Artykuł metodologiczny

Automatyczne oddzielanie i pobieranie substancji nowotworowych z próbek klinicznych

2.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64325

⸱

13 stycznia 2023

 ,  ,  , 
1Clinomics Inc.

W tym artykule

Podsumowanie

Ten artykuł opisuje zastosowanie zautomatyzowanego sprzętu do łatwego i efektywnego oddzielania i zbierania substancji, takich jak bezkomórkowe DNA i krążące komórki nowotworowe, z krwi pełnej.

Streszczenie

Ostatnio płynne biopsje są używane do diagnozowania różnych chorób, w tym raka. Płyny ustrojowe zawierają wiele substancji, w tym komórki, białka i kwasy nukleinowe pochodzące z normalnych tkanek, ale niektóre z tych substancji pochodzą również z chorego obszaru. Badanie i analiza tych substancji w płynach ustrojowych odgrywają kluczową rolę w diagnostyce różnych chorób. Dlatego ważne jest, aby dokładnie oddzielić wymagane substancje i opracowano kilka technik, które można zastosować w tym celu.

Opracowaliśmy urządzenie i platformę typu lab-on-a-disc o nazwie CD-PRIME. To urządzenie jest zautomatyzowane i daje dobre wyniki w zakresie zanieczyszczenia próbki i stabilności próbki. Ponadto ma zalety dobrej wydajności akwizycji, krótkiego czasu pracy i wysokiej powtarzalności. Ponadto, w zależności od rodzaju dysku, który ma być zamontowany, można oddzielić osocze zawierające bezkomórkowe DNA, krążące komórki nowotworowe, komórki jednojądrzaste krwi obwodowej lub kożuchy. W ten sposób pozyskiwanie różnych materiałów obecnych w płynach ustrojowych może odbywać się do różnych dalszych zastosowań, w tym do badań omicznych.

Wprowadzenie

Wczesne i dokładne wykrywanie różnych chorób, w tym raka, jest najważniejszym czynnikiem w ustalaniu strategii leczenia1,2,3,4. W szczególności wczesne wykrycie raka jest ściśle związane ze zwiększonymi szansami na przeżycie pacjenta5,6,7,8. Ostatnio płynne biopsje znalazły się w centrum uwagi w celu wczesnego wykrywania raka. Guzy lite ulegają angiogenezie i uwalniają różne substancje do krwi. W szczególności we krwi pacjentów z rakiem znaleziono krążące DNA (ctDNA), krążące RNA (ctRNA), białka, pęcherzyki, takie jak egzosomy i krążące komórki nowotworowe (CTC)2,9. Chociaż istnieją różnice w ilości tych substancji, są one konsekwentnie obserwowane nie tylko we wczesnych stadiach, ale także w późniejszych etapach6,10. Jednak te indywidualne różnice są bardzo duże; na przykład ilość bezkomórkowego DNA (cfDNA) zawierającego ctDNA jest mniejsza niż 1,000 ng, a liczba CTC jest mniejsza niż 100 w 10 ml pełnej krwi od pacjentów z rakiem11,12,13. Wiele badań charakteryzowało raka przy użyciu tych substancji obecnych w mniejszych ilościach (tj. cfDNA, ctDNA i CTC). Aby uzyskać dokładne wyniki, ważne jest, aby dokładnie oddzielić małe ilości substancji o wysokiej czystości13,14. Powszechnie stosowane są konwencjonalne metody wirowania, ale są one trudne w obsłudze i mają niską czystość w zależności od umiejętności użytkownika. Od czasu odkrycia CTC opracowano kilka technik separacji, takich jak wirowanie lub separacja o dużej gęstości, metody immunobeadowe i mikroprzepływowe. Od czasu odkrycia CTC opracowano kilka technik hermetyzacji. Jednak techniki te są często ograniczane, gdy konieczne jest odizolowanie komórek od różnych chipów i błon używanych do ich izolacji15. Ponadto metody znakowania wymagają sprzętu, takiego jak FACS, a dalszy proces jest ograniczony ze względu na zanieczyszczenie znakowania.

Ostatnio wzrosło użycie płynnych biopsji i prowadzone są różne badania nad wczesnym wykrywaniem raka. Chociaż ta metoda jest prosta, nadal istnieją trudności w dalszej analizie, a różne badania próbują przezwyciężyć te trudności16,17. Ponadto wiele placówek, w tym szpitale, wymaga zautomatyzowanych, powtarzalnych i wygodnych w użyciu metod o wysokiej czystości. W tym przypadku opracowaliśmy urządzenie typu lab-on-a-disc do automatycznego oddzielania substancji od próbek krwi po płynnej biopsji. Urządzenia te opierają się na zasadzie wirowania, mikrofluidyki i wychwytywania komórek o wielkości porów. Istnieją trzy rodzaje krążków: LBx-1 może pozyskiwać osocze i kożuch, podczas gdy LBx-2 może pozyskiwać osocze i PBMC z krwi pełnej o objętości mniejszej niż 10 ml; FAST-auto może również rejestrować CTC za pomocą membrany, którą można usunąć z dysku. W jednym cyklu można użyć do czterech sztuk każdej tarczy. Przede wszystkim zaletą tego urządzenia i metody jest to, że można uzyskać różne substancje pochodzenia rakotwórczego z tej samej próbki przy użyciu niewielkiej ilości krwi. Oznacza to, że krew pacjenta musi zostać pobrana tylko raz. Ponadto ma tę zaletę, że wyklucza błędy wynikające z różnic w okresie pobierania krwi. Platforma ta jest łatwa w użyciu i zapewnia dokładne wyniki dla płynnych biopsji i dalszych zastosowań. W tym protokole wprowadzono użycie urządzenia i kartridża.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie próbki krwi pobrano od pacjentów z rakiem płuc. Badania i analizy w Clinomics są prowadzone przez Cancer Genomics Research Institute, a zatwierdzanie badań IRB przez rząd jest prowadzone przez Asan Medical Center Institutional Review Committee (IRB NO. 2021-0802) z numerem IRB zarejestrowanym do badań w Clinomics.

1. Przygotowanie próbki

  1. Zbierz 9 ml krwi pełnej do probówki do pobierania krwi stabilnej EDTA lub cfDNA.
  2. Dobrze wymieszaj, obracając rurkę w górę iw dół około 10 razy.
  3. Próbki należy przechowywać w temperaturze pokojowej (RT; do krótkotrwałego przechowywania) lub 4 °C (do długotrwałego przechowywania). Nie zamrażać i nie rozmrażać.

2. Przygotowanie urządzenia

  1. Naciśnij wyłącznik zasilania, aby włączyć instrument.
    UWAGA: Na touchpadzie pojawi się ekran ładowania, a instrument zostanie zainicjowany. Trzymaj ręce z dala od instrumentu podczas inicjalizacji. Ekran wyboru wkładki pojawia się po zakończeniu inicjalizacji instrumentu.
  2. Wybierz tryb próbkowania, który ma być używany. Zmień liczbę próbek, naciskając strzałkę.

3. Obsługa urządzenia i pobieranie próbek

  1. Ładowanie naboju LBx-1
    1. Wybierz typ wkładki na panelu ekranu dotykowego instrumentu. Zmień liczbę próbek, naciskając przycisk strzałki.
    2. Otwórz drzwiczki przyrządu i włóż wszystkie wkłady, które mają być używane, w kolejności według numeru na uchwycie wkładu. Upewnij się, że wkład i uchwyt wkładu są prawidłowo włożone. Jeśli wkładka nie zostanie prawidłowo włożona, może to spowodować znaczne uszkodzenie instrumentu.
    3. W przypadku łącznie czterech wkładów należy umieścić atrapę naboju w pustej przestrzeni uchwytu na wkład.
    4. Użyj koła podporowego, aby zamontować wkład i dokręć nakrętkę zabezpieczającą, aby ją zabezpieczyć.
    5. Zamknij drzwi i naciśnij przycisk RUN na ekranie panelu dotykowego. Przyrząd zamyka zawory na wkładach, co trwa około 30 s.
    6. Postępuj zgodnie z komunikatem, aby otworzyć drzwi, zdjąć koło podporowe i wyjąć wkład z zamkniętym zaworem z uchwytu wkładu.
    7. Umieść wkład na stole i przygotuj się do wstrzyknięcia próbki krwi pełnej. Odpipetować maksymalnie 10 ml próbki krwi pełnej za pomocą pipety serologicznej.
      UWAGA: Niebezpieczeństwa związane z obchodzeniem się z krwią. Podczas całej procedury obchodzenia się z próbkami krwi i odczynnikami ważne jest noszenie fartucha laboratoryjnego i rękawic laboratoryjnych. Dostarczone karty charakterystyki powinny być dokładnie przebadane przez pracowników laboratorium.
    8. Włóż końcówkę pipety głęboko do wlotu próbki wkładu i powoli wstrzyknij próbkę krwi pełnej.
      UWAGA W przypadku użycia więcej niż 9 ml próbki krwi pełnej nie jest konieczne dodawanie soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). W przypadku użycia mniej niż 9 ml próbki krwi pełnej dodaj PBS, aby uzyskać całkowitą objętość do 9 ml. Na przykład, używając 7,2 ml krwi pełnej, należy dodać 1,8 ml PBS do wlotu próbki. Do wstrzykiwania krwi pełnej i PBS można użyć pipety serologicznej lub końcówki do pipety. W przypadku użycia mniej niż 8 ml próbki krwi pełnej, kożucha może nie zostać odzyskana nawet przez dodanie 1 ml PBS. Do przygotowania gDNA użyj 200 μl krwi pełnej, która została oddzielona przed tym krokiem.
    9. Włóż wkłady, które mają być używane, w kolejności od liczby na uchwycie wkładu. Użyj koła podporowego, aby zamontować wkład i dokręć nakrętkę zabezpieczającą, aby ją zabezpieczyć. Zamknij drzwi i naciśnij przycisk OK.
      UWAGA: Osocze i kożuchowa sierść są automatycznie oddzielane od krwi pełnej, co zajmuje około 30 min.
      UWAGA Niebezpieczeństwo podczas pracy. Otwieranie drzwi lub dotykanie instrumentu podczas obracania z dużą prędkością może spowodować poważne obrażenia. Istnieje również ryzyko obrażeń z powodu asymetrycznego obciążenia wirnika. Jeśli podczas uruchamiania instrumentu w trybie wspomaganego wzbogacania komórek lub w trybie eksperta wystąpią nietypowe wibracje i szumy, umieszczenie wkładki może być asymetryczne. Natychmiast naciśnij zasilania, aby zatrzymać i prawidłowo zainstalować wkład.
    10. Poszukaj komunikatu na ekranie, któremu towarzyszy dźwięk alarmu, który pojawia się po zakończeniu oddzielania plazmy i kożuchówki.
    11. Zatrzymaj alarm, otwierając drzwi lub naciskając przycisk STOP. Otwórz drzwiczki, wyjmij wkład i połóż go na stole.
    12. Odzyskaj 3 ml osocza z wylotu osocza za pomocą końcówki do pipety o pojemności 1 ml. Odzyskaj kożuchową warstwę 3 ml z wylotu kożucha za pomocą końcówki do pipety o pojemności 1 ml.
  2. Ładowanie kasety LBx-2
    1. Wybierz nazwę wkładki na panelu ekranu dotykowego instrumentu. Zmień liczbę próbek, naciskając przycisk strzałki.
    2. Otwórz drzwiczki i włóż wkłady, które mają być używane, w kolejności według liczby na uchwycie naboju.
    3. W przypadku łącznie czterech wkładów należy umieścić atrapę naboju w pustej przestrzeni uchwytu na wkład.
    4. Użyj koła podporowego, aby zamontować wkład i dokręć nakrętkę zabezpieczającą, aby ją zabezpieczyć. Upewnij się, że wkład został prawidłowo włożony do uchwytu wkładu. Jeśli wkładka nie zostanie prawidłowo włożona, może to spowodować znaczne uszkodzenie instrumentu.
    5. Zamknij drzwi i naciśnij przycisk RUN na ekranie panelu dotykowego. Przyrząd zamyka zawory na kartridżu, co trwa około 30 s.
    6. Postępuj zgodnie z komunikatem, aby otworzyć drzwi, zdejmij koło podporowe, wyjmij wkład z zamkniętym zaworem z uchwytu wkładu i umieść go na stole.
    7. Umieścić wkład na stole i przygotować się do wstrzyknięcia roztworu gradientu gęstości i próbki krwi pełnej. Sprawdzić objętość roztworu gradientu gęstości i PBS do wstrzyknięcia w zależności od objętości próbki krwi pełnej (tabela uzupełniająca 1).
    8. Odpipetować roztwór gradientu gęstości za pomocą pipety serologicznej. Włóż końcówkę pipety głęboko do wlotu wkładu i powoli wstrzykuj roztwór gradientu gęstości.
    9. Po wstrzyknięciu roztworu gradientu gęstości należy odpipetować próbkę krwi pełnej za pomocą pipety serologicznej. Włóż końcówkę pipety głęboko do wlotu próbki wkładu i powoli wstrzyknij próbkę krwi pełnej.
      UWAGA: W przypadku użycia mniej niż 9 ml próbki krwi pełnej, dodaj PBS, odwołując się do tej tabeli (Tabela uzupełniająca 1).
    10. Włóż wkłady, które mają być używane, w kolejności zgodnej z numerem na uchwycie wkładu. Użyj koła podporowego, aby zamontować wkład i dokręć nakrętkę zabezpieczającą, aby ją zabezpieczyć. Zamknij drzwi i naciśnij przycisk OK.
    11. Osocze i PBMC są automatycznie oddzielane od krwi pełnej, co trwa około 30 minut. Poszukaj komunikatu, który pojawia się wraz z dźwiękiem alarmu, gdy separacja osocza i PBMC zostanie zakończona.
    12. Zatrzymaj alarm, otwierając drzwi lub naciskając przycisk STOP. Otwórz drzwiczki, wyjmij wkład i połóż go na stole.
    13. Odzyskaj 3 ml osocza z wylotu osocza za pomocą końcówki do pipety o pojemności 1 ml. Odzyskaj 3 ml PBMC z wylotu PBMC za pomocą końcówki do pipety o pojemności 1 ml.
  3. Ładowanie kasety FAST-auto
    1. Wybierz wkładkę na panelu ekranu dotykowego instrumentu. Zmień liczbę próbek, naciskając przycisk strzałki.
    2. Otwórz drzwiczki i włóż wkłady, które mają być używane, w kolejności według liczby na uchwycie naboju. W przypadku łącznie czterech wkładów należy umieścić atrapę naboju w pustej przestrzeni uchwytu na wkład.
    3. Użyj koła podporowego, aby zamontować wkład i dokręć nakrętkę zabezpieczającą, aby ją zabezpieczyć.
    4. Zamknij drzwi i naciśnij przycisk RUN na ekranie panelu dotykowego. Przyrząd zamyka zawory na kartridżu, co trwa około 30 s.
    5. Postępuj zgodnie z komunikatem, aby otworzyć drzwi, zdjąć koło podporowe i wyjąć wkład z zamkniętym zaworem z uchwytu wkładu.
    6. Umieścić wkład na stole i przygotować się do wstrzyknięcia roztworu PBS i próbki krwi pełnej. Odpipetować 6 ml roztworu PBS za pomocą pipety serologicznej. Włóż końcówkę pipety głęboko do wlotu PBS wkładu i powoli wstrzyknij 6 ml roztworu PBS.
    7. Po wstrzyknięciu roztworu PBS należy odpipetować 3 ml krwi pełnej lub próbki PBMC uzyskanej z LBx-2 za pomocą pipety serologicznej, która została uprzednio przepłukana 1% BSA, aby zapobiec przywieraniu pozostałości. Włóż końcówkę pipety głęboko do wlotu próbki wkładu i powoli wstrzyknij próbkę krwi pełnej.
    8. Włóż wkłady, które mają być używane, w kolejności od liczby na uchwycie wkładu. Użyj koła podporowego, aby zamontować wkład i dokręć nakrętkę zabezpieczającą, aby ją zabezpieczyć. Zamknij drzwi i naciśnij przycisk OK.
    9. CTC są automatycznie wzbogacane z krwi pełnej, co trwa około 15 minut. Poszukaj komunikatu, który pojawia się wraz z dźwiękiem alarmu po zakończeniu wzbogacania CTC. Zatrzymaj alarm, otwierając drzwi lub naciskając przycisk STOP.
    10. Otwórz drzwiczki, wyjmij wkład i połóż go na stole. Włóż narzędzie do usuwania tylnej płyty (BPR) do czterech otworów z przodu wkładu. Naciśnij ciemnoniebieskie skrzydło kciukami obu rąk, a następnie naciśnij jasnoniebieski korpus, aż usłyszysz kliknięcie.
    11. Ostrożnie wyjmij korpus wkładu, podnosząc go do góry. Bardzo delikatnie podnieś membranę filtracyjną za krawędź za pomocą pęsety. Upewnij się, że używasz zewnętrznej krawędzi (krawędź o szerokości 1 mm) membrany filtracyjnej, aby ścisnąć i przytrzymać membranę filtra.
    12. Ostrożnie umieścić membranę filtracyjną (na której znajdują się wzbogacone CTC) w probówce o pojemności 1,5 ml w celu przygotowania kwasu nukleinowego. W razie potrzeby odzyskaj przefiltrowaną krew do ujścia krwi za pomocą końcówki do pipety o pojemności 1 ml.

4. Utrzymanie systemu

  1. Przygotowanie do czyszczenia i dezynfekcji instrumentu
    1. Czyść wszystkie dostępne powierzchnie instrumentu i akcesoriów raz w tygodniu za pomocą etanolu i wysuszonej chusteczki, a także natychmiast po zanieczyszczeniu.
    2. Regularnie czyść miskę i wał wirnika za pomocą alkoholu (etanolu i izopropanolu) lub środków dezynfekujących na bazie alkoholu.
  2. Czyszczenie i dezynfekcja instrumentu
    UWAGA: Aby zapoznać się z ogólnymi informacjami na temat rozwiązywania problemów i innymi uwagami dotyczącymi urządzenia, zapoznaj się z Tabelą Uzupełniającą 2.
    1. Wyłącz przyrząd za pomocą głównego wyłącznika zasilania. Odłącz wtyczkę zasilania od zasilania.
    2. Otwórz drzwi i wyczyść i zdezynfekuj wszystkie dostępne powierzchnie instrumentu, w tym zasilający, za pomocą adamp szmatką i zalecanymi środkami czyszczącymi.
    3. Sprawdź wał wirnika pod kątem uszkodzeń. Sprawdź przyrząd pod kątem korozji i uszkodzeń.
    4. Podłącz przyrząd do zasilania tylko wtedy, gdy jest całkowicie suchy wewnątrz i na zewnątrz.
  3. Odłącz główną wtyczkę zasilania i wyjmij uchwyt bezpiecznika. Uchwyt bezpiecznika znajduje się nad gniazdkiem elektrycznym. Wymień zużyty bezpiecznik na zapasowy z pojemnika.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Celem tej techniki jest łatwe i automatyczne izolowanie substancji związanych z rakiem z krwi pełnej. W szczególności każdy może stosować tę technikę we wszystkich odpowiednich dziedzinach badań i analiz. Jednoczesne i powtarzalne oddzielenie wielu substancji w jednej próbce krwi jest istotne w przypadku płynnych biopsji. Krążki LBx-1 i LBx-2 służą do izolowania osocza i kożucha lub PBMC z krwi pełnej. Rysunek 1 pokazuje materiały oddzielone przez zastosowanie tego urządzenia. Po pierwsze, o...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Ilość i stężenie cfDNA i CTC zależy od osoby, stadium i rodzaju nowotworu. Zależy to również od stanu pacjenta 2,4,5,10,20. W szczególności we wczesnych lub przedrakowych stadiach raka stężenia substancji związanych z rakiem są bardzo niskie, więc istnieje duże prawdopodobieństwo, że nie można go wykryć. Niemniej jednak wczesne wykrycie ma bardzo pozytywny wpł...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają konfliktu interesów związanego z tą pracą.

Podziękowania

Ten manuskrypt był częściowo wspierany przez Koreański Fundusz Rozwoju Urządzeń Medycznych (KMDF, Grant No. RS-2020-KD000019) oraz Koreański Instytut Rozwoju Przemysłu Opieki Zdrowotnej (KHIDI, grant nr. HI19C0521020020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1% BSA (albumina surowicy bydlęcej)Sigma-AldrichA3059
1,5 ml probówka do mikrowirówekAxygenMCT-150-C-S
15 ml probówka stożkowaSPL50015
4150 System TapeStationAgilentG2992AABezkomórkowa taśma przesiewowa DNA (Agilent, 5067-5630), bezkomórkowy bufor do próbek DNA (Agilent, 5067-5633)
Apostle MiniMax Wysokowydajny zestaw do bezkomórkowej izolacji DNA ApostlesA17622-250mL X 50 wersja przygotowawcza
BD Probówki do pobierania krwi VacutainerProbówka do367525EDTA (10 ml)
BioViewCCBSClinomicsBioView - dostosowany system Bioview. Sprzęt do personalizacji oparty na mikroskopie Allegro Plus
Przeciwciało monoklonalne CD45 (HI30), PE-Alexa Fluor 610InvitrogenMHCD4522
FAST Kartridż automatycznyClinomicsCLX-M3001
Kartridż LBx-1ClinomicsCLX-M4101
Kartridż LBx-2ClinomicsCLX-M4201
OPR-2000 instrumentClinomicsCLX-I2001
Szkło osłonoweMarienfeld SuperiorHSU-0101040
Stojak magnetyczny DynaMag 2Thermo Fisher Scientific12321D
Ficoll Paque SolutionGE healthcare17-1440-03rozwiązanie gradientu gęstości
Końcówka filtra, 10 i mikro; LAxygenAX-TF-10Końcówki do pipet z barierami aerozolowymi są zalecane, aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu.
Końcówka filtra, 200 i mikro; LAxygenAX-TF-200Końcówki do pipet z barierami aerozolowymi są zalecane, aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu.
Końcówka filtra, 100 &mikro; LAxygenAX-TF-100Końcówki do pipet z barierami aerozolowymi są zalecane, aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu.
Końcówka filtra, 1000 i mikro; LAxygenAX-TF-1000Końcówki do pipet z barierami aerozolowymi są zalecane, aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu.
Przeciwciało anty-ludzkie FITC CD326 (EpCAM)BioLegend324204
FITC Mysz Anty-ludzka cytokeratynaBD Biosciences347653
Roztwór formaldehydu (35% wag. w H2O)Sigma Aldrich433284
Kimtech Science WycieraczkiYuhan-Kimberly41117
Rękawica lateksowaMicroflex63-754
Magnetyczny stojak do separacji kulekV& P ScientificVP 772F2M-2
Pipetowanie ręczne  (0,5-10 &mikro; L)Eppendorf3120000020
Pipetowanie ręczne  (2-20 &mikro; L)Eppendorf3120000038
Pipetowanie ręczne  (10-100 &mikro; L)Eppendorf3120000046
Pipetowanie ręczne  (20-200 &mikro; L)Eppendorf3120000054
Ręczne pipetowanie  (100-1000 &mikro; L)Eppendorf3120000062
Medium montażowe z DAPI - Wodny, Fluoroshieldabcamab104139
Normalna ludzka kontrola IgGR& D Systems1-001-A
OLYMPUS BX-UCBOlympus9217316
Przeciwciało monoklonalne cytokeratyny Pan (AE1/AE3), Alexa Fluor 488Invitrogen53-9003-82
PBS (roztwór soli fizjologicznej buforowany fosforanami)Corning21-040CVC
Przenośny środek do pipetowaniaDrummond4-000-201
Szkło przesuwneMarienfeld SuperiorHSU-1000612
Pudełko do barwienia SimportM920
Sterylna pipeta serologiczna (10 ml)SPL91010
Triton  Rozwiązanie X-100Sigma Aldrich93443
TWEEN  20Sigma AldrichP7949
Krewprzechowywana w temperaturze 4-8 stopni; C przez gromadzenie w stabilnej probówce EDTA lub cfDNA : Jeśli pełna krew jest niewystarczająca w 9 ml, dodaj PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami) tyle, ile to konieczne.
X-Cite 120Q (oświetlacz świetlówki)Excelitas010-00157
5 pobierania krwi BD pełna

Bibliografia

  1. Babayan, A., Pantel, K. Advances in liquid biopsy approaches for early detection and monitoring of cancer. Genome Medicine. 10 (1), 21(2018).
  2. Crowley, E., Di Nicolantonio, F., Loupakis, F., Bardelli, A. Liquid biopsy: monitoring cancer-genetics in the blood. Nature Reviews Clinical Oncology. 10 (8), 472-484 (2013).
  3. Bardelli, A., Pantel, K. Liquid biopsies, what we do not know (yet). Cancer Cell. 31 (2), 172-179 (2017).
  4. Mattox, A. K., et al. Applications of liquid biopsies for cancer. Science Translational Medicine. 11 (507), (2019).
  5. Heitzer, E., Perakis, S., Geigl, J. B., Speicher, M. R. The potential of liquid biopsies for the early detection of cancer. NPJ Precision Oncology. 1 (1), 36(2017).
  6. Scudellari, M. Myths that will not die. Nature. 582 (7582), 322-326 (2015).
  7. Prasad, V., Fojo, T., Brada, M. Precision oncology: origins, optimism, and potential. The Lancet Oncology. 17 (2), 81-86 (2016).
  8. Prasad, V. Perspective: The precision-oncology illusion. Nature. 537 (7619), 63(2016).
  9. Siravegna, G., Marsoni, S., Siena, S., Bardelli, A. Integrating liquid biopsies into the management of cancer. Nature Reviews Clinical Oncology. 14 (9), 531-548 (2017).
  10. Bettegowda, C., et al. Detection of circulating tumor DNA in early-and late-stage human malignancies. Science Translational Medicine. 6 (224), 24(2014).
  11. Udomruk, S., Orrapin, S., Pruksakorn, D., Chaiyawat, P. Size distribution of cell-free DNA in oncology. Critical Reviews in Oncology/Hematology. 166, 103455(2021).
  12. Paterlini-Brechot, P., Benali, N. L. Circulating tumor cells (CTC) detection: clinical impact and future directions. Cancer Letters. 253 (2), 180-204 (2007).
  13. Loeian, M. S., et al. Liquid biopsy using the nanotube-CTC-chip: capture of invasive CTCs with high purity using preferential adherence in breast cancer patients. Lab on a Chip. 19 (11), 1899-1915 (2019).
  14. Rikkert, L. G., Van Der Pol, E., Van Leeuwen, T. G., Nieuwland, R., Coumans, F. A. W. Centrifugation affects the purity of liquid biopsy-based tumor biomarkers. Cytometry Part A. 93 (12), 1207-1212 (2018).
  15. Sharma, S., et al. Circulating tumor cell isolation, culture, and downstream molecular analysis. Biotechnology advances. 36 (4), 1063-1078 (2018).
  16. Bennett, C. W., Berchem, G., Kim, Y. J., El-Khoury, V. Cell-free DNA and next-generation sequencing in the service of personalized medicine for lung cancer. Oncotarget. 7 (43), 71013(2016).
  17. Lowes, L. E., et al. Circulating tumor cells (CTC) and cell-free DNA (cfDNA) workshop 2016: scientific opportunities and logistics for cancer clinical trial incorporation. International Journal of Molecular Sciences. 17 (9), 1505(2016).
  18. Bryzgunova, O. E., Konoshenko, M. Y., Laktionov, P. P. Concentration of cell-free DNA in different tumor types. Expert Review of Molecular Diagnostics. 21 (1), 63-75 (2021).
  19. Park, Y., et al. Circulating tumour cells as an indicator of early and systemic recurrence after surgical resection in pancreatic ductal adenocarcinoma. Scientific Reports. 11 (1), 1-12 (2021).
  20. Heidrich, I., Ačkar, L., Mossahebi Mohammadi, P., Pantel, K. Liquid biopsies: Potential and challenges. International Journal of Cancer. 148 (3), 528-545 (2021).
  21. Celec, P., Vlková, B., Lauková, L., Bábíčková, J., Boor, P. Cell-free DNA: the role in pathophysiology and as a biomarker in kidney diseases. Expert Reviews in Molecular Medicine. 20, 1(2018).
  22. Thierry, A. R., et al. Origin and quantification of circulating DNA in mice with human colorectal cancer xenografts. Nucleic Acids Research. 38 (18), 6159-6175 (2010).
  23. Moreira, V. G., de la Cera Martínez, T., Gonzalez, E. G., Garcia, B. P., Menendez, F. V. A. Increase in and clearance of cell-free plasma DNA in hemodialysis quantified by real-time PCR. Clinical Chemistry and Laboratory Medicine (CCLM). 44 (12), 1410-1415 (2006).
  24. Gauthier, V. J., Tyler, L. N., Mannik, M. Blood clearance kinetics and liver uptake of mononucleosomes in mice. Journal of Immunology. 156 (3), 1151-1156 (1996).
  25. Meng, S., et al. Circulating tumor cells in patients with breast cancer dormancy. Clinical Cancer Research. 10 (24), 8152-8162 (2004).
  26. Alix-Panabières, C., Pantel, K. Challenges in circulating tumour cell research. Nature Reviews Cancer. 14 (9), 623-631 (2014).
  27. Zhou, J., et al. Isolation of circulating tumor cells in non-small-cell-lung-cancer patients using a multi-flow microfluidic channel. Microsystems & Nanoengineering. 5 (1), 8(2019).
  28. Sajay, B. N. G., et al. Towards an optimal and unbiased approach for tumor cell isolation. Biomedical Microdevices. 15 (4), 699-709 (2013).
  29. Bailey, P. C., Martin, S. S. Insights on CTC biology and clinical impact emerging from advances in capture technology. Cells. 8 (6), 553(2019).
  30. Ahn, S. M., Simpson, R. J. Body fluid proteomics: Prospects for biomarker discovery. Proteomics-Clinical Applications. 1 (9), 1004-1015 (2007).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

p ynna biopsjadiagnostyka nowotwor wwolnokom rkowe DNAkr ce kom rki nowotworoweseparacja osoczaizolacja warstwy leukocytarnejobwodnicze mononuklearne kom rki krwiLab On A Discseparacja w gradiencie g sto cimikroskopia fluorescencyjna

Powiązane artykuły