Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

In vitro Ocena aktywności komórkowej adiuwantu szczepionki nanoemulsyjnej ofiopogoniny D

2.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64291

⸱

9 grudnia 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Microbiology and Biochemical Pharmacy, National Engineering Research Centre of Immunological Products, College of Pharmacy, Third Military Medical University of Chinese PLA, 2Institute of Combined Injury of PLA, College of Military Preventive Medicine, Third Military Medical University of Chinese PLA

W tym artykule

Podsumowanie

Protokół przedstawia szczegółowe metody oceny, czy adiuwant nanoemulsji ofiopogoniny D wspomaga skuteczne komórkowe odpowiedzi immunologiczne.

Streszczenie

Jako główny składnik szczepionek, adiuwanty mogą bezpośrednio indukować lub wzmacniać silną, powszechną, wrodzoną i adaptacyjną odpowiedź immunologiczną związaną z antygenami. Stwierdzono, że ofiopogonina D (OP-D), oczyszczony składnik ekstrahowany z rośliny Ophiopogon japonicus, jest przydatna jako adiuwant do szczepionek. Problemy związane z niską rozpuszczalnością i toksycznością OP-D można skutecznie przezwyciężyć poprzez zastosowanie niskoenergetycznej metody emulgowania do przygotowania nanoemulsji ofiopogoniny D (NOD). W tym artykule przeanalizowano szereg protokołów oceny aktywności komórkowej in vitro. Działanie cytotoksyczne L929 określono za pomocą testu zliczania komórek kit-8. Następnie poziomy wydzielanych cytokin i odpowiadająca im liczba komórek odpornościowych po stymulacji i hodowli splenocytów od immunizowanych myszy wykryto metodami ELISA i ELISpot. Ponadto zdolność wychwytu antygenu w komórkach dendrytycznych pochodzących ze szpiku kostnego (BMDC), które wyizolowano od myszy C57BL / 6 i dojrzały po inkubacji z GM-CSF plus IL-4, zaobserwowano za pomocą laserowej skaningowej mikroskopii konfokalnej (CLSM). Co ważne, aktywację makrofagów potwierdzono poprzez pomiar poziomów cytokin IL-1β, IL-6 i czynnika martwicy nowotworu alfa (TNF-α) za pomocą zestawów ELISA po kokulturacji makrofagów otrzewnowej (PM) od ślepych myszy z adiuwantem przez 24 godziny. Oczekuje się, że protokół ten dostarczy innym badaczom bezpośrednich i skutecznych podejść eksperymentalnych do oceny skuteczności odpowiedzi komórkowej nowych adiuwantów szczepionkowych.

Wprowadzenie

Szczepionki są ważnym środkiem zapobiegania i leczenia chorób zakaźnych i niezakaźnych. Odpowiednie dodanie adiuwantów i nośników do preparatów szczepionek jest korzystne dla zwiększenia immunogenności antygenów i generowania długotrwałych odpowiedzi immunologicznych1. Oprócz klasycznego adiuwantu ałunu (sól glinu), istnieje sześć rodzajów adiuwantów do szczepionek, które są obecnie sprzedawane: MF592,3, AS043, AS033, AS013, CpG10184 i Matrix-M5. Ogólnie rzecz biorąc, gdy organizm ludzki napotyka atak wirusa, pierwsza i druga linia obrony (skóra, błona śluzowa i makrofagi) przejmują inicjatywę w usuwaniu wirusa, a wreszcie aktywowana jest trzecia linia obrony, obejmująca narządy odpornościowe i komórki odpornościowe. Aluminium i sole glinu są najczęściej stosowanymi adiuwantami w szczepionkach dla ludzi od wczesnych lat dwudziestych XX wieku, wywołując skuteczną wrodzoną odpowiedź immunologiczną6. Zaproponowano jednak, że aktywacja komórek prezentujących antygen (APC) przez klasyczne adiuwanty, która stymuluje komórki odpornościowe do wytwarzania określonych zestawów cytokin i chemokin, jest mechanizmem, za pomocą którego adiuwanty działają i może być jednym z powodów, dla których adiuwanty wywierają tylko przejściowy wpływ na określone odpowiedzi immunologiczne7. Obecność ograniczonej liczby dopuszczonych do obrotu adiuwantów stosowanych u ludzi jest czynnikiem ograniczającym opracowywanie szczepionek, które wywołują skuteczną odpowiedź immunologiczną8.

Obecnie, coraz większa liczba badań adiuwantowych wykazuje zdolność do wywoływania silnej komórkowej odpowiedzi immunologicznej u myszy. Wykazano, że QS-21 indukuje zrównoważoną odpowiedź immunologiczną T-helper 1 (Th1) i T-helper 2 (Th2), wytwarza wyższe poziomy mian przeciwciał i przedłuża ochronę jako adiuwant, ale jego silna toksyczność i właściwości hemolityczne ograniczają jego rozwój jako samodzielnego klinicznego adiuwanta9,10. OP-D (ruscogenin-O-α-L-rhamnopyranosy1-(1→2)-β-D-xylopyranozylo-(1→3)-β-D-fukopirazyd) jest jedną z saponin steroidowych wyizolowanych z korzenia chińskiej rośliny leczniczej Ophiopogon japonicas4. Dodatkowo, jest to główny składnik farmakologicznie aktywny (Shen Mai San) występujący w Radix Ophiopogonis i wiadomo, że ma pewne właściwości farmakologiczne11. Ponadto należy do rodziny Liliaceae i jest szeroko stosowany ze względu na swoje działanie hamujące i ochronne w stanach zapalnych komórek i uszkodzeniu mięśnia sercowego. Na przykład OP-D łagodzi zmiany podobne do atopowego zapalenia skóry wywołane przez DNCB i komórki zapalne HaCaT czynnika martwicy nowotworu alfa (TNF-α) u myszy BALB/c12. Co ważne, OP-D wspomaga ochronę antyoksydacyjną układu sercowo-naczyniowego i chroni serce przed uszkodzeniem autofagicznym wywołanym przez doksorubicynę, zmniejszając zarówno wytwarzanie reaktywnych form tlenu, jak i zakłócając uszkodzenia błony mitochondrialnej. Eksperymenty wykazały, że przyjmowanie OP-D z mono-desmosydem pomaga wzmocnić zdrowie układu odpornościowego, zwiększyć liczbę białych krwinek i syntezę DNA oraz wydłużyć trwałość przeciwciał13. Wcześniej stwierdzono, że OP-D ma działanie adiuwantowe14.

Nanoemulsje to nanopreparaty typu olej w wodzie, składające się z kombinacji środków powierzchniowo czynnych, oleju, kosurfaktantów i wody12,15. Te projekty nanoszczepionek pozwalają na kapsułkowanie antygenów i adiuwantów razem w celu wzmocnienia stymulacji immunologicznej, ochrony antygenów i promowania dojrzewania komórek dendrytycznych (DC)16. W celu opracowania tych nowych adiuwantów uzyskanych z badań przesiewowych ważne jest znalezienie odpowiednich metod oceny ich zdolności do odpowiedzi komórkowej.

Celem tego protokołu jest systematyczna ocena, czy adiuwanty mogą zwiększyć fagocytozę i ekspresję komórek odpornościowych w hodowli komórkowej in vitro oraz opracowanie głównych metod eksperymentalnych. Eksperyment jest podzielony na cztery podsekcje: (1) toksyczność OP-D i NOD dla komórek L929 określa się za pomocą testu zliczania komórek-8 (CCK-8); (2) poziomy cytokin endokrynnych IFN-γ i IL-17A oraz odpowiadająca im liczba komórek u immunizowanych myszy są wykrywane za pomocą stymulacji splenocytów i testów ELISpot; (3) zdolność DC do prezentacji antygenu po stymulacji adiuwantowej obserwuje się za pomocą mikroskopii konfokalnej; oraz (4) wykryto trzy rodzaje cytokin, IL-1β, IL-6 i TNF-α, w supernatantach uzyskanych z makrofagów otrzewnowych (PM) u normalnych myszy hodowanych wspólnie z adiuwantami.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie eksperymenty komórkowe zostały przeprowadzone w laboratorium inżynierii komórkowej wyposażonym w podstawowe sale operacyjne, pokoje buforowe, sterylne pomieszczenia do hodowli oraz pokoje do identyfikacji i analizy. Środowisko i warunki pracy były wolne od skażenia mikrobiologicznego i innych szkodliwych czynników. Doświadczenia na zwierzętach przeprowadzono w oparciu o Wytyczne dotyczące opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych i zostały zatwierdzone przez Komisję ds. Dobrostanu i Etyki Zwierząt Laboratoryjnych III Wojskowego Uniwersytetu Medycznego.

1. Autoklawowanie i przygotowanie materiału

  1. Przygotować odczynniki i materiały eksploatacyjne, takie jak sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS), nożyczki, kleszcze i siatka ścierna, przez sterylizację na mokro przez autoklawowanie w temperaturze 121 °C przez 20 minut.
  2. Aby uzyskać informacje na temat wymaganych odczynników i sprzętu, patrz Tabela materiałów. Wzór na nanoemulsję ślepej próby (BNE) znajduje się w tabeli 1.

2. Test cytotoksyczności L929

  1. Włączyć łaźnię wodną i ustawić temperaturę na 37 °C. Zebrać jedną probówkę zamrożonych komórek L929 z ciekłego azotu i szybko rozmrozić w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
  2. Szybko po rozmrożeniu odpipetować komórki do sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml, dodać 2 ml DMEM i dobrze wymieszać.
  3. Odwirować próbki o masie 129 x g przez 5 minut i odrzucić supernatant. Następnie dodaj 2 ml DMEM w celu ponownego zawieszenia komórek i ponownie odwiruj próbki przy 129 x g przez 5 minut.
  4. Odrzucić supernatant, dodać 6 ml kompletnej pożywki DMEM (zawierającej 10% FBS) do ponownego zawieszenia i przenieść do kolby hodowlanej T25 w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO2 do hodowli przez 48 godzin.
  5. Odrzucić pożywkę hodowlaną do kolby hodowlanej i dwukrotnie przemyć komórki 2 ml PBS. Następnie dodaj 1 ml 0,25% trypsyny, aby trawić komórki przez 1-2 minuty w temperaturze 37 °C.
  6. Gdy zaobserwuje się zaokrąglenie komórek, dodaj 4 ml kompletnej pożywki DMEM, aby natychmiast zakończyć trawienie i dobrze wymieszaj. Następnie odessać komórki do sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i odwirować przy 129 x g przez 5 minut.
  7. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w 1 ml kompletnego podłoża DMEM. Do zliczania komórek za pomocą płytek do liczenia komórek należy użyć zawiesiny komórek o objętości 20 μl, a pozostałe komórki rozcieńczyć do 1 x 105 komórek/ml za pomocą kompletnej pożywki DMEM.
  8. Dodać 100 μl ultraczystej wody na obrzeża płytki 96-dołkowej i dodać 100 μl rozcieńczalnika komórkowego tylko do studzienek wewnętrznych. Umieścić płytkę w inkubatorze w celu przylegania do hodowli przez 4 godziny w temperaturze 37 °C.
  9. Po przyleganiu komórek dodaj OP-D i NOD oddzielnie w kompletnej pożywce DMEM do końcowej objętości 200 μl / studzienka (końcowe stężenia każdego leku to 480 μg / ml, 240 μg / ml, 120 μg / ml, 60 μg / ml i 30 μg / ml). Dla każdego stężenia należy użyć trzech studzienek jako kontrprób. Następnie umieść komórki z powrotem w inkubatorze i hoduj je przez kolejne 24 godziny.
  10. Rozcieńczyć CCK-8 do 10% kompletną pożywką DMEM i dodać 100 μl/studzienkę rozcieńczenia zawierające adiuwant i roztwory komórkowe do płytki 96-dołkowej. Umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze i inkubować przez kolejne 2-3 godziny.
  11. Często mieszaj podczas powlekania roztworu komórkowego, aby zapobiec niejednorodności spowodowanej wytrącaniem się komórek. Delikatnie wstrząsnąć płytką kilka razy przed i po dodaniu CCK-8, aby dobrze wymieszać podłoże i roztwór CCK-8.
  12. Zmierzyć absorbancję przy długości fali 450 nm za pomocą czytnika mikropłytek. Ustaw studzienkę zerującą z samym podłożem i CCK-8 dla podstawowej wartości absorbancji. Oblicz dokładne wartości absorbancji, odejmując wyzerowaną wartość absorbancji od uzyskanej wartości absorbancji podczas wykreślania.
  13. Upewnij się, że w żadnych studzienkach nie ma pęcherzyków przed testem za pomocą czytnika mikropłytek, ponieważ pęcherzyki będą zakłócać test.

3. Stymulacja splenocytów

  1. Uodpornić myszy BALB/c w wieku 6-8 tygodni 30 μg antygenu białkowego plus 30 μg adiuwantu poprzez wstrzyknięcie domięśniowe (200 μL) w dniu 0, dniu 7 i dniu 14 zgodnie z następującymi grupami eksperymentalnymi: (1) grupa PBS, (2) grupa antygenu (Ag), (3) grupa antygenu + OP-D (Ag/OP-D), (4) grupa antygenu + BNE (Ag/BNE), (5) grupa antygen + NOD (Ag/NOD) i (6) grupa antygenu + AlPO4 (Ag/Al).
  2. Pomieszczenie przygotowawcze: W 24 dniu po szczepieniu pierwotnym należy usunąć myszy z pomieszczenia dla zwierząt i poddać je eutanazji przez dootrzewnowe wstrzyknięcie 100 mg/kg 1% pentobarbitalu sodu. Umieść myszy w szklanym naczyniu i moczyć w 75% alkoholu przez 5 minut.
  3. Umieścić probówki wirówkowe na stojaku na probówki wirówkowe, ponumerować jednorazowe szalki Petriego i dodać 5 ml PBS do każdej szalki Petriego za pomocą pipety o pojemności 10 ml.
  4. Wykonaj 6-8 cm nacięcie nożyczkami pośrodku lewej brzusznej strony myszy, rozerwij skórę, odsłoń ścianę brzucha i zlokalizuj długi czerwony pasek śledziony.
  5. Podnieś otrzewną po dolnej stronie śledziony za pomocą kleszczy, rozetnij ją i obróć do góry, aby odsłonić śledzionę. Podnieś śledzionę za pomocą kleszczy, oddziel tkankę łączną pod śledzioną nożyczkami okulistycznymi i usuń śledzionę.
  6. Umieścić śledzionę na szalce Petriego zawierającej 5 ml PBS i zmielić na sitko (200 oczek, 70 μm) i pręt mielący. Po zmieleniu przenieść ciecz do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml z zakraplaczem kolankowym zgodnie z numeracją.
  7. Odwirować ciecz o sile 453 x g przez 5 minut. Wyrzucić supernatant, dodać 3 ml buforu do lizy czerwonych krwinek do każdej probówki, ponownie zawiesić komórki i poddać lizie w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
  8. Dodać 10-12 ml PBS do każdej probówki, wymieszać probówkę do góry nogami i wirować przy 453 x g przez 5 minut. Wyrzucić supernatant, dodać 10 ml PBS do każdej probówki wirówkowej i ponownie zawiesić komórki.
  9. Pobrać 20 μl każdej próbki do dołka na płytce do liczenia komórek i zapisać liczbę żywych komórek za pomocą automatycznego licznika komórek.
  10. Odwirować próbki o masie 453 x g przez 5 minut i odrzucić supernatant. Ponownie zawiesić komórki, rozcieńczyć do 2,5 x 106 komórek/ml pożywką RF-10 (informacje o postaci w Tabeli 2) i dodać do płytki 96-dołkowej w 100 μl/basenik.
  11. Rozcieńczyć antygen pożywką RF-10 do 10 μg/ml, dodać 100 μl do każdej studzienki i inkubować przez 3 dni w temperaturze 37 °C w 5% CO2 .
  12. Odessać zawiesinę komórkową otrzymaną z każdej grupy komórek do probówek wirówkowych o pojemności 1,5 ml, odwirować przy 453 x g przez 20 minut i odessać supernatant do czystej probówki wirówkowej.
  13. Wykrywanie zawartości IFN-γ i IL-17A należy przeprowadzić ściśle według instrukcji zestawu ELISA. Metody i procedury są następujące.
  14. Przygotować 1x roztwór roboczy buforu myjącego (dostarczony z zestawem), roztwór o standardowym stężeniu gradientowym (rozcieńczyć roztwór wzorcowy cytokin do 500 pg/ml, 250 pg/mL, 125 pg/mL, 62,5 pg/mL, 31,3 pg/ml i 15,6 pg/ml w buforze rozcieńczającym R [1x] dostarczonym z zestawem), biotynylowany roztwór roboczy przeciwciała (rozcieńczyć roztwór przeciwciała biotynylowanego do 1:100 za pomocą buforu rozcieńczającego R [1x] dostarczonego z zestawem w celu utworzenia roztworu roboczego), i roztwór roboczy streptawidyny-HRP w razie potrzeby.
  15. Dodać 100 μl/basenik rozcieńczonego roztworu wzorca cytokin do studzienki wzorcowej, 100 μl/studzienkę próbki do dołka próbki (bufor rozcieńczający R [1x] dostarczony z zestawem służy do rozcieńczania próbki) i 100 μl/basenik buforu rozcieńczającego R (1x) do ślepej próby kontrolnej.
  16. Dodać roztwór roboczy przeciwciała biotynylowanego w stężeniu 50 μl/studzienkę. Dobrze wymieszać, przykryć membraną uszczelniającą i inkubować w temperaturze 37 °C przez 90 minut.
  17. Usunąć płyn z dołków i dodać 1x roztwór roboczy buforu płuczącego o stężeniu 300 μl/studzienkę. Wylej płyn ze studzienek po 1 minutach. Powtórz ten proces 4 razy, pozwalając płynowi wyschnąć na bibule filtracyjnej za każdym razem.
  18. Dodać 100 μl/studzienkę roztworu roboczego streptawidyny-HRP. Przykryć i inkubować próbki w temperaturze 37 °C przez 30 minut. Odwirować próbki o masie 453 x g przez 5 minut i odrzucić supernatant.
    UWAGA: Roztwór myjący pozostający w studzience reakcyjnej podczas procesu mycia należy dokładnie wklepać, aż na bibule filtracyjnej nie będzie widać znaku wodnego.
  19. Dodać TMB w stężeniu 100 μl/studzienkę, inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez 5-30 minut w ciemności i ocenić reakcję zakończenia zgodnie z głębią koloru w studzience (ciemnoniebieski). Zwykle 10-20 minut na opracowanie koloru może przynieść dobre rezultaty.
  20. Reakcję należy szybko zakończyć, dodając roztwór zatrzymujący o stężeniu 100 μl/studzienkę. Wykryć wartość absorbancji przy 450 nm w ciągu 10 minut po zakończeniu.
    UWAGA: Przed użyciem należy zrównoważyć odczynnik w temperaturze pokojowej przez 30 minut.

4. Test ELISpot

  1. Wykonaj immunizację myszy i pobranie splenocytów dokładnie tak, jak opisano w krokach 3.1-3.10 powyżej. Wykonaj testy dla IFN-γ i IL-17A w ścisłej zgodności z instrukcjami zestawu. Metody i procedury są następujące.
  2. Wyjąć płytkę z szczelnie zamkniętego opakowania, przemyć 4x sterylnym PBS (200 μL/basenik) i dodać 1640 kompletnej pożywki hodowlanej (200 μL/basenik), aby zrównoważyć ją w temperaturze pokojowej przez 2 godziny.
  3. Usunąć pożywkę i rozcieńczyć zawiesinę splenocytów pożywką RF-10 do 2 x 105 komórek/ml, dodając 50 μl komórek i antygenu na studzienkę (końcowe stężenie: 10 μg/ml).
  4. Umieścić płytkę w nawilżonym inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 48 godzin. W tym czasie nie przesuwaj płytki i podejmij środki, aby uniknąć parowania (np. owiń płytkę folią aluminiową).
  5. Rozcieńczyć przeciwciało detekcyjne (BVD6-24G2-biotyna) do 1 μg/ml (1:1,000) w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (0,5 ml: 100 ml) zawierającej 0,5% płodowej surowicy bydlęcej (PBS-0,5% FBS). Dodać 100 μl/basenik do płytki i inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 godziny po przefiltrowaniu przez membranę 0,22 μm.
  6. Zdekantować płyn do studzienek, dodać 1x bufor płuczący o stężeniu 200 μL/studzienkę i umyć 5x. Pozostawić na 30-60 s za każdym razem, a po raz ostatni pozostawić do wyschnięcia na bibułze.
  7. Rozcieńczyć peroksydazę streptawidynowo-chrzanową (1:1000) w PBS-0,5% FBS i dodać 100 μl/basenik. Inkubować płytkę przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Umyj płytkę jak w kroku 4.6.
  8. Dodać 100 μl/studzienkę gotowego do użycia roztworu substratu TMB i rozwijać, aż pojawi się wyraźna plama. Zatrzymaj rozwój koloru poprzez intensywne mycie w wodzie dejonizowanej (wielokrotnie płukać 5x-6x). W razie potrzeby usuń przepust (miękki plastik pod płytą) i przepłucz dolną stronę membrany.
  9. Zbadaj i policz plamki na czytniku ELISpot lub mikroskopie preparacyjnym po wyschnięciu płytki.

5. Absorpcja przez DC

  1. Poddaj eutanazji normalne myszy BALB/c przez dootrzewnowe wstrzyknięcie 100 mg/kg 1% pentobarbitalu sodu. Namocz myszy w 75% alkoholu przez 5 minut.
  2. Wytnij nożyczkami 6-8 cm nacięcie poniżej brzucha myszy i zaciśnij dwa końce otworu, aby rozdzielić go w różnych kierunkach i odsłonić nogi myszy. Oddziel kość udową myszy od ciała myszy i kość piszczelową od stawu i utrzymuj kości nienaruszone na obu końcach.
  3. Usuń resztki tkanki i chrząstki ze stawów stawowych na obu końcach kości udowej za pomocą nożyczek i kleszczy. Namocz kości udowe w 75% alkoholu przez 5 minut, a następnie namocz w sterylnym roztworze PBS, aby zmyć alkohol z powierzchni.
  4. Odciąć końce kości udowych nożyczkami i przepłukać szpik kostny na sterylnej szalce Petriego sterylnym roztworem PBS, a następnie odessać strzykawką o pojemności 1 ml. Powtórz pranie 3x-5x.
  5. Przefiltrować przez sito komórkowe (200 oczek, 70 μm) i zebrać BMDC do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Odwirować próbki o masie 290 x g przez 5 minut. Odrzucić supernatant, dodać 4 ml buforu do lizy czerwonych krwinek, zawiesić i poddać lizie w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
  6. Dodać 10 ml sterylnego roztworu PBS w celu zneutralizowania lizatu, odwirować przy 290 x g przez 5 minut i wyrzucić supernatant.
  7. Ponownie zawiesić komórki w 1 ml DMEM zawierającym 1% roztworu penicyliny-streptomycyny i 10% FBS i policzyć. Następnie dodaj GM-CSF (20 ng / ml) i IL-4 (10 ng / ml) do pożywki, dostosuj stężenie komórek do 5 x 105 / ml i zaszczep komórki na szkiełkach nakrywkowych.
  8. Dodać zawiesinę komórkową do płytki 6-dołkowej w temperaturze 2 ml/basenik i umieścić płytkę w nawilżanym inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2 2 na 48 godzin. Po 2 dniach całkowicie zmienić podłoże, a po 4 dniach zmienić połowę pożywki.
  9. Wybierz pięć studzienek z komórkami w dobrym stanie (duże i przezroczyste dla promieni rentgenowskich komórki z dendrytycznymi wypukłościami na powierzchni komórki) za pomocą odwróconego mikroskopu przy 100-krotnym powiększeniu do eksperymentu w siódmym dniu hodowli. Odrzucić supernatant, dodać 2 ml roztworów GFP, OP-D + GFP i NOD + GFP rozcieńczonych kompletną pożywką DMEM (stężenie końcowe GFP: 20 μg/ml; końcowe stężenie adiuwantu: 10 μg/ml) do każdej studzienki i inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez 30 minut w ciemności.
  10. Umyj płytki 3x PBS, dodaj 1 ml 4% paraformaldehydu do każdej studzienki i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 15 min. Po utrwaleniu usuń paraformaldehyd, inkubuj komórki z falloidyną i DAPI do końcowego stężenia 10 μg/ml przez 10 minut w celu barwienia, a następnie przemyj 3x PBS.
  11. Dodaj 1 ml PBS do każdej studzienki i obserwuj wychwyt antygenu za pomocą CLSM, jak opisano poniżej.
    1. Otwórz oprogramowanie CLSM, kliknij System ZEN i poczekaj na zakończenie inicjalizacji sprzętu.
    2. Kliknij skróty GFP i DAPI w zakładce lokalizacji, aby znaleźć obszar, który można obserwować. Wyłącz światło fluorescencyjne i światło przechodzące.
    3. Kliknij Smart Setup w menu pobierania, aby otworzyć bibliotekę barwników i dodaj trzy barwniki fluorescencyjne: EGFP, falloidynę i DAPI. Kliknij Najlepszy sygnał > OK. Kliknij kanał EGFP w zakładce kanały i kliknij Na żywo, aby wybrać odpowiednie pole widzenia w prawym interfejsie.
    4. Wybierz 1 AU dla otworu, obróć precyzyjnego ustawiania ostrości, aby wyregulować ogniskową i wybierz odpowiednią płaszczyznę ogniskowej. Kliknij Wskaźnik zasięgu i dostosuj kombinację mocy lasera i wzmocnienia głównego tak, aby na obrazie pojawiały się tylko sporadyczne czerwone kropki.
    5. Dostosuj kanały falloidyny i DAPI z tymi samymi parametrami bez zmiany mocy lasera.
    6. Wybierz Zatrzymaj na żywo i kliknij Tryb akwizycji, aby zmienić parametry fotografowania: Rozmiar klatki: 1024 piksele x 1024 piksele; Szybkość skanowania: 7; Uśrednienie: 2x. Kliknij Snap i wybierz Podziel, aby wyświetlić wszystkie zrobione zdjęcia. Zapisz obrazy.

6. Aktywacja makrofagów

  1. Zanurz myszy C57BL/6 w 75% alkoholu po eutanazji i umieść je ekranem do góry na szklanej szalce Petriego w ponumerowanej kolejności.
  2. Przełóż myszy przez okienko transferowe do sterylnej sali operacyjnej i umieść na stole operacyjnym na 5 minut.
  3. Za pomocą strzykawki odessać 10 ml soli fizjologicznej, przechylić myszy w dół pod kątem około 45° i wstrzyknąć w środek jamy brzusznej. Pobrać około 5 ml zawiesiny komórkowej do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml na każde 10 ml i powtórzyć wstrzyknięcie 3 razy.
  4. Odwirować zawiesinę komórkową o sile 129 x g przez 5 minut, aby uzyskać pierwotne makrofagi otrzewnowej myszy. Ponownie zawiesić komórki, dostosować stężenie komórek do 2 x 106 komórek/ml za pomocą kompletnej pożywki RPMI 1640 (zawierającej 10% FBS) i zaszczepić zawiesinę komórek na 24-dołkowej płytce, aby zapewnić stałą liczbę komórek na dołek (1 ml / dołek).
  5. Hodowla w temperaturze 37 °C w 5% CO2 przez noc (około 16-20 godzin), a następnie inkubacja z PBS, Ag, Ag/OP-D, Ag/NOD i Ag/Al (końcowe stężenie Ag: 5 μg/ml; końcowe stężenie adiuwanta: 10 μg/ml; objętość całkowita: 2 ml) przez 24 godziny. Wykryć poziomy IL-1β, IL-6 i TNF-α w supernatancie hodowli za pomocą zestawów ELISA, stosując metody i procedury opisane w krokach 3.12-3.19.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Ocena aktywności komórkowej adiuwantów OP-D i NOD została przeprowadzona in vitro zgodnie z protokołem. Fibroblasty L929 stanowią użyteczny model przesiewowy do testowania toksyczności NOD in vitro (Rycina 1). Ilościowe oznaczenie poziomów cytokin zapalnych w śledzionie może pomóc badaczom lepiej zrozumieć odpowiedź immunologiczną (Rycina 2). Monitorowanie CTL za pomocą metody ELISpot jest złotym standardem w ocenie swoistej dla antygenu odporn...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Szczepionki podjednostkowe zapewniają doskonałe bezpieczeństwo, ale słabą immunogenność. Główną strategią zwiększania immunogenności jest fizyczna adsorpcja lub łączenie antygenów z adiuwantami i włączanie ich do systemów dostarczania leków w celu promowania wychwytu i prezentacji przez DC. Naturalne saponiny roślinne, takie jak saponina quillaia i jej pochodne, są wysoce toksyczne i nie nadają się do opracowywania szczepionek dla ludzi17. Dlatego badanie toksycznego wpływu szczepionek lub adiuwan...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie istnieją konkurencyjne interesy finansowe lub osobiste, które mogłyby mieć wpływ na pracę opisaną w tym artykule.

Podziękowania

To badanie było wspierane przez grant nr 2021YFC2302603 Narodowego Programu Kluczowych Badań i Rozwoju Chin, granty nr 31670938, 32070924, 82041045 i 32000651 Programu Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych w Chinach, granty nr 2014jcyjA0107 i nr 2019jcyjA-msxmx0159 Programu Projektu Fundacji Nauk Przyrodniczych w Chongqing, grant nr. CYS21519 Podyplomowego Projektu Badawczo-Innowacyjnego w Chongqing, grant nr 2020XBK24 Wojskowego Uniwersytetu Medycznego na projekty specjalne oraz grant nr 202090031021 Narodowego Programu Innowacji i Przedsiębiorczości dla studentów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,25% Trypsyna-EDTA (1x)GIBCO, USA25200056
96-dołkowe płytki filtracyjneMillipore. Billerica, MACLS3922
AlPO4General Chemical Company, USAnull
Automatyczny licznik komórekCountstar, ChinyMyszy IC1000
BALB/c i myszy C57BL/6Beijing HFK Bioscience Co. Ltdzerowy
trójgliceryd kaprylowo-kaprynowy (GTCC)Beijing Fengli Pharmaceutical Co. Ltd., Pekin, Chinynull
Zestawy CCK-8Dojindo, JaponiaCK04
Płytka do liczenia komórekCostar, Corning, USA
biosharp, ChinyWirówka BS-70-CS
5810 REppendorf, Niemcy 
DAPISigma-Aldrich, St. Louis, USAD9542
DMEM basic(1x) mediumGIBCO, USAC11885500BT
DSZ5000X Mikroskop odwróconyNikon, JaponiaDSZ5000X
EL-35 (Cremophor-35)Bombaj, Indienull
ELISpot classicAID, NiemcyELR06
Płodowa surowica bydlęcaGIBCO, USA10099141C
W pełni funkcjonalny czytnik mikropłytekThermo Fisher Scientific, USAVL0000D2
GFPSigma-Aldrich, St. Louis, USAP42212
GlutamaxInvitrogen, USA35050061
Czynnik stymulujący tworzenie kolonii makrofagów granulocytówGM-CSF, R& D Systems, USA315-03
HEPESInvitrogen, USA15630106
Inkubator HF 90/240Heal Force, Szwajcarianull
IL-4PeproTech, USA042149
Linia komórkowa L929FENGHUISHENGWU, Chiny  NCTC klon 929 (RRID:CVCL_0462)
Laserowa skaningowa mikroskopia konfokalnaZeiss, NiemcyLSM 980
MONTANE 85 PPISEPPIC, FrancjaL12910
MONTANOX 80 PPISEPPIC, Francja36372K
Mysz IFN-γ Zestaw ELISADakewe, ChinyMysz 1210002
IFN-γ wstępnie powlekany zestaw ELISPOTDakewe, ChinyDKW22-2000-096
Mysz IL-17A Zestaw ELISADakewe, Chiny1211702
Mysz IL-17A ELISpotPLUS Zestawebiosciences, USA3521-4HPW-2
Mysz IL-1β Zestaw ELISADakewe, Chiny1210122
Mysz IL-6 Zestaw ELISADakewe, Chiny
TNF-α Zestaw ELISADakewe, Chiny1217202
Aminokwasy endogenne(100x)Invitrogen, USA11140050
Ophiopogonin-DChengdu Purui Technology Co., Ltd945619-74-9
Roztwór penicyliny-streptomycynyInvitrogen, USA15070063
PhalloidinSolarbio, ChinyFosforan CA1620
Buforowana sól fizjologicznaZSGB-BIO, ChinyZLI-9062
Bufor do lizy czerwonych krwinekSolarbio, ChinyR1010
RPMI 1640 średnihyklon (Life Technology), USASH30809.01
Pirogronian sodu (100 mM)Invitrogen, USA11360070
SqualeneSigma, USAS3626
β- MerkaptoetanolInvitrogen, Stany Zjednoczone21985023
Sito do komórek CO010101 5811000398 Mysz 1210602

Bibliografia

  1. Cao, W., et al. Recent progress of graphene oxide as a potential vaccine carrier and adjuvant. Acta Biomaterials. 112, 14-28 (2020).
  2. Ko, E. J., Kang, S. M. Immunology and efficacy of MF59-adjuvanted vaccines. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 14 (12), 3041-3045 (2018).
  3. Shi, S., et al. Vaccine adjuvants: Understanding the structure and mechanism of adjuvanticity. Vaccine. 37 (24), 3167-3178 (2019).
  4. Kuo, T. Y., et al. Development of CpG-adjuvanted stable prefusion SARS-CoV-2 spike antigen as a subunit vaccine against COVID-19. Scientific Reports. 10, 20085(2020).
  5. Twentyman, E., et al. Interim recommendation of the Advisory Committee on Immunization Practices for use of the Novavax COVID-19 vaccine in persons aged >/=18 years - United States, July 2022. MMWR Morbidity and Mortality Weekly Report. 71 (31), 988-992 (2022).
  6. Wang, Z., et al. Improved aluminum adjuvants eliciting stronger immune response when mixed with hepatitis B virus surface antigens. ACS Omega. 7 (38), 34528-34537 (2022).
  7. Wang, N., Chen, M., Wang, T. Liposomes used as a vaccine adjuvant-delivery system: From basics to clinical immunization. Journal of Controlled Release. 303, 130-150 (2019).
  8. Akin, I., et al. Evaluation of the safety and efficacy of Advax(TM) as an adjuvant: A systematic review and meta-analysis. Advances in Medical Sciences. 67 (1), 10-17 (2022).
  9. Lacaille-Dubois, M. A. Updated insights into the mechanism of action and clinical profile of the immunoadjuvant QS-21: A review. Phytomedicine. 60, 152905(2019).
  10. Marty-Roix, R., et al. Identification of QS-21 as an inflammasome-activating molecular component of saponin adjuvants. The Journal of Biological Chemistry. 291 (3), 1123-1136 (2016).
  11. Zhang, Y. Y., et al. Ophiopogonin D attenuates doxorubicin-induced autophagic cell death by relieving mitochondrial damage in vitro and in vivo. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 352 (1), 166-174 (2015).
  12. An, E. J., et al. Ophiopogonin D ameliorates DNCB-induced atopic dermatitis-like lesions in BALB/c mice and TNF-alpha- inflamed HaCaT cell. Biochemical and Biophysical Research Communications. 522 (1), 40-46 (2020).
  13. Song, X., et al. Effects of polysaccharide from Ophiopogon japonicus on immune response to Newcastle disease vaccine in chicken. Pesquisa Veterinária Brasileira. 36 (12), 1155-1159 (2016).
  14. Tong, Y. N., et al. An immunopotentiator, ophiopogonin D, encapsulated in a nanoemulsion as a robust adjuvant to improve vaccine efficacy. Acta Biomaterialia. 77, 255-267 (2018).
  15. Lin, C. A., et al. Hyaluronic acid-glycine-cholesterol conjugate-based nanoemulsion as a potent vaccine adjuvant for T cell-mediated immunity. Pharmaceutics. 13 (10), 1569(2021).
  16. Xu, H. H., et al. Global metabolomic and lipidomic analysis reveals the potential mechanisms of hemolysis effect of ophiopogonin D and ophiopogonin D' in vivo. Chinese Medicine. 16 (1), 3(2021).
  17. Drane, D., Gittleson, C., Boyle, J., Maraskovsky, E. ISCOMATRIX adjuvant for prophylactic and therapeutic vaccines. Expert Review of Vaccines. 6 (5), 761-772 (2007).
  18. Rudolf, R., et al. Microstructure characterisation and identification of the mechanical and functional properties of a new PMMA-ZnO composite. Materials. 13 (12), 2717(2020).
  19. Cannella, V., et al. Cytotoxicity evaluation of endodontic pins on L929 cell line. BioMed Research International. 2019, 3469525(2019).
  20. Jiao, G., et al. Limitations of MTT and CCK-8 assay for evaluation of graphene cytotoxicity. RSC Advances. 5 (66), 53240-53244 (2015).
  21. Ghasemi, M., Turnbull, T., Sebastian, S., Kempson, I. The MTT assay: Utility, limitations, pitfalls, and interpretation in bulk and single-cell analysis. International Journal of Molecular Sciences. 22 (23), 12827(2021).
  22. Li, W., Zhou, J., Xu, Y. Study of the in vitro cytotoxicity testing of medical devices. Biomedical Reports. 3 (5), 617-620 (2015).
  23. Wu, F., et al. Correlation between elevated inflammatory cytokines of spleen and spleen index in acute spinal cord injury. Journal of Neuroimmunology. 344, 577264(2020).
  24. Lewis, S. M., Williams, A., Eisenbarth, S. C. Structure and function of the immune system in the spleen. Science Immunology. 4 (33), (2019).
  25. Cox, J. H., Ferrari, G., Janetzki, S. Measurement of cytokine release at the single cell level using the ELISPOT assay. Methods. 38 (4), 274-282 (2006).
  26. Elliott, A. D. Confocal microscopy: Principles and modern practices. Current Protocols in Cytometry. 92 (1), 68(2020).
  27. Zhou, Y., et al. CD4(+) T cell activation and inflammation in NASH-related fibrosis. Frontiers in Immunology. 13, 967410(2022).
  28. Martinez, F. O., Sica, A., Mantovani, A., Locati, M. Macrophage activation and polarization. Frontiers in Bioscience. 13, 453-461 (2008).
  29. Quesniaux, V., Erard, F., Ryffel, B. Adjuvant activity on murine and human macrophages. Methods in Molecular Biology. 626, 117-130 (2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Ocena in vitrodetekcja cytokintest ELISAmetoda ELISpotpobieranie przez kom rki dendrytyczneaktywacja makrofag wcytotoksyczno L929
In vitro Ocena aktywności komórkowej adiuwantu szczepionki nanoemulsyjnej ofiopogoniny D
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.