Artykuł metodologiczny

Szybka ocena jakości białka błonowego za pomocą chromatografii wykluczającej rozmiaru fluorescencyjnego

4.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64322

⸱

6 stycznia 2023

 ,  ,  , 
1Peak Proteins Ltd.

W tym artykule

Podsumowanie

Niniejszy protokół opisuje procedurę przeprowadzenia chromatografii wykluczenia rozmiaru fluorescencyjnego (FSEC) białek błonowych w celu oceny ich jakości na potrzeby dalszej analizy funkcjonalnej i strukturalnej. Przedstawiono reprezentatywne wyniki FSEC zebrane dla kilku receptorów sprzężonych z białkiem G (GPCR) w warunkach rozpuszczalnych w detergentach i bezdetergentowych.

Streszczenie

Podczas wyjaśniania struktury białek błonowych i charakteryzacji biofizycznej powszechne jest testowanie licznych konstrukcji białkowych zawierających różne tagi, obcięcia, delecje, włączenia partnerów fuzji oraz mutacje stabilizujące, aby znaleźć taki, który nie jest agregowany po ekstrakcji z błony. Ponadto przesiewowe filtry buforowe w celu określenia detergentu, dodatku, ligandu lub polimeru, który zapewnia najbardziej stabilizujące warunki dla białka błonowego, jest ważną praktyką. Wczesna charakterystyka jakości białek błonowych za pomocą chromatografii wykluczenia rozmiaru fluorescencyjnego stanowi potężne narzędzie do oceny i klasyfikowania różnych konstrukcji lub warunków bez konieczności oczyszczania białek, a także minimalizuje zapotrzebowanie na próbkę. Białka błonowe muszą być oznaczone fluorescencją, najczęściej poprzez ekspresję za pomocą tagu GFP lub podobnego. Białko może być rozpuszczane bezpośrednio z całych komórek, a następnie prymitywnie klarowizowane przez wirowanie; następnie białko jest przekazywane przez kolumnę wykluczającą wielkość, a następnie pobierany jest ślad fluorescencyjny. Przedstawiono tutaj metodę przetwarzania danych FSEC oraz reprezentatywnych FSEC dotyczących GPCR celujących w receptor sfingozyny-1-fosforanu (S1PR1) oraz receptor serotoniny (5HT2AR).

Wprowadzenie

Chromatografia wykluczenia rozmiaru (SEC), znana również jako chromatografia filtracyjna żelowa, jest powszechnie stosowana w nauce o białkach1. Podczas SEC białka są rozdzielane na podstawie ich promienia hydrodynamicznego, który zależy od rozmiaru i kształtu białka2. Krótko mówiąc, to rozdzielenie osiąga się poprzez umieszczenie próbek białka w przepływie na upakowane warstwo porowatych kulek działających jak sito molekularne. Koraliki używane do tego są często sieciowane agarozy o określonym zakresie rozmiarów porów, co pozwala białkom przedostać się lub zostać wykluczonym z porów koralików 3,4,5,6,7. Białka o mniejszych promieniach hydrodynamicznych spędzają więcej czasu w porach i dlatego przepływają przez upakowane dno wolniej, podczas gdy większe białka spędzają więcej czasu poza kulkami (objętość wyłączona) i poruszają się przez upakowane dno szybciej. SEC może być stosowany jako etap oczyszczania białek,gdy używa się kolumny przygotowawczej. Gdy używa się kolumny analitycznej, SEC może być użyte do analizy jakości i właściwości białka2. Na przykład agregaty białkowe, które mogą być obecne w próbce i wskazywać na niskiej jakości białka, mają tendencję do bardzo dużych rozmiarów, co oznacza, że poruszają się tylko w objętości wykluczonej i są eluowane z kolumny w najwcześniejszym punkcie; ten objętość nazywana jest kolumną pustą lub pustą objętością. Ponadto do kalibracji kolumny można stosować standardy masy cząsteczkowej, co pozwala na interpolację szacowanej masy cząsteczkowej interesującego białka na podstawie krzywej standardowej.

Zazwyczaj absorpcja białka na 280 nm służy do monitorowania elucii białka z kolumny wykluczającej rozmiar. Ogranicza to użycie SEC jako narzędzia analitycznego, dopóki interesujące białko nie będzie w dużej mierze wolne od zanieczyszczających białek, na przykład na ostatnim etapie oczyszczania białek. Jednak fluorescencyjne SEC (FSEC) wykorzystuje interesujące białko, które jest znakowane fluorescencjo. Dlatego sygnał fluorescencjonalny może być użyty do specyficznego monitorowania wydzielania interesującego białka w obecności innych białek lub nawet prymitywnych mieszanin 8,9. Ponadto, ponieważ sygnały fluorescencyjne są bardzo czułe, można przeprowadzić skuteczną analizę na próbkach o bardzo niskiej zawartości białka. Białko będące przedmiotem interesu jest często znakowane fluorescencją poprzez uwzględnienie zielonego białka fluorescencyjnego (GFP) lub wzmocnionego znacznika GFP (eGFP) w konstrukcji ekspresji. Sygnał fluorescencjonalny można następnie monitorować poprzez wzbudzenie przy 395 nm lub 488 nm oraz wykrywanie emisji fluorescencyjnej przy 509 nm lub 507 nm dla GFP lub eGFP, odpowiednio10.

Zaletą wykorzystania sygnału fluorescencyjnego do monitorowania wydzielania białek z kolumny SEC jest FSEC cennym narzędziem do analizy próbek błonowych, gdy poziomy ekspresji są szczególnie niskie w porównaniu z białkami rozpuszczalnymi. Co istotne, jakość i właściwości białek błonowych można analizować bezpośrednio po rozpuszczeniu z prymitywnych lizatów, bez konieczności optymalizacji procesu oczyszczania na początku11,12. Z tych powodów FSEC może być używany do szybkiej analizy jakości białka błonowego, jednocześnie badając różne czynniki niezbędne do poprawy zachowania białka błonowego w roztworze. Na przykład powszechne jest testowanie licznych konstrukcji zawierających różne tagi, skracania, delecje, wstawiania partnerów fuzji oraz mutacje stabilizujące, aby znaleźć taką, która nie jest agregowana po ekstrakcji z błony13,14. Ponadto przesiewowe filtry buforowe w celu określenia detergentu, dodatku, ligandu lub polimeru, który zapewnia najbardziej stabilizujące warunki dla białka błonowego, może określić najlepszy skład buforu do oczyszczania białek lub zapewnienia stabilności w dalszych zastosowaniach, takich jak badania biofizyczne czy charakterystyka strukturalna.

Ogólnym celem metody FSEC jest zatem zebranie profilu elucii kolumny SEC dla interesującego białka błony docelowej. Ponadto, ponieważ fluorescencja jest stosowana, ślad SEC jest zbierany w najwcześniejszym możliwym momencie optymalizacji konstrukcji i warunków przed długotrwałym oczyszczaniem. Ślad FSEC może być używany jako narzędzie porównawcze do oceny prawdopodobieństwa sukcesu oczyszczenia białka błonowego przy różnych warunkach buforowych lub konstrukcjach błonowych. W ten sposób zbieranie profili FSEC może być wykorzystane jako szybki, iteracyjny proces, aby dojść do optymalnego projektu konstrukcji i składu buforu przed poświęceniem wysiłku na generowanie ilości czystego białka potrzebnych do innych metod analizy.

Protokół

1. Przygotowanie detergentów i buforów do FSEC

  1. Przygotuj roztwór detergentu.
    1. Aby przygotować roztwór wywarczy 20 mL, zważ 4 g proszku maltozydu dodecylowego (DDM) i 0,4 g proszku hemisukcynianu cholesterylowego (CHS), a następnie zrób do 20 ml z laboratoryjnie destylowanym H2O.
    2. Po dodaniu wszystkich składników mieszaj z inwersją end-to-end w temperaturze 4 °C, aż składniki całkowicie się rozpuszczą. Zaleca się mieszanie na koniec przez noc w temperaturze 4 °C.
    3. Zachowaj i przechowuj zapasy detergentów w temperaturze −20 °C do czasu użycia. Jeśli bulion trzeba użyć natychmiast, przechowuj go na lodzie.
      UWAGA: Standardowy zapas detergentów użyty w tej pracy to mieszanka 20% (w/v) DDM i 2% (w/v) CHS (patrz Tabela materiałów). Można stosować różne detergenty (np. neopentylglikol laurylmaltozowy; LMNG), czyli stosowanie ekstrakcji bezdetergentowej z użyciem polimerów, takich jak kwas styren-maleinowy (SMA), można testować. Należy to ustalić przy projektowaniu warunków eksperymentalnych do testowania.
  2. Przygotuj bufor rozpuszczalności.
    1. Przygotuj bufor rozpuszczalności, łącząc właściwą wagę lub objętość składników, aby uzyskać końcowe stężenie 100 mM HEPES, 200 mM NaCl, 20 % (v/v) glicerolu oraz 1x koktajlu inhibitora proteazy (patrz Tabela materiałów) w zlewce.
      UWAGA: W niniejszym badaniu przygotowanie 50 mL buforu rozpuszczalności wystarczyło do przetwarzania pięciu próbek.
    2. Dodaj do zlewki objętość 0,7 (np. 35 mL przy produkcji 50 mL buforu) laboratoryjnie destylowanegoH2 O.
    3. Wymieszaj mieszadło magnetyczne i używaj pH pH, regulując pH bufora do 7,5 przez kroplę dodając skoncentrowane NaOH.
    4. Za pomocą cylindra pomiarowego uzupełnij bufor do ostatecznej wymaganej objętości laboratoryjnie destylowanym H2O.
  3. Przygotuj bufor biegu SEC.
    1. Przygotuj bufor biegający SEC, łącząc właściwą masę lub objętość składników, aby uzyskać końcowe stężenie 100 mM HEPES, 150 mM NaCl i 10% (v/v) glicerolu w zlewce.
      UWAGA: W niniejszym badaniu przygotowanie 600 mL buforu SEC wystarczyło do przeprowadzenia pięciu próbek.
    2. Do zlewki należy dodać 0,7 objętości (np. 420 mL przy produkcji 600 mL buforu) laboratoryjnie destylowanegoH2O.
    3. Wymieszaj mieszadło magnetyczne i używaj pH pH, regulując pH bufora do 7,5 przez kroplę dodając skoncentrowane NaOH.
    4. Za pomocą cylindra pomiarowego uzupełnij bufor do ostatecznej wymaganej objętości laboratoryjnie destylowanym H2O.
    5. Przefiltruj bufor SEC przez filtr porowy o średnicy 0,45 μm na butelce pod próżnią (patrz Tabela materiałów).
    6. Po przejściu bufora przez filtr, odgazuj go, zostawiając pod próżnią, aż po potrząsaniu nie pojawią się już pęcherzyki.
    7. Dodaj końcowe stężenie 0,03% (w/v) DDM i 0,003% (w/v) CHS do bufora SEC, dodając wymaganą objętość zapasów detergentów przygotowanych w kroku 1 (np. 0,9 mL przy produkcji 600 mL bufora SEC).
    8. Przed użyciem schłodź bufor.
      UWAGA: Różne bufory mogą być stosowane w zależności od testowanych warunków. Na przykład, jeśli testujemy wpływ różnych detergentów na interesujące białko, idealnie trzeba by przygotować bufor z tym samym detergentem, co ten używany do rozpuszczania białka. Jeśli testujemy warunki bezdetergentowe za pomocą SMA, detergent powinien być całkowicie wyłączony z bufora SEC. Jednak szczegóły dotyczące modyfikacji protokołów dotyczących przesiewania detergentów znajdziesz w sekcji dyskusji.

2. Przygotowanie próbek do FSEC

  1. Przygotujcie granulki komórkowe.
    UWAGA: Punktem wyjścia do testu jest pobranie pelletu komórkowego z kultury ekspresji komórek zawiesinowych białka oznaczonego tagowaniem GFP (lub innym fluorescencyjnie oznakowanym) białkiem zainteresowanym. Dokładne terminy i warunki pobierania będą zależeć od ekspresowanego białka, używanej linii komórkowej, warunków w tych komórkach oraz metody indukowania ekspresji białek. Te szczegóły wykraczają poza zakres tego protokołu. W tym badaniu użyto 0,5-1 g granulatu komórkowego Sf21 na każdy poddany test, co odpowiada 25-50 ml hodowli 2-3 dni po zakażeniu z około 4 x 10 6 żywotnymi komórkami/mL rozcieńczenia 1:20 baculowirusa P2. Prosimy zauważyć, że opisany tutaj protokół został przetestowany i wykazuje równie dobre działanie z podobną mokrą masą pelletów komórkowych z innych linii eukariotycznych (np. HEK293E).
    1. Gdy komórki z hodowli zawiesin są gotowe do pobrania, przenieś 25-50 mL hodowli aliquotów do stożkowych probówek o pojemności 50 mL.
    2. Przeciwważ rurki i użyj wirówki stołowej w wysuwanym wiadrze (patrz Tabela materiałów) o stężeniu 2000 x g przez 15 minut w temperaturze pokojowej, aby rozpylić ogniwa.
    3. Usuń i wyrzuć supernatant hodowli, delikatnie go przechylając, lub użyj pipety 50 mL z wypełniaczem do pipetu, jeśli granulka komórkowa jest szczególnie luźna.
    4. Jeśli komórki zostaną natychmiast użyte do analizy, umieść granulkę na lodzie i przejdź od razu do kroku 5. Jeśli komórki mają być zachowane na późniejszy etap, należy je zamrozić, umieszczając je w temperaturze -80 °C.
    5. Jeśli pellet komórkowy był przechowywany w temperaturze -80 °C, szybko go rozmroz, inkubując w temperaturze pokojowej przez 15 minut lub do momentu, gdy próbka przestanie być zamrożona. Po tym kroku natychmiast przenieś próbkę na lód.
  2. Ponownie zawiesić i rozpuścić próbkę.
    1. Dodaj 2 mL buforu solubilizacyjnego (krok 1.2) do osadu komórkowego.
    2. Inkubuj z inwersją end-to-end w temperaturze 4 °C przez 15-30 minut, aż uzyskasz jednorodność.
    3. Dodaj gotowy materiał detergentowy (krok 1.1) (np. 100 μL 20% DDM/2% CHS), aby uzyskać końcowe stężenie 1% DDM/0,1% CHS.
    4. Rozpuszczaj przez 30 minut z inwersją end-to-end w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Jeśli to pożądane, można testować wiele warunków równolegle. Liczba równoległych próbek, które można przetworzyć jednocześnie, zależy od dostępnego systemu do przeprowadzania eksperymentu SEC. W opisanym tutaj układzie możliwe było przetwarzanie do pięciu próbek jednocześnie.
  3. Wykonaj niskoobrotowy etap wirowania.
    1. Wiruj próbkę w schłodzonej (4 °C) wirówce stołowej w obrotowym wiadrze o stężeniu 2000 x g przez 15 minut.
  4. Wykonaj szybki etap wirowania.
    1. Ostrożnie przelać supernatant z niskoobrotowej wirówki do rurek ultra-wirowania (np. rurki 0,5-2 mL), używając tępego końca igły przymocowanej do strzykawki 5 mL, uważając, aby nie zakłócić granulki podczas niskiego wirowania.
    2. Zrównoważ pary rurek z dokładnością do 0,05 g i umieść je w wirniku ultrawirówki o stałym kącie (patrz Tabela materiałów).
    3. Wirówka w 4 °C przez 30 minut przy 250 000 x g.

3. Chromatografia wykluczenia rozmiaru (SEC)

  1. Przygotuj system szybkiej chromatografii białkowej (FPLC) i wyrównaj kolumnę.
    1. Przygotuj system zgodnie z instrukcjami producenta (patrz Tabela materiałów), na przykład napełniając system buforem SEC i oczyszczając pompy z powietrza.
    2. Połącz kolumnę SEC z FPLC, upewniając się, że powietrze nie dostaje się do kolumny. Osiąga się to poprzez zastosowanie ciśnienia zwrotnego na kolumnę SEC za pomocą strzykawki wypełnionej wodą (przymocowanej do dolnej części kolumny), aby wykonać połączenie kropla z drogą przepływu systemu FPLC.
    3. Wstępnie wyważ kolumnę SEC, przemywając ją najpierw w objętościach 1,5 kolumny (36 mL dla kolumny 24 mL) laboratoryjnie destylowanego i przefiltrowanegoH2O, a następnie w 1,5 objętości bufora SEC przy zalecanym przepływie i ciśnieniu dla kolumny (patrz Tabela materiałów).
      UWAGA: System FPLC użyty w tym badaniu do wykonania FSEC działał w zimnym środowisku i miał zawór pętli pięciopozycyjny oraz sześciopozycyjny kolektor frakcji płytowej. Takie rozwiązanie pozwala na automatyczne załadowanie i uruchomienie pięciu próbek kolejno w tej samej kolumnie bez konieczności ręcznej interwencji między kolejnymi seriami. Do prowadzenia eksperymentów SEC użyto komercyjnie dostępnej, wcześniej pakowanej kolumny 24 mL (patrz Tabela materiałów), która zawierała żywicę pozwalającą na rozdzielenie białek o masie cząsteczkowej od 10 do 600 kDa. Jeśli interesujące białko jest szczególnie duże, można zastosować alternatywną matrycę kolumnową, umożliwiającą rozdzielenie białek o masie cząsteczkowej do 5 000 kDa. Proszę zauważyć, że obecność detergentu/lipidowej miceli zwiększa całkowity rozmiar białka błonowego o >150 kDa, w zależności od użytego białka i detergentu.
  2. Przykładam próbkę do kolumny i przeprowadź eksperyment SEC.
    1. Przenieś supernatant z etapu wirowania o wysokiej prędkości do strzykawki o pojemności 1 mL, używając tępej igły przymocowanej do strzykawki. Pozwala to na odzyskanie próbki z rurki wirówki bez zakłócania granulek.
    2. Ustaw pętlę próbki na ładowanie. Przepełnienie pętli próbki o pojemności 500 μL poprzez wstrzyknięcie 600-700 μL próbki ze strzykawki do portu ładowającego. W zależności od używanego systemu, ten krok ładowania można zaprogramować w metodzie, aby upewnić się, że nie popełniono błędów.
    3. Podczas metody wstrzyknij próbkę z pętli do kolumny, opróżniając ją 4 mL buforu SEC przy zalecanym przepływie i ciśnieniu dla kolumny (patrz Tabela materiałów).
    4. Pracuj kolumna z tym samym przepływem, aż 1,5 objętości kolumny (36 mL dla kolumny 24 mL) bufora nie przejdzie w dół.
    5. Przy 0,25 objętości kolumny (6 mL dla kolumny 24 mL) zacznij zbierać ułamki 0,2 mL, aby zebrać 90 ułamków.
      UWAGA: Ponieważ objętość pustki kolumny powinna wynosić 0,3 objętości kolumny, rozpoczęcie zbierania frakcji tuż przed tym zapewni, że elucia całego białka jest monitorowana, w tym każdego białka obecnego w objętości pustki.

4. Zbieranie i analiza śladów fluorescencyjnych

  1. Przenieś próbki z kolektora frakcji (krok 3.2.5) na płytę z 96 dołkami i odczytać sygnał fluorescencyjny.
    1. Przed wykonaniem pomiaru fluorescencji rozcieńcz pobrane próbki. Za pomocą pipety wielokanałowej przelej 90 μL laboratoryjnie destylowanegoH2Oz zbiornika do każdego odwiertu nieprzezroczystej płyty z płaskim dnem z 96 dołami (patrz Tabela materiałów).
    2. Jeśli ułamki zostały zebrane do bloku 96-dołków podczas kroku 3.2.5, użyj pipety wielokanałowej, aby przenieść 10 μL ułamków SEC z bloku na nieprzezroczystą, płaską płytę 96-dołową i wymieszać przez pipetowanie w górę i w dół. W przeciwnym razie, jeśli frakcje SEC zostały zebrane do pojedynczych probówek podczas etapu 3.2.5, należy przenieść 10 μL każdej frakcji na nieprzezroczystą płaską płytkę 96-dołkową pojedynczo, pipetując za każdym razem w górę i w dół, aby wymieszać próbki.
    3. Włóż nieprzezroczystą płytkę z 96 dołkami do czytnika płytek i zmierz fluorescencję. Jeśli GFP jest znakiem fluorescencyjnym (używanym tutaj), ustaw wzbudzenie jak najbliżej 488 nm i wykrywaj emisję fluorescencyjną jak najbliżej 507 nm.
      UWAGA: Wymagane rozcieńczenie przed wykonaniem pomiaru fluorescencji zależy od całkowitej ilości interesującego białka obecnego w hodowli ekspresyjnej oraz czułości używanego czytnika płytki. W przykładach pokazanych w tym badaniu próbki zostały rozcieńczone dziesięciokrotnie w wodzie. Jako sugestię punktu wyjścia, frakcje należy rozcieńczyć 5-10 razy w wodzie lub buforze przed wykryciem. Jeśli zarejestrowany sygnał śladowy FSEC jest szczególnie niski, można użyć mniejszych rozcieńczeń lub nawet próbki nierozcieńczonej. Urządzeniem używanym do detekcji w tym badaniu był czytnik płyt zdolny do wzbudzania przy 488 nm oraz wykrywania emisji fluorescencyjnej na 507 nm (patrz Tabela materiałów).
  2. Narysuj ślady FSEC.
    1. Eksportuj dane z czytnika płyt w formacie surowym (tekst surowy lub plik z wartościami rozdzielonymi przecinkami). Te surowe dane zostaną wykreślone na osi Y śladu FSEC.
    2. Dla osi X oblicz objętość, przy której zebrano każdą frakcję. Pierwsza studnia musi być objętością elucijną, przy której zebrano pierwszą frakcję, aby uwzględnić opóźnienie frakcjonacji (6 mL w tym przykładzie). Ułamki po tym muszą stopniowo rosnąć o objętość zebranej frakcji (0,2 mL w tym przykładzie).
    3. Po obliczeniu danych z osi X i Y można je skopiować i wkleić do oprogramowania do wykresów (patrz Tabela materiałów), aby nakreślić sygnał fluorescencjonalny w każdej studni względem objętości, z jaką eludował z kolumny.
      UWAGA: Rysunek 1 przedstawia schematyczną prezentację kroków wymaganych do przeprowadzenia eksperymentu FSEC.
  3. Przeanalizuj ślady FSEC.
    1. Oceń ilość elucii białka przy objętości pustki (około 8 mL dla kolumny 24 mL), co wskazuje, że białko jest bardzo duże i prawdopodobnie jest niezłożone/zagregowane.
    2. Oceń ilość białka wydzielającego się w późniejszych szczytach, co wskazuje na fałdowane białko. Oczekuje się, że w kolumnie 24 mL będzie to od 10 mL do 16 mL, w zależności od wielkości białka (w połączeniu z detergentem/lipidową micelą). Zwracaj szczególną uwagę na kształt piku, szczególnie jeśli jest to szeroki lub rozszczepiony pik o powierzchni większej niż 3-4 mL (dla kolumny 24 mL), ponieważ wskazuje to na próbkę polidysperse.
    3. Oblicz stosunek między wysokością szczytu monomeru a szczytem pustki, dzieląc maksymalny sygnał zarejestrowany w piku monomeru przez maksymalny sygnał w piku pustki.
      UWAGA: Ta wartość reprezentuje indeks monodyspersji i pozwala ilościowo mierzyć jakość białka; Wyższe wartości wskazują na najlepszą możliwą jakość, natomiast wartości poniżej 1 wskazują na problematyczne próbki, ponieważ zawierają one więcej zagregowanego białka niż złożonego.
    4. Jeśli ma być porównane wiele przebiegów FSEC i najważniejszą cechą jest ilość monomeru w każdym przypadku, należy wykreślić ślady jako surowy sygnał rejestrowany przez czytnik płyt (np. RFU).
      UWAGA: Jeśli ważniejsze jest porównanie ilości monomeru w porównaniu z białkiem złożonym, sygnał musi zostać znormalizowany do procentu całkowitego sygnału, korzystając z minimalnych i maksymalnych odczytów w śladzie, co podkreśli różnice w stosunku między białkiem agregowanym a monomerowym między śladami.

figure-protocol-1
Rysunek 1: Schematyczne przedstawienie kroków wymaganych do przeprowadzenia eksperymentu FSEC. (1) Komórki wyrażające fluorescencyjnie oznakowane białko są rozpuszczane. (2) Prymitywna rozpuszczalność jest najpierw wyjaśniona przez obrót przy niskiej prędkości, a następnie (3) obrót z dużą prędkością. (4) Oczyszczony supernatant próbki jest ładowany i uruchamiany na odpowiedniej kolumnie SEC, a (5) pobierane są ułamki. (6) Próbki ułamków są przesyłane na płytę 96-dołkową, a sygnał fluorescencyjny GFP jest wykrywany za pomocą czytnika płytek do (7) wykreślenia śladu FSEC. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Wyniki

Najpierw zbadano zakres dynamiczny oraz dolne granice detekcji eGFP dla czytnika płyt używanego w tym badaniu. Standard oczyszczonego eGFP o znanym stężeniu rozcieńczono w końcowej objętości 50 μL do 50 ng·μL−1, 25 ng·μL−1, 12,5 ng·μL−1, 6,25 ng·μL−1, 3,125 ng·μL−1, 1,5625 ng·μL−1, 0,78125 ng·μL−1 oraz 0,390625 ng·μL−1, a fluorescencja była odczytana przy wzbudzeniu 488 nm i emisji 507 nm (Rysunek 2). Eksperyment ten wykazał, że czytnik płytek miał niższy limit wykrywania 30 ng białka znakowanego eGFP na dołek oraz zakres dynamiczny do 500 ng białka znakowanego eGFP na długo przed nasyceniem sygnału. Korzystając z wartości dolnej granicy i zakładając, że elucia białka ogranicza się do 0,33 objętości kolumny, do załadunku kolumny SEC potrzebne jest już 1,28 μg białka znakowanego eGFP, aby zaobserwować wykrywalny sygnał FSEC.

figure-results-1
Rysunek 2: standardowa krzywa eGFP. Wykres rozpraszający sygnału fluorescencyjnego dla oczyszczonego standardu eGFP rozcieńczonego do 50 ng·μL−1, 25 ng·μL−1, 12,5 ng·μL−1, 6,25 ng·μL−1, 3,125 ng·μL−1, 1,5625 ng·μL−1, 0,78125 oraz 0,390625 ng·μL−1. (A) Wyświetlane są wszystkie rozcieńczenia, w tym te z sygnalem nasyconym. (B) Powiększony wykres rozrzutowy, obejmujący tylko standardy mieszczące się w zakresie dynamicznym czytnika tablic. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Po drugie, kolumna 24 mL użyta w tym badaniu została skalibrowana według standardów masy cząsteczkowej. Stosując te same warunki buforowe i robocze, co w analizie FSEC, standardy masy cząsteczkowej niebieski dektran (>2 000 kDa), ferrytyna (440 kDa), aldolaza (158 kDa), konalbumina (75 kDa) oraz owalbumina (43 kDa) zostały indywidualnie wstrzykiwane i przeprowadzone przez kolumnę, a ślady elucji zebrano przy absorpcji 280 nm. Zarejestrowane objętości elucii wynosiły odpowiednio 8,9 mL, 12,4 mL, 15,2 mL, 16,9 mL i 18 mL. Gdy te objętości elucijne przeliczono na Kav (Równanie 1) i nakreślono względem logarytmicznych mas cząsteczkowych, można było dopasować standardową krzywą. Pozwoliło to oszacować masę cząsteczkową testowanych GPCR w tym badaniu poprzez interpolację krzywej standardowej (Rysunek 3). Na przykład ślad FSEC receptora serotoniny GPCR 2A (5HT2AR) po rozpuszczeniu w detergentze DDM wskazał objętość elucijną 13,4 mL. Ta objętość elucji 5HT2AR mieści się pomiędzy tymi objętościami elucii zarejestrowanymi dla ferrytyny i aldolazy i daje szacowaną masę cząsteczkową około 300 kDa. Konstrukcja 5HT2AR użyta w tym badaniu wynosi około 50 kDa (wliczając tag eGFP), co oznacza, że jeśli 5HT2AR uznaje się za monomeryczne, 250 kDa masy cząsteczkowej można przypisać detergentowi/lipidowej miceli DDM. Równanie do konwersji objętości elucji jest następujące (Równanie 1):

figure-results-2(Równanie 1)

gdzie Ve to objętość elucijna, V0 to kolumnowa woluminacja pusta, a Vc to całkowita objętość kolumnowa.

figure-results-3
Rysunek 3: Krzywa kalibracyjna kolumny SEC z użyciem standardów masy cząsteczkowej. (A) Reprezentatywny ślad FSEC 5HT2AR rozpuszczony w DDM, z oznaczonymi względnymi pozycjami elucii standardów masy cząsteczkowej: niebieskim dekstanem (Void), ferrytyną, aldolazą, konalbuminą i ovalbuminą. Ferrytyna, aldolaza, konalbumina i ovalbumina są odpowiednio zabarwione na zieleń, fioletowy, czerwony i cyjan. (B) Krzywa kalibracji masy cząsteczkowej wykorzystująca pozycje elucii standardów po konwersji do Kav (Równanie 1) jest nakreślona względem logarytmicznej masy cząsteczkowej (Mr). Mr z 5HT2AR w DDM zostało interpolowane z krzywej za pomocą Kav i jest wyświetlane na krzywej (niebieski kwadrat). Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

FSEC został następnie wykorzystany do oceny jakości i właściwości receptora GPCR sfingozyny-1-fosforanu (S1PR1)15. Komórki owadów wyrażające ludzki S1PR1 oznaczony tagiem GFP zostały przetworzone na FSEC zgodnie z protokołem (Rysunek 1).

Po pierwsze, optymalne warunki ekstrakcji membranowej zostały zbadane poprzez testowanie detergentów DDM i LMNG w porównaniu z ekstrakcją bezdetergentową za pomocą SMA (Rysunek 4A). Do oceny jakości próbki białka oraz stosunku między białkiem w pustce (~8 mL retencja w kolumnie) a próbką monodyspersencyjną (14-15 mL zatrzymania kolumny) do monodyspersyjnej próbki wykorzystano. Próbka rozpuszczona w LMNG wykazała lepszy profil FSEC z lepszym kształtem piku monomeru i niższym pikiem agregatu białkowego, co wskazuje, że rozpuszczalność i oczyszczanie w LMNG były najbardziej stabilizującymi warunkami dla tego białka błonowego. Dla porównania, próbka rozpuszczona w DDM miała stosunkowo gorszy profil FSEC, z większym pikiem agregatu i szerszym pikiem monomerowym, co wskazuje na polidyspersyjność w próbce.

Po drugie, badanie wpływu dodawania ligandów na profil FSEC poprzez dodanie sfingozyny-1-fosforanu (S1P) do próbki podczas rozpuszczalności. W tym przypadku DDM został użyty jako odczynnik rozpuszczający, a ślady FSEC S1PR1 w obecności i braku S1P porównano (Rysunek 4B). Próbka rozpuszczona w obecności S1P wykazała lepszy ślad FSEC przy zmniejszonej agregacji. Wskazywało to, że oczyszczanie w obecności ligandu jest korzystne dla poprawy jakości próbki białka poprzez stabilizację receptora w roztworze, ale jest także korzystne jako zastępczy marker aktywności białka, ponieważ wyniki sugerowały, że białko jest prawidłowo złożone i kompetentne do wiązania ligandów.

figure-results-4
Rysunek 4: FSEC używający surowego ekstraktu S1PR1 wskazujący optymalne warunki ekstrakcji błonowej i wiązania ligandów. (A) Porównanie śladów FSEC S1PR1 rozpuszczonego w kopolimerze styren-maleinowym (SMA; niebieski), neopentylglikolu laurylmaltozy (LMNG; czerwony) lub dodecylowej maltozydzie (DDM;). (B) Porównanie śladów FSEC S1PR1 rozpuszczonego w DDM w obecności (czerwony) lub braku () agonisty sfingozyny-1-fosforanu (S1P). Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

FSEC wykorzystano również do badania długoterminowej stabilności 5HT2AR w różnych warunkach. Ludzki 5HT2AR oznaczony GFP był rozpuszczany z błon komórkowych owadów w detergentze (DDM) lub polimerze SMA i analizowany przez FSEC w kilku momentach po przechowywaniu w temperaturze 4 °C lub w temperaturze pokojowej (Rysunek 5). Po kilku dniach inkubacji 5HT2AR w DDM wykazało istotny spadek wysokości szczytu monomerycznego przy obu temperaturach, a zaobserwowano znaczące wzrosty piku łącznego. Dla porównania, 5HT2AR w cząstce lipidowej SMA (SMALP) nie wykazało istotnego spadku wysokości szczytu monomerowego w trakcie eksperymentu, co wskazuje, że białko w SMALP pozostawało stabilne dłużej, nawet przy niekorzystnych temperaturach. Może to być istotne przy rozważaniu przygotowań białek do dalszych zastosowań biofizycznych, takich jak eksperymenty z rezonansem plazmonowym powierzchniowym (SPR), gdzie wymagane jest pozostanie stabilne i aktywne przez długi czas, aby pomyślnie zakończyć eksperymenty wiązania.

figure-results-5
Rysunek 5: Wpływ czasu i temperatury na jakość 5HT2AR ekstrahowanego z błony za pomocą DDM lub SMALP, analizowanego przez FSEC. (A) Reprezentatywne ślady FSEC 5HT2AR rozpuszczonego w DDM i przechowywanego w temperaturze pokojowej przez 1 dzień (szary), 2 dni (zielony) lub 5 dni (niebieski). (B) Histogramy znormalizowanej wysokości szczytu monomerowego dla próbek DDM przechowywanych w temperaturze 4 °C (niebieski) lub RT (zielona) w porównaniu do próbek SMALP przechowywanych w 4 °C (szara) lub RT (). Paski błędów są reprezentatywne dla SEM. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego wykresu.

Dyskusja

Ogólne systematyczne podejścia do przesiewania warunków za pomocą FSEC przedstawione tutaj umożliwiają szybką optymalizację parametrów rozpuszczalności i oczyszczania do produkcji białek błonowych. Oznacza to, że stabilne i aktywne białka błonowe mogą być szybko produkowane do badań biofizycznych i strukturalnych. Ponadto FSEC może być uruchamiany przy użyciu sprzętu laboratoryjnego, który prawdopodobnie jest już zainstalowany w laboratoriach białek błonowych, dlatego nie ma potrzeby zakupu specjalistycznego narzędzia do przeprowadzania testów.

Kluczowe kroki
Czas od punktu rozpuszczenia komórek w detergentze do momentu przepuszczenia próbki w kolumnę SEC (kroki 2.1.5-3.2.5) jest krytyczny i nie może być przerw między tymi krokami. Wszystkie kroki powinny być wykonywane w temperaturze 4 °C lub na lodzie, a czas potrzebny na ich wykonanie powinien być ograniczony do minimum. Te ograniczenia czasowe i temperaturowe są konieczne, aby zarejestrować profil FSEC białka błonowego przed ewentualnym rozwinięciem lub degradacją. Po rozpuszczeniu białka błonowego istnieje większe ryzyko rozwinięcia, agregacji i degradacji, nawet przy 4 °C. Idealnie byłoby, aby wszelkie próbki, dla których mają być porównywane ślady FSEC, przechodziły przez kolumnę SEC w tym samym czasie po etapie rozpuszczalności. W praktyce jest to trudne, zwłaszcza jeśli próbki są przekazywane kolejno w dół jednej kolumny, ale możliwe jest zebranie do pięciu śladów SEC w odstępie 3 godzin od siebie, a w tym czasie nie powinno dojść do znacznej degradacji.

Rozwiązywanie problemów
Jeśli podczas przeprowadzenia eksperymentu FSEC sygnał fluorescencjonalny jest niski lub nie występuje, możliwe jest, że interesujące białko błony nie wyraziło wybranej linii komórkowej, ma bardzo niską ekspresję wybranej linii komórkowej lub nie zostało rozpuszczone w wybranym detergentze. Jeśli próbki zostały rozcieńczone przed zebraniem sygnału fluorescencyjnego i zarejestrowaniem śladu FSEC, prostym pierwszym krokiem byłoby spróbowanie niższego lub zerowego rozcieńczenia frakcji SEC. Jeśli nadal nie da się interpretowalnego śladu FSEC, należy sprawdzić ekspresję i rozpuszczalność białka.

Analizę ekspresji białek można przeprowadzić, sprawdzając fluorescencję próbki po kroku 2.2.2. Jeśli z tej próbki jest bardzo słaby lub brak sygnału fluorescencyjnego (np. sygnał bardzo blisko tła), prawdopodobnie występuje problem z ekspresją białek. Można podjąć kroki w celu poprawy poziomu ekspresji białka błonowego, takie jak przejście na alternatywną linię komórkową lub dostosowanie warunków wzrostu, indukcji ekspresji oraz czasu między indukcją/infekcją/transfekcją a pobraniem. Jednak szczególnie słaba ekspresja białek może wskazywać na niestabilne białko błonowe, a tym samym na zły wybór konstrukcji.

Jeśli ekspresja została sprawdzona i przed FSEC nad tłem pojawia się wyraźny sygnał fluorescencyjny, efektywność rozpuszczalności można sprawdzić, mierząc pozostały sygnał fluorescencjonalny próbki po kroku 2.4.3 (rozpuszczalne białko błonowe) w porównaniu do próbki po kroku 2.2.2 (całkowite białko). Często wydajność rozpuszczalności wynosi 20%-30%, co pozwala na pomyślną analizę i oczyszczenie białka błonowego. Jednak jeśli wydajność rozpuszczalności jest mniejsza niż 20%, może być potrzebny inny detergent do rozpuszczania lub inne warunki rozpuszczalności. Jeśli próby poprawy rozpuszczalności nie przyniosą sukcesu, może to wskazywać na szczególnie niestabilne białko błonowe, a tym samym na zły wybór konstrukcji.

Jeśli w śladzie FSEC zaobserwuje się bardzo późny szczyt elucyjny (np. 18-24 mL), oznacza to, że fluorescencyjne białko ma masę cząsteczkową znacznie niższą niż oczekiwano. Może to być spowodowane degradacją interesującego białka błonowego, co skutkuje powstaniem "wolnego" GFP. Należy sprawdzić, czy białko jest nienaruszone przed i po rozpuszczalności, stosując fluorescencję GFP w żelu. Jeśli interesujące białko rzeczywiście wydaje się ulegać degradacji lub być proteolizowane, ilość inhibitora proteazy może zostać zwiększona dwukrotnie lub czterokrotnie. Jednak wysoka wrażliwość na proteazy lub zdegradowane białko jeszcze przed rozpuszczeniem może wskazywać na szczególnie niestabilne białko, a więc zły wybór konstrukcji.

Modyfikacje i dalsze zastosowania FSEC
Zazwyczaj znacznik fluorescencyjny używany w FSEC to GFP lub eGFP, jak opisano w tym protokole. Jednak dostępnych jest wiele różnych znaczników białek fluorescencyjnych. Wybór znacznika fluorescencyjnego zależy od posiadania czytnika płyt, który potrafi uzyskać właściwe parametry wzbudzenia i emisji rejestrującego sygnał fluorescencjonalny dla wybranego znacznika fluorescencyjnego, oraz od posiadania fluoroforu z niewielką lub żadną zmianą wydajności kwantowej w różnych warunkach środowiskowych. Ponadto FSEC nie ogranicza się do białek fluorescencjonalnych, ale może równie dobrze działać z białkiem oznaczonym barwnikiem fluorescencyjnym. Na przykład można użyć barwnika NTA, który korzystnie wiąże się z konstrukcjami błony oznaczonymi histydyną. Ponadto albo przeciwciało znakowane fluorescencjonie, chemicznie znakowane fluorescencyjnym barwnikiem, specyficzne do wiązania interesującego białka błonowego, lub znacznik oczyszczający zawarty w konstrukcji białka błonowego może pośrednio oznaczać cel dla FSEC.

Podczas przesiewania detergentów za pomocą FSEC można podjąć decyzję, czy bufor używany do pracy w kolumnie SEC powinien zawierać pasujący detergent, w którym białko zostało rozpuszczone, czy też stosować standardowy detergent we wszystkich seriach. Dokładniejszą reprezentację zachowania białka uzyskamy, jeśli cały eksperyment zostanie przeprowadzony z dopasowanym detergentem przez cały czas. Jednak może to być czasochłonne i marnotrawne na detergent, jeśli kolumna musi być ponownie wyważona w nowym detergentzie przed każdą kolejną serią. Ponadto, ponieważ głównym celem przesiewania detergentów jest porównanie śladów, trendy pozostaną w śladach nawet jeśli warunki nie są idealne. W ten sposób można osiągnąć kompromis, w którym białko jest rozpuszczane w danym detergentze, ale kolumna jest prowadzona w standardowym buforze z jednym detergentem we wszystkich seriach (np. DDM)11, co pozwala zaoszczędzić czas i ilość środków zużywających detergent.

Modyfikując używany sprzęt FLPC, przepustowość protokołu FSEC może zostać znacząco zwiększona, a zapotrzebowanie na próbki zminimalizowane. Na przykład system FPLC lub HPLC może być wyposażony w automatyczny próbk, kolumnę analityczną o mniejszej objętości łóżka (np. kolumnę analityczną SEC o pojemności 3,2 mL) oraz detektor fluorescencyjny w linii do monitorowania ciągłych śladów FSEC bezpośrednio z kolumny. Powstała konfiguracja pozwoliłaby na wykonanie większej liczby przebiegów FSEC w krótszym czasie i wyeliminowała ręczny etap wykresu, co pozwoliłoby na testowanie większej liczby warunków w krótszym czasie. Ponadto wymagałoby dalsze zmniejszenie wymagań, ponieważ na każdy przebieg trzeba by przygotować i załadować mniej próbek na kolumnę FSEC. Otworzyłoby to możliwości redukcji kultur ekspresji do formatu płytowego, ponieważ do analizy potrzebne byłoby niewiele materiału.

Mocne i słabe strony FSEC w porównaniu z innymi metodami
Wadą FSEC jest to, że konstrukcje błonowe muszą być zaprojektowane tak, aby wprowadzać fluorescencyjną etykietę, a po wprowadzeniu istnieje niewielkie prawdopodobieństwo, że umieszczenie etykiety może zakłócić funkcję lub fałdowanie interesującego białka błonowego. Ponadto protokół FSEC, opisany tutaj, monitoruje cechy białka błonowego w obecności lizatu komórkowego, który jest prymitywną mieszaniną białek. Zachowanie białka błonowego w tym środowisku może różnić się od sytuacji, gdy interesujące białko błonowe jest poddawane kolumnie przygotowawczo SEC na końcu oczyszczania, gdy jest całkowicie izolowane od innych białek. Ponadto FSEC dostarcza dość jakościowej miary jakości białek. Jednak poprzez konwersję śladu FSEC na indeks monodyspersyjności, jak opisano w kroku 4.3.3 protokołu, można uzyskać ilościową miarę jakości białek.

FSEC nie jest jedyną metodą stosowaną we wczesnej analizie konstrukcji białek błonowych, warunków rozpuszczania oraz składu buforu oczyszczającego. Alternatywne podejścia mają zarówno zalety, jak i wady w porównaniu z FSEC. Na przykład istnieją testy termostabilności oparte na fluoroforze, szczególnie stosowanie barwnika 7-dietyloamino-3-(4′-maleimidylfenyl)-4-metylokoumaryny (CPM)16,17. Zaletą tej metody jest to, że w przeciwieństwie do FSEC, który dostarcza jakościowej miary jakości białek, testy termostabilności dostarczają ilościowej miary w postaci względnej temperatury topnienia. Ponadto nie ma wymogu wprowadzania znacznika fluorescencyjnego na konstrukcję białka. Jednak wadą testów termostabilności w porównaniu z FSEC jest konieczność stosowania oczyszczonego białka oraz fakt, że test nie jest kompatybilny ze wszystkimi konstrukcjami białkowymi, ponieważ opiera się na korzystnych pozycjach natywnych reszt cysteiny w złożonym białku.

Inną metodą podobną zarówno do FSEC, jak i testów termostabilności opartych na fluoroforach jest test mierzący wrażliwość białka błonowego na temperaturę. W tym badaniu białko jest poddawane różnym temperaturom, a wykryto białko pozostające w roztworze po wirówce. Detekcja tą metodą była przeprowadzana na kilka sposobów, w tym mierząc fluorescencję w roztworze18, fluorescencję w paśmie żelowym SDS-PAGE19 lub natężenie sygnału w zachodnim blocie20. Jednak istotną wadą tych podejść jest to, że test jest bardzo pracochłonny i podatny na wysoki poziom szumów w wynikach, ponieważ każdy punkt temperatury musi być zbierany osobno.

Wreszcie, do oceny jakości białek błonowych można zastosować kilka bardziej zaawansowanych technik biofizycznych w sposób podobny do FSEC, na przykład analiza dyspersji indukowanej przepływem21, termoforeza mikroskalowa22 lub SPR. Chociaż są to bardzo potężne podejścia, wadą tych metod jest wymóg posiadania wysoce wyspecjalizowanych instrumentów do przeprowadzania analiz.

Podsumowując, FSEC stanowi nieocenione narzędzie do wykorzystania w kampaniach produkcji białek błonowych i choć nie jest jedyną opcją, ma kilka wyraźnych zalet w porównaniu z innymi metodami, jak wymieniono powyżej. Zawsze zaleca się krzyżową walidację wyników za pomocą testów ortogonalnych, a żadna z omówionych powyżej metod nie wyklucza się nawzajem.

Oświadczenia

Peak Proteins to organizacja badawcza działająca na kontraktach, która oferuje ekspresję, oczyszczanie, spektrometrię mas oraz określanie struktury za opłatą.

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować za pomoc i wsparcie całego zespołu Peak Proteins. Z zespołu nauk komórkowych chcielibyśmy podziękować Ianowi Hamptonowi za cenne spostrzeżenia i wskazówki dotyczące ekspresji komórek owadów. Chcielibyśmy podziękować Markowi Abbottowi za udostępnienie zasobów i możliwości realizacji tego projektu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1 mL i 5 mL plastikowych strzykawek Generycznie - Strzykawki do transferu próbek 
10x EDTA koktajl inhibitorów wolnej proteazyAbcamab201111Inhibitory proteazy
15 mL probówek   Generycznie - 15 mL probówki do przygotowania i rozpuszczania granulatów   
2 mL rurki ultra-wirówkiBeckman Coulter  344625 Rurki do wirnika ultra-wirówkowego  
Probówki 50 mLGenerycznie - Probówki 50 mL do pobierania komórek  
96 bloków głębokowiertowych  Greiner15922302Do zbierania 0,2 mL ułamków SEC 
Ä KTA  Zawór pętli V9-LCytiva 290113585 pozycji pętli zaworu   dla Ä System KTA FPLC
Ä Kolektor frakcji KTA F9-CCytiva 290277436-pozycyjny kolektor frakcji płytkowej dla Ä System KTA FPLC
Ä KTA pure 25 LCytiva 29018224 System FPLC do przeprowadzania eksperymentu 
Wirówka stołowa (np. Fisherbrand GT4 3L)    Fisher Scientific  15828722 Wirówka do wirowania przy niskich prędkościach;
Igły do napełniania na tępym końcu Generycznie - Do transferu próbek 
Filtr odkurzacza na pokrywkach od butelki Corning10005490Filtr próżniowy na pokrywce butelek do filtrowania buforów SEC
Cholecteriohemiscynian (CHS)  Generon CH210-5GM Dodatek do rozpuszczania detergentów    
Jednorazowy magazyn wielokanałowy  Generycznie - Zbiornik do dodawania wody lub buforu do mikropłytki z 96 dołkami
Dodecyl maltozyd (DDM)  Glycon D97002-C-25g Detergent do rozpuszczania i rozpuszczalności 
Standardy białek eGFPBioVisionK815-100standardy eGFP dla krzywej kalibracji fluorescencyjne  
GlicerolThermo Scientific  11443297Glicerol do przygotowania buforu
HEPESThermo Scientific  10411451HEPES do przygotowania buforu
Zestaw kalibracyjny SEC o wysokiej masie cząsteczkowejCytiva 28403842Zestaw kalibracyjny masy cząsteczkowej dla SEC
Lauryl maltoza neopentylglikol (LMNG) i nbsp;Generon NB-19-0055-5G Detergent do rozpuszczania i rozpuszczalności 
Niskie molekularne  zestaw kalibracyjny SEC do wagiCytiva 28403841Zestaw kalibracyjny masy cząsteczkowej dla SEC
Wirnik ultra-wirówki MLA-130Beckman Coulter  367114 Wirnik do ultrawirówki, który pasuje do lamp o pojemności 2 mL
Nieprzezroczysta mikropłytka z płaskim dnem z 96 dołkami Corning1065685396-dołkowa do odczytu sygnału fluorescencyjnego w czytniku płytowym 
Ultra-wirówka Optima MAX-XPBeckman Coulter  393315 Wirówka do wirowania dużych prędkości i tak szybko;
pH miernikGenerycznie - Do regulacji pH buforów podczas przygotowania
PryzmatGraphPad- Oprogramowanie do tworzenia wykresów do wyznaczania śladów
Mieszacz obrotowy  Fisher Scientific  12027144 Mikser do mieszania na końcówkę w zimnie 
Chlorek soduFisher Scientific  10316943Chlorek sodu do przygotowania buforu
Wodorotlenek soduFisher Scientific  10488790Wodorotlenek sodu do przygotowania buforu
Czytnik płyt Spectramax ID3Urządzenia molekularne735-0391Czytnik mikropłytowy zdolny do odczytu fluorescencji
Płyta mieszadłowaGenerycznie - Do mieszania buforów podczas przygotowywania
Kwas maleinowy styrenowy (SMA) & nbsp;Orbiscope SMALP 300 Polimer do ekstrakcji bez detergentów 
Superdex 200 Zwiększenie o 10/300 GL Cytiva 28990944 Kolumna SEC do przeprowadzenia eksperymentu. Objętość dna tej kolumny wynosi 24 mL. Zalecany przepływ dla tej kolumny wynosi 0,9 ml/min (w wodzie o temperaturze 4 stopni; C). Maksymalny limit ciśnienia dla tej kolumny wynosi 5 MPa.
Pompa próżniowaSartorius16694-2-50-06Do filtrowania i odgazowywania buforów

Bibliografia

  1. Burgess, R. R. A brief practical review of size exclusion chromatography: Rules of thumb, limitations, and troubleshooting. Protein Expression and Purification. 150, 81-85 (2018).
  2. Erickson, H. P. Size and shape of protein molecules at the nanometer level determined by sedimentation, gel filtration, and electron microscopy. Biological Procedures Online. 11 (1), 32-51 (2009).
  3. Lathe, G. H., Ruthven, C. R. J. The separation of substances and estimation of their relative molecular sizes by the use of columns of starch in water. Biochemical Journal. 62 (4), 665-674 (1956).
  4. Lathe, G. H., Ruthven, C. R. The separation of substances on the basis of their molecular weights, using columns of starch and water. Biochemical Journal. 60 (4), (1955).
  5. Polson, A. Fractionation of protein mixtures on columns of granulated agar. Biochimica et Biophysica Acta. 50 (3), 565-567 (1961).
  6. Hjertén, S., Mosbach, R. 34;Molecular-sieve" chromatography of proteins on columns of cross-linked polyacrylamide. Analytical Biochemistry. 3 (2), 109-118 (1962).
  7. Porath, J., Flodin, P. Gel filtration: A method for desalting and group separation. Nature. 183 (4676), 1657-1659 (1959).
  8. Kawate, T., Gouaux, E. Fluorescence-detection size-exclusion chromatography for precrystallization screening of integral membrane proteins. Structure. 14 (4), 673-681 (2006).
  9. Hattori, M., Hibbs, R. E., Gouaux, E. A Fluorescence-detection size-exclusion chromatography-based thermostability assay for membrane protein precrystallization screening. Structure. 20 (8), 1293-1299 (2012).
  10. Shimomura, O., Johnson, F. H., Saiga, Y. Extraction, purification and properties of aequorin, a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan, Aequorea. Journal of Cellular and Comparative Physiology. 59 (3), 223-239 (1962).
  11. Drew, D., et al. GFP-based optimization scheme for the overexpression and purification of eukaryotic membrane proteins in Saccharomyces cerevisiae. Nature Protocols. 3 (5), 784-798 (2008).
  12. Newstead, S., Kim, H., von Heijne, G., Iwata, S., Drew, D. High-throughput fluorescent-based optimization of eukaryotic membrane protein overexpression and purification in Saccharomyces cerevisiae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (35), 13936-13941 (2007).
  13. Vaidehi, N., Grisshammer, R., Tate, C. G. How can mutations thermostabilize G-protein-coupled receptors. Trends in Pharmacological Sciences. 37 (1), 37-46 (2016).
  14. Hardy, D., Bill, R. M., Jawhari, A., Rothnie, A. J. Overcoming bottlenecks in the membrane protein structural biology pipeline. Biochemical Society Transactions. 44 (3), 838-844 (2016).
  15. Hanson, M. A., et al. Crystal structure of a lipid G protein-coupled receptor. Science. 335 (6070), 851-855 (2012).
  16. Alexandrov, A. I., Mileni, M., Chien, E. Y. T., Hanson, M. A., Stevens, R. C. Microscale fluorescent thermal stability assay for membrane proteins. Structure. 16 (3), 351-359 (2008).
  17. Harborne, S. P. D., King, M. S., Kunji, E. R. S. Thermostability assays: A generic and versatile tool for studying the functional and structural properties of membrane proteins in detergents. Biophysical Journal. 118 (4), 105-121 (2020).
  18. Nji, E., Chatzikyriakidou, Y., Landreh, M., Drew, D. An engineered thermal-shift screen reveals specific lipid preferences of eukaryotic and prokaryotic membrane proteins. Nature Communications. 9 (1), 4253(2018).
  19. Harborne, S. P. D., et al. IMPROvER: The Integral Membrane Protein Stability Selector. Scientific Reports. 10 (1), 15165(2020).
  20. Ashok, Y., Nanekar, R., Jaakola, V. -P. Defining thermostability of membrane proteins by western blotting. Protein Engineering Design and Selection. 28 (12), 539-542 (2015).
  21. Pedersen, M. E., Østergaard, J., Jensen, H. Flow-induced dispersion analysis (FIDA) for protein quantification and characterization. Methods Mol Biol. 1972, 109-123 (2019).
  22. Wienken, C. J., Baaske, P., Rothbauer, U., Braun, D., Duhr, S. Protein-binding assays in biological liquids using microscale thermophoresis. Nature Communications. 1 (1), 100(2010).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Solubilizacja bia ekznakowanie GFPprzesiewanie detergent wanaliza FSECagregacja bia ekreceptory sprz one z bia kiem Gtest z czytnikiem p ytekkwas styrenowo maleinowy
Szybka ocena jakości białka błonowego za pomocą chromatografii wykluczającej rozmiaru fluorescencyjnego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.