Method Article

Pobieranie nasienia i komputerowa analiza nasienia w modelu teleost japońskiej Medaka (Oryzias latipes)

DOI:

10.3791/64326

⸱

October 6th, 2022

 ,  , 
1Department of Preclinical Sciences and Pathology, Faculty of Veterinary Medicine, Norwegian University of Life Sciences, 2Department of Production Animal Clinical Sciences, Faculty of Veterinary Medicine, Norwegian University of Life Sciences

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten artykuł opisuje dwie szybkie i skuteczne metody pobierania nasienia od małego modelu rybnego medaka (Oryzias latipes), a także protokół wiarygodnej oceny jakości nasienia za pomocą wspomaganej komputerowo analizy nasienia (CASA).

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Japońska medaka (Oryzias latipes) to ryba teleostyczna i wyłaniający się model kręgowców do badań ekotoksykologicznych, rozwojowych, genetycznych i fizjologicznych. Medaka jest również szeroko stosowana do badania rozmnażania kręgowców, które jest podstawową funkcją biologiczną, ponieważ pozwala gatunkowi na przetrwanie. Jakość nasienia jest ważnym wskaźnikiem męskiej płodności, a tym samym sukcesu reprodukcyjnego. Techniki ekstrakcji nasienia i analiza nasienia są dobrze udokumentowane dla wielu gatunków, w tym ryb teleostowych. Pobieranie nasienia jest stosunkowo proste u większych ryb, ale może być bardziej skomplikowane u małych ryb modelowych, ponieważ produkują one mniej plemników i są delikatniejsze. W związku z tym w niniejszym artykule opisano dwie metody pobierania nasienia u małego modelu ryby, japońskiej medaki: preparację jąder i masaż brzucha. Artykuł ten pokazuje, że oba podejścia są wykonalne w przypadku medaka i pokazuje, że masaż brzucha może być wykonywany wielokrotnie wiele razy, ponieważ ryby szybko wracają do zdrowia po zabiegu. W artykule opisano również protokół komputerowej analizy nasienia w medaka w celu obiektywnej oceny kilku ważnych wskaźników jakości nasienia medaka (ruchliwość, progresywność, czas trwania ruchliwości, względne stężenie). Procedury te, określone dla tego użytecznego modelu małego teleostu, znacznie poprawią zrozumienie środowiskowych, fizjologicznych i genetycznych czynników wpływających na płodność u samców kręgowców.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Japońska medaka to mała, składająca jaja słodkowodna ryba teleostyczna pochodząca z Azji Wschodniej. Medaka stała się doskonałym systemem modelowania kręgowców dla ekotoksykologii, genetyki rozwojowej, genomiki oraz badań nad biologią ewolucyjną i fizjologią1,2. Podobnie jak popularne danio pręgowane, są stosunkowo łatwe w hodowli i wysoce odporne na wiele powszechnych chorób ryb1,2. Istnieje kilka zalet korzystania z medaka jako modelu, w tym krótki czas generacji, przezroczysty embryos1,2 oraz sekwencjonowany genom3. W przeciwieństwie do danio pręgowanego, medaka ma gen4, a także tolerancję na wysoką temperaturę (od 4-40 °C) i zasolenie (gatunki euryhalinowe)5. Ponadto wiele narzędzi genetycznych i anatomicznych, a także protokołów6,7,8,9,10,11,12, zostały opracowane w medaka, aby ułatwić badanie jego biologii.

Rozmnażanie jest podstawową funkcją fizjologiczną, ponieważ pozwala gatunkowi przetrwać. Rozmnażanie kręgowców wymaga niezliczonych precyzyjnie zaplanowanych zdarzeń, w tym produkcji oocytów u samic i produkcji plemników u samców. Plemniki to unikalne komórki, wytwarzane w złożonym procesie spermatogenezy, w którym istnieje szereg punktów kontrolnych gwarantujących dostarczenie produktu wysokiej jakości13. Jakość gamet stała się przedmiotem zainteresowania w akwakulturze i badaniach populacji ryb ze względu na jej wpływ na sukces zapłodnienia i przeżywalność larw. Jakość nasienia jest zatem ważnym wskaźnikiem płodności samców kręgowców.

Trzy użyteczne czynniki do oceny jakości nasienia ryb to ruchliwość, postępowość i długowieczność. Ruchliwość procentowa i ruchliwość postępowa są powszechnymi wskaźnikami jakości plemników, ponieważ ruch postępowy jest niezbędny do powodzenia zapłodnienia i silnie z nim koreluje14,15. Czas trwania ruchu jest również ważnym wskaźnikiem u ryb, ponieważ plemniki pozostają w pełni ruchliwe przez mniej niż 2 minuty u większości gatunków teleostów, a trajektoria plemników jest na ogół mniej liniowa niż u ssaków15. Jednak wiele badań oceniających ruchliwość plemników w przeszłości opierało się na subiektywnych lub półilościowych metodach analizy plemników15,16. Na przykład ruchliwość plemników w medaka była w przeszłości szacowana wizualnie pod mikroskopem17. Oszacowano go również poprzez rejestrowanie ruchu plemników i używanie oprogramowania do obrazowania w celu łączenia ramek oraz pomiaru ścieżki i prędkości pływania18,19,20. Takie podejścia często nie są solidne, dając różne wyniki w zależności od osoby przeprowadzającej analizę15,21.

Komputerowa analiza nasienia (CASA) została początkowo opracowana dla ssaków. CASA to szybka metoda ilościowa do oceny jakości nasienia poprzez rejestrowanie i pomiar prędkości i trajektorii w sposób zautomatyzowany15. U ryb był używany u różnych gatunków do monitorowania wpływu kilku zanieczyszczeń wody na jakość nasienia, do identyfikacji interesujących progenitorów w celu ulepszenia stada wylęgowego, poprawy efektywności kriokonserwacji i przechowywania oraz optymalizacji warunków zapłodnienia15. Dlatego jest to potężne narzędzie do wiarygodnej oceny jakości nasienia u różnych gatunków kręgowców. Jednak ze względu na dużą różnorodność strategii rozrodczych między rybami, plemniki ryb teleost różnią się od nasienia ssaków i gatunków ryb. Ryby teleost, które przede wszystkim zapładniają jaja zewnętrznie, uwalniając gamety do wody, mają wysoce skoncentrowane plemniki, które są stosunkowo proste w budowie bez akrosomów, w przeciwieństwie do ssaków, które zapładniają wewnętrznie i dlatego nie muszą kompensować rozcieńczenia w wodzie, ale muszą wytrzymać bardziej lepkie płyny14. Ponadto plemniki większości ryb poruszają się szybko, ale są w pełni ruchliwe przez mniej niż 2 minuty po aktywacji, chociaż istnieje kilka wyjątków15,22. Ponieważ ruchliwość może gwałtownie spaść u większości ryb, należy zachować szczególną ostrożność przy czasie analizy po aktywacji podczas określania protokołu analizy nasienia dla ryb.

Rozmnażanie jest jedną z dziedzin biologii, w której teleosty i medaka były szeroko stosowane jako organizmy modelowe. Rzeczywiście, samce medaka wykazują interesujące zachowania reprodukcyjne i społeczne, takie jak ochrona partnera23,24. Ponadto istnieje kilka linii transgenicznych do badania neuroendokrynnej kontroli rozrodu u tego gatunku25,26,27. Pobieranie próbek nasienia, procedura, która jest stosunkowo prosta u większych ryb, może być bardziej skomplikowana u małych ryb modelowych, ponieważ produkują one mniej plemników i są delikatniejsze. Z tego powodu większość badań polegających na pobieraniu próbek nasienia w ekstrakcie medaka milt (nasienie ryb) poprzez zmiażdżenie wypreparowanych jąder17,28,29,30. W kilku badaniach stosuje się również zmodyfikowany masaż brzucha, aby wyrazić milt bezpośrednio w medium aktywującym18,19,20; Jednak przy tej metodzie trudno jest zobrazować ilość i kolor wydobywanego mlecza. U danio pręgowanego masaż brzucha jest powszechnie stosowany do wyrażania mleczka, które jest natychmiast zbierane w rurce kapilarnej31,32,33. Metoda ta umożliwia oszacowanie objętości mlecza, a także obserwację barwy ejakulatu, która jest szybkim i prostym wskaźnikiem jakości nasienia32,33. W związku z tym w przypadku medaki brakuje jasnego i dobrze opisanego protokołu pobierania i analizy nasienia.

Ten artykuł opisuje zatem dwie metody pobierania nasienia u małego modelu japońskiej ryby: preparację jąder i masaż brzucha za pomocą kapilarnek. Pokazuje to, że oba podejścia są wykonalne dla medaka i pokazuje, że masaż brzucha może być wykonywany wielokrotnie wiele razy, ponieważ ryba szybko wraca do zdrowia po zabiegu. Opisano w nim również protokół komputerowej analizy nasienia w medaka, aby wiarygodnie zmierzyć kilka ważnych wskaźników jakości plemników medaka (ruchliwość, progresywność, długowieczność i względne stężenie plemników). Procedury te, określone dla tego użytecznego modelu małego teleostu, znacznie poprawią zrozumienie środowiskowych, fizjologicznych i genetycznych czynników wpływających na płodność u samców kręgowców.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie eksperymenty i obchodzenie się ze zwierzętami były prowadzone zgodnie z zaleceniami dotyczącymi dobrostanu zwierząt doświadczalnych na Norweskim Uniwersytecie Przyrodniczym (NMBU). Eksperymenty przeprowadzono na dorosłym (6-9 miesięcznym) samcu japońskiej medaka (szczep Hd-rR) hodowanym w NMBU (Ås, Norwegia). Metody te zostały również krótko przetestowane na 9-miesięcznym samcu japońskiej medaka (szczep CAB) hodowanym w Narodowym Instytucie Badawczym ds. Rolnictwa, Żywności i Środowiska (INRAE, Rennes, Francja).

1. Przygotowanie instrumentu i roztworu

  1. Przygotować znieczulający roztwór podstawowy (0,6% trikainy).
    1. Rozcieńczyć 0,6 g trikainy (MS-222) w 100 ml 10x soli fizjologicznej z buforu fosforanowego (PBS).
    2. Podzielić 2 ml podstawowego roztworu środka znieczulającego na 50 probówek z tworzywa sztucznego o pojemności 2 ml i przechowywać w temperaturze -20 °C do momentu użycia w celu znieczulenia lub eutanazji.
  2. Przygotować wodę do odzysku (0,9% roztwór chlorku sodu [NaCl]).
    1. Dodaj 27 g NaCl do 3 l wody w akwarium.
    2. Roztwór należy przechowywać w temperaturze pokojowej (RT) do czasu użycia.
  3. W razie potrzeby dostosuj pożywkę aktywacyjną (zrównoważony roztwór soli Hanka [HBSS]).
    UWAGA: HBSS można zakupić komercyjnie lub wykonać w laboratorium (Tabela materiałów).
    1. Zmierz pH HBSS za pomocą pH-metru. W razie potrzeby dostosuj pH za pomocą kwasu solnego lub wodorotlenku sodu, tak aby końcowe pH wynosiło 7,1-7,3.
    2. Zmierz osmolalność HBSS za pomocą osmometru do przyszłego raportowania.
      UWAGA: Zakres na produkcie komercyjnym wynosi 266-294 mOsmol/kg; w obecnym badaniu osmolalność wynosiła 287 mOsmol/kg. W razie potrzeby można go rozcieńczyć wodą destylowaną w celu zmniejszenia osmolalności, ale nie jest to konieczne, ponieważ nie ma dużej różnicy w aktywacji plemników medaka w 150-300 mOsmol/kg HBSS.
    3. Roztwór należy przechowywać w temperaturze pokojowej do czasu użycia.
  4. Przygotuj gąbkę do trzymania.
    1. Wytnij miękką gąbkę, aby dobrze pasowała do szalki Petriego.
    2. Wytnij prostą linię na środku gąbki, która jest wystarczająco długa, aby przyjąć rybę (3-4 cm) i ma około 1 cm głębokości (Rysunek 1A). Ta szczelina w gąbce utrzyma rybę brzuszną stroną do góry, aby odsłonić kloakę.

2. Pobieranie nasienia

UWAGA: Pobieranie nasienia można osiągnąć za pomocą dwóch różnych metod: masażu brzucha lub sekcji jąder.

  1. Pobieranie nasienia za pomocą masażu brzucha
    1. Przygotuj 0,03% roztwór znieczulający, rozcieńczając jedną tubkę bulionu Trikainy (0,6%) w 38 ml wody akwariowej w szklanym pojemniku o pojemności 100 ml.
    2. Przygotuj instrumenty, w tym gładkie kleszczyki z końcem oraz jednorazową kalibrowaną szklaną mikropipetę o pojemności 10 μl i zespół rurki aspiratora (Rysunek 1A). Zwilżyć gąbkę przytrzymującą przygotowaną w kroku 1.4 roztworem znieczulającym.
    3. Przygotować probówki z 36 μl roztworu aktywującego do natychmiastowej analizy. Podgrzewać roztwór aktywujący w łaźni wodnej lub inkubatorze nastawionym na temperaturę 27 °C przez co najmniej 5 minut
      UWAGA: Chociaż próbki mogą być analizowane od pojedynczych ryb, indywidualne różnice można zmniejszyć, łącząc próbki od wielu samców w tym samym roztworze aktywującym. W przypadku łączenia próbek pochodzących od wielu ryb należy użyć 36 μl roztworu aktywującego na rybę. Rozcieńczenie to może wymagać dostosowania w zależności od szczepu lub warunków hodowli użytej medaki, ponieważ czynniki te mogą wpływać na koncentrację i objętość plemników. Program CASA wskaże, czy stężenie jest zbyt wysokie, aby zidentyfikować plemniki.
    4. Znieczulić rybę, umieszczając ją w roztworze znieczulającym na 30-90 s.
      UWAGA: Czas trwania znieczulenia musi być dostosowany, ponieważ różni się w zależności od wielkości ryby. Aby upewnić się, że ryba jest w pełni znieczulona, delikatnie uszczypnij szypułkę ogonową kleszczami. Jeśli ryba nie zareaguje, masaż można rozpocząć.
    5. Wyjmij rybę z roztworu znieczulającego i użyj ręcznika papierowego lub delikatnie wytrzyj, aby wysuszyć brzuch ryby. Umieść rybę w korycie wilgotnej gąbki trzymającej brzuszną stroną do góry, tak aby jej skrzela były wystawione na działanie roztworu znieczulającego zawartego w gąbce (Rysunek 1B).
    6. Jeśli obszar wokół kloaki jest mokry, delikatnie osusz spód ryby jednorazową chusteczką higieniczną.
    7. Umieść rybę w gąbce do trzymania pod mikroskopem preparacyjnym i umieść mikropipetę z rurką aspiratora przymocowaną do kloaki ryby (Rysunek 1C).
    8. Masuj brzuch ryby, delikatnie ściskając końcami gładkie kleszcze w ruchu rostralnym do ogonowego, jednocześnie ssąc, aby zebrać wydalony mleczak do pipety (Rysunek 1D).
    9. Uwolnij rybę z gąbki do wody regeneracyjnej. Pozwól im zregenerować się w roztworze przez co najmniej 15 minut przed powrotem do systemu akwariowego.
    10. Przenieść mleczko do przygotowanej probówki z podgrzanym roztworem aktywującym i kilkakrotnie pipetować w górę i w dół, zasysając i na zespół rurki aspiratora.
    11. Delikatnie homogenizować rozcieńczone plemniki, przesuwając rurki przed analizą.
      UWAGA: Aby uzyskać najlepsze wyniki, analizuj próbki natychmiast (np. 5 s) po aktywacji. W medace analiza może być opóźniona, jeśli to konieczne, ponieważ plemniki pozostają ruchliwe przez kilka godzin, ale czas powinien pozostać spójny między próbkami, ponieważ ruchliwość zmniejsza się z czasem.
  2. Pobieranie nasienia poprzez rozwarstwienie jąder
    1. Przygotuj 0,08% roztwór do eutanazji, rozcieńczając dwie probówki wywaru Trikainy (0,6%) w 26 ml wody akwariowej w szklanym pojemniku o pojemności 100 ml.
    2. Przygotuj narzędzia do preparowania, w tym i cienkie kleszcze oraz małe nożyczki do preparowania (Rysunek 1E).
    3. Do każdej próbki należy przygotować probówkę ze 120 μl roztworu aktywującego do natychmiastowej analizy. Podgrzewać roztwór aktywujący w łaźni wodnej lub inkubatorze nastawionym na temperaturę 27 °C przez co najmniej 5 minut
      UWAGA: Chociaż próbki mogą być analizowane od pojedynczych ryb, indywidualne różnice można zmniejszyć, łącząc próbki od wielu samców w tym samym roztworze aktywującym. Do łączenia próbek pochodzących od wielu ryb należy użyć 120 μl roztworu aktywującego na rybę. Rozcieńczenie to może wymagać dostosowania w zależności od szczepu lub warunków hodowli użytej medaki, ponieważ czynniki te mogą wpływać na koncentrację i objętość plemników. Program CASA wskaże, czy stężenie jest zbyt wysokie, aby zidentyfikować plemniki.
    4. Poddaj rybę eutanazji, umieszczając ją w 0,08% roztworze znieczulającym na 30-90 s.
      UWAGA: Czas trwania zależy od wielkości ryby. Aby upewnić się, że ryba zostanie poddana eutanazji, poczekaj, aż ruchy wieczko ustaną. Ryba nie powinna reagować na dotyk kleszczy.
    5. Wyjmij rybę z roztworu do eutanazji i delikatnie osusz rybę ręcznikiem papierowym lub delikatnie wytrzyj.
      UWAGA: Na tym etapie ryby można zważyć, aby później obliczyć indeks gonadosomatyczny (GSI, masa gonad / masa ciała).
    6. Umieść rybę pod mikroskopem preparacyjnym lewą boczną stroną skierowaną do góry (Rysunek 1F).
    7. Za pomocą małych nożyczek preparacyjnych odetnij klapę grzbietowo od kloaki, a następnie w poprzek żeber do skrzeli, aby odsłonić narządy wewnętrzne (Rysunek 1G).
    8. Zlokalizuj jądra, odetnij nasadkę na obu końcach cienkimi kleszczami i usuń jądra (Rysunek 1H).
      UWAGA: Aby obliczyć GSI, na tym etapie można zważyć jądra. Pracuj szybko, aby uniknąć wysuszenia tkanki.
    9. Przenieść jądra do przygotowanej probówki z podgrzanym roztworem aktywującym.
    10. Użyj kleszczy, aby kilkakrotnie zmiażdżyć jądra o bok rurki, aby uwolnić plemniki. Uwalnianie plemników można zwykle uwidocznić i sprawi, że roztwór będzie lekko mętny.
    11. Delikatnie homogenizować rozcieńczone plemniki, przesuwając rurki przed analizą.
      UWAGA: Aby uzyskać najlepsze wyniki, analizuj próbki natychmiast (np. 5 s) po aktywacji. W medace analiza może być opóźniona, jeśli to konieczne, ponieważ plemniki pozostają ruchliwe przez kilka godzin, ale czas powinien pozostać spójny między próbkami, ponieważ ruchliwość zmniejsza się z czasem.

figure-protocol-1
Rysunek 1: Pobieranie mleka poprzez masaż brzucha (A-D) i sekcję jąder (E-H). (A) Instrumenty do masażu brzucha: gąbka do trzymania, gładkie kleszcze i jednorazowa kalibrowana szklana mikropipeta o pojemności 10 μl z zespołem rurki aspiratora; (B) Ułożenie ryb w gąbce do trzymania, ze skrzelami wystawionymi na znieczulenie w gąbce i kloace skierowanymi do góry; (C) Położenie, gładkich kleszczy na brzuchu i mikropipety przy kloace; (D) Milt w mikropipecie po delikatnym masażu i ssaniu. (E) Narzędzia do preparowania jąder: kleszcze, cienkie kleszcze i małe nożyczki preparacyjne; (F) Pozycja ryb do rozbioru jąder; (G) Widok boczny narządów wewnętrznych; (H) Usuń jądra, przecinając nasadkę na obu końcach drobnymi kleszkami. Podziałka: 2 mm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

3. Badanie nasienia za pomocą systemu CASA

  1. System CASA (SCA Evolution) należy skonfigurować zgodnie z instrukcją z mikroskopem z zielonym filtrem i 10-krotnym obiektywem z kontrastem fazowym.
  2. Przygotować jednorazowe szkiełka z komorą liczącą o wielkości 20 μm, podgrzewając je na płycie grzewczej lub w inkubatorze ustawionym na 27 °C przez co najmniej 5 minut.
  3. Otwórz oprogramowanie do analizy nasienia i wybierz moduł ruchliwości.
  4. Ustaw konfigurację dla medaki, jak pokazano w Rysunek 2B.
  5. Umieścić wstępnie podgrzane jednorazowe szkiełko z komorą liczącą o wielkości 20 μm pod mikroskopem na podgrzewanym stoliku ustawionym na 27 °C.
  6. Odpipetować próbkę do komory na szkiełku, aż wypełni komorę bez przepełnienia. Ostrożnie zetrzyj nadmiar próbek z wejścia do komory bawełnianą końcówką lub delikatnie przetrzyj, aby zapobiec unoszeniu się komórek.
  7. Wybierz opcję Analizuj, aby przyjrzeć się próbce pod mikroskopem.
    UWAGA: Jeśli ikona mikroskopu jest czerwona, oświetlenie mikroskopu należy wyregulować, aby program dokładnie śledził plemniki. Dostosuj jasność mikroskopu, aby ruch ogona plemnika był wyraźnie widoczny. Ikona powinna być niebieska.
  8. Upewnij się, że mikroskop jest ustawiony i ponownie wybierz opcję Analizuj, aby zarejestrować plemniki w terenie. Przesuń slajd tak, aby nowy obszar próbki znalazł się w kadrze i powtórz przechwytywanie dla 3-5 różnych pól widzenia. Unikaj pól z pęcherzykami powietrza, masami komórkowymi lub artefaktami.
  9. Wybierz pozycję Wyniki, aby wyświetlić wyniki.
    UWAGA: Jeśli pola na stronie wyników są zaznaczone na czerwono, postępuj zgodnie z instrukcjami systemu, aby usunąć pola, które różnią się zbytnio pod względem stężenia lub ruchliwości.
  10. Kliknij dwukrotnie pole, aby wyświetlić wyniki dla pojedynczego pola lub ręcznie sprawdzić, czy nie ma błędnie oznaczonych lub nieśledzonych plemników. Kliknij prawym przyciskiem myszy na poszczególne plemniki, aby w razie potrzeby ponownie oznaczyć ich ruchliwość (Rysunek 2A).

figure-protocol-2
Rysunek 2: Zrzut ekranu oprogramowania SCA Evolution. (A) Wyniki śledzenia plemników dla jednego pola. Wyświetl dane pola po prawej stronie i kliknij dwukrotnie plemniki, aby wyświetlić poszczególne dane; (B) Podsumowanie wyników dla wszystkich pól z otwartym menu konfiguracji. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rodzaj uzyskanych danych
Analiza ruchliwości plemników z oprogramowania SCA Evolution dostarcza danych na temat ruchliwości (procent ruchliwych i nieruchomych plemników), a także progresji (procent plemników progresywnych i niepostępowych) oraz prędkości (procent plemników szybkich, średnich i wolno rotujących). Łączy również w sobie progresywność i prędkość (szybki progresywny, średnio progresywny, nieprogresywny). Etykiety te są oparte na pomiarach (Rysunek 3A) i obliczeniach (<...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Osmolalność jest ważnym czynnikiem w aktywacji plemników ryb36,37. Ogólnie rzecz biorąc, plemniki są nieruchome w jądrach i stają się ruchliwe w pożywkach, które są hiperosmotyczne w stosunku do płynu nasiennego u ryb morskich i hipoosmotyczne w stosunku do płynu nasiennego u ryb słodkowodnych37. Podobnie jak we krwi, osocze nasienia u ryb słodkowodnych jest zazwyczaj niższe niż u ryb morskich (około 300 mOsmol/kg w porównaniu do 400 mOsmo...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca została sfinansowana przez Norweski Uniwersytet Przyrodniczy i amerykański program Fulbrighta. Autorzy chcieliby podziękować Anthony'emu Peltierowi i Lourdes Carreon G Tan z NMBU za konserwację obiektu rybnego oraz Guillaume'owi Gourmelinowi z ISC LPGP w INRAE (Francja) za udostępnienie ryb i przestrzeni laboratoryjnej do dalszego testowania tych metod.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Probówki 1,5 mlAxygenMCT-150-CMożna użyć dowolnej standardowej marki
10 i mikro; L jednorazowy kalibrowany szklany zespół mikropipety i rurki aspiratoraDrummond2-000-010
10-krotny obiektyw z kontrastem fazowymNikonMRP90100
rurki 2 mlAxygenMCT-200-c-sMożna użyć dowolnej standardowej marki
KleszczeNarzędzia do nauki11000-12
kleszcze gładkieMilliporeXX6200006P
Jednorazowa szkiełko z komorą liczącą 20 mikronówMicroptic20.2.25 Leja 2 zjeżdżalnie komorowe
Mikroskop preparacyjnyOlympusSZX7Można użyć dowolnej standardowej marki
Drobne kleszczeFine Science Tools11253-20
HBSSSigmaaldrichH8264-1L
Gąbka trzymającawłasnej produkcji
Mikroskop odwróconyNikonEclipse Ts2R
SCA EvolutionMicroptic
Małe nożyczki preparacyjneFine Science Tools14090-09
Chlorek sodu (NaCl)SigmaaldrichS9888
Wir stołowyLabnetC1301B
TrikaineSigmaaldrichA5040

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Shima, A., Mitani, H. Medaka as a research organism: past, present and future. Mechanisms of Development. 121 (7-8), 599-604 (2004).
  2. Wittbrodt, J., Shima, A., Schartl, M. Medaka - a model organism from the far east. Nature Reviews Genetics. 3 (1), 53-64 (2001).
  3. Kasahara, M., et al. The medaka draft genome and insights into vertebrate genome evolution. Nature. 447 (7145), 714-719 (2007).
  4. Matsuda, M., et al. DMY is a Y-specific DM-domain gene required for male development in the medaka fish. Nature. 417 (6888), 559-563 (2002).
  5. Sakamoto, T., Kozaka, T., Takahashi, A., Kawauchi, H., Ando, M. Medaka (Oryzias latipes) as a model for hypoosmoregulation of euryhaline fishes. Aquaculture. 193 (3-4), 347-354 (2001).
  6. Royan, M. R., et al. 3D atlas of the pituitary gland of the model fish medaka (Oryzias latipes). Frontiers in Endocrinology. 12, 719843(2021).
  7. Fontaine, R., Hodne, K., Weltzien, F. A. Healthy brain-pituitary slices for electrophysiological investigations of pituitary cells in teleost fish. Journal of Visualized Experiments. (138), e57790(2018).
  8. Fontaine, R., Weltzien, F. -A. Labeling of blood vessels in the teleost brain and pituitary using cardiac perfusion with a dii-fixative. Journal of Visualized Experiments. (148), e59768(2019).
  9. Ager-Wick, E., et al. Preparation of a high-quality primary cell culture from fish pituitaries. Journal of Visualized Experiments. (138), e58159(2018).
  10. Porazinski, S. R., Wang, H., Furutani-Seiki, M. Microinjection of medaka embryos for use as a model genetic organism. Journal of Visualized Experiments. (46), e1937(2010).
  11. Wiley-Blackwell. Medaka: Biology, Management, and Experimental Protocols. , Wiley-Blackwell. (2019).
  12. Royan, M. R., et al. Gonadectomy and blood sampling procedures in the small size teleost model japanese medaka (Oryzias latipes). Journal of Visualized Experiments. (166), e62006(2020).
  13. Bhat, I. A., et al. Testicular development and spermatogenesis in fish: insights into molecular aspects and regulation of gene expression by different exogenous factors. Reviews in Aquaculture. 13 (4), 2142-2168 (2021).
  14. vander Horst, G., Garcia Alvarez, O., Garde, J. J., Soler, A. J., Jones, D. Status of sperm functionality assessment in wildlife species: From fish to primates. Animals. 11 (6), 1491(2021).
  15. Kime, D. E., et al. Computer-assisted sperm analysis (CASA) as a tool for monitoring sperm quality in fish. Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Toxicology & Pharmacology. 130 (4), 425-433 (2001).
  16. Rurangwa, E., Kime, D. E., Ollevier, F., Nash, J. P. The measurement of sperm motility and factors affecting sperm quality in cultured fish. Aquaculture. 234 (1-4), 1-28 (2004).
  17. Yang, H., Tiersch, T. R. Sperm motility initiation and duration in a euryhaline fish, medaka (Oryzias latipes). Theriogenology. 72 (3), 386-392 (2009).
  18. Hashimoto, S., et al. Effects of ethinylestradiol on medaka (Oryzias latipes) as measured by sperm motility and fertilization success. Archives of Environmental Contamination and Toxicology. 56 (2), 253-259 (2009).
  19. Hara, Y., Strüssmann, C. A., Hashimoto, S. Assessment of short-term exposure to nonylphenol in Japanese medaka using sperm velocity and frequency of motile sperm. Archives of Environmental Contamination and Toxicology. 53 (3), 406-410 (2007).
  20. Kawana, R., Strüssmann, C. A., Hashimoto, S. Effect of p-Nonylphenol on sperm motility in Japanese medaka (Oryzias latipes). Fish Physiology and Biochemistry. 28, 213-214 (2003).
  21. Gallego, V., Herranz-Jusdado, J. G., Rozenfeld, C., Pérez, L., Asturiano, J. F. Subjective and objective assessment of fish sperm motility: when the technique and technicians matter. Fish Physiology and Biochemistry. 44 (6), 1457-1467 (2018).
  22. Browne, R. K., et al. Sperm motility of externally fertilizing fish and amphibians. Theriogenology. 83 (1), 1-13 (2015).
  23. Arias Padilla, L. F., et al. Cystic proliferation of germline stem cells is necessary to reproductive success and normal mating behavior in medaka. eLife. 10, 62757(2021).
  24. Okuyama, T., Yokoi, S., Takeuchi, H. Molecular basis of social competence in medaka fish. Development, Growth, and Differentiation. 59 (4), 211-218 (2017).
  25. Okubo, K., et al. Forebrain Gonadotropin-releasing hormone neuronal development: Insights from transgenic medaka and the relevance to X-linked Kallmann syndrome. Endocrinology. 147 (3), 1076-1084 (2006).
  26. Hodne, K., Fontaine, R., Ager-Wick, E., Weltzien, F. A. Gnrh1-induced responses are indirect in female Medaka Fsh cells, generated through cellular networks. Endocrinology. 160 (12), 3018-3032 (2019).
  27. Karigo, T., et al. Whole brain-pituitary in vitro preparation of the transgenic Medaka (Oryzias latipes) as a tool for analyzing the differential regulatory mechanisms of LH and FSH release. Endocrinology. 155 (2), 536-547 (2014).
  28. Kowalska, A., Kowalski, R., Zakęś, Z. The effect of selective cyclooxygenase (COX) inhibitors on japanese medaka (Oryzias latipes) reproduction parameters. World Academy of Science, Engineering and Technology. 77, 19-23 (2011).
  29. Kowalska, A., Siwicki, A. K., Kowalski, R. K. Dietary resveratrol improves immunity but reduces reproduction of broodstock medaka Oryzias latipes (Temminck & Schlegel). Fish Physiology and Biochemistry. 43 (1), 27-37 (2007).
  30. Tan, E., Yang, H., Tiersch, T. R. Determination of sperm concentration for small-bodied biomedical model fishes by use of microspectrophotometry. Zebrafish. 7 (2), 233-240 (2010).
  31. Harvey, B., Kelley, R. N., Ashwood-Smith, M. J. Cryopreservation of zebra fish spermatozoa using methanol. Canadian Journal of Zoology. 60 (8), 1867-1870 (1982).
  32. Wasden, M. B., Roberts, R. L., DeLaurier, A. Optimizing sperm collection procedures in Zebrafish. Journal of the South Carolina Academy of Science. 15 (2), 7(2017).
  33. Draper, B. W., Moens, C. B. A High-throughput method for Zebrafish sperm cryopreservation and in vitro fertilization. Journal of Visualized Experiments. (29), e1395(2009).
  34. Castellini, C., Dal Bosco, A., Ruggeri, S., Collodel, G. What is the best frame rate for evaluation of sperm motility in different species by computer-assisted sperm analysis. Fertility and Sterility. 96 (1), 24-27 (2011).
  35. Acosta, I. B., et al. Effects of exposure to cadmium in sperm cells of zebrafish, Danio rerio. Toxicology Reports. 3, 696-700 (2016).
  36. Wilson-Leedy, J. G., Kanuga, M. K., Ingermann, R. L. Influence of osmolality and ions on the activation and characteristics of zebrafish sperm motility. Theriogenology. 71 (7), 1054-1062 (2009).
  37. Alavi, S. M. H., Cosson, J. Sperm motility in fishes. (II) Effects of ions and osmolality: A review. Cell Biology International. 30 (1), 1-14 (2006).
  38. Kowalska, A., Kamaszews ki, M., Czarnowska-Kujawska, M., Podlasz, P., Kowalski, R. K. Dietary ARA improves COX activity in broodstock and offspring survival fitness of a model organism (Medaka Oryzias latipes). Animals. 10 (11), 2174(2020).
  39. Inoue, K., Takei, Y. Asian medaka fishes offer new models for studying mechanisms of seawater adaptation. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology. 136 (4), 635-645 (2003).
  40. Zadmajid, V., Myers, J. N., Sørensen, S. R., Ernest Butts, I. A. Ovarian fluid and its impacts on spermatozoa performance in fish: A review. Theriogenology. 132, 144-152 (2019).
  41. Poli, F., Immler, S., Gasparini, C. Effects of ovarian fluid on sperm traits and its implications for cryptic female choice in zebrafish. Behavioral Ecology. 30 (5), 1298-1305 (2019).
  42. Cosson, J., Groison, A. L., Suquet, M., Fauvel, C., Dreanno, C., Billard, R. Studying sperm motility in marine fish: An overview on the state of the art. Journal of Applied Ichthyology. 24 (4), 460-486 (2008).
  43. Beirão, J., Soares, F., Herráez, M. P., Dinis, M. T., Cabrita, E. Sperm quality evaluation in Solea senegalensis during the reproductive season at cellular level. Theriogenology. 72 (9), 1251-1261 (2009).
  44. Beirão, J., et al. Sperm handling in aquatic animals for artificial reproduction. Theriogenology. 133, 161-178 (2019).
  45. Yang, H., Tiersch, T. R. Current status of sperm cryopreservation in biomedical research fish models: Zebrafish, medaka, and Xiphophorus. Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Toxicology & Pharmacology. 149 (2), 224-232 (2009).
  46. Yang, H., Tiersch, T. R. Sperm cryopreservation in biomedical research fish models. Cryopreservation in Aquatic Species. 2, 439-454 (2011).
  47. Viveiros, A., Fessehaye, Y., ter Veld, M., Schulz, R., Komen, H. Hand-stripping of semen and semen quality after maturational hormone treatments, in African catfish Clarias gariepinus. Aquaculture. 213 (1-4), 373-386 (2002).
  48. Ransom, D. G., Zon, L. I. Appendix 3 collection, storage, and use of Zebrafish sperm. Methods in Cell Biology. 60, 365-372 (1998).
  49. Cosson, J. Frenetic activation of fish spermatozoa flagella entails short-term motility, portending their precocious decadence. Journal of Fish Biology. 76 (1), 240-279 (2010).
  50. Kowalski, R. K., Cejko, B. I. Sperm quality in fish: Determinants and affecting factors. Theriogenology. 135, 94-108 (2019).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Sperm CollectionComputer Assisted Sperm AnalysisJapanese MedakaTeleost FishAbdominal MassageTestes DissectionSperm MotilitySperm QualityFertility AssessmentEcotoxicology Model

Related Articles