Artykuł metodologiczny

Mikroiniekcje lipopolisacharydu do komór mózgowych larwom danio pręgowanego w celu oceny zapalenia nerwów i neurotoksyczności

DOI:

10.3791/64313

⸱

23 sierpnia 2022

 , 
1State Key Laboratory of Quality Research in Chinese Medicine and Institute of Chinese Medical Sciences, University of Macau, Avenida da Universidade, 2Department of Pharmaceutical Sciences, Faculty of Health Sciences, University of Macau, Avenida da Universidade

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół demonstruje mikroiniekcję lipopolisacharydu do obszaru komorowego mózgu w modelu larwalnym danio pręgowanego w celu zbadania wynikowej reakcji neurozapalnej i neurotoksyczności.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zapalenie układu nerwowego jest kluczowym czynnikiem w różnych zaburzeniach neurologicznych, w tym chorobach neurodegeneracyjnych. Dlatego bardzo interesujące jest badanie i opracowywanie alternatywnych modeli zapalenia nerwów in vivo, aby zrozumieć rolę zapalenia nerwów w neurodegeneracji. W tym badaniu opracowano i zwalidowano model zapalenia układu nerwowego u larw danio pręgowanego, w którym pośredniczy mikroiniekcja lipopolisacharydu (LPS) w celu wywołania odpowiedzi immunologicznej i neurotoksyczności. Transgeniczne linie danio pręgowanego elavl3:mCherry, ETvmat2:GFP i mpo:EGFP wykorzystano do ilościowego określenia w czasie rzeczywistym żywotności neuronów mózgowych za pomocą obrazowania fluorescencyjnego na żywo zintegrowanego z analizą intensywności fluorescencji. Zachowanie lokomotoryczne larw danio pręgowanego rejestrowano automatycznie za pomocą rejestratora wideo. Zbadano zawartość tlenku azotu (NO) i poziomy ekspresji mRNA cytokin zapalnych, w tym interleukiny-6 (IL-6), interleukiny-1β (IL-1β) i ludzkiego czynnika martwicy nowotworu α (TNF-α) w celu oceny odpowiedzi immunologicznej wywołanej przez LPS w głowie larwy danio pręgowanego. Po 24 godzinach od wstrzyknięcia LPS do komory mózgu u larw danio pręgowanego obserwowano utratę neuronów i zaburzenia lokomocji. Ponadto zapalenie nerwów wywołane LPS zwiększyło uwalnianie NO i ekspresję mRNA IL-6, IL-1β i TNF-α w głowie larw danio pręgowanego 6 dni po zapłodnieniu (dpf) i spowodowało rekrutację neutrofili w mózgu danio pręgowanego. W tym badaniu wstrzyknięcie danio pręgowanego z LPS w stężeniu 2,5-5 mg / ml przy 5 dpf określono jako optymalny stan dla tego farmakologicznego testu zapalenia nerwów. Protokół ten przedstawia nową, szybką i skuteczną metodologię mikroiniekcji LPS do komór mózgowych w celu wywołania zapalenia nerwów i neurotoksyczności za pośrednictwem LPS u larwy danio pręgowanego, co jest przydatne do badania zapalenia nerwów i może być również stosowane jako wysokoprzepustowy test przesiewowy leków in vivo.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zapalenie układu nerwowego zostało opisane jako kluczowy czynnik antyneurogenny zaangażowany w patogenezę kilku chorób neurodegeneracyjnych ośrodkowego układu nerwowego (OUN)1. W następstwie patologicznych urazów, zapalenie układu nerwowego może skutkować różnymi niekorzystnymi konsekwencjami, w tym zahamowaniem neurogenezy i indukcją śmierci komórek neuronalnych2,3. W procesie leżącym u podstaw odpowiedzi na indukcję stanu zapalnego wiele cytokin zapalnych (takich jak TNF-α, IL-1β i IL-6) jest wydzielanych do przestrzeni zewnątrzkomórkowej i działa jako kluczowe składniki w śmierci neuronów i tłumieniu neurogenezy4,5,6.

Mikroiniekcja mediatorów stanu zapalnego (takich jak IL-1β, L-arginina i endotoksyny) do mózgu może spowodować redukcję komórek neuronalnych i zapalenie nerwów7,8,9. Lipopolisacharyd (LPS, Rysunek 1), patogenna endotoksyna obecna w ścianie komórkowej bakterii Gram-ujemnych, może wywoływać zapalenie nerwów, nasilać neurodegenerację i zmniejszać neurogenezę u zwierząt10. Wstrzyknięcie LPS bezpośrednio do OUN mózgu myszy zwiększyło poziom tlenku azotu, cytokin prozapalnych i innych regulatorów11. Co więcej, stereotaktyczne wstrzyknięcie LPS do lokalnego środowiska mózgu może wywołać nadmierną produkcję cząsteczek neurotoksycznych, co skutkuje upośledzeniem funkcji neuronów, a następnie rozwojem chorób neurodegeneracyjnych10,12,13,14,15. W dziedzinie neurobiologii obserwacje mikroskopowe procesów komórkowych i biologicznych zachodzących w organizmach żywych na żywo i w czasie mają kluczowe znaczenie dla zrozumienia mechanizmów leżących u podstaw patogenezy i działania farmakologicznego16. Jednak obrazowanie na żywo mysich modeli zapalenia układu nerwowego i neurotoksyczności jest zasadniczo ograniczone przez ograniczoną głębokość penetracji optycznej mikroskopii, co wyklucza obrazowanie funkcjonalne i obserwację procesów rozwojowych na żywo17,18,19. W związku z tym opracowanie alternatywnych modeli zapalenia układu nerwowego jest bardzo interesujące, aby ułatwić badanie patologicznego rozwoju oraz mechanizmu leżącego u podstaw zapalenia nerwów i neurodegeneracji poprzez obrazowanie na żywo.

Danio pręgowany (Danio rerio) okazał się obiecującym modelem do badania zapalenia nerwów i neurodegeneracji ze względu na ewolucyjnie zachowany wrodzony układ odpornościowy, przejrzystość optyczną, duży rozmiar lęgu zarodka, podatność genetyczną i przydatność do obrazowania in vivo19,20,21,22,23. Poprzednie protokoły albo bezpośrednio wstrzykiwały LPS do żółtka i tylnej komory mózgowia larw danio pręgowanego bez oceny mechanistycznej, albo po prostu dodawały LPS do wody dla ryb (pożywki hodowlanej) w celu wywołania śmiertelnej ogólnoustrojowej odpowiedzi immunologicznej24,25,26,27. W tym celu opracowaliśmy protokół mikroiniekcji LPS do komór mózgu, aby wywołać wrodzoną odpowiedź immunologiczną lub neurotoksyczność w ciągu 5 dni po zapłodnieniu (dpf) larw danio pręgowanego. O tej odpowiedzi świadczy utrata komórek neuronalnych, deficyt zachowań lokomotorycznych, zwiększone uwalnianie tlenku azotynów, aktywacja ekspresji genów zapalnych i rekrutacja neutrofili w mózgu danio pręgowanego po 24 godzinach od wstrzyknięcia.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

AB linii danio pręgowanego dzikiego typu i transgenicznego danio pręgowanego elavl3:mCherry, ETvmat2:GFP i mpo:EGFP zostały uzyskane z Instytutu Chińskich Nauk Medycznych (ICMS). Aprobata etyczna (UMARE-030-2017) dla eksperymentów na zwierzętach została przyznana przez Komitet Etyki Badań na Zwierzętach Uniwersytetu w Makau, a protokół jest zgodny z instytucjonalnymi wytycznymi dotyczącymi opieki nad zwierzętami.

1. Hodowla zarodków i larw danio pręgowanego

  1. Generuj zarodki danio pręgowanego (200-300 zarodków na krycie) poprzez naturalne krycie parami, jak wcześniej zgłoszono28.
  2. Przygotować pożywkę z wodą jajeczną (E3) (60×), rozpuszczając 34,8 g NaCl, 1,6 g KCl, 5,8 g CaCl2·2H2Oi 9,78 g MgCl2·6H2O w ddH2O do końcowej objętości 2 L i dostosować pH do 7,2 za pomocą NaOH i HCl. Aby przygotować stężenie robocze pożywki E3 (1×, należy rozcieńczyć bulion 60 razy w ddH2O. Przechowywać w temperaturze 28,5 °C, gdy nie jest używany.
  3. Użyj plastikowej pipety transferowej, aby przenieść zarodki danio pręgowanego do naczynia zawierającego pożywkę E3. Hodować zarodki w temperaturze 28,5 °C w inkubatorze i monitorować ich rozwój i zdrowie. Codziennie usuwaj martwe zarodki i zastępuj nieczyste podłoże E3 świeżą pożywką.
  4. W przypadku eksperymentów obrazowania danio pręgowanego użyj plastikowej pipety transferowej, aby zebrać zarodki 0-2 godziny po zapłodnieniu (hpf) (około 200 jaj) w około 15 ml pożywki 1× E3 zawierającej 0,003% N-fenylotiomocznika (PTU).
    UWAGA: PTU może hamować powstawanie melanoforów podczas embriogenezy29. Leczenie zarodków PTU podczas embriogenezy może poprawić wykrywanie sygnałów w mikroskopii lub ekspresję fluorescencji30.
  5. Utrzymuj zarodki danio pręgowanego w powyższych warunkach, aż zarodki osiągną pożądane stadium rozwojowe.

2. Przygotowanie do mikroiniekcji

  1. Przygotować się do wstrzyknięcia, pobierając szklane kapilary za pomocą ściągacza do mikropipet (patrz Tabela materiałów), postępując zgodnie z pięcioetapowym protokołem pobierania szklanej rurki kapilarnej (Tabela 1).
  2. Otwórz końcówkę igły (cienkościenne szklane kapilary [3,5 cala] z żarnikiem, średnica zewnętrzna 1,14 mm) do odpowiedniego rozmiaru pod kątem za pomocą kleszczy (Rysunek 2A).
  3. Napełnij igłę 0,1 ml oleju mineralnego, aby upewnić się, że nie ma pęcherzyków.
  4. Zdjąć nakrętkę ze stalowej igły aparatu do mikroiniekcji. Dopasuj szklany otwór na igłę do stalowej igły, a następnie dokręć nakrętkę. Zamontować załadowany aparat do mikroiniekcji igłowej w mikromanipulatorze (patrz Tabela Materiałów).
  5. Dostosuj położenie aparatu do mikroiniekcji tak, aby mikromanipulator mógł elastycznie przesuwać aparat pod mikroskopem. Wypuścić pewną objętość oleju parafinowego, aby stalowa igła weszła do szklanej rurki kapilarnej.
  6. Upuść roztwór do wstrzykiwań (taki jak 1× PBS lub 5 mg/ml LPS) na szkiełko wysterylizowane 70% etanolem i wyreguluj aparat do mikroiniekcji tak, aby końcówka została włożona do kropli cieczy. Do igły wsypać ~2 μl roztworu do wstrzykiwań.
  7. Ustaw mikromanipulator (precyzyjne ustawienia regulacji: góra, dół, lewo i prawo) tak, aby końcówka igły aparatu do mikroiniekcji znajdowała się w tym samym polu widzenia, co larwy w dużym powiększeniu (Rysunek 2B).

3. Montaż danio pręgowanego do mikroiniekcji

UWAGA: Rozwój mózgu danio pręgowanego następuje w ciągu 3 dpf i dojrzewa przy 5 dpf z dobrze rozwiniętym ośrodkowym układem nerwowym31,32. Dlatego 5 larw dpf nadaje się już do badania uszkodzeń neuronów za pośrednictwem LPS, a także reakcji behawioralnych i zapalnych.

  1. Wstrzyknąć larwy danio pręgowanego w ciągu około 30 minut od osiągnięcia etapu zainteresowania, aby utrzymać stały czas wstrzyknięcia.
  2. Aby znieczulić larwy danio pręgowanego, połącz tricainę z czystą wodą w akwarium (końcowe stężenie 0,02% w/v tricainy).
  3. Rozpuść roztwór 2% agarozy w ddH2O za pomocą kuchenki mikrofalowej. Wlej stopioną agarozę do plastikowego naczynia. Naczynie z tworzywa sztucznego pokrytego 2% agarozą można przechowywać w temperaturze 4 °C do 2 tygodni.
  4. Użyj plastikowej pipety transferowej, aby przetransportować znieczulone larwy do środka plastikowego naczynia pokrytego 2% agarozą. Ustaw zamontowane larwy stroną z mózgiem do góry, aby uzyskać dostęp do igły.

4. Wstrzykiwanie do komory mózgu

  1. Dostosuj powiększenie mikroskopu tak, aby struktura komorowa mózgu danio pręgowanego była wyraźnie widoczna w polu widzenia (Rysunek 2B).
  2. Ostrożnie umieść igłę nad rdzeniem mózgu (Rysunek 2C).
  3. Powoli nakłuj skórę mózgu danio pręgowanego końcówką igły za pomocą mikromanipulatora.
  4. Naciśnij pedał nożny, aby wysunąć 1 nL 1x PBS lub różnych stężeń LPS (1.0, 2.5 i 5.0 mg/mL) (patrz Tabela materiałów). Udane obrazy wstrzyknięcia komory, w których do komory mózgu wstrzyknięto 1 nL 1% niebieskiego barwnika Evansa (rozcieńczonego w PBS), przedstawiono jako przykład (Rysunek 2D). Natychmiast po wstrzyknięciu przenieść larwy na czyste podłoże E3. Po 24 godzinach zbierz larwy do obrazowania mikroskopowego, testu behawioralnego lokomotywy i określenia innych wskaźników.

5. Obrazowanie

  1. Przygotuj 1,5% niskotopliwy roztwór agarozy w podłożu E3 i podgrzej go w kuchence mikrofalowej, aby uzyskać klarowny płyn.
  2. Użyj czystej plastikowej pipety transferowej, aby przetransportować larwy do szklanego szkiełka i usunąć jak najwięcej wody.
  3. Użyj plastikowej pipety transferowej, aby dodać kroplę 1,5% niskotopliwej agarozy do larw.
    UWAGA: Ostudzić niskotopliwą agarozę w pipecie przez chwilę przed dodaniem, aby nie uszkodzić larw.
  4. Użyj igły do strzykawki o pojemności 1 ml, aby zorientować larwy. Poczekaj, aż agaroza ostygnie i stężeje przed rozpoczęciem obrazowania.
  5. Obserwuj i fotografuj obszar neuronów w całym mózgu danio pręgowanego Tg(ETvmat2:EGFP) i Tg(elavl3:mCherry), a także rekrutację neutrofili w mózgu danio pręgowanego Tg(mpo:EGFP) pod fluorescencyjnym mikroskopem stereoskopowym (patrz tabela materiałów).
    UWAGA: Ustawienia mikroskopu fluorescencyjnego używane do obrazowania są pokazane poniżej. Tg(ETvmat2:EGFP) mózg danio pręgowanego (długość fali wzbudzenia: 450-490 nm, długość fali emisji: 500-550 nm, powiększenie wizualne: 100x); Tg(elavl3:mCherry) mózg danio pręgowanego (długość fali wzbudzenia: 541-551 nm, długość fali emisji: 590 nm, powiększenie wizualne: 100x); Tg(mpo:EFGP) mózg danio pręgowanego (długość fali wzbudzenia: 450-490 nm, długość fali emisji: 500-550 nm, powiększenie wizualne: 63x).
  6. Zmierz i przeanalizuj intensywność i długość fluorescencji regionu neuronu Ra u danio pręgowanego Tg(ETvmat2:EGFP) oraz intensywność fluorescencji neuronów mózgowych danio pręgowanego Tg(elavl3:mCherry) za pomocą oprogramowania ImageJ. Ręcznie policz neutrofile w obszarze mózgu zebry pręgowanego.

6. Oznaczanie markerów ekspresji genów

  1. Po 24 godzinach od wstrzyknięcia LPS do komory mózgu należy przystąpić do oznaczania markerów ekspresji genów. W tym celu należy znieczulić larwy danio pręgowanego 0,02% trikainy (jak wspomniano w kroku 3.2).
  2. Użyj dwóch strzykawek o pojemności 1 ml, aby oddzielić części głowy larw (40 larw na grupę) bez obszaru oka i woreczka żółtkowego (Rysunek 2E).
  3. Ekstrahuj RNA z części głowy larwy.
    1. W przypadku ekstrakcji RNA homogenizować część głowy za pomocą 200 μl odczynnika do ekstrakcji RNA (patrz tabela materiałów) za pomocą młynka do tkanek (patrz tabela materiałów) z prędkością obrotową 11 000 obr./min przez 5 s.
    2. Przeprowadzić ekstrakcję RNA metodą chloroform-izopropanol. W tym celu należy dodać 40 μl chloroformu, energicznie wstrząsnąć probówkami i inkubować je w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Odwirować próbki o masie 12 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
    3. Przenieść fazę wodną do świeżej probówki (około 100 μl) i dodać 100 μl izopropanolu. Inkubować przez 10 minut, a następnie odwirowywać przy 12 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant.
    4. Dodaj 200 μl 75% etanolu, aby przepłukać osad RNA. Próbki należy krótko zwirować, a następnie odwirować przy 7500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i ponownie przepłukać osad RNA.
    5. Suszyć na powietrzu osad RNA przez 5-10 minut, a następnie dodać 30 μl wody wolnej od RNaz, aby rozpuścić osad RNA. Sprawdzić czystość (stosunek absorbancji przy 260 nm i 280 nm) i integralność RNA za pomocą spektrofotometru mikroobjętościowego (patrz tabela materiałów).
  4. Zsyntetyzuj cDNA z RNA wyekstrahowanego w kroku 6.3, używając odwrotnej transkryptazy z losowymi starterami (patrz Tabela materiałów).
    1. Dodaj 1 μl losowych starterów, 1 μl dNTP, 1 μg RNA i wodę destylowaną (całkowita objętość do 12 μl) do probówki bez nukleaz. Podgrzej mieszaninę do 65 °C przez 5 minut i szybko schładzaj na lodzie.
    2. Dodać 1 μl 0,1 M DTT, 1 μl inhibitora RNazy, 4 μl 5× buforu pierwszej nici i 1 μl odwrotnej transkryptazy M-MLV (całkowita objętość: 20 μL) do probówki. Delikatnie wymieszać i inkubować probówkę w temperaturze 25 °C przez 2 minuty, a następnie w temperaturze 42 °C przez 50 minut. Dezaktywować reakcję przez ogrzewanie w temperaturze 70 °C przez 15 minut.
  5. Wykonaj PCR w czasie rzeczywistym w systemie qPCR (patrz Tabela materiałów) przy użyciu dostępnego na rynku zestawu RT-qPCR (patrz Tabela materiałów) w celu określenia ekspresji docelowych genów (IL-1β, IL-6 i TNF-α). Mieszanina reakcyjna (20 μL) zawierała 10 μL zieleni SYBR, 0,4 μL barwnika referencyjnego ROX, po 0,8 μl starterów do przodu i do tyłu, 6 μL ddH2O i 2 μL matrycy cDNA (1 μg). Przeprowadzić amplifikację PCR w warunkach: 95 °C przez 30 s, następnie 40 cykli po 95 °C przez 5 s i 60 °C przez 34 s oraz z etapem dysocjacji 95 °C przez 15 s, 60 °C przez 60 s i 95 °C przez 15 s.
  6. Znormalizuj poziomy mRNA docelowych genów do poziomu genu porządkowego, czynnika wydłużenia 1 α (Ef1α). Oblicz poziomy ekspresji dla każdego genu docelowego metodą 2−ΔΔCT 33. Sekwencje starterów każdego genu opisano w tabeli 2.
  7. W celu oznaczenia tlenku azotu homogenizować porcję głowy (otrzymaną w kroku 6.2) w 100 μl zimnego PBS za pomocą młynka do tkanek. Odwirować otrzymany PBS i zawiesinę części głowy przy 12 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Zebrać lizaty i przeprowadzić test stężenia azotynów34 przy użyciu dostępnego na rynku zestawu (patrz Tabela Materiałów).

7. Test behawioralny lokomotywy danio pręgowanego

  1. Po 24 godzinach od wstrzyknięcia komory mózgowej LPS należy indywidualnie przenieść larwy dania pręgowanego do studzienek 96-dołkowej kwadratowej mikropłytki. Dodać 300 μl pożywki E3 do każdej studzienki, a następnie inkubować larwy przez 4 godziny, aby zaaklimatyzować się na płytce testowej.
  2. Przenieść mikropłytkę załadowaną larwami do pudełka do śledzenia danio pręgowanego (patrz tabela materiałów). Włącz źródło światła, a następnie wysiaduj larwy w pudełku testowym przez 30 minut, aby zaaklimatyzować się w środowisku.
  3. Monitoruj i rejestruj zachowanie danio pręgowanego za pomocą zautomatyzowanego systemu śledzenia wideo. Nagraj 12 sesji (każda po 5 minut, łącznie 1 godzina) dla każdego danio pręgowanego. Zdefiniuj całkowitą odległość (składa się z odległości nieaktywnych, małych i dużych) jako odległość (w mm), którą każda ryba przemieściła się w ciągu 60-minutowego okresu śledzenia.

8. Analiza statystyczna

  1. Wykonywanie analiz statystycznych przy użyciu standardowego oprogramowania analitycznego (patrz tabela materiałów).
  2. Przeprowadź analizę statystyczną różnic między dwiema grupami przy użyciu zwykłej jednokierunkowej analizy ANOVA. Oblicz współczynnik korelacji Pearsona, aby ocenić siłę korelacji. P < 0,05 uznano za istotne we wszystkich analizach.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisany tutaj przepływ pracy przedstawia nową, szybką i efektywną metodologię wywoływania zapalenia nerwowego i neurotoksyczności u larw danio pręgowanego. W tym opisanym protokole 5 dpf danio pręgowanego wstrzyknięto LPS (Ryc. 1) do komór mózgu za pomocą mikroiniektora (Rysunek 2A-C). Udane wstrzyknięcie w miejsce komory mózgu zweryfikowano przy użyciu 1% niebieskiego barwnika Evansa (Rysunek 2D). Głowa danio pręgowanego został...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Coraz więcej danych epidemiologicznych i eksperymentalnych wskazuje na przewlekłe infekcje bakteryjne i wirusowe jako możliwe czynniki ryzyka chorób neurodegeneracyjnych36. Infekcja wyzwala aktywację procesów zapalnych i odpowiedzi immunologicznej gospodarza37. Nawet jeśli odpowiedź działa jako mechanizm obronny, nadmiernie aktywowany stan zapalny jest szkodliwy dla neurogenezy, a środowisko zapalne nie pozwala na przeżycie nowo narodzonych neuronów38

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie było wspierane przez granty z Funduszu Rozwoju Nauki i Technologii (FDCT) Specjalnego Regionu Administracyjnego Makao (Ref. No. FDCT0058/2019/A1 i 0016/2019/AKP), Komitet Badawczy Uniwersytetu w Makau (MYRG2020-00183-ICMS i CPG2022-00023-ICMS) oraz Chińska Narodowa Fundacja Nauk Przyrodniczych (nr 81803398).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
AgarozaSigma-AldrichA6361
Agaroza, niska temperatura żelowaniaSigma-AldrichA9414
Programowalny wtryskiwacz nanolitrów Drummond Nanoject IIIDrummond Scientific3-000-207
Fluorescencyjne mikroskopy stereoskopoweLeicaM205 FA
Oprogramowanie GraphPad PrismOprogramowanie GraphPadVer. 7.04
Lipopolisacharydy z Escherichia coli O111:B4Sigma-AldrichL3024
Mikromanipulator ręcznyWorld Precision InstrumentsM3301
Olej mineralnySigma-AldrichM5904
Mx3005P system qPCRAgilent TechnologiesMx3005P
Nanovue plus spektrofotometrBiochrom80-2140-46
Zestaw do oznaczania stężenia azotynówBeyotime BiotechnologyS0021M
Sól fizjologiczna buforowana fosforanamiSigma-AldrichP4417
Programowalny ściągacz do pipet poziomychWorld Precision InstrumentsPMP-102
PTU (N-fenylotiomocznik)Sigma-AldrichP7629
Losowe starteryTakara3802
SuperScript II Odwrotna transkryptazaInvitrogen18064014
SYBR Premix Ex Taq II zestawDokładna biologiaAG11701
Tgrinder 3. generacjiTiangenOSE-Y30
Cienkościenne szklane kapilary (4") z żarnikiem, OD 1,5 mmWorld Precision InstrumentsTW150F-4
Trikaina (ester etylowy kwasu 3-aminobenzoesowego)Sigma-AldrichA-5040
TRNzol Uniwersalny odczynnikTiangenDP424
Skrzynka do śledzenia danio pręgowanegoViewPoint Behavior Technology

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Xanthos, D. N., Sandkuhler, J. Neurogenic neuroinflammation: inflammatory CNS reactions in response to neuronal activity. Nature Reviews Neuroscience. 15 (1), 43-53 (2014).
  2. Fan, L. W., Pang, Y. Dysregulation of neurogenesis by neuroinflammation: key differences in neurodevelopmental and neurological disorders. Neural Regeneration Research. 12 (3), 366-371 (2017).
  3. Kwon, H. S., Koh, S. H. Neuroinflammation in neurodegenerative disorders: the roles of microglia and astrocytes. Translational Neurodegeneration. 9 (1), 42(2020).
  4. Block, M. L., Zecca, L., Hong, J. S. Microglia-mediated neurotoxicity: uncovering the molecular mechanisms. Nature Reviews Neuroscience. 8 (1), 57-69 (2007).
  5. Tan, E. K., et al. Parkinson disease and the immune system-associations, mechanisms and therapeutics. Nature Reviews Neurology. 16 (6), 303-318 (2020).
  6. Borsini, A., Zunszain, P. A., Thuret, S., Pariante, C. M. The role of inflammatory cytokines as key modulators of neurogenesis. Trends in Neurosciences. 38 (3), 145-157 (2015).
  7. Kouhsar, S. S., Karami, M., Tafreshi, A. P., Roghani, M., Nadoushan, M. R. Microinjection of l-arginine into corpus callosum cause reduction in myelin concentration and neuroinflammation. Brain Research. 1392, 93-100 (2011).
  8. Couch, Y., Davis, A. E., Sá-Pereira, I., Campbell, S. J., Anthony, D. C. Viral pre-challenge increases central nervous system inflammation after intracranial interleukin-1β injection. Journal of Neuroinflammation. 11, 178(2014).
  9. Zhao, J., et al. Neuroinflammation induced by lipopolysaccharide causes cognitive impairment in mice. Scientific Reports. 9 (1), 5790(2019).
  10. Deng, I., Corrigan, F., Zhai, G., Zhou, X. F., Bobrovskaya, L. Lipopolysaccharide animal models of Parkinson's disease: Recent progress and relevance to clinical disease. Brain Behavior and Immunity-Health. 4, 100060(2020).
  11. Hernandez Baltazar, D., et al. Does lipopolysaccharide-based neuroinflammation induce microglia polarization. Folia Neuropathologica. 58 (2), 113-122 (2020).
  12. Dutta, G., Zhang, P., Liu, B. The lipopolysaccharide Parkinson's disease animal model: mechanistic studies and drug discovery. Fundamental and Clinical Pharmacology. 22 (5), 453-464 (2008).
  13. Castaño, A., Herrera, A. J., Cano, J., Machado, A. Lipopolysaccharide intranigral injection induces inflammatory reaction and damage in nigrostriatal dopaminergic system. Journal of Neurochemistry. 70 (4), 1584-1592 (1998).
  14. Perez-Dominguez, M., Avila-Munoz, E., Dominguez-Rivas, E., Zepeda, A. The detrimental effects of lipopolysaccharide-induced neuroinflammation on adult hippocampal neurogenesis depend on the duration of the pro-inflammatory response. Neural Regeneration Research. 14 (5), 817-825 (2019).
  15. Liu, M., Bing, G. Lipopolysaccharide animal models for Parkinson's disease. Parkinson's Disease. 2011, 327089(2011).
  16. Wilt, B. A., et al. Advances in light microscopy for neuroscience. Annual Review of Neuroscience. 32, 435-506 (2009).
  17. Huang, S. H., et al. Optical volumetric brain imaging: speed, depth, and resolution enhancement. Journal of Physics D: Applied Physics. 54 (32), 323002(2021).
  18. Ahn, C., et al. Overcoming the penetration depth limit in optical microscopy: Adaptive optics and wavefront shaping. Journal of Innovative Optical Health Sciences. 12 (04), 1930002(2019).
  19. Saleem, S., Kannan, R. R. Zebrafish: an emerging real-time model system to study Alzheimer's disease and neurospecific drug discovery. Cell Death Discovery. 4, 45(2018).
  20. Hung, M. W., et al. From omics to drug metabolism and high content screen of natural product in zebrafish: a new model for discovery of neuroactive compound. Evidence-Based Complementary and Alternative. 2012, 605303(2012).
  21. Fontana, B. D., Mezzomo, N. J., Kalueff, A. V., Rosemberg, D. B. The developing utility of zebrafish models of neurological and neuropsychiatric disorders: A critical review. Experimental Neurology. 299, 157-171 (2018).
  22. Sonawane, P. M., et al. A water-soluble boronate masked benzoindocyanin fluorescent probe for the detection of endogenous mitochondrial peroxynitrite in live cells and zebrafish as inflammation models. Dyes and Pigments. 191, 109371(2021).
  23. Sonawane, P. M., et al. Phosphinate-benzoindocyanin fluorescent probe for endogenous mitochondrial peroxynitrite detection in living cells and gallbladder access in inflammatory zebrafish animal models. Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy. 267, 120568(2022).
  24. Yang, L. L., et al. Endotoxin molecule lipopolysaccharide-induced zebrafish inflammation model: a novel screening method for anti-inflammatory drugs. Molecules. 19 (2), 2390-2409 (2014).
  25. Rojas, A. M., Shiau, C. E. Brain-localized and intravenous microinjections in the larval zebrafish to assess innate immune response. Bio-Protocol. 11 (7), 3978(2021).
  26. Brugman, S. The zebrafish as a model to study intestinal inflammation. Developmental and Comparative Immunology. 64, 82-92 (2016).
  27. Kim, E. A., et al. Anti-inflammatory effect of Apo-9'-fucoxanthinone via inhibition of MAPKs and NF-kB signaling pathway in LPS-stimulated RAW 264.7 macrophages and zebrafish model. International Immunopharmacology. 59, 339-346 (2018).
  28. He, Y. L., et al. Angiogenic effect of motherwort (Leonurus japonicus) alkaloids and toxicity of motherwort essential oil on zebrafish embryos. Fitoterapia. 128, 36-42 (2018).
  29. Lister, J. A. Development of pigment cells in the zebrafish embryo. Microscopy Research and Technique. 58 (6), 435-441 (2002).
  30. Karlsson, J., von Hofsten, J., Olsson, P. E. Generating transparent zebrafish: a refined method to improve detection of gene expression during embryonic development. Marine Biotechnology. 3 (6), 522-527 (2001).
  31. d'Amora, M., Giordani, S. The utility of zebrafish as a model for screening developmental neurotoxicity. Frontiers in Neuroscience. 12, 976(2018).
  32. Kalueff, A. V., Stewart, A. M., Gerlai, R. Zebrafish as an emerging model for studying complex brain disorders. Trends in Pharmacological Sciences. 35 (2), 63-75 (2014).
  33. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  34. Zhang, B., et al. Effects of a dammarane-type saponin, ginsenoside Rd, in nicotine-induced vascular endothelial injury. Phytomedicine. 79, 153325(2020).
  35. Chen, Y., Li, G., Law, H. C. H., Chen, H., Lee, S. M. Determination of oxyphylla A enantiomers in the fruits of Alpinia oxyphylla by a chiral high-performance liquid chromatography-multiple reaction monitoring-mass spectrometry method and comparison of their in vivo biological activities. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 68 (40), 11170-11181 (2020).
  36. De Chiara, G., et al. Infectious agents and neurodegeneration. Molecular Neurobiology. 46 (3), 614-638 (2012).
  37. Sochocka, M., Diniz, B. S., Leszek, J. Inflammatory response in the CNS: friend or foe. Molecular Neurobiology. 54 (10), 8071-8089 (2017).
  38. Whitney, N. P., Eidem, T. M., Peng, H., Huang, Y., Zheng, J. C. Inflammation mediates varying effects in neurogenesis: relevance to the pathogenesis of brain injury and neurodegenerative disorders. Journal of Neurochemistry. 108 (6), 1343-1359 (2009).
  39. Terzi, M., et al. The use of non-steroidal anti-inflammatory drugs in neurological diseases. Journal of Chemical Neuroanatomy. 87, 12-24 (2018).
  40. Shohayeb, B., Diab, M., Ahmed, M., Ng, D. C. H. Factors that influence adult neurogenesis as potential therapy. Translational Neurodegeneration. 7, 4(2018).
  41. Sullivan, C., Kim, C. H. Zebrafish as a model for infectious disease and immune function. Fish and Shellfish Immunology. 25 (4), 341-350 (2008).
  42. Meeker, N. D., Trede, N. S. Immunology and zebrafish: spawning new models of human disease. Developmental and Comparative Immunology. 32 (7), 745-757 (2008).
  43. Morales Fenero, C. I., Colombo Flores, A. A., Camara, N. O. Inflammatory diseases modelling in zebrafish. World Journal of Experimental Medicine. 6 (1), 9-20 (2016).
  44. Mottaz, H., et al. Dose-dependent effects of morphine on lipopolysaccharide (LPS)-induced inflammation, and involvement of multixenobiotic resistance (MXR) transporters in LPS efflux in teleost fish. Environmental Pollution. 221, 105-115 (2017).
  45. Novoa, B., Bowman, T. V., Zon, L., Figueras, A. LPS response and tolerance in the zebrafish (Danio rerio). Fish and Shellfish Immunology. 26 (2), 326-331 (2009).
  46. Garcia-Alloza, M., Bacskai, B. J. Techniques for brain imaging in vivo. Neuromolecular Medicine. 6 (1), 65-78 (2004).
  47. Ford, J., et al. At a glance: An update on neuroimaging and retinal imaging in Alzheimer's disease and related research. Journal of Prevention of Alzheimer's Disease. 9 (1), 67-76 (2022).
  48. Bercier, V., Rosello, M., Del Bene, F., Revenu, C. Zebrafish as a model for the study of live in vivo processive transport in neurons. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 17(2019).
  49. Antinucci, P., Hindges, R. A crystal-clear zebrafish for in vivo imaging. Scientific Reports. 6, 29490(2016).
  50. Poureetezadi, S. J., Donahue, E. K., Wingert, R. A. A manual small molecule screen approaching high-throughput using zebrafish embryos. Journal of Visualized Experiments. (93), e52063(2014).
  51. Zon, L. I., Peterson, R. T. In vivo drug discovery in the zebrafish. Nature Reviews Drug Discovery. 4 (1), 35-44 (2005).
  52. Chi, Z., Xu, Q., Zhu, L. A review of recent advances in robotic cell microinjection. Ieee Access. 8, 8520-8532 (2020).
  53. Wang, W., Liu, X., Gelinas, D., Ciruna, B., Sun, Y. A fully automated robotic system for microinjection of zebrafish embryos. PLoS One. 2 (9), 862(2007).
  54. Fu, H. Q., et al. Prolonged neuroinflammation after lipopolysaccharide exposure in aged rats. PLoS One. 9 (8), 106331(2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Model neurozapalenialarwy rybki zebrafishmikroiniekcja do m zguiniekcja lipopolisaryduocena neurotoksyczno ciobrazowanie fluorescencyjne ywych tkanekzachowanie lokomotoryczneekspresja cytokin zapalnychrekrutacja neutrofiliPCR w czasie rzeczywistym

Powiązane artykuły