Artykuł metodologiczny

Przygotowanie, charakterystyka, toksyczność i skuteczność oceny samoorganizującej się szczepionki przeciwnowotworowej z nanoemulsją do nosa in vitro i in vivo

DOI:

10.3791/64299

⸱

28 września 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1National Engineering Research Centre of Immunological Products, Department of Microbiology and Biochemical Pharmacy, College of Pharmacy, Third Military Medical University of Chinese PLA

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy szczegółowe metody przygotowania i oceny nosowej samoorganizującej się szczepionki przeciwnowotworowej z nanoemulsji in vitro i in vivo.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Peptydy epitopowe przyciągnęły szerokie zainteresowanie w dziedzinie szczepionek przeciwnowotworowych ze względu na ich bezpieczeństwo, wysoką specyficzność i wygodną produkcję; w szczególności, niektóre epitopy z ograniczeniami MHC I mogą indukować skuteczną aktywność cytotoksycznych limfocytów T w celu usunięcia komórek nowotworowych. Ponadto podawanie donosowe jest skuteczną i bezpieczną techniką podawania szczepionek przeciwnowotworowych ze względu na wygodę i lepsze przestrzeganie zaleceń przez pacjenta. Jednak peptydy epitopowe nie nadają się do podawania do nosa ze względu na ich słabą immunogenność i brak skuteczności dostarczania. Nanoemulsje (NE) to stabilne termodynamicznie systemy, które mogą być ładowane antygenami i dostarczane bezpośrednio na powierzchnię błony śluzowej nosa. Ile-Lys-Val-Ala-Val (IKVAV) jest rdzeniem pentapeptydu lamininy, peptydu wiążącego integrynę, ulegającego ekspresji przez ludzkie komórki nabłonka oddechowego. W tym badaniu donosową samoorganizującą się szczepionkę przeciwnowotworową z peptydem epitopowym NE zawierającą syntetyczny peptyd IKVAV-OVA257-264 (I-OVA) przygotowano metodą emulgacji o niskiej energii. Połączenie IKVAV i OVA257-264 może zwiększyć wychwyt antygenu przez komórki nabłonka błony śluzowej nosa. W tym miejscu ustalamy protokół do badania charakterystyki fizykochemicznej za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM), mikroskopii sił atomowych (AFM) i dynamicznego rozpraszania światła (DLS); stabilność w obecności białka mucyny; toksyczność poprzez badanie żywotności komórek BEAS-2B oraz tkanek nosa i płuc myszy C57BL/6; wychwyt komórkowy za pomocą konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej (CLSM); profile uwalniania poprzez obrazowanie małych zwierząt in vivo; oraz ochronne i terapeutyczne działanie szczepionki przy użyciu modelu nowotworu E.G7. Przewidujemy, że protokół dostarczy technicznych i teoretycznych wskazówek dla przyszłego rozwoju nowych szczepionek peptydowych z epitopami komórek T.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jako jedna z najważniejszych innowacji w dziedzinie zdrowia publicznego, szczepionki odgrywają kluczową rolę w walce z globalnym obciążeniem chorobami ludzkimi1. Na przykład obecnie testowanych jest ponad 120 potencjalnych szczepionek przeciwko chorobom COVID-19, z których część została zatwierdzona w wielu krajach2. Ostatnie doniesienia stwierdzają, że szczepionki przeciwnowotworowe skutecznie poprawiły postęp klinicznych terapii przeciwnowotworowych, ponieważ kierują układ odpornościowy pacjentów z rakiem do rozpoznawania antygenów jako obcych dla organizmu3. Co więcej, wiele epitopów limfocytów T zlokalizowanych wewnątrz lub na zewnątrz komórek nowotworowych można wykorzystać do projektowania szczepionek peptydowych, które wykazały zalety w leczeniu nowotworów z przerzutami ze względu na brak znaczącej toksyczności związanej z radioterapią i chemioterapią4,5. Od połowy lat dziewięćdziesiątych XX wieku badania przedkliniczne i kliniczne dotyczące leczenia nowotworów są prowadzone głównie przy użyciu szczepionek z peptydami antygenowymi, ale niewiele szczepionek wykazuje odpowiedni efekt terapeutyczny u pacjentów z rakiem6. Ponadto szczepionki przeciwnowotworowe z epitopami peptydowymi mają słabą immunogenność i niewystarczającą skuteczność dostarczania, co może być spowodowane szybką degradacją peptydów zewnątrzkomórkowych, które szybko dyfundują z miejsca podania, co prowadzi do niewystarczającego wychwytu antygenu przez komórki odpornościowe7. W związku z tym konieczne jest pokonanie tych przeszkód za pomocą technologii dostarczania szczepionek.

OVA257-264, epitop 257-264 wiążący MHC klasy I, wyrażony jako białko fuzyjne, jest często używanym modelowym epitopem8. Ponadto OVA257-264 ma kluczowe znaczenie dla adaptacyjnej odpowiedzi immunologicznej przeciwko nowotworom, która zależy od odpowiedzi cytotoksycznych limfocytów T (CTL). Pośredniczą w nim specyficzne dla antygenu limfocyty T CD8 + w guzie, które są indukowane przez peptyd OVA257-264. Charakteryzuje się niewystarczającą ilością granzymu B, który jest uwalniany przez cytotoksyczne limfocyty T, co prowadzi do apoptozy komórek docelowych8. Jednak podawanie wolnego peptydu OVA257-264 może indukować niewielką aktywność CTL, ponieważ wychwyt tych antygenów zachodzi w komórkach niespecyficznych, a nie w komórkach prezentujących antygen (APC). Brak odpowiedniej stymulacji immunologicznej powoduje aktywność CTL5. W związku z tym indukcja skutecznej aktywności CTL wymaga znacznego postępu.

Dzięki barierze dostarczanej przez komórki nabłonkowe i ciągłemu wydzielaniu śluzu, antygeny szczepionkowe są szybko usuwane ze śluzu nosa9,10. Opracowanie skutecznego wektora szczepionkowego, który może przenikać przez tkankę błony śluzowej, ma kluczowe znaczenie, ponieważ komórki prezentujące antygen znajdują się pod nabłonkiem błony śluzowej9. Donosowe wstrzyknięcie szczepionek teoretycznie indukuje odporność błony śluzowej w celu zwalczania infekcji błony śluzowej11. Ponadto podawanie donosowe jest skuteczną i bezpieczną metodą podawania szczepionek ze względu na wygodę, unikanie podawania jelitowego i lepszą zgodność pacjenta7. Dlatego podawanie przez nos jest dobrym sposobem podawania nowej nanoszczepionki z epitopem peptydowym.

Kilka syntetycznych biomateriałów zostało opracowanych w celu połączenia epitopów interakcji komórka-tkanka i komórka-komórka. Niektóre białka bioaktywne, takie jak Ile-Lys-Val-Ala-Val (IKVAV), zostały wprowadzone jako część struktury hydrożelu w celu nadania bioaktywności12. Peptyd ten prawdopodobnie przyczynia się do przyłączania, migracji i wzrostu komórek13 i wiąże integryny α3β1 i α6β1 w celu interakcji z różnymi typami komórek rakowych. IKVAV jest peptydem adhezyjnym pochodzącym z białka błony podstawnej lamininy α łańcuchu1, który pierwotnie był używany do modelowania mikrośrodowiska neuronalnego i powodowania różnicowania neuronów14. Dlatego znalezienie skutecznego nośnika dla tej nowej szczepionki jest ważne dla kontroli choroby.

Ostatnio zgłoszone systemy emulsji, takie jak W805EC i MF59, zostały również opracowane do dostarczania do jamy nosowej inaktywowanej szczepionki przeciw grypie lub rekombinowanego antygenu powierzchniowego wirusa zapalenia wątroby typu B i zilustrowane w celu wywołania zarówno odporności śluzówkowej, jak i ogólnoustrojowej15. Nanoemulsje (NE) mają zalety łatwego podawania i wygodnego współtworzenia ze skutecznymi adiuwantami w porównaniu z systemami dostarczania cząstek stałych do błony śluzowej16. Doniesiono, że szczepionki nanoemulsyjne zmieniają fenotyp alergiczny w sposób trwały, inny niż tradycyjne odczulanie, co powoduje długotrwałe efekty tłumiące17. Inni stwierdzili, że nanoemulsje w połączeniu z antygenami immunodominującymi specyficznymi dla Mtb mogą indukować silne odpowiedzi komórek błony śluzowej i zapewniać znaczną ochronę18. W związku z tym zaprojektowano nową, donosową, samoorganizującą się nanoszczepionkę z syntetycznym peptydem IKVAV-OVA257-264 (I-OVA, peptyd składający się z IKVAV związanego z OVA257-264). Ważne jest, aby systematycznie oceniać tę nową nanoszczepionkę.

Celem tego protokołu jest systematyczna ocena cech fizykochemicznych, toksyczności i stabilności nanoszczepionki, wykrycie, czy absorpcja antygenu oraz efekty ochronne i terapeutyczne są wzmocnione za pomocą środków technicznych, oraz opracowanie głównych treści eksperymentalnych. W tym badaniu ustaliliśmy szereg protokołów do badania właściwości fizykochemicznych i stabilności, określenia wielkości toksyczności I-OVA NE dla komórek BEAS-2B przez CCK-8 i obserwacji zdolności komórek BEAS-2B do prezentacji antygenu wobec szczepionki za pomocą mikroskopii konfokalnej, oceny profili uwalniania tej nowej nanoszczepionki in vivo i in vitroi wykryć ochronne i terapeutyczne działanie tej szczepionki za pomocą mysiego modelu E.G7-OVA zawierającego nowotwór.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z Laboratory Animal - Guideline for ethical review of animal welfare (GB/T 35892-2018) i zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Dobrostanu i Etyki Zwierząt Laboratoryjnych Trzeciego Wojskowego Uniwersytetu Medycznego. Myszy zostały poddane eutanazji poprzez dootrzewnowe wstrzyknięcie 100 mg/kg 1% pentobarbitalu sodu.

1. Przygotowanie I-OVA NE

  1. Wymieszaj 1 mg monofosforylowego lipidu A (MPLA) ze 100 μl DMSO, wiruj przez 5 minut i odstaw na 4 godziny w temperaturze pokojowej (RT) do całkowitego rozpuszczenia.
  2. Dodaj ilościowo Tween 80 i I-OVA i wymieszaj.
    UWAGA: Tween 80 i I-OVA zostały zmieszane w stosunku mas 25:119.
  3. Dodać skwalen do mieszaniny przygotowanej w kroku 1.2 (7:3, Smix: skwalen).
  4. Dodać 100 μl roztworu MPLA (10 mg/ml) do mieszaniny przygotowanej w kroku 1.3.
  5. Przygotować szczepionkę nanoemulsyjną przy użyciu niskoenergetycznych metod emulgowania19: dodać zmieszany roztwór do kropelek wody w ilości około 70% całkowitej objętości i delikatnie wymieszać, aby uzyskać przezroczystą i łatwo płynącą mieszaninę.
    UWAGA: Kontrolę BNE (ślepą emulsję) przygotowano tą samą metodą, zastępując wodę I-OVA.

2. Charakterystyka fizykochemiczna i stabilność

UWAGA: Oceń rozkład wielkości kropel, potencjał zeta i inne dane fizykochemiczne szczepionki I-OVA NE wykonując kroki 2.1-2.3; przeprowadź charakterystykę morfologiczną szczepionki I-OVA NE zgodnie z krokami 2.4-2.7; i zbadaj strukturę 3D szczepionki I-OVA NE wykonując kroki 2.8-2.9.

  1. Zmieszaj 50 mg białka mucyny ze 100 ml wody do wstrzykiwań, aby przygotować 0,05% roztwór mucyny.
  2. Rozcieńczyć 4 mg/ml I-ova ne 200-krotnie 0,05 mg/ml białka mucyny lub wodą dejonizowaną.
  3. Obserwuj wielkości cząstek, potencjał zeta, wskaźnik polidyspersyjności (PDI) i ruchliwość elektroforetyczną w temperaturze 25 °C za pomocą nanoanalizatora19.
  4. Rozcieńczyć 10 μl I-OVA NE 200-krotnie w 2 ml wody dejonizowanej.
  5. Umieścić 5 μl wstępnie rozcieńczonej szczepionki I-OVA NE (krok 2.4) na siatce miedzianej pokrytej węglem i przykryć ją 10 μl 1% kwasu fosfowolframowego na 3 minuty.
  6. Usunąć nadmiar kwasu fosfowolframowego za pomocą bibuły filtracyjnej.
  7. Uzyskiwanie obrazów za pomocą narzędzia TEM. Umieścić 10 μl próbki rozcieńczonej 50 razy na siatce z miedzi węglowej o oczkach 100 i pozostawić ją w temperaturze pokojowej (RT) na 5 minut przed dodaniem 10 μl kwasu fosfowolframowego (1%, pH 7,4). Zbadać wszystkie próbki za pomocą TEM pod napięciem 120 kV.
  8. Scharakteryzuj morfologię molekularną I-OVA NE za pomocą mikroskopu sił atomowych o wysokiej rozdzielczości. Uzyskać kolorowe obrazy I-OVA NE w następujących warunkach: dla sond wolframowych (stała siła: 0,06 N·m-1); zakres skanowania: 450 nm x 450 nm; Tryb stukania: tryb obrazowania; oraz metoda skanowania: skanowanie punkt po punkcie w RT.

3. Testy toksyczności in vitro i in vivo

UWAGA: Toksyczność in vitro szczepionki I-OVA NE została oceniona zgodnie z krokami 3.1-3.9, a toksyczność in vivo szczepionki I-OVA NE została oceniona zgodnie z krokami 3.10-3.13.

  1. Ożywić ludzkie komórki nabłonkowe BEAS-2B, wykonując czynności 3.1.1-3.1.4 i hodować je w kompletnym pożywce wzrostowej w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5%CO2.
    UWAGA: Aby przygotować kompletną pożywkę wzrostową, dodaj płodową surowicę bydlęcą (FBS) i penicylinę/streptomycynę do pożywki RPMI-1640 w końcowych stężeniach odpowiednio 10% i 1%.
    1. Włączyć łaźnię wodną i ustawić temperaturę na 37 °C. Wyjąć fiolki z komórkami zamrożone w ciekłym azocie i szybko rozmrozić w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
    2. Po rozmrożeniu szybko odpipetować komórki do sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml, dodać 2 ml kompletnej pożywki wzrostowej i odwirować przy 129 x g przez 5 minut.
    3. Usunąć supernatant, dodać 2 ml kompletnej pożywki wzrostowej w celu ponownego zawieszenia komórek i odwirować przy 129 x g przez 5 minut.
    4. Usunąć supernatant, dodać 6 ml kompletnej pożywki wzrostowej w celu ponownego zawieszenia komórek i przenieść komórki do kolby hodowlanej T25 w celu hodowli komórek w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 .
  2. Gdy gęstość komórek osiągnie 80%-90%, wyrzuć pożywkę hodowlaną i umyj komórki dwukrotnie 2 ml PBS. Dodaj 1 ml 0,25% trypsyny, aby trawić komórki przez 1-2 minuty. Gdy zaobserwuje się zaokrąglenie komórek, natychmiast dodaj 4 ml kompletnej pożywki wzrostowej, aby zneutralizować trypsynę.
  3. Wymieszać i odessać próbki do sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i wirować przy sile 129 x g przez 5 minut.
  4. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w 1 ml kompletnego podłoża RPMI-1640. Użyj 20 μl do liczenia komórek i rozcieńcz komórki do 1 x 105 komórek/ml.
  5. Płytki BEAS-2B o gęstości 1 x 104 komórki/basenik na 96-dołkowych płytkach w 100 μl kompletnej pożywki RPMI-1640 i wstępnie inkubować płytki przez 24 godziny w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 .
  6. Odrzucić sklarowany składnik osadu i dodać 100 μl I-OVA NE, 100 μl I-OVA+BNE (fizycznie zmieszanego) i 100 μl I-OVA wstępnie rozcieńczonego kompletną pożywką wzrostową o różnych stężeniach końcowych (0,5 mg/ml, 1 mg/ml, 2 mg/mL, 4 mg/mL, 8 mg/ml), z BNE jako kontrolą. Inkubować przez 24 godziny w temperaturze 37 °C.
    UWAGA: Dodać 100 μl kompletnej pożywki wzrostowej do ujemnych grup kontrolnych i 100 μl zawiesiny komórkowej (1 x 105/ml) do pozytywnych grup kontrolnych.
  7. Usunąć pożywkę i dodać 90 μl kompletnej pożywki wzrostowej i 10 μl roztworu CCK-8 do każdego dołka płytki.
  8. Inkubować płytkę przez 2 godziny w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5%CO2
    9. .
  9. Zmierzyć absorbancję każdej studzienki przy długości fali 450 nm za pomocą znakowanego enzymatycznie czytnika płytek.
  10. Oblicz współczynnik przeżycia komórek BEAS-2B, jak wskazano w następującym równaniu:
    (próbka OD450 − kontrola ujemna OD450 / kontrola pozytywna OD450 − kontrola ujemna OD450) × 100%
  11. Losowo podziel 6-tygodniowe myszy C57BL/6 na pięć grup (n = 5 w każdej grupie) i znieczul je 4% izofluranem w celu indukcji. Utrzymuj znieczulenie za pomocą 2% izofluranu. Użyj maści z siarczanu neomycyny na oczy myszy, aby zapobiec wysuszeniu.
  12. Użyj końcówek pipet o pojemności 10 μl, aby przeprowadzić immunizację donosową myszy za pomocą 10 μl/nozdrze I-OVA, I-OVA + BNE i IOVA NE w dawce 4 mg / ml przez wszystkie 3 dni. Użyj BNE i PBS jako kontroli eksperymentalnej.
    UWAGA: Zapewnij wsparcie termiczne, dopóki zwierzę nie wyzdrowieje ze znieczulenia.
  13. Poddaj eutanazji wszystkie myszy przez dootrzewnowe wstrzyknięcie 100 mg/kg 1% pentobarbitalu sodu w 4 dniu.
  14. Wytnij nożyczkami próbki tkanek nosa o grubości około 3 mm i usuń tkanki płucne.
  15. Utrwalić tkanki nosa i całe tkanki płuc w 4% paraformaldehydzie przez 24 godziny. Odwodnić tkanki za pomocą seryjnego gradientu alkoholu i ksylenu, a następnie zanurzyć w parafinie. Gotowe bloki wosku pokroić w plastry na krajalnicy parafinowej o grubości 4 μm.
  16. Wybarwić skrawki hematoksyliną i eozyną (H&E). Następnie obserwuj toksyczność błony śluzowej, w tym przekrwienie, obrzęk, naciek neutrofili i uszkodzenia strukturalne błony śluzowej nosa i tkanki płucnej, pod mikroskopem (100x i 200x)7.

4. Wychwyt komórkowy in vitro

  1. Umieścić komórki BEAS-2B w gęstości 5 x 10 5 komórek/basenik na płytkach 12-dołkowych z szkiełkami nakrywkowymi w 2 ml kompletnej pożywki wzrostowej i wstępnie inkubować płytki przez noc w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 .
  2. Dodać 100 μl znakowanej FITC I-OVA NE (czystość: 98,3%, wytwarzana przez firmę, 4 mg/ml) lub I-OVA (4 mg/ml) do 900 μl zawiesiny komórek i umieścić w temperaturze 37 °C przez 90 min.
    UWAGA: Przygotować I-OVA NE oznaczone znakiem FITC zgodnie z opisem w kroku 4.1. Dodaj 1 ml kompletnej pożywki wzrostowej do grup kontrolnych.
  3. Po zabiegu przemyć trzykrotnie 0,1 M PBS (1 ml/studzienkę) przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
  4. Utrwal te próbki za pomocą 4% paraformaldehydu przez 20 minut w ciemności. Po utrwaleniu usunąć paraformaldehyd i przemyć 3 razy 0,1 M PBS (1 ml/studzienkę) przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
  5. Próbki należy wstępnie inkubować z DAPI (4',6-diamidino-2-fenyloindolem) w końcowym stężeniu 10 μg/ml przez 10 minut w ciemności, a następnie przemyć 5 razy 0,1 M PBS (1 ml/basenik) przez 30 minut w temperaturze 37 °C po poddaniu działaniu substancji.
  6. Uzyskaj wychwyt komórkowy przez CLSM z następującymi ustawieniami parametrów: Rozmiar ramki: 512 x 512 px, Szybkość skanowania: 8; Krok linii: 1; Uśrednienie: 2.

5. Wydanie in vivo

  1. Znieczulenie nagich myszy 4% gazem izofluranowym i utrzymanie znieczulenia na poziomie 2% izofluranu. Uodporniej nagie myszy donosowo 10 μl I-OVA znakowanej PE w dawce 4 mg/ml lub I-OVA NE znakowanej PE w dawce 4 mg/ml w każdym nozdrzu.
  2. Po 0 godzinach, 0,5 godzinach, 1,5 godzinach, 3, 6 godzinach, 9 godzinach, 12 godzinach i 24 godzinach schwytaj wszystkie myszy pod narkozą za pomocą systemu IVIS.
  3. Wykonaj skanowanie tła bezpośrednio przed podaniem donosowym, aby określić wartość progową (Min = 1,06 x 106) w celu dostosowania obrazów zebranych we wszystkich punktach czasowych.
  4. Kliknij oprogramowanie Living Image, aby zainicjować sekwencję i kliknij Initialize (Zainicjuj), aby zainicjować system IVIS
  5. Po zainicjowaniu lampka stanu temperatury w panelu sterowania akwizycji IVIS świeci na czerwono. Gdy kontrolka stanu temperatury zmieni kolor na zielony, można wykonać obrazowanie.
  6. Kliknij przycisk Imaging Wizard (Kreator obrazowania), a następnie wybierz opcję Fluorescencja w wyświetlonym oknie dialogowym.
  7. Dostosuj następujące parametry: Czas ekspozycji: auto sec, Binning: 8, F/Stop: 2, Pole widzenia: D.
  8. Wybierz filtr wzbudzenia 620 nm i filtr emisji 670 nm. Kliknij Pobierz sekwencję, aby uzyskać obraz.
  9. Przetwarzaj obrazy na żywo wszystkich myszy i dane dotyczące promieniowania za pomocą oprogramowania Living Image.
    1. Po uzyskaniu obrazu kliknij Narzędzia ROI w palecie narzędzi, wybierz Okrąg i utwórz okrąg ROI.
    2. Kliknij pozycję Zmierz zwrot z inwestycji, aby uzyskać wartość ilościową dla obszaru zwrotu z inwestycji.

6. Skuteczność przeciwnowotworowa in vivo

  1. Odśwież i pohoduj komórki E.G7-OVA chłoniaka myszy z EL4 za pomocą kompletnej pożywki wzrostowej, wykonując czynności 2.1.1-2.1.4.
    UWAGA: Aby przygotować kompletną pożywkę wzrostu komórek E.G7-OVA, zmieszaj pożywkę RPMI 1640 z 2 mM L-glutaminą dostosowaną do zawartości 1,5 g/l wodorowęglanu sodu, 4,5 g/l glukozy, 10 mM HEPES i 1,0 mM pirogronianu sodu i uzupełniona 0,05 mM 2-merkaptoetanolem i 0,4 mg/ml G418, 90% oraz płodową surowicą bydlęcą 10%.
  2. Subkulturuj komórki w stosunku 1:2, gdy komórki osiągają gęstość między 1 x 106 komórek/ml a 1 x 107 komórek/ml.
  3. Oceń zapobiegawczy efekt ochronny na myszy, jak opisano w krokach 6.3.1-6.3.4.
    1. Losowo podziel 6-tygodniowe myszy C57BL/6 na pięć grup (n = 8 w każdej grupie). Znieczulenie nagich myszy 4% gazem izofluranowym i utrzymanie znieczulenia 2% izofluranem. Częściowo ogolić włosy z tyłu i maść z siarczanu neomycyny na oczach myszy, aby zapobiec wysuszeniu.
    2. Uodpornić donosowo myszy 10 μl 1 mg / mL I-OVA, BNE+I-OVA lub I-OVA NE w każdym nozdrzu, BNE (rozcieńczone czterokrotnie PBS) lub kontrolną PBS 3 razy w odstępie 7 dni między każdym szczepieniem.
    3. Zaszczepij wszystkie myszy podskórnie w prawym plecach za pomocą 5 x 105 komórek E. G7-OVA w 7 dniu po ostatecznym szczepieniu.
    4. Po 0, 6, 9, 12, 15 i 18 dniach po ostatnim szczepieniu monitoruj objętość guza, mierząc dwie osie guza za pomocą suwmiarki cyfrowej i rejestruj 30-dniowe (po ostatecznej immunizacji) przeżycie myszy.
  4. Oceń terapeutyczny efekt ochronny na myszy po inokulacji komórek E.G7-OVA, jak opisano w krokach 6.4.1-6.4.3. W celu grupowania i obchodzenia się z myszami patrz krok 6.3.1.
    1. W dniu 0 wstrzyknij myszy C57BL/6 podskórnie w prawe plecy z komórkami E.G7-OVA (5 x 105 komórek / mysz).
    2. Po 0, 7 i 14 dniach od wstrzyknięcia uodpornić wszystkie myszy donosowo 10 μl I-OVA, BNE+I-OVA, I-OVA NE (wszystkie w stężeniach 1 mg / mL), BNE lub PBS trzy razy w każdym nozdrzu.
    3. Po 0, 6, 9, 12, 15 i 18 dniach po wstrzyknięciu należy monitorować objętość guza i rejestrować 30-dniowe przeżycie myszy.
      UWAGA: Jeśli objętość guza przekracza 3,000 mm3, myszy powinny zostać poddane eutanazji ze względów humanitarnych, a myszy te zostaną uznane za martwe na krzywej przeżycia. Objętość guza oblicza się za pomocą zmodyfikowanego wzoru elipsoidalnego, jak wskazano w następującym równaniu:
      Objętość = π/6 x dł. x szer.2
      gdzie L oznacza długość guza, a W oznacza szerokość guza (jednostka długości: mm, jednostka objętości: mm3).

7. Analiza statystyczna

  1. Analizuj różnice w danych między różnymi grupami za pomocą odpowiedniego oprogramowania statystycznego z jednoczynnikową analizą ANOVA, wielokrotnymi porównaniami Tukeya lub testem t-Studenta. Użyj metody Kaplana-Meiera, aby oszacować wyniki przeżycia i porównać grupy ze statystykami logarytmicznymi. Wyraż wszystkie wyniki jako średnią ± SD. Znaczenie wartości P P < 0,05, P < 0,01 i P < 0,001 jest reprezentowane odpowiednio za pomocą *, ** i *** na wykresach.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zgodnie z protokołem, zakończyliśmy przygotowanie oraz eksperymentalną ocenę in vitro i in vivo nanoszczepionki przeciwko nowotworom nosa. TEM, AFM i DLS są skutecznymi środkami do oceny podstawowych cech powierzchniowego potencjału zeta i wielkości cząstek nanoszczepionki (Rysunek 1). Komórki nabłonkowe BEAS-2B są użytecznym modelem przesiewowym do badania toksyczności in vitro szczepionek donosowych (Rysunek 2A). Mikrofotografie barwione H&E ilustru...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nanoszczepionki funkcjonalizowane błonami immunocytów mają ogromne zalety w terapii ukierunkowanej na chorobę, a skutki uboczne są minimalizowane dzięki takim właściwościom, jak unikalny tropizm guza, identyfikacja określonych celów, przedłużone krążenie, wzmocnione interakcje międzykomórkowe i niska toksyczność ogólnoustrojowa. Można je również łatwo zintegrować z innymi modułami leczenia w celu wspólnego leczenia nowotworów16,20. Pożądane atrybuty można uzyskać...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie są im znane żadne konkurencyjne interesy finansowe ani powiązania osobiste, które mogłyby mieć wpływ na pracę opisaną w tym artykule.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie było wspierane przez nr 31670938, 32070924, 32000651 Programu Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych w Chinach, nr 2014jcyjA0107 i nr 2019jcyjA-msxmx0159 programu projektowego Fundacji Nauk Przyrodniczych w Chongqing, nr 2020XBK24 i nr 2020XBK26 projektów specjalnych Wojskowego Uniwersytetu Medycznego oraz nr 202090031021 i nr 202090031035 Narodowego Programu Innowacji i Przedsiębiorczości dla studentów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Płytki 96-dołkoweCorning Incorporated, Stany ZjednoczoneCLS3922
Czytnik mikropłytek Bio-Rad 6.0Bio-Rad Laboratories Incorporated Limited Co., CA, Stany Zjednoczone  Zestawy Bio-Rad 6.0
CCK-8Dojindo, JaponiaWirówka CK04
5810 REppendorf, Niemcy 
DAPISigma-Aldrich, St. Louis, USAD9542
płodowa surowica bydlęca (FBS)Hyklon (Life Technology, USA)SH30088.03
OVAShanghai Botai
Biotechnology Co., Ltd.		Inkubator NA
HF 90/240Heal Force, SzwajcariaNA
HPLC Shanghai Botai Biotechology Co., Ltd.E2695
Nikon, JaponiaDSZ5000X
IPC-208Uniwersytet Chong Qing, ChinySystem NA
IVIS Caliper Life Science Limited CompanyNA
JEM-1230 TEMJEOL Limited Company of Japan1230 TEM
Malvern NANO ZSMalvern Instruments Ltd., Wielka BrytaniaNA
MPLA  Invivogen
Lit. Co.		tlrl-mpla
Maść siarczanowa neomycynyShanghai CP General Pharmaceutical Co. , Ltd.
OVA257– 264Shanghai Botai
Biotechnology Co., Ltd.		NA
RPMI 1640 średnihyklon (Life Technology, USA)SH30809.01
Syntetyczny peptyd (OVA) koniugacja IKVAV-PAShanghai Botai
Biotechnology Co., Ltd.		NA
Skaningowy konfokalny mikroskop fluorescencyjny Zeiss LSM800Zeiss, NiemcyZeiss LSM800
5811000398Mikroskop odwrócony H31022262

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sung, H., et al. Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 71 (3), 209-249 (2021).
  2. Mohammed, I., et al. The efficacy and effectiveness of the COVID-19 vaccines in reducing infection, severity, hospitalization, and mortality: A systematic review. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 18 (1), 2027160(2022).
  3. Tsung, K., Norton, J. A. In situ vaccine, immunological memory and cancer cure. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 12 (1), 117-119 (2016).
  4. Abd-Aziz, N., Poh, C. L., Ding, X. Development of peptide-based vaccines for cancer. Journal of Oncology. 2022, 9749363(2022).
  5. Mochizuki, S., et al. Immunization with antigenic peptides complexed with beta-glucan induces potent cytotoxic T-lymphocyte activity in combination with CpG-ODNs. Journal of Controlled Release. 220, 495-502 (2015).
  6. Kalita, P., Tripathi, T. Methodological advances in the design of peptide-based vaccines. Drug Discovery Today. 27 (5), 1367-1380 (2022).
  7. Yang, Y., et al. A novel self-assembled epitope peptide nanoemulsion vaccine targeting nasal mucosal epithelial cell for reinvigorating CD8(+) T cell immune activity and inhibiting tumor progression. International Journal of Biological Macromolecules. 183, 1891-1902 (2021).
  8. Ren, Y., et al. OVA-specific CD8+ T cells do not express granzyme B during anterior chamber associated immune deviation. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 244 (10), 1315-1321 (2006).
  9. Suzuki, K., et al. Preparation of hyaluronic acid-coated polymeric micelles for nasal vaccine delivery. Biomaterials Science. 10 (8), 1920-1928 (2022).
  10. Georas, S. N., Rezaee, F. Epithelial barrier function: at the front line of asthma immunology and allergic airway inflammation. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 134 (3), 509-520 (2014).
  11. Lam, J. Y., et al. A nasal omicron vaccine booster elicits potent neutralizing antibody response against emerging SARS-CoV-2 variants. Emerging Microbes & Infections. 11 (1), 964-967 (2022).
  12. Chai, Y., et al. Improved functional recovery of rat transected spinal cord by peptide-grafted PNIPAM based hydrogel. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 210, 112220(2022).
  13. Paiva Dos Santos, B., et al. Production, purification and characterization of an elastin-like polypeptide containing the Ile-Lys-Val-Ala-Val (IKVAV) peptide for tissue engineering applications. Journal of Biotechnology. 298, 35-44 (2019).
  14. Okur, A. C., Erkoc, P., Kizilel, S. Targeting cancer cells via tumor-homing peptide CREKA functional PEG nanoparticles. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 147, 191-200 (2016).
  15. Makidon, P. E., et al. Pre-clinical evaluation of a novel nanoemulsion-based hepatitis B mucosal vaccine. PLoS One. 3 (8), 2954(2008).
  16. Lin, X., et al. Oil-in-ionic liquid nanoemulsion-based intranasal delivery system for influenza split-virus vaccine. Journal of Controlled Release. 346, 380-391 (2022).
  17. O'Konek, J. J., et al. Intranasal nanoemulsion vaccine confers long-lasting immunomodulation and sustained unresponsiveness in a murine model of milk allergy. Allergy. 75 (4), 872-881 (2020).
  18. Ahmed, M., et al. A novel nanoemulsion vaccine induces mucosal Interleukin-17 responses and confers protection upon Mycobacterium tuberculosis challenge in mice. Vaccine. 35 (37), 4983-4989 (2017).
  19. Sun, H., et al. Induction of systemic and mucosal immunity against methicillin-resistant Staphylococcus aureus infection by a novel nanoemulsion adjuvant vaccine. International Journal of Nanomedicine. 10, 7275-7290 (2015).
  20. Chen, C., et al. Tumor-associated-macrophage-membrane-coated nanoparticles for improved photodynamic immunotherapy. Nano Letters. 21 (13), 5522-5531 (2021).
  21. Prasanna, P., et al. Current status of nanoscale drug delivery and the future of nano-vaccine development for leishmaniasis - A review. Biomedicine & Pharmacotherapy. 141, 111920(2021).
  22. George, S., et al. Surface defects on plate-shaped silver nanoparticles contribute to its hazard potential in a fish gill cell line and zebrafish embryos. ACS Nano. 6 (5), 3745-3759 (2012).
  23. Jafari Eskandari, M., Gostariani, R., Asadi Asadabad, M. Transmission Electron Microscopy of Nanomaterials. Electron Crystallography. Singh, D., Condurache-Bota, S. , IntechOpen. London, UK. (2020).
  24. Kontomaris, S. V., Stylianou, A., Malamou, A. Atomic force microscopy nanoindentation method on collagen fibrils. Materials. 15 (7), 2477(2022).
  25. Zielinska, A., et al. Polymeric nanoparticles: Production, characterization, toxicology and ecotoxicology. Molecules. 25 (16), 3731(2020).
  26. Doncom, K. E. B., Blackman, L. D., Wright, D. B., Gibson, M. I., O'Reilly, R. K. Dispersity effects in polymer self-assemblies: A matter of hierarchical control. Chemical Society Reviews. 46 (14), 4119-4134 (2017).
  27. Pei, M., Li, H., Zhu, Y., Lu, J., Zhang, C. In vitro evidence of oncofetal antigen and TLR-9 agonist co-delivery by alginate nanovaccines for liver cancer immunotherapy. Biomaterials Science. 10 (11), 2865-2876 (2022).
  28. Zhang, J., et al. Titanium dioxide nanoparticles induced reactive oxygen species (ROS) related changes of metabolomics signatures in human normal bronchial epithelial (BEAS-2B) cells. Toxicology and Applied Pharmacology. 444, 116020(2022).
  29. Kumar, V., Sharma, N., Maitra, S. S. In vitro and in vivo toxicity assessment of nanoparticles. International Nano Letters. 7 (4), 243-256 (2017).
  30. Tong, Y. N., et al. An immunopotentiator, ophiopogonin D, encapsulated in a nanoemulsion as a robust adjuvant to improve vaccine efficacy. Acta Biomaterialia. 77, 255-267 (2018).
  31. Elliott, A. D. Confocal microscopy: Principles and modern practices. Current Protocols in Cytometry. 92 (1), 68(2020).
  32. Huang, Y., Zou, Y., Lin, L., Zheng, R. Ginsenoside Rg1 activates dendritic cells and acts as a vaccine adjuvant inducing protective cellular responses against lymphomas. DNA and Cell Biology. 36 (12), 1168-1177 (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

donosowe podawanie szczepionkiszczepionka epitopowapeptyd IKVAVocena in vitroocena in vivotransmisyjna mikroskopia elektronowamikroskopia si atomowychkom rki BEAS2Buwalnianie przed u one

Powiązane artykuły