Czasoprzestrzenna analiza aktywności mikrogleju Ca2+ w rozdzielczości pojedynczej komórki

Podsumowanie

W tym artykule opisujemy protokół obrazowania in vivo aktywności mikrogleju Ca²⁺ i późniejszej analizy jego dynamiki czasoprzestrzennej. Metoda ta umożliwia dokładne scharakteryzowanie reakcji mikrogleju na zmiany w środowisku mózgu, odpowiednio uchwycając drobne skale czasoprzestrzenne, w których takie zdarzenia zachodzą.

Streszczenie

Mikroglej to jedyne rezydujące komórki odpornościowe w ośrodkowym układzie nerwowym. Ich morfologia jest bardzo plastyczna, zmienia się w zależności od ich aktywności. W warunkach homeostatycznych mikroglej ma silnie rozgałęzioną morfologię. Ułatwia to im monitorowanie otaczającego środowiska poprzez ciągłe wydłużanie i wycofywanie ich procesów. Jednak podczas uszkodzenia mózgu i stanu zapalnego mikroglej aktywuje się i ulega dramatycznym zmianom morfologicznym, cofając swoje rozgałęzione procesy i pęczniejąc w ciele komórkowym. Ułatwia to takie czynności, jak migracja i fagocytoza, które mikroglej podejmuje, aby nawigować w środowisku mózgu do mniej patologicznego stanu.

Ten bliski związek między morfologią mikrogleju a zmianami w jego aktywności umożliwił znaczny wgląd w różne funkcje mikrogleju. Jednak takie zmiany morfologiczne i aktywność same w sobie są zjawiskami, które mogą wynikać z dowolnej liczby wewnątrzkomórkowych szlaków sygnałowych. Co więcej, opóźnienie czasowe między bodźcem a reakcją, a także wysoce podzielona morfologia mikrogleju utrudniają wyizolowanie mechanizmów sprawczych, które leżą u podstaw funkcji. Aby rozwiązać ten problem, opracowaliśmy genetycznie zmodyfikowaną linię myszy, w której wysoce czułe fluorescencyjne białko wskaźnikowe Ca²⁺ ulega specyficznej ekspresji w mikrogleju.

Po opisaniu metod obrazowania in vivo mikrogleju Ca²⁺, ten artykuł przedstawia ustrukturyzowane podejście analityczne, które klasyfikuje tę aktywność Ca²⁺ do racjonalnie zdefiniowanych regionów subkomórkowych, zapewniając w ten sposób, że przestrzenne i czasowe wymiary zakodowanej informacji są sensownie wyodrębnione. Wierzymy, że takie podejście zapewni szczegółowe zrozumienie zasad sygnalizacji wewnątrzkomórkowej, które rządzą różnorodnym wachlarzem aktywności mikrogleju związanych zarówno z wyższymi funkcjami mózgu, jak i stanami patologicznymi.

Wprowadzenie

Mikroglej to komórki odpornościowe rezydujące w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN) i odgrywają ważną rolę w utrzymaniu homeostatycznego środowiska mózgu oraz w regulowaniu tworzenia obwodów nerwowych podczas rozwoju mózgu1^,2. Unikalną cechą mikrogleju w OUN jest to, że jego morfologia jest wysoce plastyczna; Jednak różne fenotypy morfologiczne mogą być związane z określonymi funkcjami. Co więcej, transformacja między fenotypami morfologicznymi jest bardzo dynamiczna, zachodząca w szybkich skalach czasowych w odpowiedzi na zmiany w otaczającym środowisku^3,4.

W homeostatycznych warunkach fizjologicznych, mikroglej przyjmuje wysoce rozgałęzioną morfologię, z wieloma procesami promieniującymi na zewnątrz we wszystkich kierunkach. Te rozgałęzione procesy same w sobie wykazują wysoką ruchliwość, stale wydłużając się i cofając^3,4. Taka aktywność jest przede wszystkim ukierunkowana na okresowy kontakt z synapsami neuronalnymi, aksonami i somami w celu monitorowania aktywności neuronalnej^5,6,7,8,9. Jednakże, gdy mózg jest uszkodzony, mikroglej szybko wykrywa tę nieprawidłowość i jako pierwszy krok w swojej odpowiedzi adaptacyjnej kieruje rozszerzenie swoich procesów w kierunku odpowiedniego locale^3,4. Tam, gdzie mikroglej jest wymagany do przeprowadzenia fagocytozy martwych komórek i metabolitów, przyjmują morfologię podobną do ameboidu, skracając swoje procesy i powiększając ciała komórkowe, w ramach przejścia do genotypu aktywowanego immunologicznie^10,11.

Jednakże, podczas gdy dramatyczne zmiany morfologiczne procesów mikrogleju są łatwe do wykrycia, drobne zmiany skali somy komórkowej są znacznie trudniejsze do uchwycenia, zwłaszcza przy rozdzielczości czasowej, która jest fizjologicznie istotna. Co więcej, same zmiany morfologiczne stanowią tylko zintegrowany wynik dowolnej liczby wewnątrzkomórkowych szlaków sygnałowych. Jest to problematyczne dla celu, jakim jest śledzenie aktywności funkcjonalnej i mechaniczne powiązanie bodźca z reakcją końcową, którą prowokuje.

Biorąc pod uwagę jego powszechną rolę jako drugiego posłańca, badanie wewnątrzkomórkowej dynamiki Ca²⁺ lepiej rejestruje związane z nim informacje czasoprzestrzenne podczas badania dynamicznych procesów komórkowych. Takie podejście ma zastosowanie do mikrogleju, biorąc pod uwagę, że wyrażają one różnorodne receptory jonotropowe i metabotropowe związane z wewnątrzkomórkowym podwyższeniem Ca^{2 +} w dół. Rzeczywiście, obrazowanie Ca^{2 +} in vivo zostało wykorzystane do scharakteryzowania czasoprzestrzennych aspektów aktywności mikrogleju w czasie rzeczywistym, z powodzeniem korelując zmiany aktywności mikrogleju Ca^{2 +} z uszkodzeniem mózgu, stanem zapalnym oraz nadpobudliwością i hipoaktywnością neuronów^{12,13,14,15,16}. Na przykład podwyższenie Ca²⁺ związane z rozszerzeniem procesu mikrogleju w odpowiedzi na hiper / hipoaktywną aktywność neuronalną prawdopodobnie odzwierciedla leżący u podstaw proces polimeryzacji aktyny zależny od Ca^{2 + 16}. Co więcej, obrazowanie Ca²⁺ in vivo można również łatwo połączyć z podejściami farmakologicznymi. Na przykład, podczas gdy mikroglej wyraża zarówno receptory P2X (jonotropowe), jak i P2Y (metabotropowe), lokalne zastosowanie agonistów P2Y naśladuje, a następnie znieczula odpowiedź mikrogleju Ca^{2 +} na uszkodzone sąsiednie neurony¹³, co sugeruje większe znaczenie sygnalizacji P2Y dla wykrywania uszkodzeń neuronów.

Do tej pory, poprzednie raporty badające aktywność mikrogleju Ca²⁺ wykorzystywały metody analizy oparte na obszarach zainteresowania (ROI). Wadą tych podejść jest to, że są one nadal zbyt zgrubne, aby móc określić czasoprzestrzenną dynamikę aktywności Ca²⁺ na poziomie poszczególnych procesów mikroglejowych. W związku z tym protokół ten opisuje zarówno konwencjonalne metody analizy aktywności Ca^{2 +} w mikrogleju oparte na ROI, jak i nowsze podejścia oparte na zdarzeniach, które mogą wyodrębnić pojedyncze zdarzenia Ca^{2 +} w procesach mikrogleju. Wcześniej przedstawiamy ogólny przewodnik po obrazowaniu dwufotonowym in vivo, aby odpowiednio uchwycić aktywność Ca²⁺ mikrogleju w celu szczegółowej analizy.

Protokół

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komitety Badań na Zwierzętach Narodowego Instytutu Nauk Fizjologicznych i były zgodne z wytycznymi National Institutes of Health. We wszystkich eksperymentach 8-10-tygodniowe samce myszy były hodowane w 12/12-godzinnym cyklu światło/ciemność z dostępem ad libitum do pożywienia i wody. Aby zobrazować aktywność Ca^{2 +} w mikrogleju, zjonizowana cząsteczka adaptera wiążącego Ca^{2 +} 1 (Iba1) - transaktywator tetracykliny (Iba1-tTA) myszy skrzyżowano z operatorem tetracykliny-GCaMP6 (tetO-GCaMP6) myszy^17,18. Tak więc, przy braku suplementacji analogiem tetracykliny, promotor Iba1 napędza ekspresję GCaMP6, wyłącznie w mikrogleju. We wszystkich eksperymentach suplementację diety doksycykliną przerwano po 6 tygodniach od urodzenia. Pod koniec wszystkich eksperymentów myszy zostały poddane eutanazji przez przedawkowanie izofluranu, a następnie zwichnięcie szyjki macicy. Zapoznaj się z Tabelą materiałów, aby uzyskać szczegółowe informacje dotyczące wszystkich materiałów, zwierząt i odczynników użytych w tym protokole.

1. Chirurgiczne przygotowanie myszy do obrazowania dwufotonowego in vivo; dzień 1

1. Wszystkie zabiegi chirurgiczne należy wykonywać w komorze z laminarnym przepływem powietrza, aby utrzymać sterylne warunki pracy. Przed przystąpieniem do zabiegu należy wysterylizować wnętrze gabinetu światłem UV przez 5 minut.
2. Wysterylizuj wszystkie powierzchnie robocze, ramę chirurgiczną i instrumenty stereotaktyczne, przecierając je 70% etanolem.
3. Wysterylizuj wszystkie narzędzia chirurgiczne (nożyczki, kleszcze, żyletkę, pęsetę) oraz wykonaną na zamówienie płytkę na głowę, którą należy przymocować do czaszki myszy, zanurzając je w 1% roztworze glukonianu chlorheksydyny.
4. Znieczulić mysz ketaminą (7,4 mg ^kg-1, dootrzewnowo [i.p.]) i ksylazyną (10 mg ^kg-1, i.p.). Umieść go z powrotem w klatce domowej, aż znieczulenie się utrzyma. Potwierdź pełną indukcję znieczulenia przez utratę odruchu szczypania palca u nogi.
5. Wysterylizuj skórę głowy 1% glukonianem chlorheksydyny. Zgol sierść żyletką.
6. Zabezpiecz mysz w ramie operacyjnej za pomocą instrumentów stereotaktycznych.
7. Nałóż maść weterynaryjną na oczy, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia.
8. Nałóż 2% galaretki xylocaine na skórę głowy w celu złagodzenia bólu. Poczekaj 5 minut.
9. Usuń skórę głowy nożyczkami i odsłoń czaszkę. Oczyść okostną i osusz odsłoniętą powierzchnię czaszki, pocierając bawełnianymi wacikami.
   UWAGA: Odsłonięte obszary czaszki muszą być całkowicie suche, aby zapewnić silne połączenie z wykonaną na zamówienie płytą głowy.
10. Przymocuj wykonaną na zamówienie płytkę głowy do czaszki za pomocą cementu dentystycznego.
11. Po związaniu cementu wypełnij wszelkie szczeliny między powierzchnią czaszki a granicami wykonanej na zamówienie płyty głowy dodatkowym cementem dentystycznym.
12. Uszczelnij powierzchnie cementu i czaszki, nakładając cement z żywicy adhezyjnej na bazie akrylu.
13. Umieść mysz z powrotem w klatce domowej, umieszczając ją na podkładce grzewczej. Monitoruj mysz do momentu, aż odzyska wystarczającą przytomność, aby utrzymać pozycję leżącą mostka (w ciągu 2 godzin).
    UWAGA: Myszy powinny być w pełni wyleczone do następnego dnia, a następnie mogą być trzymane w pomieszczeniach z innymi zwierzętami.

2. Chirurgiczne przygotowanie myszy do obrazowania dwufotonowego in vivo; dzień 2

1. Wszystkie zabiegi chirurgiczne należy wykonywać w komorze z laminarnym przepływem powietrza, aby utrzymać sterylne warunki pracy. Przed przystąpieniem do zabiegu należy wysterylizować wnętrze gabinetu światłem UV przez 5 minut.
2. Laminowanie dwóch szklanych szkiełek nakrywkowych o różnych wymiarach (szkło górne: 3 mm × 3 mm; szkło dolne: 2 mm × 2 mm) za pomocą żywicy optycznej utwardzanej promieniami UV.
   UWAGA: Podwójne szkiełko nakrywkowe zapewnia długotrwałą ochronę obszaru mózgu odsłoniętego przez okno czaszki, umożliwiając jednocześnie przewlekły dostęp optyczny. W związku z tym jego wymiary mogą być zmieniane w celu dopasowania do obszaru mózgu, który ma być obrazowany.
3. Wysterylizuj wszystkie powierzchnie robocze i ramę chirurgiczną, przecierając je 70% etanolem.
4. Wysterylizuj wszystkie narzędzia chirurgiczne (stalowe wiertło, pęseta, hak na igłę chirurgiczną), zanurzając je w 1% roztworze glukonianu chlorheksydyny.
5. Znieczulij mysz izofluranem (4% indukcji, 1,2%-1,5% konserwacji). Zamocuj mysz w ramie operacyjnej za pomocą płyty czołowej.
6. Aby utworzyć okno czaszki nad pierwszorzędową korą ruchową, zaznacz kwadrat o wymiarach 2 mm × 2 mm wyśrodkowany 0,2 mm przed i 1 mm bocznie od punktu orientacyjnego czaszki Bregmy.
7. Rozcieńczyć czaszkę wzdłuż granicy zaznaczonego kwadratu za pomocą stalowego wiertła.
   UWAGA: Gdy zbliżysz się do pożądanej grubości, przerzedzone obszary czaszki będą przezroczyste po zwilżeniu solą fizjologiczną, a pęknięcia włoskowate zaczną się pojawiać.
8. Po upewnieniu się, że cała granica zaznaczonego kwadratu została odpowiednio przerzedzona, należy ostrożnie wprowadzić hak igły chirurgicznej tuż pod powierzchnią czaszki, kierując jego końcówkę w stronę środka kwadratu. Delikatnie podnieś kwadratowy kawałek czaszki za pomocą haczyka i użyj pęsety, aby oderwać go od reszty czaszki. Jeśli wystąpi krwawienie, należy w sposób ciągły myć odsłoniętą powierzchnię mózgu solą fizjologiczną, aż całkowicie ustąpi.
9. Umieść podwójne szkiełko nakrywkowe na odsłoniętej powierzchni mózgu, kierując stronę z mniejszym szkiełkiem nakrywkowym w kierunku mózgu. Upewnij się, że krawędzie większego szkiełka nakrywkowego stykają się z krawędziami okna czaszki.
10. Za pomocą szklanego pręta z silikonową końcówką zamontowanego w manipulatorze, delikatnie dociśnij podwójne szkiełko nakrywkowe, aby upewnić się, że dobrze styka się z powierzchnią mózgu.
11. Wypełnij szczelinę między podwójnym szkiełkiem nakrywkowym, czaszką i powierzchnią mózgu żywicą utwardzaną promieniami UV i naświetlaj światłem UV aż do stwardnienia (~20 s). Powoli podnieś szklany pręt z silikonową końcówką od podwójnego szkiełka nakrywkowego.
12. Pozwól myszy się zregenerować, umieszczając ją na podkładce rozgrzewającej. Monitoruj mysz do momentu, aż odzyska wystarczającą przytomność, aby utrzymać pozycję leżącą mostka (30 min).
13. Przejdź do kroku 3 lub umieść mysz z powrotem w klatce domowej.
    UWAGA: Po sprawnej operacji opona twarda i wszystkie leżące poniżej naczynia krwionośne będą całkowicie nienaruszone bez krwawienia. W takim przypadku stan zapalny jest minimalny i można od razu przejść do kroku 3. Jeśli nie masz pewności, odczekaj 1-3 tygodnie, aby upewnić się, że stan zapalny w pełni ustąpił.

3. Zbieranie danych za pomocą obrazowania dwufotonowego in vivo

1. Włącz konfigurację obrazowania z wyprzedzeniem, aby upewnić się, że laser ma wystarczająco dużo czasu na rozgrzanie i ustabilizowanie się. Dostrój laser tak, aby emitował na długości fali 920 nm, co jest widmem dwufotonowym, które optymalnie wzbudza fluorofor GCaMP6.
2. Umieść mysz pod soczewką obiektywu mikroskopu 25x i przyzwyczaj ją przez 30 minut. W razie potrzeby znieczulij mysz izofluranem podczas obrazowania (4% indukcji, 1,2%-1,5% konserwacji).
   UWAGA: Izofluran może nie być odpowiedni do niektórych zastosowań badawczych, ponieważ wpływa na ruchliwość procesów mikrogleju i aktywność Ca^2+19,20,21.
3. Ustaw powiększenie na 1x, a następnie wyszukaj mikroglej wyrażający GCaMP6 w obszarze okna czaszki. Szukaj na głębokości od 100 μm do 300 μm pod powierzchnią mózgu.
4. Po znalezieniu odpowiedniego mikrogleju wykazującego ekspresję GCaMP6 zmaksymalizuj powiększenie, aby można było uchwycić aktywność Ca²⁺ z rozdzielczością pojedynczej komórki.
5. Potwierdź wzrokowo, że aktywność Ca²⁺ jest wyraźnie uchwycona i w razie potrzeby dostosuj moc lasera i wzmocnienie obrazu.
   UWAGA: Moc lasera powinna być zminimalizowana tak bardzo, jak to możliwe, aby uniknąć fotowybielania i uszkodzenia mikrogleju.
6. Wykonaj akwizycję obrazu czterowymiarowego (4D) w następujący sposób (kroki 3.6.1-3.6.3; Rysunek 1B):
   1. Ustaw wymiary obrazu na Obszar XY = 512 × 512 pikseli, 0,25 μm/piksel; Obszar Z = pięć płaszczyzn z, krok z 3 μm (Rysunek 1B).
   2. Ustaw szybkość akwizycji na 2,5 klatki/s.
      UWAGA: Skanowanie Z przy tej prędkości jest ułatwione przez piezoelektryczny system pozycjonowania.
   3. Zbieraj dane, dopóki nie zaobserwuje się co najmniej 10 pojedynczych zdarzeń Ca²⁺ (zwykle 10 minut).

4. Przygotowanie do analizy (korekcja ruchu, projekcja średnia/maksymalna z)

1. Przed przystąpieniem do analizy aktywności mikrogleju Ca²⁺ należy skorygować obrazy 4D pod kątem artefaktów związanych z ruchem (rejestracja obrazu) za pomocą algorytmu wyrównania obrazu ECC²² w środowisku programowania MATLAB (R2020a). Pobierz kod z: https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/27253-ecc-image-alignment-algorithm-image-registration.
2. Utwórz referencyjny obraz 3D, rejestrując wszystkie obrazy w pierwszym przedziale czasowym za pomocą operacji imregister MATLAB (standardowy zestaw narzędzi do przetwarzania obrazów).
3. Zarejestruj wszystkie kolejne obrazy, dopasowując je do odpowiedniej płaszczyzny z referencyjnego obrazu 3D za pomocą funkcji ecc (biblioteka algorytmów wyrównania obrazu ECC).
4. Generuj projekcje z o średniej intensywności z zarejestrowanych obrazów przy użyciu średniej operacji MATLAB. Jeśli sygnał obrazowania jest zbyt słaby, zamiast tego wygeneruj projekcje z o maksymalnej intensywności, korzystając z operacji max MATLAB.
   UWAGA: Stosunek sygnału do szumu jest gorszy w przypadku korzystania z projekcji z o maksymalnej intensywności.
5. Przejdź do kroku 5 lub 6. Użyj projekcji z wygenerowanych w kroku 4 jako celu analizy do mapowania czasoprzestrzennej dynamiki aktywności Ca²⁺ w krokach 5 i 6.

5. Analiza oparta na ROI

1. Korzystając z projekcji Z wygenerowanych w kroku 4, zidentyfikuj procesy mikrogleju, które utrzymują stabilny profil obszaru (stabilny obszar) przez cały okres obrazowania w celu późniejszej analizy aktywności Ca²⁺ w następujący sposób (kroki 5.3-5.6):
   1. Generuj oddzielne projekcje t o maksymalnej intensywności zarejestrowanych obrazów 4D z 2-minutowych próbek pobranych na początku i na końcu okresu obrazowania przy użyciu maksymalnej operacji MATLAB.
   2. Binaryzuj projekcje t, aby wygenerować wielokąty morfologii mikrogleju odpowiadające początkowi i końcowi okresu obrazowania za pomocą operacji imbinaryzacji MATLAB. Użyj automatycznie ustawianego domyślnego progu.
      UWAGA: Jeśli sygnał Ca²⁺ jest słaby na początku i na końcu okresu obrazowania, binaryzacja może generować wielokąty z brakującymi obramowaniami. W takim przypadku ręcznie narysuj brakujące obramowania za pomocą narzędzia ołówek w ImageJ.
   3. Nakładanie wielokątów projekcji t za pomocą operacji imadd MATLAB. Nakładające się regiony reprezentują stabilny obszar (Rysunek 2B).
   4. W zidentyfikowanych stabilnych obszarach użyj operacji drawpolygon MATLAB, aby ręcznie zdefiniować i śledzić ROI dla każdego z głównych procesów mikrogleju i wszelkich oczywistych podgałęzi drugiego rzędu.
2. Śledź bezwzględne intensywności fluorescencji uśrednione dla indywidualnego zwrotu z inwestycji we wszystkich przedziałach czasowych (Rysunek 2C,D).
3. Z szeregów czasowych bezwzględnych intensywności fluorescencji obliczyć względną zmianę szeregów czasowych intensywności fluorescencji (ΔF/F) zgodnie z równaniem (1). Ten szereg czasowy reprezentuje znormalizowaną dynamikę Ca²⁺ mikrogleju na poziomie poszczególnych ROI.
   ΔF/F = (F(t) - F₀) / F₀ (1)
   Gdzie F(t) jest zarejestrowaną intensywnością fluorescencji w danym czasie, a F0 jest 10 percentylem intensywności fluorescencji we wszystkich przedziałach czasowych (Rysunek 2E).
4. Zidentyfikuj potencjalne zdarzenia wypalania Ca²⁺ występujące w danym indywidualnym ROI w następujący sposób (kroki 5.5.1-5.5.3):
   1. Zastosuj filtrowanie dolnoprzepustowe typu I o skończonej odpowiedzi impulsowej (FIR) na szeregach czasowych ΔF/F przy użyciu operacji MATLAB fir1. Ustawia częstotliwość odcięcia na wartość Nyquista (połowa częstotliwości próbkowania).
   2. Sprawdź wzrokowo przefiltrowany ślad, aby potwierdzić, że poszczególne piki śladów odpowiadają wybuchom aktywności Ca²⁺ na zarejestrowanych obrazach 4D (Rysunek 2F).
   3. Zidentyfikuj potencjalne zdarzenia wypalania Ca²⁺ jako wklęsłe przegięcia w dół w śladzie szeregów czasowychΔF/F. Zdefiniuj próg bazowy jako medianę wartości ΔF/F w górnym i dolnym pułapie, która wyklucza maksymalne i minimalne 10% amplitudy we wszystkich przedziałach czasowych. Zdefiniuj próg wykrywania wynoszący trzy SD powyżej progu bazowego (Rysunek 2F,H).
5. Zidentyfikuj prawdziwe zdarzenia wypalania Ca²⁺ od kandydatów w następujący sposób (kroki 5.5.1-5.5.2):
   1. Oblicz nachylenie każdego zdarzenia kandydującego, różnicując odpowiednie przefiltrowane ramy szeregów czasowych ΔF/F przy użyciu numerycznej operacji gradientu MATLAB.
   2. Następnie zidentyfikuj prawdziwe zdarzenia Ca²⁺ na podstawie czasu narastania profilu. Zdefiniuj próg linii bazowej jako średnią wartości nachylenia dla wszystkich zdarzeń kandydujących. Zdefiniuj próg wykrywania wynoszący trzy SD powyżej progu bazowego (Rysunek 2G,H).
6. Scharakteryzuj rzeczywiste zdarzenia Ca²⁺ w następujący sposób (kroki 5.6.1-5.6.3):
   UWAGA: Poniższa lista nie jest wyczerpującą listą parametrów, które można wykorzystać do scharakteryzowania zdarzeń Ca²⁺ w mikrogleju. Interesujące nas parametry zależą od celu badania.
   1. Wyprowadzić maksymalną amplitudę rzeczywistego zdarzenia wyzwalania Ca²⁺ jako wartość ΔF/F odpowiedniego układu szeregów czasowych ΔF/F.
   2. Wyprowadzić średnią amplitudę rzeczywistego zdarzenia wyzwalania Ca²⁺ jako średnią wartość ΔF/F w całym odpowiednim podzbiorze ramek szeregów czasowych ΔF/F.
   3. Wyprowadź częstotliwość prawdziwych zdarzeń Ca²⁺ jako liczbę zdarzeń podzieloną przez czas obrazowania.

6. Analiza oparta na zdarzeniach

1. Wykonuj analizę opartą na zdarzeniach na projekcjach z z kroku 4 przy użyciu biblioteki AQuA w środowisku programistycznym MATLAB. Pobierz kod ze strony: https://github.com/yu-lab-vt/AQuA.
   UWAGA: Ogólny przewodnik po bibliotece AQuA jest dostępny pod adresem: https://drive.google.com/file/d/1a3lhe0dUth-5J1-S2fZlPOCZlPbeuvUr/view. Szczegółowa dokumentacja biblioteki AQuA dostępna jest pod adresem: https://drive.google.com/file/d/1CckDLbrkw16b7MPlOQdYpZciIz80Snm_/view.
2. Po uruchomieniu MATLAB przełącz się z domyślnego folderu katalogu roboczego na folder katalogu roboczego wyznaczony przez AQuA za pomocą operacji cd.
3. Załaduj zarejestrowane obrazy 4D do potoku analizy AQuA w następujący sposób (kroki 6.3.1-6.3.2):
   1. Uruchom GUI AQuA. Wpisz aqua_gui w oknie poleceń MATLAB w wyznaczonym folderze katalogu roboczego AQuA.
   2. W graficznym interfejsie użytkownika AQuA kliknij nowy projekt i wybierz zarejestrowane obrazy do analizy. Określ typ danych (GCaMPInVivo_cyto_Lck_) i parametry obrazowania (rozdzielczość czasowa sekund na klatkę = 1,993; rozdzielczość przestrzenna μm na piksel = 0,25; wykluczenie pikseli krótszych niż ta odległość do granicy = 5). Kliknij przycisk Otwórz, aby załadować dane.
4. Definiowanie punktów orientacyjnych dla kolejnych potoków analiz poprzez śledzenie obszarów zainteresowania. Zwykle punkty orientacyjne są oparte na granicy komórki i obszarze ciała komórki.
5. Następnie wykryj zdarzenia kandydujące Ca²⁺, uruchamiając zautomatyzowane potoki analizy dla następujących parametrów: aktywny sygnał, super woksel, wykrywanie zdarzeń, czyste zdarzenia i zdarzenia scalania.
   UWAGA: Szczegółowe wyjaśnienie każdego z tych parametrów i ich wyników oceny kandydata znajduje się w przewodniku AQuA. Krótko mówiąc, parametry te dostosowują próg wykrywania zdarzeń Ca²⁺ w następujący sposób: sygnał aktywny = amplituda fluorescencji, super woksel = grupowanie fluorescencji w przestrzeni 3D, wykrywanie zdarzeń = kinetyka narastania/zaniku, czyste zdarzenia = stosunek sygnału do szumu, a zdarzenia scalania = czasowa separacja zdarzeń.
6. Wizualna inspekcja wykrytych zdarzeń Ca²⁺ (automatycznie nakładanych na oryginalnie zarejestrowane obrazy). W razie potrzeby dostosuj ustawienia parametrów potoków analizy, biorąc pod uwagę jakość obrazu pod kątem powyższych parametrów; Jeśli jakość obrazu dla danego parametru jest dobra, można ustawić wyższy próg i na odwrót.
7. Po odpowiednim wykryciu wszystkich zdarzeń Ca²⁺ scharakteryzuj te zdarzenia w głównym środowisku MATLAB w następujący sposób (kroki 6.8-6.14):
8. Eksportuj pliki wyjściowe analizy AQuA.
   UWAGA: Szczegółowe wyjaśnienie dotyczące plików wyjściowych, wyodrębnionych cech, które są używane do definiowania zdarzeń Ca²⁺, oraz podstawowych parametrów tych wyodrębnionych funkcji znajduje się w dokumentacji AQuA.
9. (opcjonalnie) Podziel wszystkie zdarzenia Ca²⁺ na dwie grupy: 1) zdarzenia rozpoczynające się w somie i 2) zdarzenia rozpoczynające się w procesach.
10. Uzyskaj dostęp do amplitudy poszczególnych zdarzeń Ca²⁺ w strukturze res.dffMat MATLAB pliku wyjściowego analizy AQuA (plik .mat).
11. Wyznacz częstotliwość poszczególnych zdarzeń Ca²⁺ za pomocą operacji res.fts.loc.x3D MATLAB (biblioteka AQuA).
12. Wyznacz czas trwania poszczególnych zdarzeń Ca²⁺ za pomocą operacji res.fts.curve.width11 MATLAB (biblioteka AQuA).
13. Wyznacz obszar poszczególnych zdarzeń Ca²⁺ za pomocą operacji res.fts.basic.area MATLAB (biblioteka AQuA).
14. Skategoryzuj wszystkie zdarzenia Ca²⁺ jako: 1) zdarzenia lokalne, 2) zdarzenia propagacyjne przemieszczające się w kierunku somy i 3) zdarzenia propagacyjne przemieszczające się z dala od somy. Aby to zrobić, użyj operacji res.fts.region.landmarkDir.chgTowards i res.fts.region.landmarkDir.chgAway MATLAB (biblioteka AQuA) (Rysunek 3C).

Wyniki

U myszy transgenicznych wykazujących wyłącznie ekspresję GCaMP6 (białko fluorescencyjne wrażliwe na Ca²⁺) w mikrogleju, zazwyczaj obserwujemy różne wzorce aktywności mikrogleju Ca²⁺ (Rysunek 2A). Co ważne, nawet w obrębie pojedynczego mikrogleju wzorce aktywności Ca²⁺ mogą się znacznie różnić w zależności od procesu.

Aby określić ilościowo takie różnice między procesami w czasoprzestrzennej dynamice aktywności mikrogleju Ca²⁺, należy najpierw zidentyfikować stabilne obszary, a następnie podzielić je na drobno segmentowane ROI (Rysunek 2B,C). Dla każdego ROI należy wyprowadzić i określić ilościowo parametry aktywności Ca²⁺, takie jak amplituda i częstotliwość, poprzez wyodrębnienie cech, takich jak lokalne amplitudy i nachylenia śladów z szeregu czasowego intensywności fluorescencji (Rysunek 2D-G).

Następnie, poszczególne zdarzenia Ca²⁺ muszą zostać zbadane za pomocą dokładnego algorytmu kwantyfikacji AQuA (Rysunek 3A). Z takich analiz opartych na zdarzeniach zwykle obserwuje się ogromne różnice w charakterystyce pochodzenia, amplitudy, czasu trwania, lokalizacji i kierunku przepływu poszczególnych zdarzeń Ca²⁺ (Rysunek 3B). Jeśli skupiamy się na analizie dynamiki aktywności Ca²⁺ w procesach mikrogleju, schemat klasyfikacji zdarzeń lokalnych, zdarzeń przemieszczających się w kierunku somy i zdarzeń przemieszczających się z dala od somy jest pouczający (Rysunek 3C).

Rysunek 1: Eksperymentalna konfiguracja do obrazowania in vivo mikrogleju Ca²⁺. (A) Konfiguracja eksperymentalna. Mysz Iba1-tTA × tetO-GCaMP6 z ekspresją GCaMP6 specyficzną dla mikrogleju. Poprzez umieszczenie okienka czaszkowego w czaszce myszy, aktywność mikrogleju Ca²⁺ można zaobserwować in vivo za pomocą mikroskopii dwufotonowej. (B) Harmonogram eksperymentu i procedura analizy. Obrazy 4D są rejestrowane przez co najmniej 10 minut jako stosy z pięcioma klatkami. Szybkość akwizycji klatek wynosi 2,5 klatki/s. Przed analizą aktywności Ca²⁺ mikrogleju, pięcioramkowe stosy Z są przekształcane w projekcje Z 2D, biorąc średnią (lub maksymalną) intensywność. Szybkość odtwarzania projekcji z wynosi 0,5 klatki/s. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Analiza oparta na ROI dla aktywności mikrogleju Ca²⁺. (A) Średnia projekcja intensywności GCaMP6 w ciągu 10 minut dla pojedynczego mikrogleju. (B) Stabilne obszary (białe) są zdefiniowane przez nałożenie binaryzowanych, maksymalnych projekcji t o intensywności GCaMP6 pochodzących z 2-minutowych próbek pobranych na początku (magenta) i na końcu (zielony) okresu obrazowania. (C) Stabilne obszary są dalej podzielone na regionalne ROI. Poszczególne kolory wskazują indywidualne ROI. (D) Ślady ΔF/F wszystkich indywidualnych ROI w C. Zwróć uwagę na różnice we wzorcach aktywności między ROI. (E) Oryginalny ślad szeregu czasowego ΔF/F wyprowadzony na podstawie bezwzględnych wartości intensywności dla pojedynczego ROI. (F) Ten sam szereg czasowy ΔF/F po filtrowaniu dolnoprzepustowym. Zdarzenia kandydujące Ca²⁺ są wykrywane za pomocą progu odcięcia amplitudy (czerwona linia) zdefiniowanego jako linia bazowa + trzy SD. Linię bazową (zieloną linię) definiuje się jako wartość mediany w całym szeregu czasowym ΔF/F w ramach górnego i dolnego pułapu, która nie obejmuje maksymalnych i minimalnych 10 % wartości ΔF/F. (G) Ślad nachylenia wyprowadzony z przefiltrowanego szeregu czasowego ΔF/F w F. Rzeczywiste zdarzenia Ca²⁺ są sortowane od kandydujących zdarzeń Ca²⁺ na podstawie progu odcięcia nachylenia (czerwona linia) zdefiniowanego jako linia bazowa + trzy SD. Linię bazową (zieloną linię) definiuje się jako średnią wartość dla całego szeregu czasowego nachylenia w obrębie górnego i dolnego pułapu, która nie obejmuje maksymalnych i minimalnych 10 % wartości nachylenia. (H) Zdarzenia kandydujące^Ca2+ oznaczone za pomocą kryteriów amplitudy w F są oznaczone kolorem pomarańczowym. Rzeczywiste zdarzenia Ca²⁺ posortowane od kandydujących zdarzeń Ca²⁺ według kryteriów nachylenia w G na czerwono. Należy pamiętać, że niektóre kandydujące zawody Ca²⁺ zostały scalone na podstawie kryteriów nachylenia. Odpowiednie przefiltrowane szeregi czasowe ΔF/F są nałożone poniżej w celach informacyjnych. linia oznacza zerową amplitudę (ΔF/F). Średnia i maksymalna amplituda rzeczywistych zdarzeń Ca²⁺ jest wyprowadzana jako średnia i maksimum odpowiadających im pików w przefiltrowanym szeregu czasowym ΔF/F. Częstotliwość (zdarzenia/min) określa się jako liczbę rzeczywistych zdarzeń wypalania Ca²⁺ podzieloną przez okres obrazowania (10 min). Podziałka = 20 μm (A,B), 10 μm (C). Skrót: ROI = region zainteresowania. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Analiza oparta na zdarzeniach dla aktywności mikrogleju Ca²⁺. (A) Reprezentatywne obrazy zdarzeń wykrytych przy użyciu algorytmu AQuA. Kolory wskazują poszczególne obszary zdarzeń wykryte w jednym określonym punkcie czasowym. (B) Reprezentatywna znormalizowana aktywność Ca²⁺ (ΔF/F) w poszczególnych zdarzeniach posortowana według kolejności wystąpienia. Prawy pasek wskazuje oznaczony kolorem ΔF/F. (C) Reprezentatywne ślady aktywności zdarzeń propagujących się w kierunku i od somy lub zdarzeń lokalnych. W przypadku wydarzeń lokalnych kształt wydarzenia jest wyświetlany w kolorze niebieskim. W przypadku zdarzeń propagacyjnych czas rozpoczęcia zdarzenia jest wskazywany przez niebiesko-żółtą skalę. Ponieważ AQuA początkowo wykrywa zdarzenia Ca²⁺ indywidualnie, zdarzenia propagacyjne są następnie identyfikowane na podstawie nakładających się lokalizacji przestrzennych i szeregów czasowych wielu pojedynczych zdarzeń Ca²⁺. Zauważ, że jest to ta sama gałąź dendrytyczna, która jest używana do analizy ROI w Rysunek 2E-H. Podziałka = 20 μm (A), 10 μm (C). Skrót: ROI = region zainteresowania; S = soma. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

W artykule przedstawiono ulepszone podejście do obrazowania aktywności mikrogleju Ca²⁺ z wysoką rozdzielczością czasoprzestrzenną. Metoda ta jest wystarczająco czuła, aby wykryć różne typy aktywności mikrogleju Ca²⁺ na poziomie pojedynczych rozgałęzionych procesów, łatwo rozróżniając zdarzenia lokalne i propagacyjne.

W ogólnej metodzie obrazowania dwufotonowego in vivo aktywności mikrogleju Ca²⁺ należy zwrócić szczególną uwagę na następujące punkty, aby zmaksymalizować jakość obrazowania. Po pierwsze, ponieważ mikroglej jest niezwykle wrażliwy na urazy, ważne jest, aby zminimalizować bezpośrednie dotykanie powierzchni mózgu narzędziami chirurgicznymi podczas operacji. Kluczowymi wskazaniami świadczącymi o tym, że operacja została sprawnie przeprowadzona, są nienaruszone naczynia krwionośne i opona twarda oraz bardzo minimalne krwawienie podczas operacji. Po drugie, bezpieczne przymocowanie płytki głowy do czaszki myszy i dobry kontakt między podwójnym szkiełkiem nakrywkowym a powierzchnią mózgu znacznie redukują artefakty związane z ruchem podczas obrazowania. Jest to szczególnie ważne podczas obrazowania z wysokimi rozdzielczościami czasoprzestrzennymi oraz u w pełni wybudzonych myszy. Podczas gdy potok analizy niezawodnie kompensuje artefakty związane z ruchem wynikający z bicia serca, oddychania i ogólnego dryfu, jest mniej niezawodny w przypadku obsługi znacznych zniekształceń geometrycznych, które powstają w wyniku nagłych dużych ruchów.

Dwie opisane tutaj metody analizy oferują różne zalety i są dostosowane do różnych pytań badawczych. W analizie opartej na ROI użytkownik wstępnie definiuje ROI (np. poszczególne procesy), co pozwala na wyodrębnienie zagregowanej dynamiki aktywności Ca²⁺ tego ROI. W związku z tym najlepiej nadaje się do sytuacji, w których oczekuje się, że zjawiska będą zlokalizowane w obszarze subkomórkowym, który ma zarówno dobrze zdefiniowane granice morfologiczne, jak i stosunkowo duży obszar (tj. gałąź procesu). W analizie opartej na zdarzeniach poszczególne zdarzenia są definiowane w oparciu o czasoprzestrzenną dynamikę samej aktywności Ca²⁺ mikrogleju, a następnie muszą być umieszczone w kontekście zdefiniowanych przez użytkownika punktów orientacyjnych w mikrogleju, aby można było zinterpretować ich funkcję. W związku z tym najlepiej sprawdza się w sytuacjach, w których nie można przyjąć założeń dotyczących lokalizacji zjawisk lub gdy obszar zainteresowania jest stosunkowo mały (tj. końcówka procesu). W związku z tym analiza oparta na zdarzeniach oferuje lepszą rozdzielczość czasoprzestrzenną podczas charakteryzowania aktywności Ca²⁺ mikrogleju w porównaniu z poprzednimi metodami.

U tych myszy jedynym markerem fluorescencyjnym wyrażanym przez mikroglej jest wskaźnik Ca^{2 +} GCaMP6. Tak więc w regionach, w których aktywność Ca²⁺ jest niska, morfologia mikrogleju musi zostać wyodrębniona poprzez połączenie wielu ram czasowych, co może pogorszyć rozdzielczość czasową. Jednak to ograniczenie można przezwyciężyć poprzez ekspresję oddzielnego czerwonego, stabilnie fluorescencyjnego białka w mikrogleju. Warto zauważyć, że niedawno opisano nowe wirusy związane z adenowirusami zdolnymi do transfekcji mikrogleju 23,24,25.

To, w jaki sposób aktywność mikrogleju Ca²⁺ jest zmieniana przez otaczające środowisko, jest coraz bardziej interesującym tematem. W szczególności aktywność mikrogleju Ca^{2 +} wydaje się wykazywać znaczące korelacje z aktywnością neuronalną, chociaż funkcjonalne znaczenie tego nie zostało jeszcze dokładnie scharakteryzowane. Tak więc połączenie manipulacji aktywnością neuronalną z przedstawionymi tutaj metodami obrazowania i analizy aktywności Ca^{2 +} mikrogleju powinno przynieść nowe informacje na temat fizjologii mikrogleju i pogłębić nasze zrozumienie ról, jakie mikroglej odgrywa w stanach fizjologicznych i patologicznych.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
2% galaretka ksylokainowa	AstraZeneca, Wielka Brytania
B6(129S6)-Tg(Aif1-tTA)54Kftnk	RIKEN RBC, Japonia	RBRC05769	myszy Iba1-tTA
B6; 129-Actb(tm3.1(tetO-GCaMP6)Kftnk)	RIKEN RBC, Japonia	RBRC09552	myszy tetO-GCaMP6
Kleszcze	Narzędzia do precyzyjnej nauki, USA	13008-12
G-CEM ONE	GC corporation, Japonia
Kapilara szklana	Narishige, Japonia	GDC-1
ImageJ	NIH, USA
Isofulrane	Pfizer, USA
Ketamin	Daiichi-Sankyo, Japonia
Kwik-sil	World Precision Instruments, US	KWIK-SIL
MATLAB, 2020a	MathWorks, US
Micro cover glass  (2 x 2 mm, nr 3)	Matsunami, Japonia	Szkło	dolne do czaszki  Okno
Mikro szkło osłonowe  (3 x 3 mm, nr 0)	Matsunami, Japonia	Szkło	górne do okna czaszki
N25X-APO-MP	Nikon, Japonia	Soczewka obiektywu N25X-APO-MP	(25x)
Klej optyczny Norland	Optyka Edmund, US	6101
Piezoelektryczny system nanopozycjonowania, Nano-Drive	Mao City Labs, USA
Żyletka	Feather, Japonia	FA-10
Nożyczki	Narzędzia do precyzyjnego nauki, US	14060-11
Wiertarka stalowa	Minitor, Japonia	BS1201
Instrumenty stereotaktyczne	Narishige, Japonia	SR-5M-HT
Super-bond (C& Zestaw B)	Sun Medical, Japonia	4560227797382
Chirurgiczny haczyk na igłę	Narzędzia do precyzyjnej nauki, US	10065-15
Laser Ti:Sapire, MaiTai DeepSee	Spectra Physics, US	Mai Tai eHP
Pęseta	Fine Science, US	11051-10
Pęseta	Fine Science, US	11255-20
Two-photon mikroskop	Nikon, Japonia	Żywica rzemieślnicza A1R-MP
UV	Kiyohara, Japonia	UVR
Ksylazyna	Bayer, Niemcy