Artykuł metodologiczny

Budowa cyklicznych peptydów penetrujących komórki w celu zwiększenia penetracji barier biologicznych

DOI:

10.3791/64293

⸱

19 września 2022

 ,  ,  , 
1Sichuan Engineering Research Center for Biomimetic Synthesis of Natural Drugs, School of Life Science and Engineering, Southwest Jiaotong University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje syntezę cyklicznych peptydów penetrujących komórki z aromatycznymi wiązaniami krzyżowymi oraz ocenę ich przepuszczalności przez bariery biologiczne.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rak jest wielkim wyzwaniem dla globalnego zdrowia. Jednak złożone mikrośrodowisko guza na ogół ogranicza dostęp terapii do głębszych komórek nowotworowych, co prowadzi do nawrotu guza. Aby przezwyciężyć ograniczoną penetrację barier biologicznych, odkryto peptydy penetrujące komórki (CPP) o doskonałej zdolności translokacji błony i okazały się użytecznymi transporterami molekularnymi do dostarczania różnych ładunków do komórek. Jednak konwencjonalne liniowe CPP na ogół wykazują upośledzoną stabilność proteolityczną, co ogranicza ich przepuszczalność przez bariery biologiczne. W związku z tym opracowanie nowych transporterów molekularnych, które mogą przenikać przez bariery biologiczne i wykazywać zwiększoną stabilność proteolityczną, jest wysoce pożądane w celu zwiększenia efektywności dostarczania leków w zastosowaniach biomedycznych. Wcześniej zsyntetyzowaliśmy panel krótkich cyklicznych CPP z aromatycznymi wiązaniami krzyżowymi, które wykazywały lepszą przepuszczalność w komórkach i tkankach nowotworowych w porównaniu z ich liniowymi odpowiednikami. W tym miejscu opisano zwięzły protokół syntezy znakowanego fluorescencyjnie cyklicznego peptydu poliargininowego R8 i jego liniowego odpowiednika, a także kluczowe kroki w celu zbadania ich przepuszczalności komórek.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ostatnie kilka dekad było świadkiem szybkiego postępu w rozwoju peptydów penetrujących komórki (CPP) do dostarczania leków. CPP są szeroko stosowane jako transportery molekularne w leczeniu szeregu chorób zagrażających życiu, w tym zaburzeń neurologicznych1,2, choroby serca3, cukrzyca4, dermatosis5 i rak6,7. Rak pozostaje globalnym obciążeniem zdrowotnym, któremu towarzyszy wysoki wskaźnik zachorowalności i śmiertelności, pomimo szeroko zakrojonych wysiłków badawczych8. Poważną przeszkodą w leczeniu raka jest ograniczony dostęp terapii do głębszych komórek nowotworowych ze względu na bariery fizjologiczne, takie jak zwarta macierz zewnątrzkomórkowa (ECM), nieprawidłowe unaczynienie guza, wiele barier błonowych i wysokie ciśnienie płynu śródmiąższowego (IFP)9. W związku z tym opracowanie nowatorskich CPP o doskonałej zdolności do dostarczania ładunków przez bariery biologiczne jest uważane za niezbędną strategię leczenia raka10,11.

CPP można podzielić na kationowe, amfipatyczne i hydrofobowe CPP pod względem ich właściwości fizykochemicznych12. Wśród nich dodatnio naładowany peptyd HIV-TAT i syntetyczna poliarginina mają duże znaczenie w badaniach biomedycznych i były szeroko badane w celu ułatwienia wewnątrzkomórkowego dostarczania leków13. Tunnemann i wsp. stwierdzili, że minimalna długość ośmiu arginin jest niezbędna do efektywnej penetracji komórek syntetycznych peptydów poliargininy, w oparciu o badanie przepuszczalności komórek przeprowadzone przy użyciu peptydów R3 do R1214. Jednak te CPP mają na ogół krótkie okresy półtrwania osocza ze względu na ich szybką hydrolizę in vivo. Ponadto niewiele wiadomo na temat optymalizacji struktury chemicznej CPP w celu zwiększenia ich zdolności transbarierowej, ponieważ penetracja wielu błon komórkowych jest trudna15. W związku z tym opracowanie nowych transporterów molekularnych zdolnych do przenikania przez bariery biologiczne jest bardzo pożądane w celu zwiększenia wydajności dostarczania leków. W 2020 roku Komin i wsp.16 odkryli CPP zwany peptydem CL, który zawiera motyw helisy (RLLRLLR) i ogon poliargininowy (R7) do krzyżowania monowarstwy nabłonka. Zsyntetyzowano również zestaw wariantów peptydu CL poprzez zmianę wzoru spiralnego. Badania te mogą być istotną wskazówką dla rozwoju nowych CPP do dostarczania ładunków przez bariery biologiczne. Co więcej, Dietrich i wsp. zoptymalizowali przepuszczalność komórkową peptydu StAX, hamując szlak sygnałowy Wnt/β-kateniny poprzez zwiększenie ogólnej hydrofobowości peptydów17.

Konformacyjne ograniczenie nieustrukturyzowanych peptydów liniowych poprzez cyklizację jest skutecznym sposobem na zwiększenie ich proteolitycznej stabilności i przepuszczalności18,19,20. Wzmocnienie strukturalne zwiększa oporność peptydów cyklicznych na proteazy, dzięki czemu są one bardziej stabilne in vivo w porównaniu z ich liniowymi odpowiednikami. Ponadto cyklizacja peptydów może potencjalnie maskować polarny szkielet peptydowy poprzez promowanie wewnątrzcząsteczkowych wiązań wodorowych, zwiększając w ten sposób przepuszczalność błony peptydów21. W ciągu ostatnich dwóch dekad chemoselektywne metody cyklizacji stały się skutecznymi strategiami budowy cyklicznych peptydów o różnych architekturach, takich jak all-węglowodory, laktam, triazol, m-ksylen, perfluoroaryl i inne sieci krzyżowe22,23. Bariera biologiczna narzucona przez wyrafinowane mikrośrodowisko guza może zmniejszyć przenikanie leków do guzów litych24. Wcześniej odkryliśmy, że cykliczne CPP wykazywały wyższą odporność na trawienie enzymatyczne niż ich liniowe odpowiedniki20. Co więcej, ogólna hydrofobowość peptydów ma kluczowe znaczenie dla ich zwiększonej przepuszczalności komórek22. Na podstawie badań omówionych powyżej można postawić hipotezę, że połączenie dodatnio naładowanego wzorca, podwyższonej ogólnej hydrofobowości i zwiększonej stabilności proteolizy zwiększa przepuszczalność CPP przez bariery biologiczne. W niedawnym badaniu zidentyfikowaliśmy dwa cykliczne CPP z aromatycznymi wiązaniami krzyżowymi w pozycjach i i i i+7, które wykazują lepszą przepuszczalność w komórkach i tkankach nowotworowych w porównaniu z ich liniowymi odpowiednikami15. W tym miejscu przedstawiono zwięzły syntetyczny protokół syntezy znakowanych fluorescencyjnie cyklicznych CPP oraz kluczowe kroki w celu zbadania ich przepuszczalności.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie sprzętu

UWAGA: Wykonaj wszystkie procedury w dygestorium z odpowiednim sprzętem ochrony osobistej.

  1. Zamontuj ręczny aparat do syntezy peptydów w dygestorii (Rysunek 1). Umieścić zawory odcinające trójdrogowe (patrz Tabela materiałów) na kolektorze podciśnieniowym (patrz Tabela materiałów) i podłączyć do azotu (N2). Upewnij się, że zakryłeś nieużywane wloty.
  2. Przymocuj kolumnę polipropylenową o pojemności 10 ml (patrz tabela materiałów) do zaworów trójdrogowych. Spuść mieszaninę reakcyjną lub rozpuszczalniki z kolumny polipropylenowej za pomocą gumowej bańki pipety lub odkurzacza przez syfon na odpady.

2. Synteza liniowego peptydu R8 znakowanego FITC (FITC-R8) i znakowanego FITC zszywanego peptydu R8 (FITC-sR8-4)

UWAGA: Peptydy zostały zsyntetyzowane zgodnie ze standardowym protokołem syntezy peptydów w fazie stałej (SPPS) opartym na Fmoc25. W całym badaniu zastosowano żywicę 4-(2',4'-Dimethoxypheyl-Fmoc-aminometylo)-phenoxyacetamido-norleucyl-MBHA (żywica MBHA z amidu lodowiska, patrz tabela materiałów).

UWAGA: N, N-dimetyloformamid (DMF), N, N-diizopropyloetyloamina (DIPEA), morfolina i dichlorometan (DCM) są bezbarwne i są szkodliwe, jeśli są wdychane lub wchłaniane przez skórę. Eter jest wyjątkowo łatwopalny. 1,2-Etanedithiol (EDT) jest substancją o szczególnie nieprzyjemnym zapachu. Kwas trifluorooctowy (TFA) jest silnie, a jego kwasowość jest 105 razy większa niż kwasu octowego. W związku z tym wszystkie odczynniki i chemikalia powinny być usuwane przy użyciu sprzętu ochronnego w dygestorium.

  1. Przygotuj żywicę do syntezy peptydów.
    1. Oblicz masę żywicy potrzebną do syntezy:Masa żywicy (mg) = skala (mmol) / pojemność żywicy (mmol/g) × 1,000 (mg/g)
      UWAGA: Na przykład masa żywicy amidowej MBHA na lodowisku (0,572 mmol/g) dla 0,2 mmol = 0,2 mmol / 0,572 mmol/g × 1,000 mg/g = 350 mg.
    2. Dodaj 4-5 ml DMF do wymaganej ilości żywicy i przenieś do kolumny polipropylenowej o pojemności 10 ml (krok 1.2) z delikatnym bulgotaniem N2 przez 30 minut, aby odpowiednio spęcznić żywicę, a następnie opróżnij DMF.
    3. Dodaj 4-5 ml 50% morfoliny/DMF (v/v) do żywicy, delikatnie bąbelkuj N2 przez 30 minut 2x, aby usunąć N-końcową grupę Fmoc, a następnie odcedź mieszaninę. Następnie dokładnie umyj żywicę 3x, dodając 4-5 ml DMF do kolumny i bulgoczącN2 przez co najmniej 1 minutę za każdym razem. Kontynuuj mycie żywicy za pomocą DCM (3x) i DMF (3x) w ten sam sposób.
  2. Wykonaj sprzężenie aminokwasów chronione przez Fmoc, jak opisano poniżej.
    UWAGA: Sprzężenie argininy w ręcznej syntezie w skali 0,2 mmol jest opisane tutaj jako przykład.
    1. Rozpuścić Fmoc-Arg (Pbf)-OH (5 równoważnik, 648,8 mg) i 2-(7-azobenzotriazol)-N, N, N', N'-tetrametylofluorofosforan heksafluorofosforanu (HATU, odpowiednik 4,9, 372,6 mg) w 5 ml DMF w probówce wirówkowej.
    2. Dodać DIPEA (odpowiednik 10, 348,4 μl) w celu aktywacji reakcji sprzęgającej, a następnie przenieść mieszaninę reakcyjną do 10 ml kolumny polipropylenowej z żywicą (przygotowaną w kroku 2.1.3). Następnie delikatnie mieszaj mieszaninę z bulgotaniem N2 przez 1-2 godziny.
    3. Powtórzyć reakcję sprzęgania (etap 2.2.1 i etap 2.2.2) jeden raz.
    4. Po zakończeniu sprzęgania należy odcedzić mieszaninę reakcyjną i kolejno przemywać żywicę za pomocą DMF, DCM i DMF po 3x przez co najmniej 1 minutę za każdym razem.
    5. Wykonaj sprzęganie każdego aminokwasu w uporządkowanych krokach: Dodaj 4-5 ml 50% morfoliny/DMF (v/v) do żywicy, delikatnie bąbelkujN2 przez 30 minut 2x, aby usunąć grupę N α-Fmoc, następnie umyj żywicę (jak pokazano w kroku 2.2.4) i przystąp do łączenia następnego aminokwasu (jak pokazano w kroku 2.2.1 i kroku 2.2.2). Wykonaj kilka cykli tego etapu, aby osiągnąć syntezę pożądanego peptydu.
      UWAGA: Ten proces można wstrzymać w tym miejscu. Skondensować żywicę z metanolem i wysuszyć żywicę przy ciągłym przepływieN2. Przykryj kolumnę polipropylenową, a następnie przechowuj żywicę w temperaturze 4 °C przez kilka dni (lub w temperaturze -20 °C w przypadku dłuższego przechowywania). Pęcznieć żywicę 4-5 ml DMF przez 0,5-1 godziny przed rozpoczęciem nowej syntezy. Jeśli bezpośrednio przejdziesz do następnego kroku, nie ma potrzeby kondensacji żywicy.
  3. Oznaczyć peptydy izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC) zgodnie z poniższym opisem.
    1. Sprzęgnij beta-alaninę jako przekładkę do znakowania FITC, stosując ten sam proces, który jest używany do sprzęgania aminokwasów w kroku 2.2.
    2. Wykonaj znakowanie FITC peptydów na żywicy, dodając mieszaninę FITC (5 ekwiwalentów), DIPEA (10 ekwiwalentów) i DMF do kolumny polipropylenowej i reagując w ciemności przez 8 godzin.
  4. W celu syntezy FITC-sR8-4 należy przeprowadzić cyklizację peptydu liniowego, jak opisano poniżej.
    1. Dodać mieszaninę TFA/triizopropylosilanu (TIS)/DCM (3/5/92, v/v/v) do kolumny polipropylenowej na 2 minuty, aby selektywnie usunąć grupę ochronną Cys (Trt), a następnie odcedzić mieszaninę. Powtarzaj powyższą procedurę, aż żółtawy roztwór stanie się bezbarwny, aby całkowicie usunąć grupę ochronną Trt.
    2. Następnie należy wykonać sekwencyjne płukanie żywicy DMF i DCM co najmniej 3 razy. Następnie rozpuścić 4,4'-bis(bromometylo)bifenyl (2 ekwiwalent) w DMF za pomocą DIPEA (4 ekwiwalenty), dodać go do kolumny i reagować przez 4 godziny.
  5. Rozszczepić peptydy zgodnie z opisem: Po zakończeniu syntezy peptydów przemyć żywicę 4-5 ml metanolu dwa razy przez 5 minut każdy i wysuszyć ją ciągłym przepływemN2. Potraktuj żywicę skutecznym koktajlem łupliwym TFA/TIS/H2O (95/2,5/2,5, v/v/v) lub TFA/TIS/EDT/H2O (92,5/2,5/2,5/2,5, v/v/v/v) dla peptydów zawierających cysteiny, używając około 1 ml koktajlu rozszczepienia na 100 mg żywicy. Traktuj żywicę związaną z peptydami przez 2-3 godziny, aby rozszczepić peptyd, a następnie ostrożnie usuń TFA strumieniem N2.
  6. Aby otrzymać surowe peptydy, dodać 4-5 ml eteru dietylowego do rozszczepionego preparatu peptydowego w celu wytrącenia surowych peptydów i odwirować przy 10 000 × g przez 4 minuty. Ostrożnie wyrzucić supernatant i suszyć peptyd na powietrzu przez 3 minuty w skutecznym dygestorium.
  7. Analiza peptydów: Rozpuścić surowy peptyd na małą skalę (rozszczepiony z około 10 mg żywicy związanej z peptydami) w 800 μl acetonitrylu (ACN)/H2O (1/1, v/v), a następnie przeanalizować za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej z odwróconymi fazami (RP-HPLC) i chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas (LC-MS) (patrz tabela materiałów).
  8. Oczyść peptydy za pomocą RP-HPLC i LC-MS.
    1. Rozpuścić 50 mg surowego produktu peptydowego w 4 ml ACN/H2O (1/1, v/v) i wstrzyknąć roztwór do systemu RP-HPLC wyposażonego w kolumnę C18 (4,6 mm x 150 mm, wielkość porów: 120 A, wielkość cząstek: 4 μm; patrz tabela materiałów). Elucjuj peptyd za pomocą fazy ruchomej zawierającej 0,1% TFA/H2O(v/v) i ACN, z gradientem od 10% do 90% ACN w ciągu 30 minut. Konwencjonalne peptydy wykryto przy 220 nm, a peptydy znakowane FITC przy 494 nm.
    2. Zbierz frakcje odpowiadające głównemu pikowi peptydu zidentyfikowanemu przez stwardnienie rozsiane, a następnie liofilizuj pożądane frakcje peptydowe. Oczyszczony peptyd przechowywać w temperaturze -20 °C.
      UWAGA: Znalezione m/z oczyszczonego FITC-R8 są następujące: [M + 3 H]3+: 576.63; [M + 4 H]4+: 432,72; [M + 5 H]5+: 346,39; [M + 6 H]6+: 288,85. Znalezione m/z oczyszczonego FITC-sR8-4 są następujące: [M + 3 H]3+: 704.74; [M + 4 H]4+: 528,77; [M + 5 H]5+: 423,34; [M + 6 H]6+: 352,91. Warunki analityczne MS: przyrząd: ESI (polaryzacja sondy: +4,5 kV; detektor: 1,2 kV); przepływ gazu nebulizatora: 1,5 l/min; zakrzywiona linia desolwatacyjna (CDL): −20 V; Temperatura CDL: 250 °C; temperatura bloku: 400 °C; przepływ: 0,2 ml/min; faza mobilna: 50% H2O/50% ACN.

3. Kwantyfikacja peptydów znakowanych FITC

  1. Rozpuścić niewielką ilość oczyszczonego peptydu w DMSO jako roztwór podstawowy (np. 40 μmol/ml).
  2. Zmierzyć absorbancję przy 494 nm (A494) 2 μl roztworu podstawowego w 498 μl 10 mM roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (1x PBS, pH 7,4) za pomocą płytki do mikromiareczkowania (patrz tabela materiałów) przy użyciu czytnika mikropłytek wielofunkcyjnych (patrz tabela materiałów). Współczynnik rozcieńczenia wynosi 500 μl/ 2 μL = 250, a długość drogi płytki mikromiareczkowej wynosi 0,5 mm.
  3. Obliczyć stężenie roztworu podstawowego, korzystając z następującego wzoru:
    Stężenie (mM) = A494 × współczynnik rozcieńczenia / 0,05 (cm) / 77 000 (cm−1·M−1) × 1,000 (mM·M−1)
  4. Dostosować do odpowiedniego rozcieńczenia, tak aby zmierzona wartość A494 mieściła się w przedziale od 0,1 do 1,0,
    UWAGA: Pomiary należy powtórzyć kilka razy, aby upewnić się, że zmierzone stężenie jest dokładne. Współczynnik ekstynkcji wynoszący 77 000 cm−1·M−1 pochodzi z grupy FITC.

4. Stabilność peptydów w płodowej surowicy bydlęcej (FBS)

  1. Inkubować peptyd w stężeniu 100 μM z 250 μl 25% FBS/H2O (v/v) w temperaturze 37 °C. Po inkubacji przez 0 h, 1 h, 2 h i 4 h, pobrać 10 μl podwielokrotności, a następnie dodać 150 μl 12% kwasu trichlorooctowego rozpuszczonego w H2O/ACN (1/3, v/v) w celu wytrącenia białek surowicy.
  2. Odwirować próbki o masie 10 000 × g przez 5 minut i przeanalizować supernatant za pomocą HPLC (jak opisano w kroku 2.8) w celu określenia stopnia degradacji peptydów.
  3. Obliczyć stosunek powierzchni piku po 1 godzinie, 2 godzinach i 4 godzinach do powierzchni piku po 0 godzinach, aby uzyskać frakcję niezdegradowanego peptydu w odpowiednim czasie. Wynikiem jest średnia z trzech równoległych próbek.

5. Komórkowy wychwyt peptydów

  1. Obrazowanie mikroskopem fluorescencyjnym
    1. Umieść okrągłe szkiełko nakrywkowe na płytce 12-dołkowej. Następnie zaszczepić równomiernie 1 x 105 komórek na szkiełkach nakrywkowych i hodować przez noc z 2 ml pożywki. Usuń pożywkę i umyj komórki 3x 1 ml PBS.
      UWAGA: W tym badaniu komórki HeLa i komórki 4T1 hodowano w zmodyfikowanym pożywce Eagle Medium (DMEM, patrz tabela materiałów) uzupełnionej 10% FBS w nawilżanym inkubatorze o temperaturze 37 °C zawierającym 5% CO2 .
    2. Inkubować komórki z 1 ml 3 μM peptydów znakowanych FITC w DMEM wolnym od FBS przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C. Następnie usunąć pożywkę zawierającą peptydy i przemyć komórki 3 razy 1 ml PBS.
    3. Wybarwić komórki 1 ml Hoechst 33258 przez 15 minut. Obserwuj internalizację każdego peptydu za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego (patrz tabela materiałów) o tej samej intensywności fluorescencji i czasie ekspozycji.
      UWAGA: Do mikroskopii fluorescencyjnej użyto następujących ustawień. Obiektyw: Plan-apochromat: 63 x/1.40 Oil DIC M27; Kanał 1 dla FITC: filtr wzbudzenia: 450-490 nm, filtr emisyjny: 500-550 nm, czas naświetlania: 230 ms; Kanał 2 dla Hoechst 33258: filtr wzbudzenia: 335-383 nm, filtr emisyjny: 420-470 nm, czas ekspozycji: 27 ms.
  2. Analiza cytometrii przepływowej
    1. Zaszczepić równomiernie 5 x 105 komórek HeLa na płytkach 12-dołkowych i hodować w DMEM przez 24 godziny w temperaturze 37 °C. Następnie usunąć pożywkę i przemyć komórki 3x 1 ml PBS.
    2. Inkubować komórki z 1 ml 3 μM peptydów znakowanych FITC w DMEM wolnym od FBS przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C. Usunąć pożywkę zawierającą peptydy, dysocjować komórki za pomocą 0,25% (w/v) trypsyny i 0,53 mM EDTA w PBS przez 5 minut, a następnie zebrać komórki przez odwirowanie w stężeniu 306 × g przez 4 min. Przemyć osad komórkowy PBS.
    3. Inkubować komórki z 1 ml 0,05% (w/v) błękitu trypanowego w PBS przez 3 minuty w celu wygaszenia fluorescencji powierzchniowej i przeprowadzić analizę ilościową fluorescencji wewnątrzkomórkowej za pomocą cytometru przepływowego (patrz Tabela materiałów).
      UWAGA: Ustawienia cytometrii przepływowej: wzbudzenie: 488 nm, emisja: 530 nm. Błękit trypanowy może również wygaszać fluorescencję martwych komórek i pomagać w rozróżnianiu żywych i martwych komórek podczas analizy wychwytu peptydów.
    4. Leczyć i oznaczać komórki 4T1 za pomocą cytometrii przepływowej zgodnie z tym samym protokołem, jak opisano dla komórek HeLa. Zbierz 5 x 105 komórek na próbkę i ustaw trzy równoległe próbki w grupie.

6. Badanie penetracji peptydów między komórkami za pomocą modeli transwell

  1. Zaszczepić 1 x 105 komórek HeLa w 2 ml DMEM w 12-dołkowej komorze z wkładką do hodowli tkankowej (patrz tabela materiałów) i inkubować przez 24 godziny w nawilżanym inkubatorze o temperaturze 37 °C zawierającym 5% CO2 . Następnie usunąć pożywkę i inkubować komórki w komorach z 1 ml 10 μM FITC-R8 lub FITC-sR8-4 (oczyszczonych przy użyciu HPLC) w DMEM wolnym od FBS przez 1 godzinę.
  2. Usunąć pożywkę zawierającą peptydy i przemyć komórki 3x 1 ml PBS. Dodać 1 ml świeżego DMEM wolnego od FBS do komór, a następnie wspólnie inkubować komórki HeLa w komorze z wkładką do płytki do hodowli tkankowej z komórkami HeLa na okrągłych szkiełkach nakrywkowych na dnie przez 2 godziny.
  3. Utrwal komórki HeLa na okrągłych szkiełkach nakrywkowych 2,5% aldehydem glutarowym przez 15 minut, a następnie barwij komórki DAPI przez 15 minut. Następnie obserwuj komórki HeLa na szkiełkach nakrywkowych pod mikroskopem fluorescencyjnym. Traktuj i testuj komórki 4T1 przy użyciu tego samego protokołu, który jest używany w przypadku komórek HeLa.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym protokole przedstawiono syntetyczną procedurę ograniczającą liniową poliargininę R8 do jej cyklicznej formy. SPPS został przeprowadzony ręcznie przy użyciu prostego aparatu (Rysunek 1). Szczegółowy proces syntezy SPPS jest pokazany w Rysunek 2. Krótko mówiąc, żywica została wystarczająco spęczniona, po czym nastąpiła deprotekcja grupy ochronnej N α-Fmoc. Następnie aminokwas chroniony przez Nα-Fmoc został zakotwiczony w żywicy a...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chemiczna stabilizacja peptydów poprzez włączenie ograniczeń konformacyjnych okazała się skuteczną strategią poprawy stabilności i przepuszczalności komórkowej peptydu26. W protokole tym opisano krok po kroku procedurę syntezy cyklicznych CPP z aromatycznymi wiązaniami krzyżowymi oraz oceny ich przepuszczalności przez bariery biologiczne. W porównaniu z hydrofilowymi sieciami laktamowymi lub triazolowymi 22,27, włączenie aromatycznych wiąz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca jest wspierana przez Chińską Fundację Nauk Przyrodniczych (21708031), Chińską Fundację Nauk Podoktoranckich (BX20180264, 2018M643519) oraz Fundusze Badań Podstawowych dla Uniwersytetów Centralnych (2682021ZTPY075).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1,2-etanedithiolAladynK1722093smród
2-(7-azobenzotriazol)-N,N,N',N'-tetrametylofluorofosforan heksafluorofosforanu (HATU)HEOWNSA-0443697
4,4'-bis(bromometylo)bifenylTCIB1921
4T1 komórkiATCCKomórki 4T1 hodowano w pożywce DMEM uzupełnionej 10% FBS (Hyklonem) w 37 & stopniach; C Inkubator nawilżany zawierający 5% CO2.
Acetonitryl Adamas1484971toksyczność
DichlorometanEnergiaW330229skórze szkodliwy
Eter dietylowyAldrich673811łatwopalny
DimetylosulfotlenekBeyotimeST038szkodliwy dla skóry
Dulbecco' s Zmodyfikowane podłoże Eagle (DMEM)Gibco
Elektrospray Jonizacja Spektrometr masowyWodyG2-S Tof
Etylen-diamino-kwas tetraoctowy (EDTA)BioFroxx1340
Płodowa surowica bydlęca (FBS)HyClone
Cytometr przepływowyBeckman CoulterCytoFLEX
Izomer izotiocyjanianu fluoresceiny ( FITC)Mikroskop
Carl ZeissAxio Observer 7
Fmoc-Arg(Pbf)-OHHEOWNSF-81070
Fmoc-Cys(Trt)-OHGL BiochemGLS201115-35202
Fmoc-β Komórki Ala-OHAdamas51341C
HeLaATCCHeLa hodowano w DMEM uzupełnionym 10% FBS (Hyklonem) w 37 & stopniach; C Inkubator nawilżany zawierający 5% CO2.
Wysokosprawna chromatografia cieczowaAgilentAgilent 1260
Kolumna do wysokosprawnej chromatografii cieczowejAgilentPoroshell EC-C18 120, 4,6 & razy; 150 mm (wielkość porów 120 Å, wielkość cząstek 4 μ m)
LiofilizatorSP ScientificVir Tis
MetanolAldrich9758toksyczność
Płytka do mikromiareczkowaniaThermo μ płytka opadowaN12391
MorpholineHEOWNSM99040drażniący
Wielofunkcyjny czytnik mikropłytekThermoVARIOSKAN LUX
N,N-DiizopropyloetyloaminaHEOWNSE-81416drażniący
N,N-dimetyloformamidEnergetycznyB020051szkodliwy dla skóry
Kolumna Poly-PrepBio-Rad7321010kolumny do chromatografii polipropylenowej
Lodowisko Amid Żywica MBHA (0,572 mmol/g)GL BiochemGLS180301-49101
Zawory trójdrogoweBio-Rad7328107
Wkładka do płytek do hodowli tkankowychLABSELECT14211
Kwas trifluorooctowyHEOWNST63278
TriizopropylosilanHEOWNST-0284475
TrypsinBioFroxx1004
Kolektor próżniowyPromegaA7231
fluorescencyjny E0801812500 energii Komórki

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zhang, L., et al. Brain-targeted dual site-selective functionalized poly(β-amino esters) delivery platform for nerve regeneration. Nano Letters. 21 (7), 3007-3015 (2021).
  2. Park, T. E., et al. Enhanced BBB permeability of osmotically active poly(mannitol-co-PEI) modified with rabies virus glycoprotein via selective stimulation of caveolar endocytosis for RNAi therapeutics in Alzheimer's disease. Biomaterials. 38, 61-71 (2015).
  3. Bian, J., et al. Effect of cell-based intercellular delivery of transcription factor GATA4 on ischemic cardiomyopathy. Circulation Research. 100 (11), 1626-1633 (2007).
  4. He, H., et al. The use of low molecular weight protamine chemical chimera to enhance monomeric insulin intestinal absorption. Biomaterials. 34 (31), 7733-7743 (2013).
  5. Kim, D., et al. A specific STAT3-binding peptide exerts antiproliferative effects and antitumor activity by inhibiting STAT3 phosphorylation and signaling. Cancer Research. 74 (8), 2144-2151 (2014).
  6. Yang, Y., et al. PEGylated liposomes with NGR ligand and heat-activable cell-penetrating peptide-doxorubicin conjugate for tumor-specific therapy. Biomaterials. 35 (14), 4368-4381 (2014).
  7. Wei, Y., et al. Intracellular paclitaxel delivery facilitated by a dual-functional CPP with a hydrophobic hairpin tail. ACS Applied Materials and Interfaces. 13 (4), 4853-4860 (2021).
  8. Vasan, N., Baselga, J., Hyman, D. M. A view on drug resistance in cancer. Nature. 575 (7782), 299-309 (2019).
  9. Cong, Y., et al. Microenvironment-induced in situ self-assembly of polymer-peptide conjugates that attack solid tumors deeply. Angewandte Chemie International Edition. 131 (14), 4680-4685 (2019).
  10. Blanco, E., Shen, H., Ferrari, M. Principles of nanoparticle design for overcoming biological barriers to drug delivery. Nature Biotechnology. 33 (9), 941-951 (2015).
  11. Tian, Y., Zhou, S. Advances in cell-penetrating peptides and their functionalization of polymeric nanoplatforms for drug delivery. Wiley Interdisciplinary Reviews. Nanomedicine and Nanobiotechnology. 13 (2), 1-12 (2021).
  12. Milletti, F. Cell-penetrating peptides: Classes, origin, and current landscape. Drug Discovery Today. 17 (15-16), 850-860 (2012).
  13. Turner, J. J., et al. Cell-penetrating peptide conjugates of peptide nucleic acids (PNA) as inhibitors of HIV-1 Tat-dependent trans-activation in cells. Nucleic Acids Research. 33 (21), 6837-6849 (2005).
  14. Tunnemann, G., et al. Live-cell analysis of cell penetration ability and toxicity of oligo-arginines. Journal of Peptide Science. 14 (4), 469-476 (2008).
  15. Shi, M., et al. Stapling of short cell-penetrating peptides for enhanced tumor cell-and-tissue dual-penetration. Chemical Communications. 58 (14), 2299-2302 (2022).
  16. Komin, A., et al. A peptide for transcellular cargo delivery: Structure-function relationship and mechanism of action. Journal of Controlled Release. 324, 633-643 (2020).
  17. Dietrich, L., et al. Cell permeable stapled peptide inhibitor of Wnt signaling that targets β-catenin protein-protein interactions. Cell Chemical Biology. 24 (8), 958-968 (2017).
  18. Tian, Y., et al. Stapling of unprotected helical peptides via photo-induced intramolecular thiol-yne hydrothiolation. Chemical Science. 7 (5), 3325-3330 (2016).
  19. De Araujo, A. D., et al. Comparative α-helicity of cyclic pentapeptides in water. Angewandte Chemie International Edition. 53 (27), 6965-6969 (2014).
  20. Chu, Q., et al. Towards understanding cell penetration by stapled peptides. Medicinal Chemistry Communications. 6 (1), 111-119 (2015).
  21. Bock, J. E., Gavenonis, J., Kritzer, J. A. Getting in shape: Controlling peptide bioactivity and bioavailability using conformational constraints. ACS Chemical Biology. 8 (3), 488-499 (2013).
  22. Tian, Y., et al. Effect of stapling architecture on physiochemical properties and cell permeability of stapled α-helical peptides: A comparative study. ChemBioChem. 18 (21), 2087-2093 (2017).
  23. White, C. J., Yudin, A. K. Contemporary strategies for peptide macrocyclization. Nature Chemistry. 3 (7), 509-524 (2011).
  24. Jain, R. K. Normalization of tumor vasculature: An emerging concept in antiangiogenic therapy. Science. 307 (5706), 58-62 (2005).
  25. Patgiri, A., Menzenski, M. Z., Mahon, A. B., Arora, P. S. Solid-phase synthesis of short α-helices stabilized by the hydrogen bond surrogate approach. Nature Protocols. 5 (11), 1857-1865 (2010).
  26. Baek, S., et al. Structure of the stapled p53 peptide bound to Mdm2. Journal of the American Chemical Society. 134 (1), 103-106 (2012).
  27. Traboulsi, H., et al. Macrocyclic cell penetrating peptides: A study of structure-penetration properties. Bioconjugate Chemistry. 26 (3), 405-411 (2015).
  28. Tian, Y., et al. A proline-derived transannular N-cap for nucleation of short α-helical peptides. Chemical Communications. 52 (59), 9275-9278 (2016).
  29. Muppidi, A., et al. Rational design of proteolytically stable, cell-permeable peptide-based selective Mcl-1 inhibitors. Journal of the American Chemical Society. 134 (36), 14734-14737 (2012).
  30. Wiradharma, N., et al. Synthetic cationic amphiphilic α-helical peptides as antimicrobial agents. Biomaterials. 32 (8), 2204-2212 (2011).
  31. Jones, A. T., Sayers, E. J. Cell entry of cell penetrating peptides: Tales of tails wagging dogs. Journal of Controlled Release. 161 (2), 582-591 (2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Przenikanie przez barier biologiczncyklizacja peptyd wsieciowanie aromatycznestabilno proteolitycznaznakowanie FITCHPLC w fazie odwr conejmikroskopia fluorescencyjnacytometria przep ywowaprzepuszczalno w uk adzie Transwell

Powiązane artykuły