z tym wymagany jest system dostarczania z pewnymi materiałami biofunkcjonalnymi, aby zahamować degradację cząsteczek mRNA IVT i ułatwić wychwyt komórkowy16.

Poza kilkoma wyjątkowymi przypadkami, w których nagie mRNA IVT zostało bezpośrednio wykorzystane do badań in vivo, różne systemy dostarczania są używane do przenoszenia mRNA IVT do terapeutycznego miejsca działania17,18. Wcześniejsze badania wykazały, że tylko kilka mRNA IVT jest wykrywanych w cytozolu bez pomocy systemu dostarczania19. Opracowano liczne strategie mające na celu poprawę dostarczania RNA dzięki ciągłym wysiłkom w tej dziedzinie, począwszy od kondensacji protaminy, a skończywszy na enkapsulacji lipidów20. Nanocząstki lipidowe (LNP) są najbardziej zaawansowane klinicznie spośród nośników mRNA, o czym świadczy fakt, że wszystkie zatwierdzone szczepionki mRNA COVID-19 do użytku klinicznego wykorzystują systemy dostarczania oparte na LNP21. Jednak LNP nie mogą pośredniczyć w skutecznej transfekcji mRNA, gdy preparaty są dostarczane drogą oddechową22, co znacznie ogranicza stosowanie tych preparatów w indukowaniu odpowiedzi immunologicznej błony śluzowej lub leczeniu chorób związanych z płucami, takich jak mukowiscydoza lub niedobór α1-antytrypsyny. W związku z tym konieczne jest opracowanie nowatorskiego systemu dostarczania w celu ułatwienia skutecznego dostarczania i transfekcji mRNA IVT w komórkach związanych z drogami oddechowymi, aby rozwiązać tę niezaspokojoną potrzebę.

Potwierdzono, że system dostarczania samoorganizujących się nanocząsteczek peptyd-poloksamina (PP-sNp) może pośredniczyć w efektywnej transfekcji kwasów nukleinowych w drogach oddechowych myszy23. PP-sNp przyjmuje wielofunkcyjne podejście do projektowania modułowego, które może integrować różne moduły funkcjonalne z nanocząstkami w celu szybkiego przesiewania i optymalizacji23. Syntetyczne peptydy i elektrycznie obojętne amfifilowe kopolimery blokowe (poloksamina) w PP-sNp mogą spontanicznie oddziaływać z mRNA IVT, tworząc równomiernie rozmieszczone nanocząstki o zwartej strukturze i gładkiej powierzchni23. PP-sNp może poprawić efekt transfekcji genów cząsteczek mRNA IVT w hodowanych komórkach i drogach oddechowych myszy23. W niniejszym badaniu opisano protokół generowania PP-sNp zawierającego mRNA IVT, który koduje lucyferazy Metridia (MetLuc-mRNA) (Figura 1). W tym protokole wykorzystuje się kontrolowane i szybkie mieszanie za pomocą mikroprzepływowego urządzenia mieszającego, które wykorzystuje naprzemienną konstrukcję mieszania w jodełkę. Procedura jest łatwa do wykonania i pozwala na generowanie PP-sNp o bardziej jednolitych rozmiarach. Ogólnym celem produkcji PP-sNp za pomocą mieszalnika mikroprzepływowego jest wytworzenie PP-sNp do kompleksowania mRNA w dobrze kontrolowany sposób, umożliwiając w ten sposób wydajną i powtarzalną transfekcję komórek in vitro. Niniejszy protokół opisuje przygotowanie, składanie i charakterystykę PP-sNp zawierającego MetLuc-mRNA.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Transkrypcja in vitro chemicznie zmodyfikowanego mRNA

UWAGA: Wymagane jest używanie probówek, odczynników, szkła, końcówek do pipet, itp., ponieważ RNazy są wszechobecne w środowisku, takim jak roztwory laboratoryjne, powierzchnie instrumentów, włosy, skóra, kurz, itp. Wyczyść dokładnie powierzchnie stołu i pipety przed użyciem oraz załóż rękawice, aby uniknąć zanieczyszczenia RNazą.

  1. Wykonaj linearyzację matrycy DNA.
    1. Zsyntetyzuj otwartą ramkę odczytu (ORF) lucyferazy Metridia (MetLuc) otoczoną promotorem polimerazy T7, regionem 5' nieulegającym translacji (UTR), 3'UTR i ogonami poli (A) i sklonuj ją do wektora PUC57, który ulega ekspresji w bakteriach (patrz Tabela materiałów).
      UWAGA: Sekwencja kodowania matrycy DNA znajduje się w pliku uzupełniającym 1.
    2. Hoduj bakterie, poddaj je lizie i oczyść plazmidowy DNA za pomocą odpowiedniej kolumny (patrz zestaw do ekstrakcji plazmidowego DNA w Tabeli materiałów).
    3. Przeprowadzić pojedynczą reakcję o objętości 50 μl, która zawiera 2 μl BamHI, 2 μl KpnI (patrz tabela materiałów) i 2 μg plazmidowego DNA w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę i osiągnąć linearyzację matrycy DNA.
  2. Wykonaj transkrypcję in vitro, aby wygenerować mRNA bez capped-IVT.
    1. Przeprowadź syntezę mRNA w pojedynczej reakcji 20 μl przy użyciu zestawu transkrypcyjnego T7 i pseudourydyny (patrz tabela materiałów): 10 μl (0,8-1 μg) zlinearyzowanej matrycy DNA, 1,5 μl (150 mM) ATP, pseudo-UTP, GTP i CTP, 2 μl 10x buforu transkrypcyjnego, 1 μl enzymu T7 i 1 μl wody wolnej od nukleaz (woda NF). Dokładnie wymieszać wyżej wymienione składniki i inkubować w temperaturze 37 °C przez 3 godziny.
  3. Usuń matrycę DNA.
    1. Dodać 1 μl (1 U) DNazy (wolnej od RNazy) po procesie transkrypcji i inkubować w temperaturze 37 °C przez 15 minut.
  4. Przeprowadzić oczyszczanie mRNA bez osłonki IVT za pomocą wytrącania chlorku litu.
    1. Oczyść nieosłonięte mRNA IVT za pomocą chlorku litu (patrz tabela materiałów) o stężeniu roboczym 10 mM. Dodać 50 μl 10 mM chlorku litu do 20 μl roztworu mRNA bez nakrętki IVT.
    2. Dokładnie wymieszaj całą objętość i schładzaj w temperaturze -20 °C przez 1 godzinę. Zbieraj mRNA bez osłonki IVT przez 12 minut przy 12 000 x g, co rutynowo wytwarza 80-120 μg nieosłoniętego mRNA IVT z każdej pojedynczej reakcji o objętości 20 μl.
  5. Wykonaj capping mRNA IVT.
    1. Wykonaj capping mRNA IVT za pomocą systemu capping 1 (patrz Tabela materiałów). Krótko usunąć, wtórną strukturę 50 μg nieosłoniętego mRNA IVT, ogrzewając w temperaturze 65 °C przez 10 minut, a następnie połączyć koniec 5' mRNA bez osłonki IVT z czapeczką 1, którą przygotowuje się przez modyfikację struktury kapu m7G przy użyciu 2,5 μl s-adenozylometioniny (SAM) (20 mM) i 4 μl 2'-O-metylotransferazy (100 U) w reakcji 100 μl w temperaturze 37 °C przez 30-60 min.
    2. Oczyść 100 μl zamkniętego mRNA IVT za pomocą 250 μl 10 mM chlorku litu i rozcieńczyć w 50 μl wody NF.
  6. Określ czystość i wielkość cząsteczkową mRNA z czapeczką IVT.
    1. Zmierz stężenie mRNA z czapeczką IVT za pomocą spektrofotometru UV-visible. Używając markera RNA (patrz Tabela materiałów), przeanalizuj wielkość cząsteczkową mRNA z czapeczką IVT w 1% denaturującym formaldehyd żelu agarozowym zawierającym 18% formaldehydu (napięcie wynosi 120 V). Upewnij się, że mRNA bez osłonki IVT i mRNA z pokrywą IVT są przechowywane w temperaturze -80 °C.
      UWAGA: Uznano, że mRNA IVT ma dobrą czystość w stosunku A260/A280 1,8-2,1 i stosunku A260/A230 2,0 lub nieco wyższym.

2. Generacja mRNA/PP-sNp IVT

  1. Przygotować roztwór podstawowy poloksaminy 704 (T704) przez solubilizację T704 (patrz Tabela materiałów) w wodzie NF w celu uzyskania roztworu podstawowego o stężeniu 10 mg/ml. Przygotowany roztwór przechowywać w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: T704 zawiera strukturę w kształcie litery X wykonaną z centralnej grupy etylenodiaminy połączonej z czterema łańcuchami bloków poli(tlenku propylenu) (PPO) i bloków poli(tlenku etylenu) (PEO)24. Masa cząsteczkowa (Mw) T704 wynosi 5500.
  2. Przygotować roztwór podstawowy syntetycznego peptydu (sPep, patrz Tabela Materiałów) poprzez solubilizację sPep (sekwencja: KETWWETWWTEWWTEWKKKKRRRRRKKKKGACSE
    RSMNFCG) w wodzie NF w celu otrzymania roztworu podstawowego o stężeniu 2 mg/ml i przechowywania w temperaturze 4 °C.
  3. Przygotuj roztwór mRNA IVT, rozmrażając mRNA IVT (krok 1) na lodzie i krótko odwirowując przez 3 s przy 300 x g w temperaturze pokojowej przed otwarciem probówki. Rozcieńczyć roztwór mRNA IVT do 0,04 μg/μl NF-water.
    UWAGA: Zaleca się pracę w komorze bezpieczeństwa biologicznego, gdy tylko jest to możliwe, z mRNA IVT.
  4. Przygotować roztwór mieszaniny T704 i sPep, rozcieńczając roztwór sPep do 0,555 μg/μl, a roztwór T704 do 8 μg/μl wodą NF. Inkubować zmieszany roztwór przez 15 minut w temperaturze pokojowej przed dalszym użyciem.
    UWAGA: Oblicz wymagany składnik sPep na podstawie żądanego współczynnika N/P. Stosunek N/P to całkowita liczba reszt azotu (N) w sPep do całkowitej liczby ujemnie naładowanych grup fosforanowych (P) w mRNA IVT. Oblicz wymagany T704 na podstawie stosunku masy do masy (w/w) między T704 a mRNA IVT. Konieczne jest, aby stosunek N/P wynosił 5, a stosunek w/w wynosił 100.
  5. Przygotuj preparat mRNA/PP-sNp IVT, postępując zgodnie z poniższymi krokami.
    1. Pobrać roztwór mRNA IVT (krok 3) do strzykawki o pojemności 1 ml, upewniając się, że w końcówce strzykawki nie ma szczelin powietrznych ani pęcherzyków powietrza. Załadować strzykawkę po jednej stronie wkładu obok obracającego się bloku.
    2. Napełnij strzykawkę o pojemności 1 ml roztworem mieszanki T704 i sPep (krok 4). Usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza lub szczeliny powietrzne na końcówce strzykawki i umieścić strzykawkę w drugim wlocie pompy (patrz Tabela materiałów).
    3. Ustaw pompę na stosunek przepływu 1:1 i całkowite natężenie przepływu 4-10 ml/min.
      UWAGA: Całkowite natężenie przepływu wynoszące 6 ml/min jest optymalne w prezentowanych tutaj badaniach.
    4. Umieścić stożkową probówkę o pojemności 10 ml wolną od RNaz (patrz tabela materiałów) w celu zebrania zmieszanego roztworu IVT-mRNA/PP-sNp na końcu ścieżki przepływu urządzenia mieszającego.
    5. Uruchom pompę, aby rozpocząć mieszanie, upewniając się, że parametry są prawidłowo wprowadzone. Po zakończeniu pracy pompy przez 6 s, pobrać próbkę IVT-mRNA/PP-sNp z rurki stożkowej.
      UWAGA: PP-sNp zostały wygenerowane przy użyciu mieszalnika mikroprzepływowego (rysunek uzupełniający 1). Urządzenie składa się z pompy o stałym przepływie, urządzenia łączącego, układu scalonego i urządzenia stałego. W procesie mieszania pompa o stałym przepływie podłączona do wióra dostarcza ciecz do wióra zgodnie z ustawionym natężeniem przepływu. Podłączoną pompę o stałym przepływie można podłączyć do wielu kanałów wejściowych układu za pomocą jednego kanału wyjściowego. Elementy urządzenia, w tym chip, zostały pozyskane ze źródeł komercyjnych i racjonalnie zmontowane (patrz tabela materiałów). Parametry, takie jak natężenie przepływu i objętość roztworu mRNA IVT i roztworu mieszanego T704-sPep, mogą różnić się od tych wyświetlanych w bieżącym protokole, jeśli używana jest inna konfiguracja i należy je odpowiednio zoptymalizować.

3. Pomiar średnicy hydrodynamicznej i polidyspersyjności IVT-mRNA/PP-sNp

  1. Rozcieńczyć podwielokrotność roztworu mRNA/PP-sNp IVT (etap 2) wodą NF, aby uzyskać końcową objętość 1 ml.
  2. Zmierz rozmiar hydrodynamiczny i wskaźnik polidyspersyjności (PDI) za pomocą półmikro kuwety25. Dodaj roztwór mRNA/PP-sNp IVT do kuwety i umieść go w mierniku wielkości cząstek (patrz tabela materiałów). Ustaw standardową procedurę operacyjną i kliknij Start, aby rozpocząć pobieranie danych.

4. Przygotowanie komórek do transfekcji

  1. Płytki z ludzkimi komórkami nabłonka oskrzeli (16HBE) i linią komórek dendrytycznych (DC2.4) na płytkach 96-dołkowych o gęstości 3,5 x 104 komórek/dołk, 24 godziny przed transfekcją. Hoduj komórki w pożywce hodowlanej uzupełnionej 10% inaktywowaną termicznie płodową surowicą bydlęcą i 1% penicyliny/streptomycyny.
    UWAGA: Ogniwa zostały pozyskane ze źródła komercyjnego (patrz Tabela materiałów).
  2. Inkubować komórki w inkubatorze (37 °C i 5% atmosferyCO2) przez 24 godziny, aby upewnić się, że komórki są zlewane w 60%-80% przed transfekcją.

5. Transfekcja hodowanych komórek

  1. Po usunięciu pożywki wzrostowej przemyć posiane komórki 0,2 ml/studzienkę 1x PBS.
  2. Dodać 170 μl pożywki hodowlanej bez surowicy do każdego dołka zawierającego posiane kultury komórkowe.
  3. Dodawać kroplami preparat mRNA/PP-sNp zawierający 0,4 μg mRNA MetLuc (przygotowanego w kroku 2) w ilości 30 μl/basenik.
  4. Inkubować komórki z preparatem mRNA/PP-sNp IVT w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze wzbogaconej w 5% CO2 przez 4 godziny.
  5. Zastąp pożywkę do transfekcji 0,2 ml świeżej pożywki hodowlanej uzupełnionej 10% inaktywowaną termicznie płodową surowicą bydlęcą i 1% (v/v) penicyliną/streptomycyną.
    UWAGA: Płodową surowicę bydlęcą podgrzewano w temperaturze 56 °C przez 30 minut w celu inaktywacji.
  6. Inkubować transfekowane komórki w temperaturze 37 °C i w atmosferze wzbogaconej w 5% CO2 przez 24 godziny i zebrać supernatanty do wykrycia w każdym dołku.

6. Analiza skuteczności transfekcji komórek za pomocą testu Metridia lucyferazy (MetLuc)

  1. Oznaczyć supernatant z każdej studzienki pod kątem aktywności MetLuc przy użyciu substratu celenterazyny (patrz tabela materiałów), postępując zgodnie z poniższymi krokami.
    1. Przygotować świeży roztwór do oznaczania, dodając 1x PBS do substratu coelenterazine (stężenie coelenterazine wynosi 15 mM).
    2. Wirować roztwór celelenterazyny przez 10 sekund w celu dokładnego wymieszania.
    3. Dodać 50 μl supernatantu (zebranego w kroku 5) do płytki 96-dołkowej.
    4. Ustawić czytnik mikropłytek (patrz tabela materiałów) tak, aby czas odczytu wynosił 1 000 ms przed dodaniem 30 μl roztworu coelenterazine (15 mM) do każdego dołka ręcznie lub przez automatyczne wstrzyknięcie.
    5. Kliknij Start, aby zmierzyć sygnał luminescencji natychmiast po dodaniu roztworu koelenkterazyny do supernatantu.
      UWAGA: Sygnał luminescencji jest mierzony za pomocą czytnika mikropłytek, a jego aktywność jest wyrażana we względnych jednostkach światła. Wartości uzyskane ze studni transfekowanych PBS zostaną wykorzystane jako ślepe próby kontrolne.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rekombinowany plazmid został strawiony w celu wytworzenia zlinearyzowanej matrycy DNA (Rysunek 2A). Korzystając z opisanego protokołu, zestaw do transkrypcji in vitro T7 może wytworzyć do 80-120 μg nieosłoniętego MetLuc-mRNA na 20 μl reakcji i 50-60 μg zamkniętego MetLuc-mRNA na 100 μl reakcji. Podczas analizy za pomocą elektroforezy, nienaruszone MetLuc-mRNA o wysokiej jakości powinno wykazywać pojedyncze i wyraźne prążko, jak pokazano w Rysunek 2B. Zanieczyszczenia wpro...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisany tutaj protokół nie tylko pozwala na opłacalną i szybką produkcję preparatów szczepionek mRNA IVT o określonych właściwościach, ale także oferuje możliwość dostosowania preparatu PP-sNp do określonych celów terapeutycznych, takich jak terapia genowa. Aby zapewnić pomyślne wytworzenie mRNA/PP-sNP IVT, sugeruje się zwrócenie szczególnej uwagi na kilka krytycznych kroków. Podczas pracy z mRNA należy zawsze pamiętać, że warunki wolne od RNaz powinny być utrzymywane przez cały proces, ponieważ mRNA IVT jest bardzo wraż...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (NSFC, Grant nr 82041045 i 82173764), główny projekt Study on Pathogenesis and Epidemic Prevention Technology System (2021YFC2302500) przez Ministerstwo Nauki i Technologii Chin, Chongqing Talents: Exceptional Young Talents Project (CQYC202005027) oraz Natural Science Foundation of Chongqing (cstc2021jcyj-msxmX0136). Autorzy są wdzięczni dr Xiaoyanowi Dingowi za pomiar średnicy hydrodynamicznej (nm) i wskaźnika polidyspersyjności (PDI).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
BamHITakara1010
cap 1 system zamykaniaJinanM082
Dendrytyczna linia komórkowaSigmaSCC142
Sekwencja DNAGenescript
Ludzkie komórki nabłonka oskrzeliSigmaSCC150
KpnITakara1068
LPBeyotimeC0533
Chlorek lituAPEXBioB6083
Malvern Zetasizer Nano ZS90MalvernNB007605
Układ mikroprzepływowyZHONGXINQIHENGStandardowy układ
Czytniki mikropłytekThermoFisherVarioskan lux
NanoDrop OneThermoFisherND-ONE-W (A30221)
Woda wolna od nukleazThermoFisherAM9932
OptiMEMGibco31985070
Penicylina-streptomycynaGibco15140122
PseudourydynaAPE&czasy; BioB7972
QIAprep Spin Miniprep KitQiagen27106
Quanti-LucInvivoGenRep-qlc2
RiboRuler High Range RNA LadderThermoFisherSM1821
Rurka stożkowa bez RNazBiosharpBS-100-M
RPMI Medium 1640ThermoFisherC11875500BT
Pompa strzykawkowaChemyxFusion 101
T7 zestaw do transkrypcjiJinanE131
PDMS

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fehervari, Z., Minton, K., Duarte, J. H. Nature milestones in vaccines. Springer Nature. , Available from: https://www.nature.com/collections/hcajdiajij (2020).
  2. Barbier, A. J., Jiang, A. Y., Zhang, P., Wooster, R., Anderson, D. G. The clinical progress of mRNA vaccines and immunotherapies. Nature Biotechnology. 40 (6), 840-854 (2022).
  3. Mulligan, M. J., et al. Phase I/II study of COVID-19 RNA vaccine BNT162b1 in adults. Nature. 586 (7830), 589-593 (2020).
  4. Tang, J., et al. Nanotechnologies in delivery of DNA and mRNA vaccines to the nasal and pulmonary mucosa. Nanomaterials. 12 (2), 226(2022).
  5. Freyn, A. W., et al. A multi-targeting, nucleoside-modified mRNA influenza virus vaccine provides broad protection in mice. Molecular Therapy. 28 (7), 1569-1584 (2020).
  6. Wu, K., et al. Variant SARS-CoV-2 mRNA vaccines confer broad neutralization as primary or booster series in mice. Vaccine. 39 (51), 7394-7400 (2021).
  7. Chaudhary, N., Weissman, D., Whitehead, K. A. mRNA vaccines for infectious diseases: Principles, delivery and clinical translation. Nature Reviews Drug Discovery. 20, 817-838 (2021).
  8. Kormann, M. S. D., et al. Expression of therapeutic proteins after delivery of chemically modified mRNA in mice. Nature Biotechnology. 29 (2), 154-157 (2011).
  9. Tavernier, G., et al. mRNA as gene therapeutic: How to control protein expression. Journal of Controlled Release. 150 (3), 238-247 (2011).
  10. Walsh, E. E., et al. Safety and immunogenicity of two RNA-based Covid-19 vaccine candidates. The New England Journal of Medicine. 383 (25), 2439-2450 (2020).
  11. Baden, L. R., et al. Efficacy and safety of the mRNA-1273 SARS-CoV-2 vaccine. The New England Journal of Medicine. 384 (5), 403-416 (2021).
  12. Guan, S., Rosenecker, J. Nanotechnologies in delivery of mRNA therapeutics using nonviral vector-based delivery systems. Gene Therapy. 24 (3), 133-143 (2017).
  13. Sharova, L. V., et al. Database for mRNA half-life of 19 977 genes obtained by DNA microarray analysis of pluripotent and differentiating mouse embryonic stem cells. DNA Research. 16 (1), 45-58 (2009).
  14. Houseley, J., Tollervey, D. The many pathways of RNA degradation. Cell. 136 (4), 763-776 (2009).
  15. Kowalski, P. S., Rudra, A., Miao, L., Anderson, D. G. Delivering the messenger: Advances in technologies for therapeutic mRNA delivery. Molecular Therapy. 27 (4), 710-728 (2019).
  16. Sahin, U., Karikó, K., Türeci, Ö MRNA-based therapeutics-developing a new class of drugs. Nature Reviews Drug Discovery. 13, 359-380 (2014).
  17. Hajj, K. A., Whitehead, K. A. Tools for translation: Non-viral materials for therapeutic mRNA delivery. Nature Reviews Materials. 2, 17056(2017).
  18. Deering, R. P., Kommareddy, S., Ulmer, J. B., Brito, L. A., Geall, A. J. Nucleic acid vaccines: Prospects for non-viral delivery of mRNA vaccines. Expert Opinion on Drug Delivery. 11 (6), 885-899 (2014).
  19. Wadhwa, A., Aljabbari, A., Lokras, A., Foged, C., Thakur, A. Opportunities and challenges in the delivery of mRNA-based vaccines. Pharmaceutics. 12 (2), 102(2020).
  20. Hou, X., Zaks, T., Langer, R., Dong, Y. Lipid nanoparticles for mRNA delivery. Nature Reviews Materials. 6 (12), 1078-1094 (2021).
  21. Sahin, U., et al. COVID-19 vaccine BNT162b1 elicits human antibody and T(H)1 T cell responses. Nature. 586 (7830), 594-599 (2020).
  22. Azzi, L., et al. Mucosal immune response in BNT162b2 COVID-19 vaccine recipients. EBioMedicine. 75, 103788(2022).
  23. Guan, S., et al. Self-assembled peptide-poloxamine nanoparticles enable in vitro and in vivo genome restoration for cystic fibrosis. Nature Nanotechnology. 14 (3), 287-297 (2019).
  24. Pitard, B., et al. Negatively charged self-assembling DNA/poloxamine nanospheres for in vivo gene transfer. Nucleic Acids Research. 32 (20), 159(2004).
  25. Hiroi, T., Shibayama, M. Measurement of particle size distribution in turbid solutions by dynamic light scattering microscopy. Journal of Visualized Experiments. (119), e54885(2017).
  26. Hassett, K. J., et al. Impact of lipid nanoparticle size on mRNA vaccine immunogenicity. Journal of Controlled Release. 335, 237-246 (2021).
  27. Suk, J. S., et al. The penetration of fresh undiluted sputum expectorated by cystic fibrosis patients by non-adhesive polymer nanoparticles. Biomaterials. 30 (13), 2591-2597 (2009).
  28. Kim, N., Duncan, G. A., Hanes, J., Suk, J. S. Barriers to inhaled gene therapy of obstructive lung diseases: A review. Journal of Controlled Release. 240, 465-488 (2016).
  29. Liu, Z., Fontana, F., Python, A., Hirvonen, J. T., Santos, H. A. Microfluidics for production of particles: Mechanism, methodology, and applications. Small. 16 (9), 1904673(2020).
  30. Guan, S., Darmstädter, M., Xu, C., Rosenecker, J. In vitro investigations on optimizing and nebulization of IVT-mRNA formulations for potential pulmonary-based alpha-1-antitrypsin deficiency treatment. Pharmaceutics. 13 (8), 1281(2021).
  31. Shepherd, S. J., Issadore, D., Mitchell, M. J. Microfluidic formulation of nanoparticles for biomedical applications. Biomaterials. 274, 120826(2021).
  32. Han, J., et al. A simple confined impingement jets mixer for flash nanoprecipitation. Journal of Pharmaceutical Sciences. 101 (10), 4018-4023 (2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Transfekcja mRNAtranskrypcja in vitropulmonalne dostarczanie mRNAmRNA lucyferazy Metridiamieszanie mikrofluidycznedynamiczne rozpraszanie wiat aludzkie kom rki oskrzelitransmisyjna mikroskopia elektronowadostarczanie szczepionek mRNA

Powiązane artykuły