Test ligacji zbliżeniowej umożliwia wykrycie, lokalizację i kwantyfikację metylacji białka argininy w tkance utrwalonej

Podsumowanie

Test ligacji zbliżeniowej jest bardzo przydatną techniką do lokalizacji i ilościowego określenia metylacji argininy danego białka, gdy zmodyfikowana reszta argininy jest nieznana i/lub jeśli nie jest dostępne żadne specyficzne przeciwciało.

Streszczenie

Metylacja argininy staje się kluczową modyfikacją potranslacyjną zaangażowaną w szeroki zakres procesów biologicznych. Jego badanie w tkance jest często ograniczone przez brak swoistego przeciwciała rozpoznającego docelową resztę argininy. Test ligacji zbliżeniowej (PLA) został pierwotnie opracowany do badania interakcji białko/białko. W tym miejscu szczegółowo opisujemy protokół PLA dedykowany do wykrywania metylacji argininy, który zastosowaliśmy do receptora glukokortykoidowego (GR). Po wcześniejszym wykazaniu, że PRMT5 dimetylanuje GR w komórkach, użyliśmy PLA z symetrycznym przeciwciałem dimetylowym i przeciwciałem anty-GR do pomiaru metylacji GR w guzach piersi. Wykazaliśmy, że PLA oferuje unikalne podejście do pomiaru metylacji argininy białka docelowego, nawet jeśli miejsce metylacji nie zostało zidentyfikowane. Technikę tę można rozszerzyć na inne modyfikacje potranslacyjne, w których dostępne są skuteczne przeciwciała PAN. W związku z tym szczegółowo opisujemy technologię PLA używaną do wykrywania metylacji argininy w utrwalonej tkance na przykładzie GR.

Wprowadzenie

Metylacja argininy przez białkowe metylotransferazy argininowe (PRMT) jest obfitą modyfikacją potranslacyjną (PTM) zaangażowaną w liczne procesy biologiczne. PRMT katalizują przenoszenie grup metylowych z S-adenozylometioniny do reszt argininy. Rodzina PRMT składa się z dziewięciu członków sklasyfikowanych ze względu na rodzaj metylacji, którą wykonują. Wszyscy członkowie przeprowadzają monometylację (MMA). PRMT typu 1 (PRMT1, 2, 3, 4, 6 i 8) katalizują asymetryczną dimetylację (ADMA), podczas gdy typ 2 (PRMT5 i 9) katalizuje symetryczną dimetylację (SDMA), a typ 3 (PRMT7) generuje tylko MMA¹. Poprzez metylację wielu substratów, różne PRMT regulują szeroką gamę ważnych procesów komórkowych, takich jak naprawa DNA, regulacja transkrypcji, odpowiedź immunologiczna, przetwarzanie RNA i transdukcja sygnału^2,3. Jest to szczególnie prawdziwe w przypadku sygnalizacji hormonów steroidowych, gdzie PRMT modyfikują aktywność receptorów steroidowych poprzez metylację nie tylko samych receptorów, ale także ich regulatorów lub histonów².

Metylacja argininy jest głównie badana w raku, ponieważ wykazano, że większość PRMT ma nadekspresję w raku w porównaniu z normalnymi tkankami, a ich ekspresja jest często związana ze złym rokowaniem^4,5. Wykrycie metylacji argininy in vivo jest niezbędne do zrozumienia funkcji komórkowych związanych z tą modyfikacją. Konwencjonalnie osiąga się to poprzez przeprowadzenie immunohistochemii (IHC) ze specyficznym przeciwciałem rozpoznającym metylowaną resztę argininy. Metoda ta jest jednak bardzo ograniczona, ponieważ opiera się na identyfikacji zmodyfikowanej reszty argininy i zależy od skuteczności zastosowanego przeciwciała. Test ligacji zbliżeniowej in situ (PLA) został początkowo opracowany do badania interakcji białko/białko w stałych komórkach lub tkankach⁶. Co ciekawe, technologia ta może być również wykorzystywana do wykrywania PTM za pomocą przeciwciała pan przeciwko modyfikacji będącej przedmiotem zainteresowania, a także przeciwciała rozpoznającego docelowe białko. Nasz zespół wcześniej zaadaptował tę technikę do badania metylacji receptora estrogenowego alfa (ERα), używając przeciwciała anty-ERα i przeciwciała specyficznie rozpoznającego miejsce metylacji na argininie 260⁷. Warto zauważyć, że technikę tę można rozszerzyć na przeciwciała rozpoznające specjalny rodzaj metylacji, nawet jeśli metylowana reszta jest nieznana. Rzeczywiście, kilka firm dostarcza przeciwciała pan specyficznie rozpoznające MMA, ADMA lub SDMA, które można z powodzeniem wykorzystać do badania metylacji białek in vivo.

Tutaj, jako dowód słuszności koncepcji, przedstawiamy szczegółową analizę metylacji GR przy użyciu przeciwciała SDMA w ludzkich nowotworach piersi, od projektu eksperymentalnego do analizy danych.

Protokół

Od każdego pacjenta uzyskano pisemną świadomą zgodę. Protokół badania został zatwierdzony przez instytucjonalną komisję etyczną Centrum Badań nad Rakiem w Lyonie.

1. Wybór przeciwciał

1. Stosować przeciwciała pierwszorzędowe zwalidowane za pomocą IHC lub immunofluorescencji (IF).
   UWAGA: Pierwotne przeciwciała wybrane do badania mają kluczowe znaczenie dla powodzenia PLA, a w szczególności w tkance utrwalonej. Użycie przeciwciała zwalidowanego przez IHC lub IF zwiększy wskaźnik powodzenia eksperymentu. Optymalizacja i swoistość przeciwciał są wymagane przed przeprowadzeniem eksperymentów, najlepiej poprzez przeprowadzenie eksperymentów kontrolnych w komórkach unieważnionych w celu ekspresji białka będącego przedmiotem zainteresowania i przy użyciu inhibitora specyficznego dla aktywności enzymatycznej zaangażowanej metylotransferazy. Tutaj warunki zostały wcześniej zoptymalizowane¹⁰.

2. Przygotowanie osadzanych w parafinie osadzanych granulek linii komórkowej

UWAGA: Próbki są umieszczane w żelu, a następnie umieszczane w automatycznym procesorze tkanek w celu odwodnienia próbki i zatopienia parafiny.

1. Przygotować osad komórkowy w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml za pomocą dysocjacji trypsyny.
   UWAGA: Nie skrob w celu zebrania komórek.
2. Zawiesić osad komórkowy w 1,5 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).
3. Odwirować komórki w temperaturze pokojowej (RT) przy 200 x g. Odessać supernatant PBS.
4. Zawiesić osad w 1 ml 4% formaliny i przechowywać probówki w temperaturze 4 °C przez 3 godziny.
5. Umyj komórki w 1X Tris-buforowana sól fizjologiczna (TBS).
   UWAGA: Nie używaj roztworu na bazie fosforanów, ponieważ powoduje on depolimeryzację żelu.
6. Dodaj 1 ml TBS i homogenizuj przez 30 sekund przez wirowanie. Wirować przez 5 minut przy 200 x g i usunąć supernatant.
7. Powtórz kroki od 2.5 do 2.7 dwukrotnie.
8. Przeprowadzić włączenie tkanki do automatycznego procesora tkanek zgodnie z określonym programem:
   Formalina 1 h 37 °C
   Woda destylowana 2 min RT
   EtOH 70% 40 min 45 °C
   EtOH 80% 40 min 45 °C
   EtOH 95% 40 min 45 °C
   EtOH 100% 40 min 45 °C
   EtOH 100% 40 min 45 °C
   EtOH 100% 40 min 45 °C
   Ksylen 40 min 45 °C
   Ksylen 40 min 45 °C
   Ksylen 40 min 45 °C
   Parafina 1 h 60 °C
   Parafina 1 h 60 °C
   Parafina 1 h 30 min 60 °C

3. Utrwalanie tkanek i przygotowanie preparatu

1. Utrwal tkanki w 4% formalinie na 24 godziny przed włączeniem.
2. Wytnij szeregowe odcinki bloków zawierających tkanki o grubości 3 μm za pomocą mikrotomu.
3. Przeprowadzić deparafinowanie za pomocą automatycznego stainera, sekwencyjnie inkubując szkiełka w dwukrotnie ksylenie (10 min), 100% etanolu (5 min), 95% etanolu (5 min) i wodzie (5 min).
4. Przeprowadzić indukowane ciepłem pobieranie epitopów w 10 mM buforze cytrynianowym przy użyciu łaźni wodnej o temperaturze 98 °C przez 40 minut przy odpowiednim pH (zwykle 6-9).
   UWAGA: Oba przeciwciała muszą działać przy tym samym pH, aby metoda była skuteczna. Przeprowadzono kilka testów przed ustaleniem optymalnego pH stosowanego w niniejszym dokumencie. Przeciwciała stosowane w tym badaniu to przeciwciało SDMA i przeciwciało GR.
5. Pozwól szkiełkom ostygnąć przez 20 minut, a następnie umyj je w 1x PBS przez 20 minut.

4. Eksperyment IHC

UWAGA: Eksperymenty IHC są wykonywane przy użyciu instrumentu badawczego Discovery XT (Tabela Materiałów) w celu automatyzacji i odtwarzalności.

1. Aby uniknąć wygaszania peroksydazy, należy użyć inhibitora zawartego w zestawie diaminobenzydyny (DAB).
2. Inkubować szkiełka z dwoma pierwszorzędowymi przeciwciałami rozcieńczonymi w rozcieńczalniku przeciwciał przez 60 minut.
3. Inkubować szkiełka z drugorzędowym przeciwciałem przeciwko króliczej peroksydazie chrzanowej (HRP) przez 16 minut lub przeciwciałem przeciwko myszom przez 30 minut.
   UWAGA: Zaleca się stosowanie dostępnego w handlu zestawu diaminobenzydyny (DAB) (Tabela materiałów) do wykrywania IHC.
4. Nanieść hematoksynę (100 μl/szkiełko przez 8 min) i niebieszczenie (100 μl/szkiełko przez 4 min) do próbek w celu zabarwienia jąder.
5. Umyj szkiełka w ciepłej wodzie z mydłem, a następnie odwodnij za pomocą automatycznego barwnika i zamontuj na automatycznym szkielecie nakrywkowym za pomocą medium montażowego.

5. Reakcje na próbę ligacji zbliżeniowej

UWAGA: Wszystkie użyte odczynniki są zawarte w zestawach PLA (Tabela Materiałów). Zaleca się użycie 40 μl odczynnika na 1^cm2 tkanki. Wszystkie inkubacje muszą być wykonywane w wilgotnym środowisku, aby zapobiec nadmiernemu parowaniu. Nie pozwól, aby próbka wyschła, ponieważ może to prowadzić do szumów tła. Zaleca się stosowanie 1x buforu A (bufor do płukania in situ, tabela materiałów) do mycia w słoikach. Podczas inkubacji próbek pod mieszaniem w słoikach powinna znajdować się minimalna objętość 70 ml. Próbki należy przechowywać w temperaturze pokojowej przed użyciem.

1. Hartowanie peroksydazą
   1. Za pomocą pisaka hydrofobowego należy wyznaczyć obszar reakcji, aby zapobiec nadmiernemu parowaniu roztworu podczas eksperymentu. Dodać jedną kroplę roztworu nadtlenku wodoru na 1^cm2 każdej próbki. Inkubować przez 5 minut w temperaturze RT.
      UWAGA: Zaleca się optymalizację czasu inkubacji w zależności od użytych próbek/przeciwciał.
2. Blokowanie
   1. Delikatnie wlać bufor A na próbki i przemyć w buforze A przy 50 obr./min pod mieszaniem przez 5 minut w temperaturze suchej masy.
   2. Strząśnij pozostały bufor A i dodaj jedną kroplę na 1^cm2 roztworu blokującego (dołączonego do zestawu PLA). Inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
3. Inkubacja przeciwciał pierwotnych
   1. Rozcieńczyć dwa pierwszorzędowe przeciwciała w odpowiednich stężeniach w rozcieńczalniku przeciwciał.
   2. Usuń roztwór blokujący ze szkiełek i natychmiast dodaj roztwór przeciwciała pierwotnego (zawarty w zestawie PLA). Inkubować przez 1 godzinę w komorze wilgotnościowej w temperaturze 37 °C.
4. Inkubacja sondy PLA
   1. Rozcieńczyć sondę PLA PLUS (1:5) sondą PLA minus (1:5) w rozcieńczalniku przeciwciał.
      UWAGA: Zaleca się użycie 8 μl sondy PLA minus zapas (5x), 8 μl sondy PLA plus zapas (5x) i 24 μl rozcieńczalnika przeciwciał do reakcji 40 μL.
   2. Delikatnie wlać bufor A na próbki i przemyć w buforze A z prędkością 50 obr./min przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
   3. Strząśnij pozostały bufor A i nałóż roztwór sondy PLA (dołączony do zestawu PLA) na próbki. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
5. Ligacji
   1. Rozmrozić bufor ligacyjny (zawarty w zestawie PLA) przed wykonaniem kolejnych kroków.
   2. Delikatnie wlać bufor A na próbki i przemyć w buforze A z prędkością 50 obr./min przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
   3. Rozcieńczyć 5-krotny bufor ligacyjny (1:5) (zawarty w zestawie PLA) w wodzie o wysokiej czystości. Dodaj ligazę (1:40) (dołączoną do zestawu PLA) bezpośrednio przed dodaniem jej do próbki.
      UWAGA: Zaleca się dodanie 8 μl buforu 5x ligacji do 31 μl wody o wysokiej czystości w celu uzyskania reakcji 40 μl. Następnie dodaj 1 μl ligazy.
   4. Stuknąć pozostały bufor A i nanieść roztwór ligazy na próbki. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
6. wzmocnienie
   1. Rozmrozić bufor wzmacniający przed wykonaniem poniższych kroków.
   2. Delikatnie wlać bufor A na próbki i przemyć je w buforze A z prędkością 50 obr./min przez 2 minuty w temperaturze pokojowej.
   3. Rozcieńczyć 5-krotny bufor wzmacniający (1:5) (zawarty w zestawie PLA) w wodzie o wysokiej czystości. Dodaj polimerazę (1:80) (dołączoną do zestawu PLA) bezpośrednio przed delikatnym nalaniem jej na próbkę.
      UWAGA: Zaleca się dodanie 8 μl 5x buforu ligacyjnego do 31,5 μl wody o wysokiej czystości w celu uzyskania reakcji 40 μl. Następnie dodaj 0,5 μl ligazy.
   4. Stuknąć pozostały bufor A i nanieść roztwór amplifikacyjny na próbki. Inkubować przez 2 godziny w temperaturze 37 °C.
7. wykrywanie
   1. Delikatnie wlać bufor A na próbki i przemyć je w buforze A z prędkością 50 obr./min przez 2 minuty w temperaturze pokojowej.
   2. Rozcieńczyć 5-krotny bufor detekcji jasnego pola (1:5) (zawarty w zestawie PLA) w wodzie o wysokiej czystości.
      UWAGA: Zaleca się dodanie 8 μl buforu detekcyjnego 5x do 32 μl wody o wysokiej czystości w celu uzyskania reakcji 40 μl.
   3. Sklepać pozostały bufor A i nanieść roztwór detekcyjne na próbki. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
8. Opracowanie podłoża
   1. Delikatnie wlać bufor A na próbki i przemyć je w buforze A z prędkością 50 obr./min przez 2 minuty w temperaturze pokojowej.
   2. Rozcieńczyć roztwór substratu, rozcieńczając odczynniki substratowe A (1:70), B (1:100), C (1:100) i D (1:50) (zawarte w zestawie PLA) w wodzie o wysokiej czystości.
      UWAGA: Zaleca się dodanie 0,6 μl substratu A, 0,4 μl substratu B, 0,4 μl substratu C i 0,8 μl substratu D w 37,8 μl wody o wysokiej czystości w celu uzyskania reakcji 40 μl.
   3. Stuknąć pozostały bufor A i nanieść roztwór amplifikacyjny na próbki. Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
9. Barwienie jądrowe
   1. Delikatnie wlać wodę destylowaną na próbki i myć w wodzie destylowanej z prędkością 50 obr./min przez 2 minuty w temperaturze pokojowej.
   2. Strząśnij pozostałą wodę destylowaną. Dodać jedną kroplę barwnika jądrowego (dołączonego do zestawu PLA) do każdej próbki o wielkości^{1 cm2} i inkubować przez 2 minuty w temperaturze pokojowej.
   3. Opłucz szkiełka pod bieżącą wodą z kranu przez 10 minut, aby plama dojrzała i uzyskała niebieskie zabarwienie. Nie używaj stojącej wody z kranu.
10. odwodnienie
    1. Inkubować szkiełka w roztworze zawierającym 96% etanolu dwa razy przez 2 minuty. Następnie inkubować szkiełka w roztworze zawierającym 99,7% etanolu dwukrotnie przez 2 minuty.
    2. Inkubować szkiełka w ksylenie przez 10 minut. Następnie przenieś szkiełka do świeżego ksylenu.
11. Montaż zjeżdżalni
    1. Użyć minimalnej objętości niewodnego podłoża montażowego i nałożyć szkiełko nakrywkowe na próbkę próbki, upewniając się, że pęcherzyki powietrza nie dostaną się pod szkiełka nakrywkowe.
    2. Pozostaw szkiełka do wyschnięcia przed analizą pod mikroskopem jasnego pola.

6. Obrazowanie do lokalizacji

1. Rejestruj obrazy za pomocą mikroskopu pionowego.
   UWAGA: W tym badaniu obrazowanie szkiełek przeprowadzono pod pionowym mikroskopem jasnego pola (Tabela materiałów). Obrazy zostały uzyskane w identycznych warunkach przy 40-krotnym powiększeniu dla co najmniej 10 losowo wybranych pól widzenia w sposób zautomatyzowany. Zaleca się analizę co najmniej 500 komórek na warunek.

7. Analiza do kwantyfikacji

UWAGA: Kwantyfikacja próbek została przeprowadzona za pomocą oprogramowania ImageJ⁸. FIJI, dystrybucja ImageJ zawierająca ImageJ i inne preinstalowane wtyczki, została wykorzystana do kolejnych analiz^9,10.

1. Aby określić liczbę kropek:
   1. Otwórz obraz.
   2. Wykonaj dekonwolucję kolorów. W tym celu kliknij Obraz > Kolory > Dekonwolucja kolorów.
   3. Wybierz obraz: - (color_1) w nazwie pliku.
   4. Użyj polecenia Znajdź maksima, aby określić liczbę kropek (Process > Find Maxima).
2. Aby określić liczbę komórek:
   1. Otwórz obraz.
   2. Wykonaj dekonwolucję kolorów. W tym celu kliknij Obraz > Kolory > Dekonwolucja kolorów.
   3. Wybierz obraz: - (color_1) w nazwie pliku.
   4. Znajdź próg, który pokazuje maksymalną liczbę jąder. W tym celu kliknij Obraz > Jasność/Kontrast > Próg.
   5. Wypełnij otwory, klikając Process > Binary > Fill Holes.
   6. Użyj polecenia zlewiska, aby podzielić połączone komponenty na oddzielne. Kliknij Process > binary > Watershed.
   7. Analizuj cząstki, aby określić liczbę jąder, klikając Analizuj > Analizuj cząstki.

Wyniki

Korzystając z procedury opisanej powyżej, możliwe jest wykrycie i ilościowe określenie metylacji interesującego białka. Tutaj pokazujemy przykład metylacji GR przez PRMT5. Przeciwciała i warunki eksperymentalne dla PLA zostały wcześniej zastosowane do komórek¹⁰. Krótko mówiąc, pierwszorzędowe przeciwciała skierowane przeciwko GR i SDMA są rozpoznawane przez sondy zbliżeniowe sprzężone z komplementarnymi oligonukleotydami. Następnie hybrydyzacja kolistej sondy DNA zachodzi, gdy białka znajdują się ...

Dyskusja

Metylacja argininy, podobnie jak inne PTM, przyczynia się do precyzyjnej regulacji funkcji białek. Jego wpływ jest jednak niedoceniany ze względu na trudności w ocenie tych modyfikacji, przede wszystkim ze względu na brak narzędzi. Jest to szczególnie prawdziwe podczas badania metylacji in vivo, gdzie jedynym sposobem pomiaru metylacji argininy jest posiadanie specyficznych przeciwciał rozpoznających metylowaną resztę białka będącego przedmiotem zainteresowania. Stanowi to wyraźne ograniczenie, ponieważ metylowa...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Prowadnice adhezyjne TOMO 90°, x100	VWR	631-1239
przeciwciało anty-GR (mysz)	Przeciwciało anty-GR Santa Cruz	sc393232
mysz)	santa cruz	sc393232
przeciwciało anty-PRMT5 (królik)	Przeciwciało anty-SDMA Merck	07-405
(królik)	CST	13222
Automate d'włączenie	Leica	ASP 6025	Infiltracja parafiny i przygotowanie bloków
Autostainer XL	Kasety z autostainerem	Leica	ST5010
path macrostar III  x1500	VWR	720-2233
CC1		5279801001
Bufor cytrynianowy pH 6 10x, 100 mL	MMF	F/T0050
Rozcieńczalnik przeciwciał Dako	Rozcieńczalnik przeciwciał	Dako Agilent	S202230-2
Zestaw Discovery ChromoMap Diaminobenzydyna (DAB)	Roche	760-159	Zestaw Diaminobenzydyny (DAB)
Discovery Wash	Roche	7311079001
Duolink insitu  Sonda PLA anty-mysz minus	Sigma-Aldrich	DUO92004	zestaw PLA  (sonda anty-królik minus)
Odczynniki do wykrywania Duolink insitu brightfield	Sigma-Aldrich	DUO92012	PLA  zestaw (odczynniki do wykrywania in situ)
Sonda Duolink insitu PLA anty-królik plus	Sigma-Aldrich	DUO92002	zestaw PLA  (sonda anty-królik plus)
Bufor do płukania Duolink insitu brightfield	Sigma-Aldrich	DUO82047	PLA  zestaw (bufor do płukania in situ)
Etanol 96% VOL TECHNISOLV, 5 L	VWR	83804.360
Etanol absolutny ≥ 99,8%, AnalaR NORMAPUR ACS,  5 L	VWR	20821.365
EZ Prep 10x	Roche	5279771001
Formol, gotowy do użycia, 5 L	MMF	F/40877-36	Formalin
W pełni zautomatyzowane szkiełko nakrywkowe Automatyczne szkiełko nakrywkowe	Leica	CV5030
Szkiełka nakrywkowe szklane 24 x 40	Dutscher	100037
Hematoxylin	Ventana	760-2021
Przyrząd IHC	Roche	DISCOVERY XT	Automatyzacja IHC
LCS	Roche	5264839001
Microtome	Thermo Scientific	Microm HM340E	Cięcie tkanek, w tym w blokach
Podłoże montażowe Pertex	Histolab	00801-FR
PAP Długopis do barwienia immunologicznego	Sigma-Aldrich	Z672548-1EA
Wosk parafinowy tek III, 4 x 2, 5 kg	Sakura	4511
Pipety jednorazowe Pasteura	Fisher Scientific	12583237
PBS Bufor 10x, 100 mL	MMF	F/T0020
Bufor reakcyjny 10x	Roche	5353955001
Ribo Wash 10x	Roche	5266262001
RiboCC1	Roche
Przeciwciało drugorzędowe przeciwko myszy	Abcam	ab133469
Przeciwciało drugorzędowe OmniMap anty-królicze HRP Roche		760-4311
Centrum zatapiania tkanek	MMF	EC 350
Ksylen (mieszanina izomerów) ≥ 98,5%, AnalaR NORMAPUR ACS, 5 L	Mikroskop pionowy pionowy VWR	28975.360
Zeiss Axio Imager M2			pionowy mikroskop jasnego pola