Method Article

Automatyczne przetwarzanie obrazu w celu określenia struktury wielkości zbiorowiska makrobezkręgowców rzecznych

DOI:

10.3791/64320

⸱

January 13th, 2023

 ,  ,  , 
1Center for the Study of Mediterranean Rivers (CERM), Universitat de Vic - Universitat Central de Catalunya, 2Laboratoire Evolution et Diversité Biologique (EDB), UMR5174, Université Toulouse 3 Paul Sabatier, Centre national de la recherche scientifique (CNRS), Institut de Recherche pour le Développement (IRD), 3Department of Marine Biology and Oceanography, Institut de Ciències del Mar, Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC), 4Aquatic Ecology Group, Universitat de Vic - Universitat Central de Catalunya

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Artykuł opiera się na stworzeniu dostosowanego protokołu do skanowania, wykrywania, sortowania i identyfikowania zdigitalizowanych obiektów odpowiadających makrobezkręgowcom rzecznym bentosowym za pomocą procedury półautomatycznego obrazowania. Procedura ta pozwala na uzyskanie indywidualnych rozkładów wielkości i metryk wielkości zbiorowiska makrobezkręgowców w ciągu około 1 godziny.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rozmiar ciała jest ważną cechą funkcjonalną, która może być wykorzystana jako bioindykator do oceny wpływu zaburzeń w naturalnych zbiorowiskach. Struktura wielkości zbiorowiska reaguje na gradienty biotyczne i abiotyczne, w tym antropogeniczne perturbacje między taksonami i ekosystemami. Jednak ręczny pomiar małych organizmów, takich jak makrobezkręgowce bentosowe (np. >500 μm do kilku centymetrów długości) jest czasochłonny. Aby przyspieszyć oszacowanie struktury wielkości zbiorowiska, opracowaliśmy protokół do półautomatycznego pomiaru indywidualnej wielkości ciała zachowanych makrobezkręgowców rzecznych, które są jednym z najczęściej stosowanych bioindykatorów do oceny stanu ekologicznego ekosystemów słodkowodnych. Protokół ten został zaadaptowany z istniejącej metodologii opracowanej do skanowania mezozooplanktonu morskiego za pomocą systemu skanowania przeznaczonego do próbek wody. Protokół składa się z trzech głównych etapów: (1) skanowania podpróbek (drobnych i grubych frakcji wielkości próbki) makrobezkręgowców rzecznych i przetwarzania zdigitalizowanych obrazów w celu indywidualizacji każdego wykrytego obiektu na każdym obrazie; (2) tworzenie, ocenianie i walidacja zbioru uczenia się za pomocą sztucznej inteligencji w celu półautomatycznego oddzielenia indywidualnych obrazów makrobezkręgowców od detrytusu i artefaktów w zeskanowanych próbkach; oraz (3) przedstawienie struktury wielkości zbiorowisk makrobezkręgowców. Oprócz protokołu, praca ta obejmuje wyniki kalibracji i wymienia kilka wyzwań i zaleceń dotyczących dostosowania procedury do próbek makrobezkręgowców i rozważenia dalszych ulepszeń. Ogólnie rzecz biorąc, uzyskane wyniki przemawiają za wykorzystaniem zaprezentowanego systemu skanowania do automatycznego pomiaru wielkości ciała makrobezkręgowców rzecznych i sugerują, że przedstawienie ich spektrum wielkości jest cennym narzędziem do szybkiej oceny biologicznej ekosystemów słodkowodnych.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Makrobezkręgowce bentosowe są powszechnie używane jako bioindykatory do określania stanu ekologicznego zbiorników wodnych1. Większość wskaźników opisujących zbiorowiska makrobezkręgowców koncentruje się na wskaźnikach taksonomicznych. Zachęca się jednak do stosowania nowych narzędzi oceny biologicznej, które uwzględniają rozmiar ciała, aby zapewnić alternatywną lub uzupełniającą perspektywę dla podejść taksonomicznych2,3.

Rozmiar ciała jest uważany za metacechę, która jest związana z innymi istotnymi cechami, takimi jak metabolizm, wzrost, oddychanie i ruch4. Ponadto rozmiar ciała może określać pozycję troficzną i interakcje5. Zależność między indywidualnym rozmiarem ciała a znormalizowaną biomasą (lub obfitością) według klasy wielkości w społeczności jest zdefiniowana jako spektrum rozmiarów6 i podąża za ogólnym wzorcem liniowego spadku znormalizowanej biomasy wraz ze wzrostem indywidualnej wielkości w skali logarytmicznej7. Nachylenie tej liniowej zależności zostało szeroko zbadane teoretycznie, a badania empiryczne w różnych ekosystemach wykorzystały je jako ekologiczny wskaźnik struktury wielkości społeczności4. Innym syntetycznym wskaźnikiem struktury wielkości społeczności, który został z powodzeniem wykorzystany w badaniach nad funkcjonowaniem ekosystemów bioróżnorodności, jest różnorodność wielkości społeczności, która jest reprezentowana jako indeks Shannona klas wielkości spektrum wielkości lub jego odpowiednik, który jest obliczany na podstawie indywidualnych rozkładów wielkości8.

W ekosystemach słodkowodnych struktura wielkości różnych grup fauny jest używana jako wskaźnik ataksji do oceny reakcji społeczności biotycznych na gradienty środowiskowe9,10,11 i do antropogenicznych zakłóceń12,13,14,15,16. Makrobezkręgowce nie są wyjątkiem, a ich struktura wielkości reaguje również na zmiany środowiskowe17,18 oraz perturbacje antropogeniczne, takie jak mining19, land use20, lub wzbogacenie azotem (N) i fosforem (P)20,21,22. Jednak mierzenie setek osobników w celu opisania struktury wielkości społeczności jest żmudnym i czasochłonnym zadaniem, którego często unika się jako rutynowego pomiaru w laboratoriach z powodu braku czasu. W związku z tym opracowano kilka półautomatycznych lub automatycznych metod obrazowania do klasyfikowania i mierzenia próbek23,24,25,26. Jednak większość z tych metod koncentruje się bardziej na klasyfikacji taksonomicznej niż na indywidualnej wielkości organizmów i nie jest gotowa do użycia dla wszystkich rodzajów makrobezkręgowców. W ekologii planktonu morskiego system skanowania obrazu analizy jest szeroko stosowany do określania wielkości i składu taksonomicznego społeczności zooplanktonu27,28,29,30,31. Instrument ten można znaleźć w kilku instytutach morskich na całym świecie i służy do skanowania zachowanych próbek zooplanktonu w celu uzyskania cyfrowych obrazów całej próbki w wysokiej rozdzielczości. Niniejszy protokół dostosowuje wykorzystanie tego instrumentu do szacowania widma wielkości społeczności makrobezkręgowców w rzekach w szybki automatyczny sposób bez inwestowania w tworzenie nowego urządzenia.

Protokół składa się ze skanowania próbki i przetwarzania całego obrazu, aby automatycznie uzyskać pojedyncze obrazy (tj. winiety) obiektów w próbce. Każdy obiekt charakteryzuje się kilkoma miarami kształtu, rozmiaru i cech szarości, które pozwalają na automatyczną klasyfikację obiektów do kategorii, które są następnie weryfikowane przez eksperta. Indywidualna wielkość każdego organizmu jest obliczana za pomocą elipsoidalnej bioobjętości (mm3), która jest określana na podstawie obszaru organizmu mierzonego w pikselach. Pozwala to na szybkie uzyskanie widma wielkości próbki. Zgodnie z naszą najlepszą wiedzą, ten skanujący system obrazowania był używany tylko do przetwarzania próbek mezozooplanktonu, ale urządzenie może potencjalnie pozwolić na pracę ze słodkowodnymi makrobezkręgowcami bentosowymi.

Ogólnym celem tego badania jest zatem wprowadzenie metody szybkiego uzyskiwania indywidualnej wielkości zachowanych makrobezkręgowców rzecznych poprzez adaptację istniejącego protokołu używanego wcześniej z morskim mezozooplanktonem27,32,33. Procedura polega na zastosowaniu podejścia półautomatycznego, które współpracuje z urządzeniem skanującym do skanowania próbek wody i trzema otwartymi programami do przetwarzania zeskanowanych obrazów. W niniejszym dokumencie przedstawiono dostosowany protokół skanowania, wykrywania i identyfikacji zdigitalizowanych makrobezkręgowców rzecznych w celu automatycznego uzyskania struktury wielkości zbiorowiska i powiązanych wskaźników wielkości. Przedstawiono również ocenę procedury oraz wytyczne mające na celu zwiększenie efektywności w oparciu o 42 zeskanowane obrazy próbek makrobezkręgowców rzecznych pobranych z trzech basenów północno-wschodniego (NE) Półwyspu Iberyjskiego (Ter, Segre-Ebre i Besòs).

Próbki zostały pobrane na 100 m odcinkach rzeki zgodnie z protokołem pobierania próbek w terenie i analizy laboratoryjnej makrobezkręgowców rzecznych bentosowych w rzekach nadających się do przeprawiania przez rząd hiszpański34. Próbki pobrano za pomocą próbnika Surber (rama: 0,3 m x 0,3 m, oczko: 250 μm) po przeprowadzeniu badań wielosiedliskowych. W laboratorium próbki oczyszczono i przesiano przez oczka 5 mm i 500 μm w celu uzyskania dwóch podpróbek: podpróbki grubej (oczka 5 mm) i podpróbki drobnej (oczka 500 μm), które przechowywano w oddzielnych fiolkach i konserwowano w 70% etanolu. Rozdzielenie próbki na dwie frakcje wielkości pozwala na lepsze oszacowanie struktury wielkości zbiorowiska, ponieważ duże organizmy są rzadsze i mniej niż małe organizmy. W przeciwnym razie zeskanowana próbka ma stronniczą reprezentację frakcji o dużym rozmiarze.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Opisany tutaj protokół jest oparty na systemie opracowanym przez Gorsky et al.27 dla morskiego mezozooplanktonu. Szczegółowy opis kroków skanera (ZooSCAN), oprogramowania skanującego (VueScan 9x64 [9.5.09]), oprogramowania do przetwarzania obrazu (Zooprocess, ImageJ) i oprogramowania do automatycznej identyfikacji (Plankton Identifier) można znaleźć w poprzednich odniesieniach32,33. Aby jak najlepiej dostosować rozmiary makrobezkręgowców bentosowych w odniesieniu do mezozooplanktonu, po utworzeniu projektu zgodnie z oryginalnym protokołem32,33, zmień parametr minimalnego rozmiaru (minsizeesd_mm) na 0,3 mm i parametr maksymalnego rozmiaru (maxsizeesd_mm) na 100 mm w pliku konfiguracyjnym. Aby pomóc w przestrzeganiu protokołu, jest to podsumowane w wykresie roboczym (Rysunek 1). Utworzony projekt jest przechowywany w folderze C komputera i jest zorganizowany w następujących folderach: PID_process, Zooscan_back, Zooscan_check, Zooscan_config, Zooscan_meta, Zooscan_results i Zooscan_scan. Każdy folder składa się z kilku podfolderów, których różne aplikacje używają w kolejnych krokach protokołu.

1. Akwizycja obrazów cyfrowych dla próbek makrobezkręgowców

  1. Skanowanie i przetwarzanie blanku
    UWAGA: Przed skanowaniem należy tworzyć dwa puste obrazy dziennie, aby wyodrębnić skany tła podczas przetwarzania zeskanowanych obrazów tego samego dnia.
    1. Włącz skaner i włącz światło w podwójnej pozycji, aby emitować białe światło od góry i od dołu.
      UWAGA: Podczas skanowania próbek mezozooplanktonu używany jest kierunek światła skierowany w górę, ale ponieważ makrobezkręgowce są bardziej nieprzezroczyste, zaleca się przełączenie światła w podwójną pozycję.
    2. Wyczyść i opłucz tacę skanera wodą z kranu.
    3. Wlej 110 ml wody z kranu przechowywanej w temperaturze pokojowej (RT) do tacki skanującej, aż szklanka zostanie przykryta. Umieść dużą ramkę (24,5 cm x 15,8 cm) na tacy skanowania we właściwej pozycji (z rogiem w lewej górnej części tacy skanowania) i napełnij ją wodą z kranu, aż stopień ramki zostanie zakryty, aby uniknąć efektu menisku, który mógłby zmienić zeskanowany obraz. Zamknij pokrywę skanera.
      UWAGA: Używaj wody o temperaturze pokojowej, aby uniknąć kondensacji i tworzenia się pęcherzyków. Wyczyść ramę bez śladów i kropel, aby uniknąć odbicia światła.
    4. Przejdź do oprogramowania do przetwarzania obrazu, wybierz działający projekt i kliknij Skanuj (konwertuj) obraz tła.
    5. Przejdź do oprogramowania do skanowania i kliknij Podgląd. Upewnij się, że masz podgląd zeskanowanego obrazu, sprawdź, czy nie ma linii ani plam i odczekaj co najmniej 30 sekund przed rozpoczęciem kolejnego skanowania. Kliknij Skanuj i naciśnij OK w oknie instrukcji przed drugim skanowaniem, aby wysłać dane z oprogramowania skanującego do oprogramowania do przetwarzania obrazu.
      UWAGA: Skanuj dwukrotnie, aby uzyskać dwa skany w tle, które będą składać się na puste miejsce. Ten krok jest wykonywany raz dziennie przed rozpoczęciem przetwarzania próbki, a obrazy są przechowywane w folderze Zooscan_back.
    6. Zamknij oprogramowanie skanujące po zakończeniu skanowania.
  2. Przygotowanie i skanowanie próbek
    UWAGA: Etanol jest łatwopalną cieczą i może spowodować poważne uszkodzenie/podrażnienie oczu.
    1. Wypełnij przykładowe metadane. Przejdź do oprogramowania do przetwarzania obrazu i wybierz opcję Wypełnij przykładowe metadane. Wprowadź przykładową tożsamość, kliknij OK i wypełnij metadata.
      UWAGA: Metaplik jest tworzony specjalnie dla próbek mezozooplanktonu, więc nie pasuje do metodologii pobierania próbek makrobezkręgowców bentosowych, ale wszystkie pola pliku muszą zostać wypełnione przed skanowaniem, w przeciwnym razie pojawi się flaga błędu.
    2. Wlej 110 ml 70% etanolu do tacki skanującej, aż szkło zostanie przykryte, a następnie umieść dużą ramkę (24.5 cm x 15.8 cm) tak, aby róg znajdował się w lewej górnej części tacki skanowania.
      UWAGA: Pracuj z etanolem zamiast wodą, ponieważ makrobezkręgowce są konserwowane w etanolu. W wodzie unoszą się i dryfują w tacce skanującej, zapobiegając uzyskaniu ostrego obrazu, a tym samym wiarygodnym pomiarom rozmiaru. Etanol powinien być przechowywany w temperaturze pokojowej, aby uniknąć kondensacji i tworzenia się pęcherzyków.
    3. Wlej próbkę makrobezkręgowców do tacy skanującej obramowanej ramką i w razie potrzeby przykryj stopień ramy większą ilością etanolu.
      UWAGA: Powstrzymaj się od dodawania zbyt dużej ilości etanolu, aby uniknąć unoszenia się i dryfowania organizmów.
    4. Homogenizuj próbkę w całym obszarze ramy, umieszczając największe osobniki na środku tacki w celu prawidłowego przetwarzania obrazu, a następnie zanurz unoszące się w powietrzu organizmy za pomocą drewnianej igły.
      UWAGA: Jeśli podpróbka zawiera liczbowo więcej niż 1,000 osobników, podziel podpróbkę na dwie lub więcej frakcji, aby zminimalizować dotykanie organizmów na zeskanowanym obrazie, i zeskanuj frakcje osobno.
    5. Oddziel organizmy dotykające i organizmy dotykające krawędzi ramy za pomocą drewnianej igły.
      UWAGA: Ten krok wymaga 5-20 minut. Dotykające się organizmy są uważane przez oprogramowanie za pojedynczy obiekt; W związku z tym w tych przypadkach obliczone indywidualne rozmiary nie odpowiadają rzeczywistym pojedynczym organizmom i mogą zniekształcić oszacowanie struktury wielkości zbiorowiska. Istnieje możliwość edycji obrazu za pomocą oprogramowania do przetwarzania obrazu w celu ich rozdzielenia, ale ten dodatkowy krok obejmuje co najmniej 1,5 godziny ponownego przetwarzania; Dlatego zdecydowanie zaleca się ręczną separację.
    6. Aby zeskanować próbkę, zamknij pokrywę skanera, przejdź do oprogramowania do przetwarzania obrazu, wybierz projekt roboczy i kliknij SCAN Sample with Zooscan (For Archive, No Process).
    7. Wybierz próbkę i postępuj zgodnie z instrukcjami.
    8. Przejdź do oprogramowania do skanowania i kliknij Podgląd. Upewnij się, że masz podgląd zeskanowanego obrazu, sprawdź, czy nie ma linii ani plam i odczekaj co najmniej 30 sekund przed rozpoczęciem kolejnego skanowania.
    9. Po upływie co najmniej 30 sekund kliknij przycisk Skanuj w oprogramowaniu do skanowania.
      UWAGA: Naciśnij OK w oprogramowaniu do przetwarzania obrazu po naciśnięciu przycisku Skanuj w oprogramowaniu do skanowania. Nie naciskaj żadnego na klawiaturze komputera i unikaj wibracji skanowania podczas skanowania. W folderze Zooscan_scan > _raw generowane są trzy pliki: (i) oznaczony format pliku obrazu (.tif) (16-bitowy); (ii) standardowy dokument tekstowy o nazwie LOG (.txt), który rejestruje informacje na temat parametrów skanowania; oraz (iii) standardowy dokument tekstowy o nazwie META (.txt) zawierający informacje na temat metod pobierania próbek.
    10. Sprawdź, czy skanowanie w formacie RAW jest poprawne.
      UWAGA: Jeśli skanowanie ma jasne paski lub inne widoczne problemy, rozważ powtórzenie skanowania, aby uniknąć problemów w poniższych krokach.
  3. Odzyskiwanie próbek
    1. Zdejmij ramkę i opłucz ją nad tacą skanującą za pomocą wyciśniętej butelki wypełnionej 70% etanolem, aby odzyskać wszelkie przyczepione makrobezkręgowce.
    2. Podnieś górną część skanera, aby pobrać wszystkie organizmy i etanol z tacy przez lejek do skanowania do zlewki. Trzymając górną część skanera nadal podniesioną, opłucz tacę butelką do wyciskania, aby zamiatać wszelkie pozostałe organizmy.
    3. Przepuścić próbki i etanol ze zlewki przez siatkę o wielkości 500 μm, aby zatrzymać bezkręgowce w siatce, i przechowywać je z powrotem w fiolce zawierającej 70% etanol.
    4. Gdy wszystkie próbki zostaną odzyskane w fiolce, wyczyść tackę wodą z kranu.
      UWAGA: Umyj tackę wodą z kranu między próbkami, aby zminimalizować wytrącanie się etanolu, co wpływa na przetwarzanie obrazu. Opłucz ramę wodą z kranu, aby uniknąć potencjalnych uszkodzeń związanych z użyciem etanolu. Pod koniec dnia wyczyść tacę wodą z kranu i delikatnie osusz ją papierem, aby uniknąć zarysowań.
  4. Przetwarzanie obrazu
    1. Przejdź do oprogramowania do przetwarzania obrazu i wybierz KONWERTUJ i PRZETWARZAJ obrazy i organizmy w trybie wsadowym, a następnie Konwertuj i przetwarzaj obraz ORAZ cząstki (obraz w folderze RAW). Zachowaj ustawienia domyślne i kliknij OK. Na końcu procesu pojawi się NORMALNY KONIEC.
      UWAGA: W folderze Zooscan_scan > _work zostanie utworzony plik PID oraz winiety odpowiadające wszystkim wykrytym obiektom na zeskanowanym obrazie (w pliku Joint Photographic Group [.jpg]). Plik PID to pojedynczy plik, w którym przechowywane są wszystkie metadane (metaplik), dane techniczne powiązane z plikiem dziennika oraz tabela z 36 zmierzonymi zmiennymi wszystkich obiektów wykrytych na obrazie. Mierzone zmienne odpowiadają różnym oszacowaniom poziomu szarości, wymiaru fraktala, kształtu i rozmiaru. Zmiennymi, które można wykorzystać do oszacowania rozmiaru, są pole oraz oś główna i pomocnicza elipsy o powierzchni równej powierzchni obiektu (patrz sekcja 3 protokołu). Czas przetwarzania zależy od gęstości obrazu i charakterystyki komputera i może być uruchamiany między próbkami podczas odzyskiwania i przygotowywania następnej próbki. W przeciwnym razie zaleca się rozpoczęcie przetwarzania próbek skanowanych każdego dnia w trybie wsadowym w nocy i sprawdzenie, czy obraz jest prawidłowo przetwarzany następnego dnia rano.
    2. Sprawdź, czy tło w przetworzonym obrazie jest odpowiednio odjęte od przykładowego obrazu za pomocą oprogramowania do przetwarzania obrazu lub sprawdzając obrazy masek (zakończone w msk1.gif) znajdujące się w Zooscan_scan > _work. Jeśli tło zawiera nasycone obszary lub wiele punktów, rozważ powtórzenie skanowania, aby zapewnić wysoką jakość obrazów.
      UWAGA: Aby uniknąć nasyconych obszarów w tle, tacę skanującą należy spłukać wodą z kranu po każdym skanowaniu etanolem. Ważne jest również, aby (1) zmniejszyć liczbę skanowanych osobników (poprzez frakcjonowanie próbki i skanowanie w różnych fałdach); (2) Upewnij się, że duże organizmy są umieszczone na środku tacki skanującej; (3) używać czystego, przefiltrowanego etanolu; (4) zmniejszyć zabrudzenie próbek; 5) zapewnić, aby ilość etanolu do skanowania była odpowiednia; oraz (6) upewnić się, że opóźnienie między podglądem próbki a skanowaniem wynosi co najmniej 30 s.
  5. Separacja organizmów dotykających
    UWAGA: W przypadku kilku winiet z dotykającymi się organizmami, konieczne jest oddzielenie obrazów dotykających organizmów od innych organizmów i/lub od włókien/szczątków, aby zapewnić prawidłowe oszacowanie struktury wielkości społeczności.
    1. Przejdź do oprogramowania do przetwarzania obrazu, aby wykryć winiety z wieloma obiektami. Wybierz SEPARACJA za pomocą winiet i naciśnij OK. W oknie wyboru konfiguracji zachowaj ustawienia domyślne i kliknij OK.
    2. W oknie SEPARACJA od winiet zachowaj ustawienia domyślne, dodatkowo wybierz DODAJ Kontury na winietach, a następnie wybierz próbkę do edycji.
    3. Oddziel dotykające się organizmy w każdej wyskakującej winiecie, rysując linię myszą (naciśnij przycisk przewijania, aby narysować). Po zakończeniu separacji w winiecie kliknij przycisk X w prawym górnym rogu okna i naciśnij TAK, aby przetworzyć następny. Naciśnij NO, aby zakończyć i zapisać zmiany. Pod koniec procesu pojawi się NORMALNY KONIEC, jeśli wszystko jest w porządku.
    4. Po rozdzieleniu ponownie przetwórz obraz, aby uzyskać zaktualizowane dane obiektu. Przejdź do oprogramowania do przetwarzania obrazu, kliknij PROCESS (Converted) Image (Process One) i wybierz Process Again Particles from Processed Images w podfolderach WORK. Wybierz próbkę, a następnie w oknie Proces pojedynczego obrazu zachowaj ustawienia domyślne, zaznacz opcję Praca z maską separacji (CREATE-MODIFY-INCLUDE), a następnie kliknij przycisk OK. Pod koniec procesu pojawi się NORMALNY KONIEC, jeśli wszystko jest w porządku.
    5. W oknie Kontrola separacji naciśnij OK, aby zapisać obraz z konturami przed przetwarzaniem; jeśli istnieje poprzedni obraz, zostanie on zastąpiony.
    6. W oknie Maska kontroli separacji, jeśli to konieczne, wybierz EDYTUJ, aby dodać linie separacji do maski za pomocą myszy, aby oddzielić dotykające się organizmy, które nie pojawiły się wcześniej w kroku separacji za pomocą winiet. Po zakończeniu zakończ proces, a następnie w oknie Kontrola maski separacji wybierz TAK, aby zaakceptować maskę. Pod koniec procesu pojawi się NORMALNY KONIEC, jeśli wszystko jest w porządku.
      UWAGA: Ponowne przygotowanie próbki za pomocą maski separacyjnej jest czasochłonne (może to zająć więcej niż 1,5 godziny na próbkę). Zaleca się poświęcenie wymaganego czasu w kroku 1.2.5, aby uniknąć tego dodatkowego kroku.

2. Automatyczne rozpoznawanie obiektów

UWAGA: Utwórz zestaw do automatycznego przewidywania tożsamości wykrytych obiektów, oddzielając w ten sposób organizmy od szczątków w próbce.

  1. Tworzenie zestawu edukacyjnego
    1. Skopiuj obrazy i pliki .pid skojarzone z obrazami, które będą używane do tworzenia kategorii zestawu edukacyjnego z Zooscan_scan > _work do PID_process > Unsorted_vignettes_pid.
      UWAGA: Aby zapewnić maksymalną reprezentatywność organizmów w próbkach, należy wybrać podzbiór próbek o dużej różnorodności taksonów i różnych miejscach pobierania próbek i/lub sezonach pobierania próbek.
    2. W folderze PID_process > Zestaw edukacyjny utwórz podfolder z nazwą nowego zestawu edukacyjnego (tj. yyyymmdd_raw_LS), a w nim utwórz podfoldery, które będą odpowiadać każdej kategorii zestawu edukacyjnego (np. makrobezkręgowce, szczątki, inne bezkręgowce).
      UWAGA: Aby skutecznie uzyskać strukturę wielkości zbiorowiska próbek makrobezkręgowców rzecznych, zaleca się użycie zestawu uczenia opartego tylko na trzech kategoriach: makrobezkręgowce, inne bezkręgowce i szczątki. Ten zestaw do nauki zasadniczo oddziela winiety obiektów odpowiadających organizmom od tych odpowiadających szczątkom (np. włóknom, cząstkom lub nitkowatym glonom).
    3. Przejdź do oprogramowania do przetwarzania obrazu (tylko w trybie zaawansowanym) i wybierz WYODRĘBNIJ winiety dla IDENTYFIKATORA PLANKTONU (nieposortowane winiety do treningu). Zachowaj opcje domyślne i zaznacz pole Dodaj konspekty.
    4. Przejdź do oprogramowania do automatycznej identyfikacji, kliknij Nauka, wybierz z PID_process > Learning_set utworzonego podfolderu dla nowego zestawu edukacyjnego (krok 2.1.2) i naciśnij OK.
    5. W lewej sekcji (Nieposortowane kciuki) otwartego okna wybierz folder Nieposortowane vignettes_pid. Wybierz winiety i przeciągnij je myszą z nieposortowanych kciuków do folderu odpowiadającej im kategorii w prawej sekcji, Posortowane kciuki, aby sklasyfikować każdy obiekt do zdefiniowanych kategorii. Przeniesione winiety zostaną oznaczone czerwonym znakiem X.
      UWAGA: Zdefiniuj kategorie ręcznie, tworząc podfoldery w posortowanym folderze kciuków lub utwórz je, klikając ikonę folderów w oprogramowaniu. Nie wolno przewozić więcej niż 50 winiet jednocześnie.
    6. Gdy wszystkie kategorie zostaną uzupełnione wybranymi obiektami (około 300 obiektów w kategorii), kliknij Utwórz plik edukacyjny i zapisz go pod żądaną nazwą.
      UWAGA: Zestaw edukacyjny zostanie zapisany jako plik .pid w folderze PID_process > Learning set projektu. Zaleca się stworzenie i przetestowanie kilku zestawów edukacyjnych o różnych poziomach kategorii (od form zgrubnych do subtelnych) i z różnym balansem liczby obiektów w każdej kategorii. Zacznij od zestawu do nauki zgrubnej z małą liczbą kategorii i co najmniej 50 obiektami w kategorii, a następnie zwiększ liczbę obiektów w każdej kategorii i/lub utwórz dokładniejsze zestawy do nauki. Kategoria powinna być reprezentatywna dla jej zmienności w zbiorze próbek.
  2. Ocena zestawu do nauki
    UWAGA: Przeprowadzić walidację krzyżową z dwoma krotnościami i pięcioma próbami przy użyciu metody Random Forest z oprogramowaniem do automatycznej identyfikacji, aby uzyskać macierz pomyłek wynikowej klasyfikacji obiektów.
    1. Przejdź do oprogramowania do automatycznej klasyfikacji i kliknij Analiza danych.
    2. W polu Wybierz plik edukacyjny wybierz utworzony plik zestawu edukacyjnego z PID_process > Zestaw edukacyjny.
    3. W obszarze Wybierz metodę wybierz metodę lasu losowego z krzyżową walidacją. W polu Oryginalne zmienne usuń zaznaczenie zmiennych pozycji (X, Y, XM, YM, BX, BY i Wysokość). W polu Zmienne niestandardowe zaznacz tylko ESD.
      UWAGA: Ta metoda wykorzystuje jedną losową część zestawu do uczenia się do rozpoznania drugiej części (dwie fałdy) i jest powtarzana pięć razy, aby upewnić się, że jest statystycznie solidna.
    4. Kliknij przycisk Rozpocznij analizę i zapisz wyniki w Analysis_name.txt w folderze PID_process > Prediction. Po pomyślnym zakończeniu analizy zakończ analizę danych.
    5. Przejdź do folderu PID_process > Prediction i kliknij plik krzyżowej walidacji. Pojawi się okno z macierzą pomyłek między prawdziwą klasyfikacją (wiersze) a klasyfikacją automatyczną (kolumny).
      UWAGA: Wycofanie to procent organizmów należących do grupy, która została automatycznie dobrze rozpoznana, podczas gdy precyzja 1 to procent organizmów sklasyfikowanych przez algorytm jako grupa, która nie została rozpoznana (zanieczyszczenie w grupie). Wycofanie powinno wynosić powyżej 70%, a zanieczyszczenie (1-precyzja) powinno być niższe niż 20%.
    6. Powtórz kroki 2.1-2.5, jeśli utworzono kilka zestawów do nauki i należy uzyskać przywołanie i dokładność 1 każdego z nich.
      UWAGA: Jeśli utworzono kilka zestawów uczących się, wybierz ten, który ma największą pamięć (dobre rozpoznawanie) i precyzję (niskie zanieczyszczenie) grupy zainteresowania (tj. makrobezkręgowce), aby przetestować automatyczne przewidywanie zestawu próbek w następnym kroku.
  3. Przewidywanie identyfikacji makrobezkręgowców
    UWAGA: Użyj wybranego zestawu uczącego się, aby przewidzieć tożsamość wszystkich obiektów w podzbiorze próbek za pomocą oprogramowania do automatycznej identyfikacji z algorytmem lasu losowego.
    1. Przejdź do oprogramowania do automatycznej identyfikacji i kliknij Analiza danych.
    2. W polu Wybierz plik edukacyjny wybierz plik zestawu edukacyjnego z zestawu PID_process > edukacyjnego, który ma być używany do przewidywania.
    3. W obszarze Select Sample File(s) (Wybierz przykładowe pliki) wybierz z folderu PID_results próbki (pliki PID), które mają być przewidywane.
      UWAGA: Przetwarzaj maksymalnie 20 plików .pid w tym samym czasie, aby uniknąć błędów związanych z problemami z pamięcią. Jeśli w tym samym czasie przetwarzanych jest zbyt wiele plików .pid, proces pokaże prawidłowe zakończenie, ale może nie zostać dobrze przetworzony, a w kolejnych krokach może wystąpić błąd podczas przetwarzania za pomocą oprogramowania do przetwarzania obrazu.
    4. W polu Wybierz metodę wybierz metodę lasu losowego. Zaznacz pole wyboru Zapisz szczegółowe wyniki dla każdej próbki. W polu Zmienne oryginalne usuń zaznaczenie zmiennych pozycji (X, Y, XM, YM, BX, BY i Wysokość). W polu Zmienne niestandardowe zaznacz tylko ESD.
    5. Kliknij przycisk Rozpocznij analizę i zapisz wyniki w Analysis_name.txt w folderze PID_process > Prediction.
  4. Walidacja ręczna
    UWAGA: Ekspert ręcznie weryfikuje prognozę z poprzedniego kroku, aby ponownie przeklasyfikować błędnie sklasyfikowane obiekty do właściwej kategorii.
    1. Skopiuj pliki Analysis_sample_dat1.txt, które mają zostać zweryfikowane, z folderu PID_process > Prediction do folderu PID_process > Pid_results.
    2. Przejdź do oprogramowania do przetwarzania obrazu i wybierz opcję WYODRĘBNIJ winiety w folderach zgodnie z PRZEWIDYWANIEM lub WALIDACJĄ. Następnie wybierz opcję Użyj PRZEWIDYWANYCH plików z folderu "pid_results". Zachowaj ustawienia domyślne i naciśnij OK.
    3. Oprogramowanie tworzy folder o nazwie sample_yyyymmdd_hhmm_to_validate z przewidywanymi obiektami w folderze PID_process > Posortowane winiety.
    4. Przejdź do folderu PID_process > Posortowane winiety i skopiuj go sample_yyyymmdd_ hhmm_to_validate. Zastąp nazwę folderu _to walidacji nazwą _validated.
    5. Aby ręcznie sprawdzić poprawność automatycznej klasyfikacji, otwórz folder sample_yyyymmdd_ hhmm_validated i przejrzyj wszystkie winiety z każdego podfolderu (kategorii) w celu określenia, czy nie ma tam błędnie sklasyfikowanych obiektów. Gdy jeden obiekt zostanie błędnie sklasyfikowany, przeciągnij winietę za pomocą myszy do odpowiedniego folderu (kategorii).
    6. Przejdź do oprogramowania do przetwarzania obrazu i wybierz LOAD Identifications z posortowanych winiet. Zachowaj ustawienia domyślne i wybierz yyyymmdd_hhmm_name_validated do przetworzenia.
    7. Przejdź do PID_process > Pid_results > Dat1_validated, w którym został utworzony plik o nazwie Id_from_sorted_vignettes_yyyymmdd_hhmm.txt i jeden plik .txt dla każdej ze zweryfikowanych próbek (sample_tot_1_dat1.txt).
      UWAGA: Te pliki .txt zawierają nową kolumnę prezentującą prognozę, zwaną pred_valid_Id_yyyymmdd_hhmm, która określa klasyfikację ekspercką każdego obiektu (tj. klasyfikację zweryfikowaną). Na tym etapie, podczas walidacji, mogą zostać utworzone nowe kategorie (np. dokładniejsze kategorie taksonomiczne). Zachowaj jednak nazwę oryginalnej kategorii w nowej nazwie (np. macroinvertebrate_chironomidae). Pozwala to na odtworzenie oryginalnej kategorii podczas obliczania przywołania i precyzji oraz na łatwe grupowanie wszystkich makrobezkręgowców w celu obliczenia parametrów struktury wielkości zbiorowiska (tj. spektrum wielkości i różnorodności wielkości). Plik tekstowy zawiera dane skojarzone z każdym obiektem, w tym osie mniejsze i główne, które są używane do uzyskania elipsoidalnej objętości każdego organizmu jako miary indywidualnego rozmiaru ciała. Ponadto dwie ostatnie kolumny tabeli zawierają przewidywane i zwalidowane kategorie każdego obiektu (wiersza), które pozwalają na obliczenie, według kategorii, przywołania i precyzji zbioru uczenia się na podzbiorze prób. figure-protocol-1

Rysunek 1: Wykres pracy przedstawiający sekcję 1 i sekcję 2 protokołu. Czasy są poglądowe i mogą się zmieniać w zależności od komputera, obfitości winiet do przetworzenia oraz liczby kategorii zestawu do nauki. Przypadek ten odpowiada walidacji zbioru uczenia się składającego się z trzech kategorii na zestawie 42 podpróbek (w sumie 47 473 winiet). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

3. Obliczanie indywidualnego rozkładu rozmiarów, widm rozmiarów i metryk wielkości

UWAGA: Obliczenia wymienione w tej sekcji zostały wykonane przy użyciu Matlaba (zobacz skrypt jako Plik uzupełniający 1).

  1. Indywidualny rozkład wielkości
    1. Ostatnia kolumna pliku Id_from_sorted_vignettes_YYYYMMDD_HHHH.txt zawiera zweryfikowaną klasyfikację obiektów. Zaznacz tylko obiekty sklasyfikowane jako makrobezkręgowce, aby zobrazować ich indywidualny rozkład wielkości w próbce.
      UWAGA: Wielkość ciała poszczególnych osób odpowiada objętości elipsoidalnej organizmów makrobezkręgowych. System zapewnia pomiary w pikselach.
    2. Połącz wektory z pomiarami rozmiaru z obu skanów, ponieważ każda frakcja ma inny wykładnik podpróbkowania. Przed konkatenacją należy skorygować frakcjonowanie, replikując wektory wielkości tyle razy, ile odpowiadająca im podpróbka została pofrakcjonowana.
      UWAGA: Ten krok jest potrzebny, jeśli skan odpowiada frakcji próbki (tj. grubej lub drobnej).
    3. Oblicz objętość elipsoidalną z osi głównej (M) i mniejszej (m) elipsoid prolate o tych samych obszarach pikseli co organizmy. Przed obliczeniem objętości elipsoidalnej przekonwertuj oś główną (M) i pomocniczą (m) z pikseli na milimetry (mm) z następującym współczynnikiem konwersji (cf):
      1 piksel = 2,400 dpi
      1 cal = 25,4 mm
      cf = 25,4/2400
      Objętość elipsoidalna (elipVol z jednostkami w mm3) odpowiada:
      figure-protocol-2
    4. Przedstaw funkcję gęstości prawdopodobieństwa indywidualnego rozkładu wielkości na skali logarytmu2.
  2. Różnorodność rozmiarów
    1. Oblicz różnorodność rozmiarów (Sd) zgodnie z Quintana et al. (2008)8, jak w García-Comas et al. (2016)35:
      figure-protocol-3
      gdzie px(x) jest funkcją gęstości prawdopodobieństwa o rozmiarze x, a x reprezentuje logarytm2 (ellipVol). Miarą tą jest zatem wskaźnik różnorodności Shannona dostosowany do miary ciągłej, takiej jak rozkład wielkości osobnika w społeczności.
  3. Znormalizowane spektrum wielkości biowoluminu (NBSS)
    1. Zdefiniuj klasy wielkości NBSS, ustanawiając dolną granicę widma jako kwantyl 0,01 rozkładu wielkości makrobezkręgowców w próbkach i tworząc klasy wielkości według skali geometrycznej o podstawie 2, aż do objęcia największego organizmu w próbkach.
      UWAGA: Szerokość klasy rozmiarów zwiększa się wraz z rozmiarem, aby uwzględnić większą zmienność związaną z większymi rozmiarami. NBSS analizowanych tu zbiorowisk makrobezkręgowców miał 14 klas wielkości (tabela 1).
    2. Uzyskaj znormalizowaną bioobjętość, dzieląc całkowitą bioobjętość w każdej klasie wielkości przez szerokość klasy wielkości.
  4. Rozmiar, nachylenie widma
    1. Obliczanie nachylenia liniowego NBSS.
      UWAGA: Nachylenie (μ) oblicza się na podstawie relacji między logarytmem2 (punkt środkowy klasy wielkości) a logarytmem2 (znormalizowana biomasa) w klasach wielkości większych niż moda, ignorując wszelkie puste (w tym badaniu klasy wielkości od 3 do 14).
jezdnego jezdnego TGL TGL zł zł TGL TGL TGL TGL TGL TGL TGL TGL TGL TGL TGL TGL osób zł zł jedn.
Limity klas wielkości (mm3)Klasa wielkości punktu środkowego (mm3)
0,12360,1855
0,2473Numer katalogowy: 0,3709
0,49460,7418
0,9891Numer katalogowy: 1,4837
Numer katalogowy: 1,9783Numer katalogowy: 1,4837
3,95605,9348
7,9131Numer katalogowy: 11,8696
Numer katalogowy: 15 826123 7392
31 652247 4783
Numer katalogowy: 63 3044Numer katalogowy: 94 9567
Numer katalogowy: 126 6089Numer katalogowy: 189,9133
253,2178Numer katalogowy: 379 8267
506 43007597,7000
Numer katalogowy: 1012,900015193 0000
2025,7000

Tabela 1: Klasy wielkości znormalizowanego spektrum wielkości biomasy (NBSS). W tabeli przedstawiono również limity 15 klas wielkości oraz punkty środkowe klasy wielkości organizmów.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Akwizycja cyfrowych obrazów próbek makrobezkręgowców
Niuanse skanowania: Osadzanie etanolu w podajniku skanowania
Podczas testowania systemu pod kątem makrobezkręgowców kilka skanów było słabej jakości. Ciemny, nasycony obszar w tle uniemożliwiał normalne przetwarzanie obrazu i pomiar poszczególnych rozmiarów makrobezkręgowców (Rysunek 2). Podano kilka powodów pojawienia się nasyconych obszarów w tle lub silnie rozpikselowanych obrazów: (1) obecność zbyt wiel...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Adaptacja metodologii opisanej przez Gorsky'ego i wsp. 2010 dla makrobezkręgowców rzecznych pozwala na uzyskanie wysokiej dokładności klasyfikacyjnej w szacowaniu struktury wielkości zbiorowisk u makrobezkręgowców słodkowodnych. Wyniki sugerują, że protokół może skrócić czas szacowania indywidualnej struktury wielkości w próbce do około 1 godziny. W związku z tym proponowany protokół ma na celu promowanie rutynowego stosowania widm wielkości makrobezkręgowców jako szybkiego i integracyjnego bioindykatora do oceny wpływu ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak potencjalnych konkurencyjnych interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez hiszpańskie Ministerstwo Nauki, Innowacji i Uniwersytetów (numer grantu RTI2018-095363-B-I00). Dziękujemy członkom CERM-UVic-UCC: Èlii Bretxie, Annie Costarrosie, Lai Jiménez, Maríi Isabel González, Marcie Jutglar, Francescowi Llachowi i Núrii Sellarès za ich pracę w zakresie pobierania próbek makrobezkręgowców w terenie i sortowania laboratoryjnego oraz Davidowi Albesie za współpracę przy skanowaniu próbek. Na koniec dziękujemy Josepowi Marii Gili i Institut de Ciències del Mar (ICM-CSIC) za udostępnienie wyposażenia laboratoryjnego i skanera.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
ZlewkaLabboxMożna użyć innych pojemników Woda
dzbanizowanaIcopresa  8420239600123Do rozcieńczania etanolu
LejekVitlab41094
Fiolki szklane 8 mlLabboxSVSN-C10-1951 fiolka/podpróbka
Oprogramowanie ImageJ Bezpłatny dostępWersja 4.41o/ Oprogramowanie do przetwarzania obrazu
Duża ramaHydroptyczna  Dostarczone przez ZooScan24,5 cm x 15,8 cm
Monalcol 96 (Etanol 96)Montplet1050JE001
Oprogramowanie do identyfikacji planktonuBezpłatny dostępWersja 1.2.6/ Oprogramowanie do automatycznej identyfikacji
SitoCisa26852.2Otwór nominalny 500&mikro; i apertura nominalna 0,5 cm
PęsetaBondlineB5SANierdzewny, antymagnetyczny, przeciwkwasowe
oprogramowanie VueScan 9 x 64 (9.5.09)Wersja hydroptyku9.0.51/ Oprogramowanie Sacn
Igła drewnianaMożna użyć dowolnej igły plastikowej lub drewnianej
Oprogramowanie Zooprocess Bezpłatny dostępWersja 7.14/Oprogramowanie do przetwarzania obrazu
ZooScan Skaner Hydroptic54Wersja III/ Skaner

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Birk, S., et al. Three hundred ways to assess Europe's surface waters: An almost complete overview of biological methods to implement the Water Framework Directive. Ecological Indicators. 18, 31-41 (2012).
  2. Basset, A., Sangiorgio, F., Pinna, M. Monitoring with benthic macroinvertebrates: advantages and disadvantages of body size descriptors. Aquatic Conservation: Marine and Freshwater Ecosystems. 14, S43-S58 (2004).
  3. Reyjol, Y., et al. Assessing the ecological status in the context of the European Water Framework Directive: Where do we go now. Science of the Total Environment. 497-498, 332-344 (2014).
  4. Brown, J. H., Gillooly, J. F., Allen, A. P., Savage, V. M., West, G. B. Toward a metabolic theory of ecology. Ecology. 85 (7), 1771-1789 (2004).
  5. Woodward, G., et al. Body size in ecological networks. Trends in Ecology & Evolution. 20 (7), 402-409 (2005).
  6. Sprules, W. G., Barth, L. E. Surfing the biomass size spectrum: Some remarks on history, theory, and application. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences. 73 (4), 477-495 (2016).
  7. White, E. P., Ernest, S. K. M., Kerkhoff, A. J., Enquist, B. J. Relationships between body size and abundance in ecology. Trends in Ecology & Evolution. 22 (6), 323-330 (2007).
  8. Quintana, X. D., et al. A nonparametric method for the measurement of size diversity with emphasis on data standardization. Limnology and Oceanography - Methods. 6 (1), 75-86 (2008).
  9. Blanchard, J. L., Heneghan, R. F., Everett, J. D., Trebilco, R., Richardson, A. J. From bacteria to whales: Using functional size spectra to model marine ecosystems. Trends in Ecology & Evolution. 32 (3), 174-186 (2017).
  10. Petchey, O. L., Belgrano, A. Body-size distributions and size-spectra: Universal indicators of ecological status. Biology Letters. 6 (4), 434-437 (2010).
  11. Emmrich, M., et al. Geographical patterns in the body-size structure of European lake fish assemblages along abiotic and biotic gradients. Journal of Biogeography. 41 (12), 2221-2233 (2014).
  12. Arranz, I., Brucet, S., Bartrons, M., García-Comas, C., Benejam, L. Fish size spectra are affected by nutrient concentration and relative abundance of non-native species across streams on the NE Iberian Peninsula. Science of the Total Environment. 795, 148792(2021).
  13. Vila-Martínez, N., Caiola, N., Ibáñez, C., Benejam, L. l, Brucet, S. Normalized abundance spectra of the fish community reflect hydropeaking on a Mediterranean large river. Ecological Indicators. 97, 280-289 (2019).
  14. Benejam, L. l, Tobes, I., Brucet, S., Miranda, R. Size spectra and other size-related variables of river fish communities: systematic changes along the altitudinal gradient on pristine Andean streams. Ecological Indicators. 90, 366-378 (2018).
  15. Sutton, I. A., Jones, N. E. Measures of fish community size structure as indicators for stream monitoring programs. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences. 77 (5), 824-835 (2019).
  16. Murry, B. A., Farrell, J. M. Resistance of the size structure of the fish community to ecological perturbations in a large river ecosystem. Freshwater Biology. 59, 155-167 (2014).
  17. Townsend, C. R., Thompson, R. M. Body size in streams: Macroinvertebrate community size composition along natural and human-induced environmental gradients. In Body Size: The Structure and Function of Aquatic Ecosystems. Hildrew, A. G., Raffaelli, D. G., Edmonds-Brown, R. , Cambridge University Press. Cambridge, UK. (2007).
  18. Gjoni, V., et al. Patterns of functional diversity of macroinvertebrates across three aquatic ecosystem types, NE Mediterranean. Mediterranean Marine Science. 20 (4), 703-717 (2019).
  19. Pomeranz, J. P. F., Warburton, H. J., Harding, J. S. Anthropogenic mining alters macroinvertebrate size spectra in streams. Freshwater Biology. 64 (1), 81-92 (2019).
  20. García-Girón, J., et al. Anthropogenic land-use impacts on the size structure of macroinvertebrate assemblages are jointly modulated by local conditions and spatial processes. Environmental Research. 204, 112055(2022).
  21. Demi, L. M., Benstead, J. P., Rosemond, A. D., Maerz, J. C. Experimental N and P additions alter stream macroinvertebrate community composition via taxon-level responses to shifts in detrital resource stoichiometry. Functional Ecology. 33 (5), 855-867 (2019).
  22. Basset, A., et al. A benthic macroinvertebrate size spectra index for implementing the Water Framework Directive in coastal lagoons in Mediterranean and Black Sea ecoregions. Ecological Indicators. 12 (1), 72-83 (2012).
  23. Ärje, J., et al. Automatic image-based identification and biomass estimation of invertebrates. Methods in Ecology and Evolution. 11 (8), 922-931 (2020).
  24. Raitoharju, J., et al. Benchmark database for fine-grained image classification of benthic macroinvertebrates. Image and Vision Computing. 78, 73-83 (2018).
  25. Lytle, D. A., et al. Automated processing and identification of benthic invertebrate samples. Journal of the North American Benthological Society. 29 (3), 867-874 (2010).
  26. Serna, J. P., Fernández, D. S., Vélez, F. J., Aguirre, N. J. An image processing method for recognition of four aquatic macroinvertebrates genera in freshwater environments in the Andean region of Colombia. Environmental Monitoring and Assessment. 192, 617(2020).
  27. Gorsky, G., et al. Digital zooplankton image analysis using the ZooScan integrated system. Journal of Plankton Research. 32 (3), 285-303 (2010).
  28. Marcolin, C. R., Schultes, S., Jackson, G. A., Lopes, R. M. Plankton and seston size spectra estimated by the LOPC and ZooScan in the Abrolhos Bank ecosystem (SE Atlantic). Continental Shelf Research. 70, 74-87 (2013).
  29. Silva, N., Marcolin, C. R., Schwamborn, R. Using image analysis to assess the contributions of plankton and particles to tropical coastal ecosystems. Estuarine, Coast and Shelf Science. 219, 252-261 (2019).
  30. Vandromme, P., et al. Assessing biases in computing size spectra of automatically classified zooplankton from imaging systems: A case study with the ZooScan integrated system. Methods in Oceanography. 1-2, 3-21 (2012).
  31. Naito, A., et al. Surface zooplankton size and taxonomic composition in Bowdoin Fjord, north-western Greenland: A comparison of ZooScan, OPC and microscopic analyses. Polar Science. 19, 120-129 (2019).
  32. García-Comas, C., Picheral, E. Zooprocess/Plankton Identifier protocol for computer assisted zooplankton sorting. , Available from: https://manualzz.com/doc/43116355/zooprocess—plankton-identifier-protocol-for (2013).
  33. Picheral, E. ZooSCAN: Manual to scan and process samples. Quantitative Imaging Platform of Villefranche sur Mer (PlQv). , Available from: http://www.hydroptic.com/assets/uploads/files/documentations/ae4e0-zooscan_user_manual.pdf (2020).
  34. Protocolo de muestreo y laboratorio de fauna bentónica de invertebrados en ríos vadeables. CÓDIGO: ML-Rv-I-2013. Ministerio de Agricultura, Alimentación y Medio Ambiente. , Available from: https://www.miteco.gob.es/es/agua/temas/estado-y-calidad-de-las-aguas/ML-Rv-I-2013_Muestreo%20y%20laboratorio_Fauna%20bent%C3%B3nica%20de%20de%20invertebrado_%20R%C3%Ados%20vadeables_24_05_2013_tcm30-175284.pdf (2013).
  35. García-Comas, C., et al. Prey size diversity hinders biomass trophic transfer and predator size diversity promotes it in planktonic communities. Proceedings of the Royal Society Biological Sciences. 283 (1824), 20152129(2016).
  36. García-Comas, C., et al. Mesozooplankton size structure in response to environmental conditions in the East China Sea: How much does size spectra theory fit empirical data of a dynamic coastal area. Progress in Oceanography. 121, 141-157 (2014).
  37. Marquina, D., Buczek, M., Ronquist, F., Lukasik, P. The effect of ethanol concentration on the morphological and molecular preservation of insects for biodiversity studies. PeerJ. 9, 10799(2021).
  38. Bell, J. L., Hopcroft, R. R. Assessment of ZooImage as a tool for the classification of zooplankton. Journal of Plankton Research. 30 (12), 1351-1367 (2008).
  39. Colas, F., et al. The ZooCAM, a new in-flow imaging system for fast onboard counting, sizing and classification of fish eggs and metazooplankton. Progress in Oceanography. 166, 54-65 (2018).
  40. Bachiller, E., Fernandes, J. A., Irigoien, X. Improving semiautomated zooplankton classification using an internal control and different imaging devices. Limnology and Oceanography Methods. 10 (1), 1-9 (2012).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Image ProcessingMacroinvertebrate Size StructureRiver MacroinvertebratesAutomatic Body Size MeasurementCommunity Size SpectrumFreshwater BioassessmentScanning SystemArtificial Intelligence ClassificationRandom Forest MethodManual Validation

Related Articles