Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Pobieranie nasienia i komputerowa analiza nasienia w modelu teleost japońskiej Medaka (Oryzias latipes)

4.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64326

⸱

6 października 2022

 ,  , 
1Department of Preclinical Sciences and Pathology, Faculty of Veterinary Medicine, Norwegian University of Life Sciences, 2Department of Production Animal Clinical Sciences, Faculty of Veterinary Medicine, Norwegian University of Life Sciences

W tym artykule

Podsumowanie

Ten artykuł opisuje dwie szybkie i skuteczne metody pobierania nasienia od małego modelu rybnego medaka (Oryzias latipes), a także protokół wiarygodnej oceny jakości nasienia za pomocą wspomaganej komputerowo analizy nasienia (CASA).

Streszczenie

Japońska medaka (Oryzias latipes) to ryba teleostyczna i wyłaniający się model kręgowców do badań ekotoksykologicznych, rozwojowych, genetycznych i fizjologicznych. Medaka jest również szeroko stosowana do badania rozmnażania kręgowców, które jest podstawową funkcją biologiczną, ponieważ pozwala gatunkowi na przetrwanie. Jakość nasienia jest ważnym wskaźnikiem męskiej płodności, a tym samym sukcesu reprodukcyjnego. Techniki ekstrakcji nasienia i analiza nasienia są dobrze udokumentowane dla wielu gatunków, w tym ryb teleostowych. Pobieranie nasienia jest stosunkowo proste u większych ryb, ale może być bardziej skomplikowane u małych ryb modelowych, ponieważ produkują one mniej plemników i są delikatniejsze. W związku z tym w niniejszym artykule opisano dwie metody pobierania nasienia u małego modelu ryby, japońskiej medaki: preparację jąder i masaż brzucha. Artykuł ten pokazuje, że oba podejścia są wykonalne w przypadku medaka i pokazuje, że masaż brzucha może być wykonywany wielokrotnie wiele razy, ponieważ ryby szybko wracają do zdrowia po zabiegu. W artykule opisano również protokół komputerowej analizy nasienia w medaka w celu obiektywnej oceny kilku ważnych wskaźników jakości nasienia medaka (ruchliwość, progresywność, czas trwania ruchliwości, względne stężenie). Procedury te, określone dla tego użytecznego modelu małego teleostu, znacznie poprawią zrozumienie środowiskowych, fizjologicznych i genetycznych czynników wpływających na płodność u samców kręgowców.

Wprowadzenie

Japońska medaka to mała, składająca jaja słodkowodna ryba teleostyczna pochodząca z Azji Wschodniej. Medaka stała się doskonałym systemem modelowania kręgowców dla ekotoksykologii, genetyki rozwojowej, genomiki oraz badań nad biologią ewolucyjną i fizjologią1,2. Podobnie jak popularne danio pręgowane, są stosunkowo łatwe w hodowli i wysoce odporne na wiele powszechnych chorób ryb1,2. Istnieje kilka zalet korzystania z medaka jako modelu, w tym krótki czas generacji, przezroczysty embryos1,2 oraz sekwencjonowany genom3. W przeciwieństwie do danio pręgowanego, medaka ma gen4, a także tolerancję na wysoką temperaturę (od 4-40 °C) i zasolenie (gatunki euryhalinowe)5. Ponadto wiele narzędzi genetycznych i anatomicznych, a także protokołów6,7,8,9,10,11,12, zostały opracowane w medaka, aby ułatwić badanie jego biologii.

Rozmnażanie jest podstawową funkcją fizjologiczną, ponieważ pozwala gatunkowi przetrwać. Rozmnażanie kręgowców wymaga niezliczonych precyzyjnie zaplanowanych zdarzeń, w tym produkcji oocytów u samic i produkcji plemników u samców. Plemniki to unikalne komórki, wytwarzane w złożonym procesie spermatogenezy, w którym istnieje szereg punktów kontrolnych gwarantujących dostarczenie produktu wysokiej jakości13. Jakość gamet stała się przedmiotem zainteresowania w akwakulturze i badaniach populacji ryb ze względu na jej wpływ na sukces zapłodnienia i przeżywalność larw. Jakość nasienia jest zatem ważnym wskaźnikiem płodności samców kręgowców.

Trzy użyteczne czynniki do oceny jakości nasienia ryb to ruchliwość, postępowość i długowieczność. Ruchliwość procentowa i ruchliwość postępowa są powszechnymi wskaźnikami jakości plemników, ponieważ ruch postępowy jest niezbędny do powodzenia zapłodnienia i silnie z nim koreluje14,15. Czas trwania ruchu jest również ważnym wskaźnikiem u ryb, ponieważ plemniki pozostają w pełni ruchliwe przez mniej niż 2 minuty u większości gatunków teleostów, a trajektoria plemników jest na ogół mniej liniowa niż u ssaków15. Jednak wiele badań oceniających ruchliwość plemników w przeszłości opierało się na subiektywnych lub półilościowych metodach analizy plemników15,16. Na przykład ruchliwość plemników w medaka była w przeszłości szacowana wizualnie pod mikroskopem17. Oszacowano go również poprzez rejestrowanie ruchu plemników i używanie oprogramowania do obrazowania w celu łączenia ramek oraz pomiaru ścieżki i prędkości pływania18,19,20. Takie podejścia często nie są solidne, dając różne wyniki w zależności od osoby przeprowadzającej analizę15,21.

Komputerowa analiza nasienia (CASA) została początkowo opracowana dla ssaków. CASA to szybka metoda ilościowa do oceny jakości nasienia poprzez rejestrowanie i pomiar prędkości i trajektorii w sposób zautomatyzowany15. U ryb był używany u różnych gatunków do monitorowania wpływu kilku zanieczyszczeń wody na jakość nasienia, do identyfikacji interesujących progenitorów w celu ulepszenia stada wylęgowego, poprawy efektywności kriokonserwacji i przechowywania oraz optymalizacji warunków zapłodnienia15. Dlatego jest to potężne narzędzie do wiarygodnej oceny jakości nasienia u różnych gatunków kręgowców. Jednak ze względu na dużą różnorodność strategii rozrodczych między rybami, plemniki ryb teleost różnią się od nasienia ssaków i gatunków ryb. Ryby teleost, które przede wszystkim zapładniają jaja zewnętrznie, uwalniając gamety do wody, mają wysoce skoncentrowane plemniki, które są stosunkowo proste w budowie bez akrosomów, w przeciwieństwie do ssaków, które zapładniają wewnętrznie i dlatego nie muszą kompensować rozcieńczenia w wodzie, ale muszą wytrzymać bardziej lepkie płyny14. Ponadto plemniki większości ryb poruszają się szybko, ale są w pełni ruchliwe przez mniej niż 2 minuty po aktywacji, chociaż istnieje kilka wyjątków15,22. Ponieważ ruchliwość może gwałtownie spaść u większości ryb, należy zachować szczególną ostrożność przy czasie analizy po aktywacji podczas określania protokołu analizy nasienia dla ryb.

Rozmnażanie jest jedną z dziedzin biologii, w której teleosty i medaka były szeroko stosowane jako organizmy modelowe. Rzeczywiście, samce medaka wykazują interesujące zachowania reprodukcyjne i społeczne, takie jak ochrona partnera23,24. Ponadto istnieje kilka linii transgenicznych do badania neuroendokrynnej kontroli rozrodu u tego gatunku25,26,27. Pobieranie próbek nasienia, procedura, która jest stosunkowo prosta u większych ryb, może być bardziej skomplikowana u małych ryb modelowych, ponieważ produkują one mniej plemników i są delikatniejsze. Z tego powodu większość badań polegających na pobieraniu próbek nasienia w ekstrakcie medaka milt (nasienie ryb) poprzez zmiażdżenie wypreparowanych jąder17,28,29,30. W kilku badaniach stosuje się również zmodyfikowany masaż brzucha, aby wyrazić milt bezpośrednio w medium aktywującym18,19,20; Jednak przy tej metodzie trudno jest zobrazować ilość i kolor wydobywanego mlecza. U danio pręgowanego masaż brzucha jest powszechnie stosowany do wyrażania mleczka, które jest natychmiast zbierane w rurce kapilarnej31,32,33. Metoda ta umożliwia oszacowanie objętości mlecza, a także obserwację barwy ejakulatu, która jest szybkim i prostym wskaźnikiem jakości nasienia32,33. W związku z tym w przypadku medaki brakuje jasnego i dobrze opisanego protokołu pobierania i analizy nasienia.

Ten artykuł opisuje zatem dwie metody pobierania nasienia u małego modelu japońskiej ryby: preparację jąder i masaż brzucha za pomocą kapilarnek. Pokazuje to, że oba podejścia są wykonalne dla medaka i pokazuje, że masaż brzucha może być wykonywany wielokrotnie wiele razy, ponieważ ryba szybko wraca do zdrowia po zabiegu. Opisano w nim również protokół komputerowej analizy nasienia w medaka, aby wiarygodnie zmierzyć kilka ważnych wskaźników jakości plemników medaka (ruchliwość, progresywność, długowieczność i względne stężenie plemników). Procedury te, określone dla tego użytecznego modelu małego teleostu, znacznie poprawią zrozumienie środowiskowych, fizjologicznych i genetycznych czynników wpływających na płodność u samców kręgowców.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie eksperymenty i prace z zwierzętami przeprowadzono zgodnie z zaleceniami dotyczącymi dobrostanu zwierząt doświadczalnych w Norweskim Uniwersytecie Nauk Przyrodniczych (NMBU). Doświadczenia wykonano na dorosłych (6–9-miesięcznych) samcach japońskiej medaki (szczep Hd-rR) hodowanych w NMBU (Ås, Norwegia). Metody zostały również krótko przetestowane na 9-miesięcznych samcach japońskiej medaki (szczep CAB) hodowanych w Narodowym Instytucie Badawczym Rolnictwa, Żywności i Środowiska (INRAE, Rennes, Francja).

1. Przygotowanie aparatury i roztworów

  1. Przygotuj roztwór zapasowy środka znieczulającego (0,6% tricainy).
    1. Rozpuścić 0,6 g trikainy (MS-222) w 100 ml 10-krotnego roztworu soli buforowych z fosforanem (PBS).
    2. Przenieś po 2 ml roztworu zakładowego środka znieczulającego do 50 plastikowych probówek o pojemności 2 ml i przechowuj w temperaturze -20 °C do momentu zastosowania w celu znieczulenia lub eutanazji.
  2. Przygotuj wodę do odzyskiwania (0,9% roztwór chlorku sodu [NaCl]).
    1. Do 3 L wody akwariowej dodać 27 g NaCl.
    2. Przechowywać roztwór w temperaturze pokojowej (RT) do momentu użycia.
  3. W razie potrzeby dostosować medium aktywacyjne (zrównoważony roztwór soli Hanksa [HBSS]).
    UWAGA: Roztwór HBSS można nabyć w handlu lub przygotować w laboratorium (Tabela materiałów).
    1. Zmierz pH roztworu HBSS za pomocą pH-metru. W razie potrzeby skoryguj wartość pH, używając kwasu solnego lub wodorotlenku sodu, tak aby końcowe pH wynosiło 7,1–7,3.
    2. Zmierz osmolalność roztworu HBSS za pomocą osmometru w celu późniejszego zaraportowania wyników.
      UWAGA: Zakres dla produktu komercyjnego wynosi 266–294 mOsmol/kg; w niniejszym badaniu osmolalność wynosiła 287 mOsmol/kg. W razie potrzeby można go rozcieńczyć wodą destylowaną w celu obniżenia osmolalności, jednak nie jest to konieczne, ponieważ nie występuje znacząca różnica w aktywacji plemników medaki w HBSS o osmolalności 150–300 mOsmol/kg.
    3. Przechowywać roztwór w temperaturze pokojowej do momentu użycia.
  4. Przygotować gąbkę stabilizującą.
    1. Wytnij kawałek miękkiej gąbki tak, aby ściśle pasował do szalki Petriego.
    2. Wytnij w środku gąbki prostą linię o długości wystarczającej do umieszczenia ryby (3–4 cm) i głębokości około 1 cm (Rysunek 1A). To nacięcie w gąbce pozwoli utrzymać rybę stroną brzuszną do góry, aby odsłonić kloakę.

2. Pobieranie nasienia

UWAGA: Pobieranie plemników można przeprowadzić dwiema różnymi metodami: masażem jamy brzusznej lub sekcją jąder.

  1. Pozyskiwanie nasienia poprzez masaż brzuszny
    1. Przygotować 0,03% roztwór znieczulający, rozcieńczając jedną probówkę stoku Tricaine (0,6%) w 38 mL wody akwariowej w szklanym pojemniku o pojemności 100 mL.
    2. Przygotować instrumenty, w tym gładkie pęsety z tępym końcem oraz jednorazową kalibrowaną szklaną mikropipetę o pojemności 10 µL wraz z zestawem rurki aspiracyjnej (Rysunek 1A). Zwilżyć gąbkę do unieruchamiania przygotowaną w kroku 1.4 roztworem znieczulającym.
    3. Przygotować probówki zawierające 36 µL roztworu aktywującego do natychmiastowej analizy. Podgrzać roztwór aktywujący w kąpieli wodnej lub inkubatorze ustawionym na 27 °C przez co najmniej 5 min.
      UWAGA: Chociaż analizę można przeprowadzać na próbkach od pojedynczych ryb, zmienność osobniczą można zredukować poprzez łączenie próbek od wielu samców w tym samym roztworze aktywującym. Przy łączeniu próbek od wielu ryb należy stosować 36 µL roztworu aktywującego na jedną rybę. Rozcieńczenie to może wymagać korekty w zależności od szczepu lub warunków hodowli medaki, ponieważ czynniki te mogą wpływać na stężenie i objętość nasienia. Program CASA wskaże, czy stężenie jest zbyt wysokie, aby zidentyfikować plemniki.
    4. Znieczulić rybę, umieszczając ją w roztworze znieczulającym na 30-90 s.
      UWAGA: Czas znieczulenia musi zostać dostosowany, ponieważ różni się on w zależności od wielkości ryby. Aby upewnić się, że ryba jest całkowicie znieczulona, należy delikatnie ucisnąć pęsetą szypułkę ogonową. Jeśli ryba nie reaguje, można rozpocząć masaż.
    5. Wyjąć rybę z roztworu znieczulającego i za pomocą ręcznika papierowego lub delikatnie wytrzeć, aby osuszyć brzuch ryby. Umieścić rybę w zagłębieniu wilgotnej gąbki do unieruchamiania stroną brzuszną do góry, tak aby skrzela były wystawione na działanie roztworu znieczulającego w gąbce (Rysunek 1B).
    6. Jeśli obszar wokół kloaki jest mokry, delikatnie osuszyć spód ryby jednorazową chusteczką higieniczną.
    7. Umieścić rybę w gąbce do unieruchamiania pod mikroskopem stereoskopowym i przyłożyć mikropipetę z dołączoną rurką aspiracyjną do kloaki ryby (Rysunek 1C).
    8. Wykonuje masaż brzucha ryby, delikatnie uciskając go gładkimi pęsetami z tępym końcem w kierunku od głowy do ogona, jednocześnie zasysając wydzielaną milt do pipety (Rysunek 1D).
    9. Przenieść rybę z gąbki do wody regeneracyjnej. Pozostawić ryby w roztworze na co najmniej 15 min przed powrotem do systemu akwariowego.
    10. Przenieść milt do przygotowanej probówki z podgrzanym roztworem aktywującym i kilkukrotnie pipetować, zasysając i wydmuchując powietrze przez zestaw rurki aspiracyjnej.
    11. Delikatnie zhomogenizować rozcieńczone nasienie poprzez strzepywanie probówek przed analizą.
      UWAGA: Dla uzyskania najlepszych wyników próbki należy analizować natychmiast (np. po 5 s) po aktywacji. U medaki analizę można w razie potrzeby opóźnić, ponieważ plemniki pozostają ruchliwe przez kilka godzin, jednak czas ten powinien być spójny dla wszystkich próbek, gdyż ruchliwość zmniejsza się z czasem.
  2. Pozyskiwanie nasienia poprzez sekcję jąder
    1. Przygotować 0,08% roztwór do eutanazji, rozcieńczając dwie probówki stoku Tricaine (0,6%) w 26 mL wody akwariowej w szklanym pojemniku o pojemności 100 mL.
    2. Przygotować narzędzia do sekcji, w tym pęsety tępe i precyzyjne oraz małe nożyczki sekcyjne (Rysunek 1E).
    3. Przygotować probówkę dla każdej próbki z 120 µL roztworu aktywującego do natychmiastowej analizy. Podgrzać roztwór aktywujący w kąpieli wodnej lub inkubatorze ustawionym na 27 °C przez co najmniej 5 min.
      UWAGA: Chociaż analizę można przeprowadzać na próbkach od pojedynczych ryb, zmienność osobniczą można zredukować poprzez łączenie próbek od wielu samców w tym samym roztworze aktywującym. Przy łączeniu próbek od wielu ryb należy stosować 120 µL roztworu aktywującego na jedną rybę. Rozcieńczenie to może wymagać korekty w zależności od szczepu lub warunków hodowli medaki, ponieważ czynniki te mogą wpływać na stężenie i objętość nasienia. Program CASA wskaże, czy stężenie jest zbyt wysokie, aby zidentyfikować plemniki.
    4. Uśmiercić rybę, umieszczając ją w 0,08% roztworze znieczulającym na 30-90 s.
      UWAGA: Czas zależy od wielkości ryby. Aby upewnić się, że ryba została uśmiercona, należy poczekać do ustania ruchów pokryw skrzelowych. Ryba nie powinna reagować na dotyk pęsety.
    5. Wyjąć rybę z roztworu do eutanazji i delikatnie osuszyć ją ręcznikiem papierowym lub miękko wytrzeć.
      UWAGA: Na tym etapie rybę można zważyć, aby później obliczyć wskaźnik gonadosomatyczny (GSI, masa gonad / masa ciała).
    6. Umieścić rybę pod mikroskopem stereoskopowym lewą stroną boczną skierowaną do góry (Rysunek 1F).
    7. Za pomocą małych nożyczek sekcyjnych wyciąć płat grzbietowo od strony kloaki, a następnie w poprzek żeber aż do skrzeli, aby odsłonić narządy wewnętrzne (Rysunek 1G).
    8. Zlokalizować jądra, odciąć przyczepy na obu końcach precyzyjną pęsetą i usunąć jądra (Rysunek 1H).
      UWAGA: Aby obliczyć GSI, jądra można zważyć na tym etapie. Należy pracować szybko, aby uniknąć wyschnięcia tkanki.
    9. Przenieść jądra do przygotowanej probówki z podgrzanym roztworem aktywującym.
    10. Za pomocą pęsety kilka razy rozgnieść jądra o ściankę probówki, aby uwolnić nasienie. Uwolnienie plemników jest zazwyczaj widoczne i spowoduje lekkie zmętnienie roztworu.
    11. Delikatnie zhomogenizować rozcieńczone nasienie poprzez strzepywanie probówek przed analizą.
      UWAGA: Dla uzyskania najlepszych wyników próbki należy analizować natychmiast (np. po 5 s) po aktywacji. U medaki analizę można w razie potrzeby opóźnić, ponieważ plemniki pozostają ruchliwe przez kilka godzin, jednak czas ten powinien być spójny dla wszystkich próbek, gdyż ruchliwość zmniejsza się z czasem.

Ekstrakcja i sekcja nasienia ryb; mikropipeta, pęseta i nożyczki; proces eksperymentalny.
Rycina 1: Pobieranie nasienia poprzez masaż brzuszny (A-D) oraz sekcję jąder (E-H). (A) Narzędzia do masażu brzusznego: gąbka stabilizująca, tępa gładka pęseta oraz jednorazowa kalibrowana szklana mikropipeta 10 µL z zestawem rurki aspiracyjnej; (B) Położenie ryby w gąbce stabilizującej, z odsłoniętymi skrzelami do znieczulenia w gąbce i otworem kloaki skierowanym do góry; (C) Położenie tępej gładkiej pęsety na brzuchu i mikropipety przy kloace; (D) Nasienie w mikropipecie po delikatnym masażu i zasysaniu. (E) Narzędzia do sekcji jąder: pęseta tępa, pęseta precyzyjna i małe nożyczki sekcyjne; (F) Położenie ryby do sekcji jąder; (G) Widok boczny narządów wewnętrznych; (H) Usunięcie jąder poprzez przecięcie przyczepów na obu końcach za pomocą pęsety precyzyjnej. Pasek skali: 2 mm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

3. Analiza nasienia z wykorzystaniem systemu CASA

  1. System CASA (SCA Evolution) należy skonfigurować zgodnie z instrukcją obsługi, używając mikroskopu z filtrem zielonym i obiektywem 10x z kontrastem fazowym.
  2. Jednorazowe szkiełka z komorą liczbową 20 µm należy przygotować poprzez wstępne podgrzanie na płycie grzejnej lub w inkubatorze ustawionym na 27 °C przez co najmniej 5 min.
  3. Otwórz oprogramowanie do analizy nasionsia i wybierz moduł ruchliwości.
  4. Ustaw konfigurację dla medaka, zgodnie z przedstawionym na Rysunku 2B.
  5. Umieść wstępnie podgrzane jednorazowe szkiełko z komorą liczbową 20 µm pod mikroskopem na podgrzewanym stole ustawionym na 27 °C.
  6. Pipetuj próbkę do komory na szkiełku, aż wypełni ona przestrzeń, uważając, aby jej nie przepełnić. Ostrożnie usuń nadmiar próbki z wlotu komory za pomocą patyczka bawełnianego lub delikatnie przemyj, aby zapobiec pojawieniu się pływających komórek.
  7. Wybierz Analyze, aby obejrzeć próbkę pod mikroskopem.
    UWAGA: Jeśli ikona mikroskopu jest czerwona, należy dostosować oświetlenie mikroskopu, aby program mógł dokładnie śledzić plemniki. Dostosuj jasność mikroskopu tak, aby ruch ogonów plemników był wyraźnie widoczny. Ikona powinna stać się niebieska.
  8. Upewnij się, że mikroskop jest ustawiony w ostrości i ponownie wybierz Analyze, aby zarejestrować plemniki w polu widzenia. Przesuń szkiełko tak, aby w kadrze znalazł się nowy obszar próbki i powtórz czynność dla 3-5 różnych pól widzenia. Unikaj pól z pęcherzykami powietrza, skupiskami komórek lub artefaktami.
  9. Wybierz Results, aby wyświetlić wyniki.
    UWAGA: Jeśli pola na stronie wyników są obwiedzione na czerwono, postępuj zgodnie z komunikatami systemu, aby usunąć pola, w których stężenie lub ruchliwość zbyt mocno odbiegają od normy.
  10. Kliknij dwukrotnie pole, aby wyświetlić wyniki dla pojedynczego pola lub ręcznie sprawdzić błędnie oznaczone lub nienaniesione plemniki. Jeśli jest to konieczne, kliknij prawym przyciskiem myszy na poszczególne plemniki, aby zmienić etykietę ich ruchliwości (Rysunek 2A).

Interfejs oprogramowania do analizy nasienia; dane dotyczące ruchliwości, konfiguracja parametrów, wykres wizualizacji wyników.
Rycina 2: Zrzut ekranu oprogramowania SCA Evolution. (A) Wyniki śledzenia plemników dla jednego pola. Dane pola są widoczne po prawej stronie; dwukrotne kliknięcie plemnika pozwala wyświetlić indywidualne dane; (B) Podsumowanie wyników dla wszystkich pól z otwartym menu konfiguracji. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Rodzaj uzyskanych danych
Analiza ruchliwości plemników za pomocą oprogramowania SCA Evolution dostarcza danych na temat ruchliwości (procent plemników ruchliwych i nieruchomych), progresywności (procent plemników progresywnych i nieprogresywnych) oraz prędkości (procent plemników poruszających się szybko, średnio i powoli). Łączy ona również progresywność z prędkością (szybko progresywne, średnio progresywne, nieprogresywne). Etykiety te opierają się na pomiarach (Rysunek 3A

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Osmolalność jest ważnym czynnikiem w aktywacji plemników ryb36,37. Ogólnie rzecz biorąc, plemniki są nieruchome w jądrach i stają się ruchliwe w pożywkach, które są hiperosmotyczne w stosunku do płynu nasiennego u ryb morskich i hipoosmotyczne w stosunku do płynu nasiennego u ryb słodkowodnych37. Podobnie jak we krwi, osocze nasienia u ryb słodkowodnych jest zazwyczaj niższe niż u ryb morskich (około 300 mOsmol/kg w porównaniu do 400 mOsmo...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca została sfinansowana przez Norweski Uniwersytet Przyrodniczy i amerykański program Fulbrighta. Autorzy chcieliby podziękować Anthony'emu Peltierowi i Lourdes Carreon G Tan z NMBU za konserwację obiektu rybnego oraz Guillaume'owi Gourmelinowi z ISC LPGP w INRAE (Francja) za udostępnienie ryb i przestrzeni laboratoryjnej do dalszego testowania tych metod.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Probówki 1,5 mlAxygenMCT-150-CMożna użyć dowolnej standardowej marki
10 i mikro; L jednorazowy kalibrowany szklany zespół mikropipety i rurki aspiratoraDrummond2-000-010
10-krotny obiektyw z kontrastem fazowymNikonMRP90100
rurki 2 mlAxygenMCT-200-c-sMożna użyć dowolnej standardowej marki
KleszczeNarzędzia do nauki11000-12
kleszcze gładkieMilliporeXX6200006P
Jednorazowa szkiełko z komorą liczącą 20 mikronówMicroptic20.2.25 Leja 2 zjeżdżalnie komorowe
Mikroskop preparacyjnyOlympusSZX7Można użyć dowolnej standardowej marki
Drobne kleszczeFine Science Tools11253-20
HBSSSigmaaldrichH8264-1L
Gąbka trzymającawłasnej produkcji
Mikroskop odwróconyNikonEclipse Ts2R
SCA EvolutionMicroptic
Małe nożyczki preparacyjneFine Science Tools14090-09
Chlorek sodu (NaCl)SigmaaldrichS9888
Wir stołowyLabnetC1301B
TrikaineSigmaaldrichA5040

Bibliografia

  1. Shima, A., Mitani, H. Medaka as a research organism: past, present and future. Mechanisms of Development. 121 (7-8), 599-604 (2004).
  2. Wittbrodt, J., Shima, A., Schartl, M. Medaka - a model organism from the far east. Nature Reviews Genetics. 3 (1), 53-64 (2001).
  3. Kasahara, M., et al. The medaka draft genome and insights into vertebrate genome evolution. Nature. 447 (7145), 714-719 (2007).
  4. Matsuda, M., et al. DMY is a Y-specific DM-domain gene required for male development in the medaka fish. Nature. 417 (6888), 559-563 (2002).
  5. Sakamoto, T., Kozaka, T., Takahashi, A., Kawauchi, H., Ando, M. Medaka (Oryzias latipes) as a model for hypoosmoregulation of euryhaline fishes. Aquaculture. 193 (3-4), 347-354 (2001).
  6. Royan, M. R., et al. 3D atlas of the pituitary gland of the model fish medaka (Oryzias latipes). Frontiers in Endocrinology. 12, 719843(2021).
  7. Fontaine, R., Hodne, K., Weltzien, F. A. Healthy brain-pituitary slices for electrophysiological investigations of pituitary cells in teleost fish. Journal of Visualized Experiments. (138), e57790(2018).
  8. Fontaine, R., Weltzien, F. -A. Labeling of blood vessels in the teleost brain and pituitary using cardiac perfusion with a dii-fixative. Journal of Visualized Experiments. (148), e59768(2019).
  9. Ager-Wick, E., et al. Preparation of a high-quality primary cell culture from fish pituitaries. Journal of Visualized Experiments. (138), e58159(2018).
  10. Porazinski, S. R., Wang, H., Furutani-Seiki, M. Microinjection of medaka embryos for use as a model genetic organism. Journal of Visualized Experiments. (46), e1937(2010).
  11. Wiley-Blackwell. Medaka: Biology, Management, and Experimental Protocols. , Wiley-Blackwell. (2019).
  12. Royan, M. R., et al. Gonadectomy and blood sampling procedures in the small size teleost model japanese medaka (Oryzias latipes). Journal of Visualized Experiments. (166), e62006(2020).
  13. Bhat, I. A., et al. Testicular development and spermatogenesis in fish: insights into molecular aspects and regulation of gene expression by different exogenous factors. Reviews in Aquaculture. 13 (4), 2142-2168 (2021).
  14. vander Horst, G., Garcia Alvarez, O., Garde, J. J., Soler, A. J., Jones, D. Status of sperm functionality assessment in wildlife species: From fish to primates. Animals. 11 (6), 1491(2021).
  15. Kime, D. E., et al. Computer-assisted sperm analysis (CASA) as a tool for monitoring sperm quality in fish. Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Toxicology & Pharmacology. 130 (4), 425-433 (2001).
  16. Rurangwa, E., Kime, D. E., Ollevier, F., Nash, J. P. The measurement of sperm motility and factors affecting sperm quality in cultured fish. Aquaculture. 234 (1-4), 1-28 (2004).
  17. Yang, H., Tiersch, T. R. Sperm motility initiation and duration in a euryhaline fish, medaka (Oryzias latipes). Theriogenology. 72 (3), 386-392 (2009).
  18. Hashimoto, S., et al. Effects of ethinylestradiol on medaka (Oryzias latipes) as measured by sperm motility and fertilization success. Archives of Environmental Contamination and Toxicology. 56 (2), 253-259 (2009).
  19. Hara, Y., Strüssmann, C. A., Hashimoto, S. Assessment of short-term exposure to nonylphenol in Japanese medaka using sperm velocity and frequency of motile sperm. Archives of Environmental Contamination and Toxicology. 53 (3), 406-410 (2007).
  20. Kawana, R., Strüssmann, C. A., Hashimoto, S. Effect of p-Nonylphenol on sperm motility in Japanese medaka (Oryzias latipes). Fish Physiology and Biochemistry. 28, 213-214 (2003).
  21. Gallego, V., Herranz-Jusdado, J. G., Rozenfeld, C., Pérez, L., Asturiano, J. F. Subjective and objective assessment of fish sperm motility: when the technique and technicians matter. Fish Physiology and Biochemistry. 44 (6), 1457-1467 (2018).
  22. Browne, R. K., et al. Sperm motility of externally fertilizing fish and amphibians. Theriogenology. 83 (1), 1-13 (2015).
  23. Arias Padilla, L. F., et al. Cystic proliferation of germline stem cells is necessary to reproductive success and normal mating behavior in medaka. eLife. 10, 62757(2021).
  24. Okuyama, T., Yokoi, S., Takeuchi, H. Molecular basis of social competence in medaka fish. Development, Growth, and Differentiation. 59 (4), 211-218 (2017).
  25. Okubo, K., et al. Forebrain Gonadotropin-releasing hormone neuronal development: Insights from transgenic medaka and the relevance to X-linked Kallmann syndrome. Endocrinology. 147 (3), 1076-1084 (2006).
  26. Hodne, K., Fontaine, R., Ager-Wick, E., Weltzien, F. A. Gnrh1-induced responses are indirect in female Medaka Fsh cells, generated through cellular networks. Endocrinology. 160 (12), 3018-3032 (2019).
  27. Karigo, T., et al. Whole brain-pituitary in vitro preparation of the transgenic Medaka (Oryzias latipes) as a tool for analyzing the differential regulatory mechanisms of LH and FSH release. Endocrinology. 155 (2), 536-547 (2014).
  28. Kowalska, A., Kowalski, R., Zakęś, Z. The effect of selective cyclooxygenase (COX) inhibitors on japanese medaka (Oryzias latipes) reproduction parameters. World Academy of Science, Engineering and Technology. 77, 19-23 (2011).
  29. Kowalska, A., Siwicki, A. K., Kowalski, R. K. Dietary resveratrol improves immunity but reduces reproduction of broodstock medaka Oryzias latipes (Temminck & Schlegel). Fish Physiology and Biochemistry. 43 (1), 27-37 (2007).
  30. Tan, E., Yang, H., Tiersch, T. R. Determination of sperm concentration for small-bodied biomedical model fishes by use of microspectrophotometry. Zebrafish. 7 (2), 233-240 (2010).
  31. Harvey, B., Kelley, R. N., Ashwood-Smith, M. J. Cryopreservation of zebra fish spermatozoa using methanol. Canadian Journal of Zoology. 60 (8), 1867-1870 (1982).
  32. Wasden, M. B., Roberts, R. L., DeLaurier, A. Optimizing sperm collection procedures in Zebrafish. Journal of the South Carolina Academy of Science. 15 (2), 7(2017).
  33. Draper, B. W., Moens, C. B. A High-throughput method for Zebrafish sperm cryopreservation and in vitro fertilization. Journal of Visualized Experiments. (29), e1395(2009).
  34. Castellini, C., Dal Bosco, A., Ruggeri, S., Collodel, G. What is the best frame rate for evaluation of sperm motility in different species by computer-assisted sperm analysis. Fertility and Sterility. 96 (1), 24-27 (2011).
  35. Acosta, I. B., et al. Effects of exposure to cadmium in sperm cells of zebrafish, Danio rerio. Toxicology Reports. 3, 696-700 (2016).
  36. Wilson-Leedy, J. G., Kanuga, M. K., Ingermann, R. L. Influence of osmolality and ions on the activation and characteristics of zebrafish sperm motility. Theriogenology. 71 (7), 1054-1062 (2009).
  37. Alavi, S. M. H., Cosson, J. Sperm motility in fishes. (II) Effects of ions and osmolality: A review. Cell Biology International. 30 (1), 1-14 (2006).
  38. Kowalska, A., Kamaszews ki, M., Czarnowska-Kujawska, M., Podlasz, P., Kowalski, R. K. Dietary ARA improves COX activity in broodstock and offspring survival fitness of a model organism (Medaka Oryzias latipes). Animals. 10 (11), 2174(2020).
  39. Inoue, K., Takei, Y. Asian medaka fishes offer new models for studying mechanisms of seawater adaptation. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology. 136 (4), 635-645 (2003).
  40. Zadmajid, V., Myers, J. N., Sørensen, S. R., Ernest Butts, I. A. Ovarian fluid and its impacts on spermatozoa performance in fish: A review. Theriogenology. 132, 144-152 (2019).
  41. Poli, F., Immler, S., Gasparini, C. Effects of ovarian fluid on sperm traits and its implications for cryptic female choice in zebrafish. Behavioral Ecology. 30 (5), 1298-1305 (2019).
  42. Cosson, J., Groison, A. L., Suquet, M., Fauvel, C., Dreanno, C., Billard, R. Studying sperm motility in marine fish: An overview on the state of the art. Journal of Applied Ichthyology. 24 (4), 460-486 (2008).
  43. Beirão, J., Soares, F., Herráez, M. P., Dinis, M. T., Cabrita, E. Sperm quality evaluation in Solea senegalensis during the reproductive season at cellular level. Theriogenology. 72 (9), 1251-1261 (2009).
  44. Beirão, J., et al. Sperm handling in aquatic animals for artificial reproduction. Theriogenology. 133, 161-178 (2019).
  45. Yang, H., Tiersch, T. R. Current status of sperm cryopreservation in biomedical research fish models: Zebrafish, medaka, and Xiphophorus. Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Toxicology & Pharmacology. 149 (2), 224-232 (2009).
  46. Yang, H., Tiersch, T. R. Sperm cryopreservation in biomedical research fish models. Cryopreservation in Aquatic Species. 2, 439-454 (2011).
  47. Viveiros, A., Fessehaye, Y., ter Veld, M., Schulz, R., Komen, H. Hand-stripping of semen and semen quality after maturational hormone treatments, in African catfish Clarias gariepinus. Aquaculture. 213 (1-4), 373-386 (2002).
  48. Ransom, D. G., Zon, L. I. Appendix 3 collection, storage, and use of Zebrafish sperm. Methods in Cell Biology. 60, 365-372 (1998).
  49. Cosson, J. Frenetic activation of fish spermatozoa flagella entails short-term motility, portending their precocious decadence. Journal of Fish Biology. 76 (1), 240-279 (2010).
  50. Kowalski, R. K., Cejko, B. I. Sperm quality in fish: Determinants and affecting factors. Theriogenology. 135, 94-108 (2019).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

ryby kostnoszkieletowemasaż brzusznysekcja jąderruchliwość plemnikówjakość nasieniaocena płodnościmodel ekotoksykologiczny
Pobieranie nasienia i komputerowa analiza nasienia w modelu teleost japońskiej Medaka (Oryzias latipes)
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.