Method Article

Test ligacji zbliżeniowej umożliwia wykrycie, lokalizację i kwantyfikację metylacji białka argininy w tkance utrwalonej

DOI:

10.3791/64294

⸱

July 20th, 2022

 ,  ,  ,  , 
1Université de Lyon, 2Inserm U1052, Centre de Recherche en Cancérologie de Lyon, 3CNRS UMR5286, Centre de Recherche en Cancérologie de Lyon, 4Pathology Department, Centre Leon Bérard, 5Plateforme Anatomopathologie Recherche

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Test ligacji zbliżeniowej jest bardzo przydatną techniką do lokalizacji i ilościowego określenia metylacji argininy danego białka, gdy zmodyfikowana reszta argininy jest nieznana i/lub jeśli nie jest dostępne żadne specyficzne przeciwciało.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metylacja argininy staje się kluczową modyfikacją potranslacyjną zaangażowaną w szeroki zakres procesów biologicznych. Jego badanie w tkance jest często ograniczone przez brak swoistego przeciwciała rozpoznającego docelową resztę argininy. Test ligacji zbliżeniowej (PLA) został pierwotnie opracowany do badania interakcji białko/białko. W tym miejscu szczegółowo opisujemy protokół PLA dedykowany do wykrywania metylacji argininy, który zastosowaliśmy do receptora glukokortykoidowego (GR). Po wcześniejszym wykazaniu, że PRMT5 dimetylanuje GR w komórkach, użyliśmy PLA z symetrycznym przeciwciałem dimetylowym i przeciwciałem anty-GR do pomiaru metylacji GR w guzach piersi. Wykazaliśmy, że PLA oferuje unikalne podejście do pomiaru metylacji argininy białka docelowego, nawet jeśli miejsce metylacji nie zostało zidentyfikowane. Technikę tę można rozszerzyć na inne modyfikacje potranslacyjne, w których dostępne są skuteczne przeciwciała PAN. W związku z tym szczegółowo opisujemy technologię PLA używaną do wykrywania metylacji argininy w utrwalonej tkance na przykładzie GR.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metylacja argininy przez białkowe metylotransferazy argininowe (PRMT) jest obfitą modyfikacją potranslacyjną (PTM) zaangażowaną w liczne procesy biologiczne. PRMT katalizują przenoszenie grup metylowych z S-adenozylometioniny do reszt argininy. Rodzina PRMT składa się z dziewięciu członków sklasyfikowanych ze względu na rodzaj metylacji, którą wykonują. Wszyscy członkowie przeprowadzają monometylację (MMA). PRMT typu 1 (PRMT1, 2, 3, 4, 6 i 8) katalizują asymetryczną dimetylację (ADMA), podczas gdy typ 2 (PRMT5 i 9) katalizuje symetryczną dimetylację (SDMA), a typ 3 (PRMT7) generuje tylko MMA1. Poprzez metylację wielu substratów, różne PRMT regu....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Od każdego pacjenta uzyskano pisemną świadomą zgodę. Protokół badania został zatwierdzony przez instytucjonalną komisję etyczną Centrum Badań nad Rakiem w Lyonie.

1. Wybór przeciwciał

  1. Stosować przeciwciała pierwszorzędowe zwalidowane za pomocą IHC lub immunofluorescencji (IF).
    UWAGA: Pierwotne przeciwciała wybrane do badania mają kluczowe znaczenie dla powodzenia PLA, a w szczególności w tkance utrwalonej. Użycie przeciwciała zwalidowanego przez IHC lub IF zwiększy wskaźnik powodzenia eksperymentu. Optymalizacja i swoistość przeciwciał są wymagane przed przeprowadzeniem eksperymentów, najlepiej poprzez pr....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Korzystając z procedury opisanej powyżej, możliwe jest wykrycie i ilościowe określenie metylacji interesującego białka. Tutaj pokazujemy przykład metylacji GR przez PRMT5. Przeciwciała i warunki eksperymentalne dla PLA zostały wcześniej zastosowane do komórek10. Krótko mówiąc, pierwszorzędowe przeciwciała skierowane przeciwko GR i SDMA są rozpoznawane przez sondy zbliżeniowe sprzężone z komplementarnymi oligonukleotydami. Następnie hybrydyzacja kolistej sondy DNA zachodzi, gdy białka znajdują się .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metylacja argininy, podobnie jak inne PTM, przyczynia się do precyzyjnej regulacji funkcji białek. Jego wpływ jest jednak niedoceniany ze względu na trudności w ocenie tych modyfikacji, przede wszystkim ze względu na brak narzędzi. Jest to szczególnie prawdziwe podczas badania metylacji in vivo, gdzie jedynym sposobem pomiaru metylacji argininy jest posiadanie specyficznych przeciwciał rozpoznających metylowaną resztę białka będącego przedmiotem zainteresowania. Stanowi to wyraźne ograniczenie, ponieważ metylowa.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie pozostają w konflikcie interesów

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chcielibyśmy podziękować B. Manshipowi za korektę manuskryptu. Dziękujemy Laurze Francols, Clémentine Le Nevé, Research Patology Platform (CRCL) za pomoc techniczną. Rysunek 1 został stworzony przy użyciu Servier Medical Art. Badanie to było wspierane przez Ligue Inter-régionale contre le Cancer and the Association: 'Le Cancer du sein, parlons-en.'

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Prowadnice adhezyjne TOMO 90°, x100VWR631-1239
przeciwciało anty-GR (mysz)Przeciwciało anty-GR Santa Cruzsc393232
mysz)santa cruzsc393232
przeciwciało anty-PRMT5 (królik)Przeciwciało anty-SDMA Merck07-405
(królik)CST13222
Automate d'włączenieLeicaASP 6025Infiltracja parafiny i przygotowanie bloków
Autostainer XLKasety z autostaineremLeicaST5010
path macrostar III  x1500VWR720-2233
CC15279801001
Bufor cytrynianowy pH 6 10x, 100 mLMMFF/T0050
Rozcieńczalnik przeciwciał DakoRozcieńczalnik przeciwciałDako AgilentS202230-2
Zestaw Discovery ChromoMap Diaminobenzydyna (DAB)Roche760-159Zestaw Diaminobenzydyny (DAB)
Discovery WashRoche7311079001
Duolink insitu  Sonda PLA anty-mysz minusSigma-AldrichDUO92004zestaw PLA  (sonda anty-królik minus)
Odczynniki do wykrywania Duolink insitu brightfieldSigma-AldrichDUO92012PLA  zestaw (odczynniki do wykrywania in situ)
Sonda Duolink insitu PLA anty-królik plusSigma-AldrichDUO92002zestaw PLA  (sonda anty-królik plus)
Bufor do płukania Duolink insitu brightfieldSigma-AldrichDUO82047PLA  zestaw (bufor do płukania in situ)
Etanol 96% VOL TECHNISOLV, 5 LVWR83804.360
Etanol absolutny ≥ 99,8%, AnalaR NORMAPUR ACS,  5 LVWR20821.365
EZ Prep 10xRoche5279771001
Formol, gotowy do użycia, 5 LMMFF/40877-36Formalin
W pełni zautomatyzowane szkiełko nakrywkowe Automatyczne szkiełko nakrywkoweLeicaCV5030
Szkiełka nakrywkowe szklane 24 x 40Dutscher100037
HematoxylinVentana760-2021
Przyrząd IHCRocheDISCOVERY XTAutomatyzacja IHC
LCSRoche5264839001
MicrotomeThermo ScientificMicrom HM340ECięcie tkanek, w tym w blokach
Podłoże montażowe PertexHistolab00801-FR
PAP Długopis do barwienia immunologicznegoSigma-AldrichZ672548-1EA
Wosk parafinowy tek III, 4 x 2, 5 kgSakura4511
Pipety jednorazowe PasteuraFisher Scientific12583237
PBS Bufor 10x, 100 mLMMFF/T0020
Bufor reakcyjny 10xRoche5353955001
Ribo Wash 10xRoche5266262001
RiboCC1Roche
Przeciwciało drugorzędowe przeciwko myszyAbcamab133469
Przeciwciało drugorzędowe OmniMap anty-królicze HRP Roche760-4311
Centrum zatapiania tkanekMMFEC 350
Ksylen (mieszanina izomerów) ≥ 98,5%, AnalaR NORMAPUR ACS, 5 LMikroskop pionowy pionowy VWR28975.360
Zeiss Axio Imager M2pionowy mikroskop jasnego pola
( Q Roche 5266297001

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Blanc, R. S., Richard, S. Arginine methylation: The coming of age. Molecular Cell. 65 (1), 8-24 (2017).
  2. Malbeteau, L., et al. How protein methylation regulates steroid receptor function. Endocrine Reviews. 43 (1), 160-197 (2021).
  3. Guccione, E., Richard, S.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Proximity Ligation AssayArginine MethylationProtein MethylationFixed TissuePost Translational ModificationGlucocorticoid ReceptorPRMT5 DimethylationPan Dimethyl AntibodyProtein LocalizationProtein Quantification
Video Coming Soon

Related Articles