Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wzmocnienie sygnału tyramidu do barwienia immunofluorescencyjnego zależnej od ZBP1 fosforylacji RIPK3 i MLKL po zakażeniu HSV-1 w komórkach ludzkich

2.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64332

⸱

20 października 2022

 ,  ,  , 
1VIB-UGent Center for Inflammation Research, 2Department of Biomedical Molecular Biology, Ghent University

W tym artykule

Podsumowanie

Wzmocnienie sygnału tyramidu podczas barwienia immunofluorescencyjnego umożliwia czułe wykrywanie fosforylowanych RIPK3 i MLKL podczas nekroptozy wywołanej przez ZBP1 po zakażeniu HSV-1.

Streszczenie

Kinaza białkowa serynowo-treoninowa 3 (RIPK3) oddziałująca z receptorem kinazy (RIPK3) i jej substrat podobny do domeny kinazy o mieszanej linii (MLKL) są krytycznymi regulatorami nekroptozy, zapalnej formy śmierci komórki o ważnych funkcjach przeciwwirusowych. Autofosforylacja RIPK3 indukuje fosforylację i aktywację tworzącego pory białka kata nekroptozy MLKL. Transport i oligomeryzacja fosforylowanego MLKL na błonie komórkowej powoduje lizę komórek, charakterystyczną dla nekroptotycznej śmierci komórki. Czujnik kwasu nukleinowego ZBP1 jest aktywowany przez wiązanie się z lewoskrętnym dwuniciowym RNA (Z-RNA) w formie Z po zakażeniu wirusami RNA i DNA. Aktywacja ZBP1 ogranicza infekcję wirusową poprzez indukowanie regulowanej śmierci komórek, w tym nekroptozy, zakażonych komórek gospodarza. Mikroskopia immunofluorescencyjna umożliwia wizualizację różnych etapów sygnalizacji po nekroptozie za pośrednictwem ZBP1 w odniesieniu do poszczególnych komórek. Jednak czułość standardowej mikroskopii fluorescencyjnej, wykorzystującej obecnie dostępne na rynku przeciwciała specyficzne dla fosfo przeciwko ludzkim RIPK3 i MLKL, wyklucza odtwarzalność obrazowania tych markerów. W tym miejscu opisujemy zoptymalizowaną procedurę barwienia fosforylowanych seryny (S) RIPK3 (S227) i MLKL (S358) w ludzkich komórkach HT-29 zakażonych wirusem opryszczki pospolitej 1 (HSV-1). Włączenie etapu wzmocnienia sygnału tyramidu (TSA) do protokołu barwienia immunofluorescencyjnego pozwala na specyficzne wykrywanie fosforylowanego S227 RIPK3. Co więcej, TSA znacznie zwiększa czułość wykrywania fosforylowanego S358 MLKL. Łącznie metoda ta umożliwia wizualizację tych dwóch krytycznych zdarzeń sygnalizacyjnych podczas indukcji nekroptozy wywołanej przez ZBP1.

Wprowadzenie

Kinaza białkowa serynowo-treoninowa 3 (RIPK3) oddziałująca z receptorem i kinaza mieszanej linii (MLKL) są centralnymi regulatorami nekroptotycznej śmierci komórki1,2. Nekroptoza jest lityczną i zapalną formą regulowanej śmierci komórek biorącą udział w odporności przeciwwirusowej i autozapaleniu. Nekroptoza komórek zakażonych wirusem natychmiast wyłącza replikację wirusa. Liza komórek po indukcji nekroptozy uwalnia również wzorce molekularne związane z uszkodzeniem, które stymulują odporność przeciwwirusową3,4. Nekroptoza jest inicjowana przez aktywację RIPK3 po interakcjach za pośrednictwem motywu homotypowego RIP (RHIM) z jedną z trzech cząsteczek aktywujących wcześniej: RIPK1 (po zaangażowaniu receptora TNF 1 [TNFR1]), interferon-β indukującym adaptor zawierającym domenę TIR (TRIF; po zaangażowaniu receptora Toll-podobnego 3 i 4) lub przeciwwirusowym czujnikiem kwasów nukleinowych Z-DNA wiążącym białko 1 (ZBP1)1,2. Sygnalizacja nekroptozy przebiega poprzez serię zdarzeń fosforylacji, rozpoczynających się od autofosforylacji RIPK3. Autofosforylacja ludzkiego RIPK3 w serynie (S)227 wewnątrz jego domeny kinazy jest warunkiem wstępnym nekroptozy poprzez umożliwienie interakcji z MLKL i jest powszechnie stosowana jako marker biochemiczny aktywacji ludzkiego RIPK3 i nekroptotycznej śmierci komórek1,5. Po aktywacji RIPK3 fosforyluje pętlę aktywacji MLKL w treoninie (T)357 i S3581. Powoduje to zmianę konformacji MLKL, co skutkuje odsłonięciem N-końcowej domeny pęczka czterech helis. MLKL następnie oligomeryzuje i przemieszcza się do błony komórkowej, gdzie tworzy pory poprzez wprowadzenie odsłoniętych czterech wiązek helisy w dwuwarstwie lipidowej, ostatecznie prowadząc do śmierci komórki2,6.

ZBP1 to przeciwwirusowy czujnik kwasów nukleinowych, który rozpoznaje lewoskrętne kwasy nukleinowe w formie Z, w tym dwuniciowe RNA w konformacji Z (Z-RNA). Wiązanie Z-RNA zachodzi za pośrednictwem dwóch domen Zα umieszczonych na N-końcu ZBP1. Uważa się, że Z-RNA gromadzące się podczas infekcji wirusem RNA i DNA bezpośrednio angażuje ZBP17,8. Aktywowany ZBP1 rekrutuje RIPK3 przez swoje centralne RHIM i indukuje regulowaną śmierć komórki, w tym nekroptozę9,10. Wirusy przyjęły liczne mechanizmy ucieczki, aby przeciwdziałać nekroptozie komórek gospodarza wywołanej przez ZBP111. Na przykład podjednostka 1 rybonukleotydowej wirusa opryszczki pospolitej 1 (HSV-1), znana jako ICP6 i kodowana przez UL39, zawiera RHIM na swoim N-końcu, który zakłóca aktywację RIPK3 za pośrednictwem ZBP1 w komórkach ludzkich12,13,14,15. ZBP1 nie tylko ogranicza replikację wirusa, ale badania na myszach wykazały, że aktywacja ZBP1 powoduje choroby zapalne i stymuluje odporność na raka16,17,18,19,20,21. Protokoły wykrywające zdarzenia sygnalizacyjne występujące podczas nekroptozy indukowanej przez ZBP1 w komórkach ludzkich są zatem cenne dla oceny roli ZBP1 w tych procesach.

Wzmocnienie sygnału tyramidowego (TSA), zwane również katalizowanym osadzaniem reporterowym (CARD), zostało opracowane w celu poprawy granicy wykrywalności i stosunku sygnału do szumu w testach immunologicznych opartych na przeciwciałach. Podczas TSA każde przeciwciało pierwszorzędowe może być użyte do wykrycia antygenu będącego przedmiotem zainteresowania. Peroksydaza chrzanowa (HRP), sprzężona z przeciwciałem drugorzędowym, katalizuje miejscowe gromadzenie się biotynylowanych rodników tyramidu w obecności nadtlenku wodoru. Te aktywowane rodniki biotynowo-tyramidowe reagują następnie z proksymalnymi resztami tyrozyny, tworząc wiązania kowalencyjne. Potencjalne substraty tyramidowo-biotynowe obejmują sam antygen, przeciwciała pierwszorzędowe i drugorzędowe oraz sąsiednie białka. W ten sposób, chociaż TSA znacznie poprawia czułość testu, część jego rozdzielczości przestrzennej zostaje utracona. W ostatnim etapie cząsteczki biotyny są wykrywane za pomocą znakowanej fluorescencyjnie streptawidyny. Reakcja HRP osadza wiele cząsteczek tyramidu-biotyny na lub w pobliżu antygenu będącego przedmiotem zainteresowania. To znacznie zwiększa liczbę miejsc wiązania streptawidyny i fluorochromu, a tym samym znacznie zwiększa czułość testu (Rysunek 1). Alternatywnie, tyramid może być bezpośrednio sprzężony z fluorochromem, eliminując potrzebę stosowania fluoroforów sprzężonych ze streptawidyną. Immunohistochemia białek i hybrydyzacja DNA/RNA in situ były jednymi z pierwszych metod, za pomocą których zastosowano TSA w celu poprawy intensywności sygnału22,23. Ostatnio TSA została połączona z wewnątrzkomórkową cytometrią przepływową24 i spektrometrią mas25.

Tutaj prezentujemy protokół wykrywania fosforylowanego seryny 227 ludzkiego RIPK3 (p-RIPK3 [S227]) i fosforylowanego ludzkiego MLKL (p-MLKL [S358]) po aktywacji ZBP1 przez zakażenie HSV-1 za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej. Używamy wrażliwej na nekroptozę ludzkiej linii komórkowej gruczolakoraka jelita grubego HT-29, która została transdukowana w celu stabilnej ekspresji ludzkiego ZBP1. Komórki te zostały zakażone szczepem HSV-1 eksprymującym zmutowane białko ICP6 (HSV-1ICP6 mutRHIM), w którym cztery podstawowe aminokwasy w wirusowym RHIM (VQCG) zostały zastąpione alaninami (AAAA), co spowodowało, że ICP6 nie był w stanie zablokować nekroptozy za pośrednictwem ZBP113,14,15. Aby przezwyciężyć problem niskiego stosunku sygnału do szumu obecnie dostępnych na rynku przeciwciał skierowanych przeciwko p-RIPK3 i p-MLKL w immunostainingu26, przeprowadzamy etap wzmocnienia sygnału tyramidowego (TSA) (Rysunek 1), co skutkuje solidnym wykrywaniem ludzkiego p-RIPK3 (S227) i poprawia czułość wykrywania ludzkiego p-MLKL (S358) o rząd wielkości.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie biotynylowanego tyramidu

  1. Przygotuj biotynylowany tyramide, zaczynając od biotyny-tyramidu. Aby przygotować 10 mM roztwór podstawowy, rozpuść 3,6 mg biotyny-tyramidu w 1 ml DMSO. Rozpuszczony produkt należy przechowywać w porcjach w temperaturze -20 °C w celu zachowania jakości.

2. Utrzymanie komórek HT-29 w hodowli

UWAGA: HT-29 wykazujące ekspresję ZBP1 zostały wygenerowane przez transdukcję za pomocą lentivector27 kodującego ludzkiego ZBP1.

  1. Utrzymuj komórki HT-29 z ekspresją ZBP1 w pożywce McCoy's 5A uzupełnionej L-glutaminą, pirogronianem sodu i 10% płodową surowicą bydlęcą (od teraz określaną jako pełna pożywka) i utrzymuj w inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% dwutlenkiem węgla. Najlepiej używać komórek o niskiej liczbie pasaży (mniejszej niż 10). Pozostaw komórki do regeneracji przez co najmniej 5 dni po cyklu rozmrażania przed rozpoczęciem eksperymentu.
  2. Aby odłączyć komórki od kolby hodowlanej, usunąć pożywkę i przemyć komórki 5 ml PBS (podgrzanego do temperatury 37 °C). Następnie dodać odpowiednią ilość trypsyny/EDTA (odpowiednio 0,05% trypsyny i 0,032% EDTA, podgrzanych do 37 °C) do komórek (2 ml dla kolby T75, 3 ml dla kolby T175).
  3. Inkubować komórki z trypsyną/EDTA przez okres do 10 minut w inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% dwutlenkiem węgla. Następnie dotknij kolby i wizualnie sprawdź, czy komórki odłączyły się od kolby za pomocą mikroskopu z powiększeniem obiektywu 4x-20x.
  4. Jeżeli komórki nie są całkowicie oderwane, inkubować przez kolejne 5 minut w temperaturze 37 °C. Po odłączeniu komórek należy zatrzymać reakcję enzymatyczną, dodając do kolby 6 ml pełnej pożywki.
  5. Zebrać zawiesinę komórkową w probówce o pojemności 15 ml. Policz komórki, używając barwienia błękitem trypanowym, aby ocenić żywotność; Zalecane jest rozcieńczenie 1:5. Kontynuuj eksperyment tylko wtedy, gdy żywotność komórek przekracza 90%.

3. Rozpoczęcie eksperymentu, wysiewanie i stymulacja komórek

  1. Zasiaj 90 000 komórek HT-29 z ekspresją ZBP1 w pełnym podłożu na płytce studzienkowej o powierzchni 1 cm², która umożliwia mikroskopię wysokiej klasy. Użyj końcowej objętości 200 μl na studzienkę.
  2. Inkubować komórki przez noc w temperaturze 37 °C z 5% dwutlenkiem węgla. Weź pod uwagę, że w celu kontroli barwienia należy zasiać kilka dodatkowych studzienek, co wyjaśniono bardziej szczegółowo w kroku 5.6.
  3. Kiedy komórki osiągną zbieżność 70%-80%, dodaj do komórek bodziec wywołujący nekroptozę. W tym przypadku komórki zostały zakażoneHSV-1 ICP6 mutRHIM (mnogość infekcji [MOI] wynosząca 5, zdefiniowana jako jednostki tworzące blaszkę (pfu) podzielone przez liczbę komórek; pfu oznaczono ilościowo za pomocą testu płytki nazębnej na komórkach Vero) przez 6 godzin, 8 godzin lub 10 godzin.
  4. Jako pozytywną kontrolę indukcji nekroptozy, stymuluj komórki przez 4 godziny koktajlem indukującym nekroptozę zawierającym 30 ng / ml TNF, 20 μM inhibitora pan-kaspazy zVAD-fmk i 5 μM mimetycznego BV6 SMAC.
  5. Jako negatywną kontrolę barwienia p-RIPK3 (S227) należy włączyć GSK'840 (1 μM) w celu zahamowania aktywności kinazy RIPK3 i zapobieżenia autofosforylacji S227. Najlepiej dodać inhibitor w stanie nieleczonym i po stymulacji nekroptozą. Inhibitor może być dodawany jednocześnie z infekcją wirusową.
  6. Przygotować stymulację w pełnym podłożu, podgrzanym do temperatury 37 °C. Do wszystkich stymulacji należy użyć końcowej objętości 200 μl na studzienkę.

4. Naprawianie komórek

  1. Usuń pożywkę i umyj komórki 200 μl 1x PBS. Następnie dodać 150 μl 4% PFA (już zrównoważonego w temperaturze pokojowej) do komórek i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 min.
    UWAGA: Jeśli używasz komórek, które łatwo się odłączają, utrwalenie komórek można zoptymalizować w następujący sposób. Usuń 100 μl pożywki ze studzienki, tak aby objętość 100 μl pozostała na płytce. Dodaj 100 μL 4% PFA do komórek. Inkubować komórki przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Następnie usuń pożywkę/utrwalacz z dołków i zastąp 150 μl 4% PFA. Inkubować komórki przez kolejne 20 minut w temperaturze pokojowej, aby zapewnić całkowite utrwalenie komórek.
  2. Po utrwaleniu usuń 4% PFA i umyj komórki 3x 200 μL 1x PBS. Próbki można przechowywać w nadmiarze (>200 μl) 1x PBS w temperaturze 4 °C przez noc do czasu dalszego przetwarzania.

5. Przepuszczalność i barwienie pierwotne

  1. Usunąć PBS i dodać 100 μl buforu permeabilacyjnego (0,5% Triton X-100 w PBS). Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
  2. Usunąć bufor permeabilizacyjny, a następnie przemyć studzienki 100 μl buforu do przemywania (0,1% Triton X-100 w PBS). Inkubować komorę obrazowania z buforem płuczącym przez 5 minut w temperaturze pokojowej na przechylanej wytrząsarce laboratoryjnej (20-30 ruchów kołysania na minutę).
  3. Aby zapobiec nieswoistemu wiązaniu przeciwciał pierwszorzędowych, dodać 100 μl pożywki blokującej i inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 godziny. Alternatywnie, ten etap blokowania można zastąpić blokowaniem 3% BSA, 0,1% Triton-X-100 w PBS przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  4. Przemyć studzienki 3x 100 μl buforu do przemywania (0,1% Triton X-100 w PBS). Inkubować etapy mycia przez 5 minut w temperaturze pokojowej na przechylanej wytrząsarce laboratoryjnej.
  5. Po usunięciu buforu płuczącego dodać przeciwciała pierwszorzędowe do komory obrazowania i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C. Użyć końcowej objętości 100 μl do przykrycia studzienki. Podczas nocnej inkubacji w temperaturze 4°C nie należy umieszczać komory obrazowania na przechylanej wytrząsarce laboratoryjnej.
    UWAGA: Anti p-MLKL (S358; rozcieńczenie: 1:200) i anty-p-RIPK3 (S227; rozcieńczenie: 1:200) dzielą królika jako gatunek żywiciela i dlatego nie powinny być łączone w jednym studzience. Aby monitorować infekcję wirusową, należy połączyć pierwszorzędowe przeciwciało przeciwko białemu wirusowemu z wyboru z p-MLKL (S358) lub p-RIPK3 (S227). W tym przypadku komórki zostały zakażone zakażeniem HSV-1, a następnie barwieniem ICP0 (rozcieńczenie: 1:50, gatunek gospodarza: mysz).
  6. W tym momencie weź pod uwagę niezbędne kontrole barwienia. Zawsze uwzględniaj warunek braku przeciwciał pierwszorzędowych, aby uwidocznić potencjalne tło etapu amplifikacji TSA w celu ustawienia progu maskowania (patrz krok 9).
    UWAGA: W przypadku protokołu jednoczesnego barwienia (np. połączenie p-MLKL [S358] lub p-RIPK3 [S227] z przeciwciałem przeciwko białku wirusa) należy również stosować pojedyncze barwienia. Stosowanie pojedynczych barwników jest ważne w celu skorygowania potencjalnego sygnału przebijania w innych kanałach obrazowania.

6. Wzmocnienie sygnału tyramidu (TSA)

  1. Usunąć pierwotną mieszaninę przeciwciał i przemyć studzienki 3x 100 μl buforu do przemywania (0,1% Triton X-100 w PBS). Inkubować etapy mycia przez 5 minut w temperaturze pokojowej na przechylanej wytrząsarce laboratoryjnej.
  2. Usunąć bufor do przemywania i dodać 100 μl przeciwciała drugorzędowego znakowanego HRP, rozpoznając gatunki przeciwciał pierwszorzędowych, które należy amplifikować. Aby wzmocnić sygnał p-RIPK3 (S227) lub p-MLKL (S358), dodaj 100 μl anty-króliczego HRP i inkubuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej na uchylnej wytrząsarce laboratoryjnej.
    UWAGA: Tylko p-MLKL (S358) lub p-RIPK3 (S227) zostaną amplifikowane. Barwienie białka wirusowego zostanie uwidocznione przy użyciu standardowej metody barwienia pośredniego.
  3. Następnie przemyć studzienki 3x 100 μl buforu do przemywania (0,1% Triton X-100 w PBS). Inkubować etapy mycia przez 5 minut w temperaturze pokojowej na przechylanej wytrząsarce laboratoryjnej.
  4. W kolejnych krokach dodaj biotynylowany tyramid do płytki mikroskopowej. Wykorzystując grupę HRP sprzężoną z przeciwciałami drugorzędowymi, reakcja enzymatyczna wywoła tworzenie rodników tyramidowych w bliskiej odległości od pierwotnego celu (tutaj p-MLKL [S358] lub p-RIPK3 [S227]).
  5. Aby aktywować aktywność enzymatyczną HRP, dodaj substrat utleniający wraz z biotynylowanym tyramidem. Aby to osiągnąć, należy uzupełnić bufor TSA (0,1 M kwas borowy [pH 8,5]) o 0,03 M H2O2 ; w szczególności weź 5 ml buforu TSA i dodaj 5 μl 30% H2O2.
  6. Teraz rozcieńczyć tyramid biotyny w buforze TSA uzupełnionym H2O2 w zakresie od 1:1 000 do 1:20 000.
    UWAGA: Współczynnik rozcieńczenia biotyny-tyramidu musi być zoptymalizowany dla każdej partii.
  7. Usunąć bufor płuczący ze studzienek i dodać rozcieńczony biotyna-tyramid do studzienek do końcowej objętości 100 μl. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut na przechylanej wytrząsarce laboratoryjnej.
  8. Następnie przemyć studzienki 3x 100 μl buforu do przemywania (0,1% Triton X-100 w PBS). Inkubować etapy mycia przez 5 minut w temperaturze pokojowej na przechylanej wytrząsarce laboratoryjnej.

7. Fluorofory

UWAGA: Ponieważ sygnał przeciwciała pierwotnego jest przekształcany w grupę biotyny, p-MLKL (S358) i p-RIPK3 (S227) są wizualizowane za pomocą streptawidyny sprzężonej z fluoroforem (fluorofor 568, rozcieńczenie: 1:500). Dodatkowo jądra są barwione DAPI (5 μg/ml). Jeśli w protokole barwienia znajduje się białko wirusowe, należy dołączyć odpowiednie, znakowane fluorescencyjnie przeciwciało drugorzędowe przeciwko gatunkom gospodarza przeciwciała pierwszorzędowego. W reprezentatywnych wynikach zastosowano mysi anty-ICP0. Jako przeciwciało drugorzędowe włączono kozi anty-mysz sprzężony z fluoroforem 633 (rozcieńczenie: 1:1000).

  1. Przygotować mieszaninę barwiącą w buforze do płukania (0,1% Triton X-100 w PBS) zawierającym przeciwciała i barwniki wymienione powyżej. Usunąć bufor do płukania, dodać 100 μl mieszanki barwiącej i inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę na przechylanej wytrząsarce laboratoryjnej. Począwszy od tego etapu, komorę obrazowania należy chronić przed światłem.
  2. Następnie przemyć studzienki 2x buforem do płukania (0,1% Triton X-100 w PBS). Inkubować etapy mycia przez 5 minut w temperaturze pokojowej na przechylanej wytrząsarce laboratoryjnej.
  3. Na koniec przepłucz studzienki 2x 1x PBS. Próbki należy przechowywać w nadmiarze (> 200 μl) 1 x PBS do czasu obrazowania. Alternatywnie, zanurz próbki w podłożu montażowym, aby zachować zabarwienie. Komora obrazowania jest teraz gotowa do wizualizacji pod mikroskopem konfokalnym.

8. Obrazowanie za pomocą mikroskopu konfokalnego

  1. Włącz mikroskop konfokalny i lasery co najmniej 10 minut przed obrazowaniem.
  2. Użyj obiektywu immersyjnego, aby uzyskać czułość. Najlepiej używać powiększenia obiektywu 40x lub 63x. Przed obrazowaniem wyczyść obiektywy zanurzeniowe środkiem do czyszczenia soczewek za pomocą odpowiednich wacików. Brudne obiektywy (np. z powodu kurzu) mogą skutkować niższą jakością obrazów.
  3. Umieść nadmiar oleju na dnie komory obrazowania. Dodatkowo dodaj kroplę oleju na wybrany cel.
  4. Umieść komorę obrazowania na mikroskopie. Znajdź pole ostrości za pomocą barwienia DAPI lub obrazowania w jasnym polu. W razie potrzeby poruszaj się po komorze obrazowania, aby zapewnić prawidłowe rozprowadzenie olejku immersyjnego.
  5. Ustaw niezbędne ścieżki obrazowania w mikroskopie. W zależności od mikroskopu następujące kroki mogą się różnić (Tabela 1).
    UWAGA: Podczas ustawiania ścieżek obrazowania zaprogramuj ścieżki tak, aby barwienie jądrowe było mierzone jako ostatnie. Laser o długości fali 405 nm może przyczyniać się do fotowybielania, a co za tym idzie do utraty określonego sygnału we wszystkich kanałach.
  6. Aby przeanalizować całą komórkę pod kątem obecności p-RIPK3 (S227) lub p-MLKL (S358), zmierz stosy z rozciągające się na wysokość komórki. W tym przypadku stosy z zostały wykonane z 40 warstw co 0,16 μm, co daje zakres 6,22 μm.

śledzićlaserRozdzielacz wiązkifiltr
pRIPK3 (S227) /pMLKL (S358)561MBS -405 +BP 570-620 + LP645
MBS 488/561/633 + SBS SP615
Gen wirusa: ICP0633MBS -405 +BP 420-480 + LP605
MBS 488/561/633 + SBS LP570
Jądro: DAPI405MBS -405 +BP 420-480 + BP 495-550
MBS 488/561/633

Tabela 1: Ścieżki obrazowania do wizualizacji komórek.

9. Analiza danych i kwantyfikacja

  1. Prześlij obrazy mikroskopowe do oprogramowania. Użyj rozszerzonej ostrości, aby zwizualizować wszystkie informacje o stosie z na obrazie 2D.
  2. Następnie zaprogramuj protokół analizy, aby wyodrębnić następujące informacje: liczbę komórek na obrazie, sumę wokseli pokazujących barwienie p-RIPK3 (S227)+ lub p-MLKL (S358)+. Woksel reprezentuje trójwymiarową objętość, zdefiniowaną jako trójwymiarowy odpowiednik piksela.
  3. Aby określić ilościowo liczbę komórek na obrazie, należy podzielić jądro na segmenty. Aby zredukować szumy w wynikach segmentacji, dodaj ograniczenie rozmiaru do segmentacji (>100 μm³). Liczba segmentowanych jąder reprezentuje liczbę komórek na obrazie.
  4. Aby określić ilościowo ilość wokseli p-RIPK3 (S227)+ lub p-MLKL (S358)+, zaprogramuj segmentację opartą na progach. Ustaw próg tak, aby żaden sygnał nie był odbierany w obrazach bez przeciwciał pierwszorzędowych (NP).
  5. Dalej dostosuj próg, korzystając z obrazów z nieleczonego stanu próbnego. Aby zapewnić czułe wykrywanie wzrostu sygnału spowodowanego stymulacją nekroptozą, należy ograniczyć wychwytywanie wokseli p-RIPK3 (S227)+ lub p-MLKL (S358)+ w warunkach pozorowanych, ustawiając wyższy próg. Zawsze sprawdzaj zaprogramowany protokół analizy na kilku obrazach od symulowanego stanu i infekcji wirusowej wywołującej nekroptozę.
  6. Uruchom analizę dla wszystkich zestawów obrazów. Eksportuj kwantyfikację wokseli i segmentację jądra do pliku .txt w celu dalszego przetwarzania w arkuszu kalkulacyjnym.
  7. Utwórz tabelę przestawną danych pokazujących nazwę obrazu, kwantyfikację jądra i sumę wykrytych wokseli.
  8. Następnie podziel sumę dodatnich wokseli przez liczbę komórek na obrazie. Daje to względną wartość dodatnich wokseli na komórkę. Aby zobrazować wzrost fałdowania, podziel względną wartość wokseli p-RIPK3 (S227)+ lub p-MLKL (S358)+ na komórkę przez medianę stanu nieleczonego (makieta).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Immunofluorescencyjna detekcja fosforylacji MLKL, a w szczególności fosforylacji RIPK3 w komórkach ludzkich, jest trudna pod względem technicznym26. Przedstawiamy tutaj ulepszony protokół barwienia dla ludzkiego p-RIPK3 (S227) oraz p-MLKL (S358) po aktywacji ZBP1. Protokół obejmuje etap TSA w celu poprawy granicy detekcji i czułości sygnałów fluorescencyjnych. Aby zwalidować tę metodę, przeprowadzono bezpośrednie porównanie immunofluorescencji z zastosowaniem TSA ze standardowym pośrednim barwieni...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Ten protokół barwienia immunofluorescencyjnego opisuje zastosowanie wzmocnienia sygnału tyramidu (TSA) w celu zwiększenia czułości na zdarzenia sygnalizacyjne ludzkiego szlaku sygnalizacji nekroptotycznej, które są trudne do wykrycia, w tym fosforylację RIPK3 i MLKL26. Włączenie kroku TSA znacznie poprawia próg wykrywania p-RIPK3 (S227) i p-MLKL (S358) oraz zwiększa czułość odkształcania p-MLKL (S358). TSA ujawniło sygnał p-RIPK3 (S227) już obecny w próbkach poddanych próbce. W komórkach ludzkich ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować VIB Bioimaging Core za szkolenie, wsparcie i dostęp do parku instrumentów. J.N. jest wspierany przez stypendium doktoranckie z Fundacji Badawczej Flandria (FWO). Badania w grupie J.M. były wspierane przez Odysseus II Grant (G0H8618N), EOS INFLADIS (40007512), junior research grant (G031022N) z Fundacji Badawczej Flandrii (FWO), grant CRIG dla młodych badaczy proof-of-concept oraz przez Uniwersytet w Gandawie. Badania w grupie P.V. były wspierane przez EOS MODEL-IDI (30826052), EOS INFLADIS (40007512), FWO senior research grants (G.0C76.18N, G.0B71.18N, G.0B96.20N, G.0A9322N), Methusalem (BOF16/MET_V/007), iBOF20/IBF/039 ATLANTIS, Foundation against Cancer (F/2016/865, F/2020/1505), konsorcja CRIG i GIGG oraz VIB.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Przeciwciała
Anti-rabbit HRPAgilent Technologies BelgiaK4002Envision+ System-HRP Znakowany polimerem anty-króliczym
Kozim anty-mysim DyLight 633Thermofisher35513Przeciwciało wtórne
HSV-1 ICP0Santa Cruzsc-53070Mysie przeciwciało
anty-ICP0 (HSV-1)Serum myszy IAV-PR8Produkcja własnaxxMysie przeciwciało poliklonalne anty-IAV-PR8
pMLKLAbcamab187091Królicze przeciwciało anty-MLKL-fospho S358
pRIPK3Abcamab209384Królicze przeciwciało anty-RIPK3-fosfo S227
Fluorophores
DAPIThermofisherD21490Wizualizacja jądra komórkowego
Streptawidyna sprzężona z Alexa Fluor 568ThermofisherS11226Wizualizacja cząsteczek biotyny
< silne>związki < / mocne>
30% H2O2SigmaH1009Substrat utleniający, niezbędny do aktywności HRP
4% PFASANBIOAR1068Aby naprawić/usieciować komórki
Biotynylo-tyramidR& D Systems6241Do wzmacniania sygnału, podłoże HRP
BV-6SelleckchemS7597BV6 Inhibitor IAP
         W przypadku hodowli komórkowej: odłączenie komórek
         8,0 g/l NaCl
         0,4 g/l sól disodowa EDTA
EDTA 0,04%Preparat1,1 g/L Na2HPO4
         0,2 g/L NaH2PO4
         0,2 g/L KCl
         0,2 g/l glukozy
Surowica bydlęcapłodu TICOFBS EU XXXDo hodowli komórkowych, utrzymanie hodowli komórkowej; numer partii: 90439
GSK'840Inhibitor kinazy RIPK3AobiousAOB0917
L-GlutamineSigma-AldrichG7513Do hodowli komórkowych, utrzymania hodowli komórkowej
MAXblockActive Motif15252Roztwór blokujący
PBSGibco
Pirogronian soduSigma-AldrichS8636Do hodowli komórkowych, utrzymania hodowli komórkowej
TNF-αProdukcja w domu-Cząsteczka sygnalizacyjna, zdolna do wywołania śmierci komórki w połączeniu z BV6 i zVAD
Triton X-100Sigma AldrichT8787-50MLDo przenikania komórek
Błękit trypanowyMerck11732Do zliczania komórek, stosowany jako żywy/martwy marker przy 0,1%
trypszynySigma-AldrichT4424Do hodowli komórkowych: do odłączenia komórek
zVADBachemBACE4026865.0005Z-Val-Ala-DL-Asp-fluorometyloketon
Materiał
&mikro;-Slide 8 well high glass bottomiBidi80807Do hodowli komórek
Bawełniane kulki do przygotowywania-rozmiar średniMikroskopia elektronowa Sciences71001-10Do czyszczenia obiektywów
Immersol 518 F / 30 ° CZEISS444970-9000-000Do wizualizacji próbki przy dużych powiększeniach
Środek do czyszczenia soczewekZEISS000000-0105-200Do czyszczenia obiektywów
LSM880 Szybki mikroskopAby zobrazować próbkę
Software
ExcelOfficexxAby przetworzyć dane
Prism 9GraphpadxxDo analizy danych - testy statystyczne i generowanie wykresów
Volocity 6.3VolocityxxDo wykonywania kwantyfikacji
Zen blackZEISSxxDo pozyskiwania i przetwarzania obrazów
Zen blueZEISSxxDo wizualizacji obrazów
Viruses
Szczep HSV-1 (mutRHIM) Fwyprodukowany przez  Dr. Jiahuai Hanw replikacji wewnętrznejHSV-1 jako czynnik wyzwalający nekroptozę; Domena rdzeniowa RHIM UL39 / ICP6 jest zmutowana (VQCG>AAAA)
HSV-1 (WT) Szczep FWytwarzany przez dr Jiahuai Hanw replikacji domowejHSV-1 (WT) jako kontrola negatywna dla indukcji nekroptozy (hamowanie ICP6)
IAV PR8w zapasie domowymreplikacja w domuIAV jako wyzwalacz nekroptozy
własny 10444402 konfokalny Airyscan

Bibliografia

  1. Meng, Y., Sandow, J. J., Czabotar, P. E., Murphy, J. M. The regulation of necroptosis by post-translational modifications. Cell Death & Differentiation. 28 (3), 861-883 (2021).
  2. Petrie, E. J., Czabotar, P. E., Murphy, J. M. The structural basis of necroptotic cell death signaling. Trends in Biochemical Sciences. 44 (1), 53-63 (2019).
  3. Mocarski, E. S., Guo, H., Kaiser, W. J. Necroptosis: The Trojan horse in cell autonomous antiviral host defense. Virology. 479-480, 160-166 (2015).
  4. Nailwal, H., Chan, F. K. Necroptosis in anti-viral inflammation. Cell Death & Differentiation. 26 (1), 4-13 (2019).
  5. Meng, Y., et al. Human RIPK3 maintains MLKL in an inactive conformation prior to cell death by necroptosis. Nature Communications. 12 (1), 6783(2021).
  6. Samson, A. L., Garnish, S. E., Hildebrand, J. M., Murphy, J. M. Location, location, location: A compartmentalized view of TNF-induced necroptotic signaling. Science Signalling. 14 (668), (2021).
  7. Koehler, H., et al. Vaccinia virus E3 prevents sensing of Z-RNA to block ZBP1-dependent necroptosis. Cell Host Microbe. 29 (8), 1266-1276 (2021).
  8. Balachandran, S., Mocarski, E. S. Viral Z-RNA triggers ZBP1-dependent cell death. Current Opinion in Virology. 51, 134-140 (2021).
  9. Kuriakose, T., Kanneganti, T. D. ZBP1: Innate sensor regulating cell death and inflammation. Trends in Immunology. 39 (2), 123-134 (2018).
  10. Maelfait, J., Liverpool, L., Rehwinkel, J. Nucleic acid sensors and programmed cell death. Journal of Molecular Biology. 432 (2), 552-568 (2020).
  11. Verdonck, S., Nemegeer, J., Vandenabeele, P., Maelfait, J. Viral manipulation of host cell necroptosis and pyroptosis. Trends in Microbiology. 30 (6), 593-605 (2022).
  12. Guo, H., et al. Herpes simplex virus suppresses necroptosis in human cells. Cell Host & Microbe. 17 (2), 243-251 (2015).
  13. Yu, X., et al. Herpes simplex virus 1 (HSV-1) and HSV-2 mediate species-specific modulations of programmed necrosis through the viral ribonucleotide reductase large subunit R1. Journal of Virology. 90 (2), 1088-1095 (2016).
  14. Huang, Z., et al. RIP1/RIP3 binding to HSV-1 ICP6 initiates necroptosis to restrict virus propagation in mice. Cell Host & Microbe. 17 (2), 229-242 (2015).
  15. Guo, H., et al. Species-independent contribution of ZBP1/DAI/DLM-1-triggered necroptosis in host defense against HSV1. Cell Death & Disease. 9 (8), 816(2018).
  16. Devos, M., et al. Sensing of endogenous nucleic acids by ZBP1 induces keratinocyte necroptosis and skin inflammation. The Journal of Experimental Medicine. 217 (7), 20191913(2020).
  17. Jiao, H., et al. Z-nucleic-acid sensing triggers ZBP1-dependent necroptosis and inflammation. Nature. 580 (7803), 391-395 (2020).
  18. de Reuver, R., et al. ADAR1 prevents autoinflammation by suppressing spontaneous ZBP1 activation. Nature. 607 (7920), 784-789 (2022).
  19. Jiao, H., et al. ADAR1 averts fatal type I interferon induction by ZBP1. Nature. 607 (7920), 776-783 (2022).
  20. Hubbard, N. W., et al. ADAR1 mutation causes ZBP1-dependent immunopathology. Nature. 607 (7920), 769-775 (2022).
  21. Zhang, T., et al. ADAR1 masks the cancer immunotherapeutic promise of ZBP1-driven necroptosis. Nature. 606 (7914), 594-602 (2022).
  22. Adams, J. C. Biotin amplification of biotin and horseradish peroxidase signals in histochemical stains. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 40 (10), 1457-1463 (1992).
  23. Speel, E. J., Hopman, A. H., Komminoth, P. Tyramide signal amplification for DNA and mRNA in situ hybridization. Methods in Molecular Biology. 326, 33-60 (2006).
  24. Clutter, M. R., Heffner, G. C., Krutzik, P. O., Sachen, K. L., Nolan, G. P. Tyramide signal amplification for analysis of kinase activity by intracellular flow cytometry. Cytometry A. 77 (11), 1020-1031 (2010).
  25. Dopie, J., Sweredoski, M. J., Moradian, A., Belmont, A. S. Tyramide signal amplification mass spectrometry (TSA-MS) ratio identifies nuclear speckle proteins. The Journal of Cell Biology. 219 (9), 201910207(2020).
  26. Samson, A. L., et al. A toolbox for imaging RIPK1, RIPK3, and MLKL in mouse and human cells. Cell Death and Differentiation. 28 (7), 2126-2144 (2021).
  27. De Groote, P., et al. Generation of a new gateway-compatible inducible lentiviral vector platform allowing easy derivation of co-transduced cells. Biotechniques. 60 (5), 252-259 (2016).
  28. Ali, M., Roback, L., Mocarski, E. S. Herpes simplex virus 1 ICP6 impedes TNF receptor 1-induced necrosome assembly during compartmentalization to detergent-resistant membrane vesicles. The Journal of Biological Chemistry. 294 (3), 991-1004 (2019).
  29. Mandal, P., et al. RIP3 induces apoptosis independent of pronecrotic kinase activity. Moleular Cell. 56 (4), 481-495 (2014).
  30. Zhang, T., et al. Influenza virus Z-RNAs induce ZBP1-mediated necroptosis. Cell. 180 (6), 1115-1129 (2020).
  31. Garnish, S. E., et al. Conformational interconversion of MLKL and disengagement from RIPK3 precede cell death by necroptosis. Nature Communications. 12 (1), 2211(2021).
  32. Clay, H., Ramakrishnan, L. Multiplex fluorescent in situ hybridization in zebrafish embryos using tyramide signal amplification. Zebrafish. 2 (2), 105-111 (2005).
  33. Parra, E. R., et al. Procedural requirements and recommendations for multiplex immunofluorescence tyramide signal amplification assays to support translational oncology studies. Cancers. 12 (2), 255(2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Nekroptoza zale na od ZBP1fosforylowany RIPK3fosforylowany MLKLmikroskopia konfokalnabiomarkery nekroptozyszlaki mierci kom rkowejludzkie kom rki HT 29
Wzmocnienie sygnału tyramidu do barwienia immunofluorescencyjnego zależnej od ZBP1 fosforylacji RIPK3 i MLKL po zakażeniu HSV-1 w komórkach ludzkich
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.