Artykuł metodologiczny

Izolacja przepływającej limfy krezkowej u myszy w celu ilościowego określenia in vivo kinetyki wchłaniania lipidów w diecie i wydzielania chylomikronu

3.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64338

⸱

30 listopada 2022

 ,  , 
1Division of Endocrinology and Metabolism, Department of Medicine, School of Medicine, University of Pittsburgh

W tym artykule

Podsumowanie

Obecny protokół opisuje szczegółowy protokół chirurgiczny izolowania przepływającej limfy jelitowej w odpowiedzi na infuzje składników odżywczych dodwunastnicy u myszy. Pozwala to na fizjologiczne określenie całkowitego wchłaniania lipidów w jelitach oraz syntezy i wydzielania chylomikronu w odpowiedzi na różne eksperymentalne składniki odżywcze.

Streszczenie

Lipoproteiny jelitowe, zwłaszcza chylomikrony bogate w trójglicerydy, są głównym motorem metabolizmu, stanów zapalnych i chorób sercowo-naczyniowych. Jednak wyizolowanie lipoprotein jelitowych jest bardzo trudne in vivo, ponieważ są one najpierw wydzielane z jelita cienkiego do limfy krezkowej. Limfa zawierająca chylomikron jest następnie opróżniana do żyły podobojczykowej z przewodu piersiowego, aby dostarczyć składniki posiłku do serca, płuc i ostatecznie do krążenia w całym ciele. Wyizolowanie naiwnych chylomikronów z krwi jest niemożliwe, ponieważ trójgliceryd chylomikronu ulega hydrolizie natychmiast po interakcji z lipazą lipoproteinową i innymi receptorami lipoprotein w krążeniu. Dlatego oryginalna 2-dniowa procedura przetoki limfatycznej, opisana przez Bollmana i wsp. u szczurów, była historycznie stosowana do izolowania świeżej limfy krezkowej przed jej wejściem do żyły piersiowej. Protokół ten został ulepszony i sprofesjonalizowany przez laboratorium Patricka Tso przez ostatnie 45 lat, co pozwala na analizę tych krytycznych lipoprotein i wydzielin z jelit. Procedura przetoki limfatycznej Tso została teraz zaktualizowana i po raz pierwszy została tutaj przedstawiona wizualnie. Ta zmieniona procedura jest jednodniową techniką chirurgiczną polegającą na zainstalowaniu sondy do karmienia dwunastnicy, kaniulacji kanału limfatycznego krezki i zbieraniu limfy po posiłku u przytomnych myszy. Do głównych korzyści płynących z tych nowych technik należą: zdolność do powtarzalnego pobierania limfy od myszy (co wykorzystuje moc genetycznych modeli myszy); skrócony czas znieczulenia u myszy podczas implantacji rurki infuzyjnej dwunastnicy i kaniuli limfatycznej; zdolność do ciągłego pobierania próbek limfy przez cały okres karmienia i poposiłkowy; zdolność do ilościowego pomiaru hormonów i cytokin przed ich rozcieńczeniem i hydrolizą enzymatyczną we krwi; oraz zdolność do zbierania dużych ilości limfy w celu izolowania lipoprotein jelitowych. Technika ta jest potężnym narzędziem do bezpośredniego i ilościowego pomiaru wchłaniania składników odżywczych w diecie, syntezy lipoprotein jelitowych i wydzielania chylomikronu.

Wprowadzenie

Fizjologiczne znaczenie krezkowego układu limfatycznego
Limfa krezkowa została opisana w jakiejś formie od ~300 r. p.n.e., kiedy Herofilos opisał system wrotny wątroby i wszystkie "żyły absorpcyjne w jelitach"1,2,3,4,5. Przez ponad 1700 lat po tym początkowym opisie, cechą charakterystyczną limfy jelitowej była obecność mlecznego płynu w limfie krezkowej krótko po posiłku3. Obecnie wiadomo, że mleczna limfa zawierająca chylomikron (limfa "chylous") nie spływa do żyły wrotnej i wątroby, ale zamiast tego przemieszcza się przez cisterna chyli do przewodu piersiowego i ostatecznie łączy się z krwią w lewej żyle podobojczykowej6. Ze względu na ten anatomiczny układ limfa chylous najpierw przemieszcza się przez serce i płuca, zanim zacznie krążyć po reszcie ciała. Oznacza to, że serce i płuca otrzymują "pierwsze przejście" przez wydzieliny do krezki limfy7.

Główną rolą limfów krezkowych jest transport lipidów z jelita cienkiego z diety8,9,10. Anatomicznie, chylomikrony, jelitowe komórki odpornościowe11,12,13,14, hormony jelitowe15,16,17,18, antygeny19,20,21, niechylomikronowe związki lipofilowe22,23, a nadmiar płynu dostaje się do mleka leżącego poniżej błony podstawnej enterocytów, a następnie jest zagęszczany przez naczynia włosowate limfatyczne do krezkowych węzłów chłonnych. Prawdopodobnie istnieje wiele nieznanych składników limfatycznych krezki, w tym metabolity, antygeny, zanieczyszczenia środowiska, składniki odżywcze i cząsteczki sygnałowe.

Składniki limfy krezkowej nie były systematycznie identyfikowane, głównie z powodu trudności w wyizolowaniu limfy krezkowej. Dostęp do limfy krezkowej zawsze był poważnym wyzwaniem, ponieważ przewody limfatyczne są bezbarwne i z wyjątkiem tłustego posiłku, kiedy stają się tłuste i mleczne, limfy krezkowe zawierają bezbarwny płyn limfatyczny6,8,9,10.

Obecne i powszechne metody izolacji limfy jelitowej
Dostęp do limfy krezkowej u ludzi nie jest możliwy (z wyjątkiem rzadkich i ekstremalnych okoliczności, w których doszło do poważnego urazu przewodu pokarmowego)24. Pobieranie limfy in vivo jest chirurgicznie skomplikowane i wymagające. Oryginalna procedura 2-dniowej przetoki limfatycznej została opisana przez Bollmana i wsp.25 i została ulepszona i sprofesjonalizowana przez laboratorium Patricka Tso przez ostatnie 45 lat26,27. Zabieg przetoki limfatycznej pozwala badaczom na pobranie płynącej limfy od przytomnych zwierząt podczas 6-godzinnego okresu infuzji lipidów z dwunastnicy.

Model przetoki limfatycznej był głównie używany u szczurów do pomiaru szybkości przepływu limfy, produkcji trójglicerydów i cholesterolu (lub innych związków z dwunastnicą), składu chylomikronu i stężenia hormonów jelitowych. W mniejszym stopniu technika ta może być również stosowana u myszy, chociaż cierpi na tym przeżycie chirurgiczne i objętość limfy. Ze względu na trudności w widzeniu krezkowych przewodów chłonnych, historyczne metody obejmowały kaniulowanie limfy krezkowej u większych zwierząt, takich jak mini-pigs28, sheep29, pigs30, dogs31 i rats17. Praca z tymi większymi modelami wymaga dużych zasobów i nie pozwala na badania w modelach knock-in lub knock-out.

Alternatywne podejścia również zostały użyte. Chylomikrony można wyizolować z krwi w stanie poposiłkowym (choć będą one częściowo hydrolizowane przez lipazę lipoproteinową osocza)32,33,34,35. Przewód piersiowy może być również kaniulowany, chociaż zebrana tam limfa zawiera domieszkę limfy krezkowej i drenaż limfy zewnątrzjelitowej26,36. In vitro komórki Caco-2 wydzielają cząsteczkę podobną do chylomikronu w odpowiedzi na leczenie kwasami tłuszczowymi, a komórki te mogą być hodowane wspólnie z odpowiednimi komórkami śródbłonka limfatycznego lub naczyń krwionośnych37,38. Wykazano, że hodowle organoidów jelitowych ludzi i myszy przetwarzają lipidy wierzchołkowe i wydzielają chylomikrony39,40,41,42. Modele te są bardzo korzystne i umożliwiają mechanistyczny wgląd w fizjologię jelita cienkiego, ale nie są w stanie odtworzyć złożoności, gradientów fizykochemicznych ani dynamicznego przepływu limfy krezkowej in situ.

Zalety modelu przetoki limfatycznej myszy na 1 dzień prezentowany tutaj
W odniesieniu do tych innych metod izolowania lipoprotein jelitowych, technika przetoki limfatycznej Tso Lab jest tradycyjnie uważana za złoty standard pomiaru wchłaniania składników odżywczych w diecie do limfy krezkowej. Ta technika in vivo ma tę zaletę, że pozwala uchwycić kluczowe fizjologiczne aspekty wchłaniania lipidów w diecie - dynamiczne pojawianie się związków w okresie wchłaniania, co wymaga wielokrotnego pobierania próbek przepływającej limfy krezkowej u żywych zwierząt ze składnikami odżywczymi dwunastnicy. Ta technika chirurgiczna mierzy również hormony jelitowe i cytokiny bezpośrednio w ich fizjologicznym kompartmencie, a nie we krwi, gdzie są rozcieńczane i enzymatycznie degradowane17,43.

Jeśli pytanie eksperymentalne wymaga zrozumienia dynamiki wydzielania lipidów lub dynamicznej absorpcji i metabolizmu jakiegokolwiek hydrofobowego związku GI lub leku, to ta technika jest nie tylko odpowiednia, ale jest również jedynym podejściem, które interpoluje ruch zawartości światła od bliższego do dystalnego jelita (żołądek do okrężnicy) i od powierzchni wierzchołkowej do podstawno-bocznej (zawartość światła przez enterocyty do mleczonów i krążenia wrotnego). Ponieważ technika ta wykorzystuje dostarczanie składników odżywczych w świetle przez cewnik dodwunastniczy, a płynąca limfa krezkowa jest kierowana i zbierana, cały aparat absorpcyjny jest pod kontrolą eksperymentalną i może być wykorzystany do jakościowej oceny profili wchłaniania w jelicie cienkim.

Prezentowany tutaj wizualnie po raz pierwszy jest duża aktualizacja modelu przetoki limfatycznej Tso Lab, która (1) skraca czas eksperymentu do 1-dniowego okresu implantacji chirurgicznej i eksperymentalnego pobierania danych; (2) poprawia przeżywalność myszy i względy dobrostanu zwierząt; oraz (3) zwiększa powtarzalność podejścia u myszy w celu wykorzystania mocy mysich modeli genetycznych. Technika ta musi być uważana za złoty standard dla wszystkich eksperymentalnych pytań dotyczących wydzielin jelitowych, lipoprotein lub wchłaniania lipidów w diecie i jest najlepszą techniką do precyzyjnego określania kinetyki wchłaniania lipidów i chylomikronów.

Protokół

Wszystkie procedury chirurgiczne zostały zatwierdzone przez Wewnętrzną Komisję ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu w Pittsburghu [Protokół # 20047008] i są zgodne z Przewodnikiem NIH dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych. Do niniejszego badania wykorzystano samce myszy C57BL6/J w wieku 8-14 tygodni. Myszy uzyskano ze źródła komercyjnego (patrz tabela materiałów). Wszystkie myszy trzymano w 12-godzinnym cyklu światło/ciemność z dostępem ad libitum do standardowej karmy i wody.

1. Przygotowanie zwierząt

  1. W zależności od projektu eksperymentalnego, nakarm myszy lub pozwól im pościć.
    UWAGA: Nocny post nie jest konieczny, chyba że istnieją obawy dotyczące różnic w tempie opróżniania żołądka.
  2. Wywołać znieczulenie 5% gazem izofluranowym i zapewnić prawidłowe znieczulenie przez uszczypnięcie ogona i palców u nóg. Po znieczuleniu utrzymuj myszy w odpowiedniej płaszczyźnie znieczulenia za pomocą 2%-3% izofluranu i umieść je za pomocą taśmy na platformie chirurgicznej.
  3. Utrzymuj myszy w cieple na podgrzewanej platformie chirurgicznej, która wykorzystuje krążącą ciepłą wodę (patrz tabela materiałów).

2. Chirurgia i projektowanie eksperymentalne

  1. Rozpocznij operację od nałożenia maści weterynaryjnej na oczy, ogolenia brzucha i nałożenia antyseptycznego peelingu chirurgicznego (patrz tabela materiałów) na miejsce operowane. Powoduje to sterylizację nacięcia i zmniejsza wytwarzanie się futra unoszącego się w powietrzu podczas nacięcia w linii środkowej.
  2. Utrzymuj sterylne miejsce pracy, używając sterylnych narzędzi, zasłon oraz innego potrzebnego sprzętu i materiałów.
  3. Wstrzyknąć pierwszą dawkę karprofenu (patrz tabela materiałów) w celu złagodzenia bólu (i.p.) w dawce 5 mg/kg.
  4. Chwyć skórę pęsetą i wykonaj nacięcie brzucha w linii środkowej małymi nożyczkami. Przeciąć w kierunku mostka (nigdy powyżej) i przyciąć do tłuszczu pachwinowego. Następnie przetnij warstwę mięśniową osobno za pomocą nożyczek.
    UWAGA: Wysterylizuj cały sprzęt przed użyciem.
  5. Za pomocą retraktora odsuń wnętrzności otrzewnej na bok, aż przewód limfatyczny będzie widoczny.
  6. Za pomocą patyczka higienicznego nasączonego solą fizjologiczną (patrz Tabela materiałów), przesuń wątrobę w kierunku prawej górnej strony ciała, a jelita i żołądek po lewej stronie zwierzęcia.
  7. Rozciągnij dwunastnicę w kierunku lewej poprzecznie, aby odsłonić tętnicę krezkową górną i przewód limfatyczny jelita.
  8. Przygotuj rurkę kaniuli o długości 30-40 cm, wkładając igłę do rurki kaniuli (patrz Tabela materiałów) i przepłucz niewielką ilość heparyny (1,000 U/L) przez rurkę za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml.
    UWAGA: Przepływ limfy jest wspomagany grawitacyjnie, aby spływać w dół i do probówek zbiorczych mikrowirówek na lodzie. W zależności od tego, gdzie znajduje się pojemnik na lód w sąsiedztwie zestawu chirurgicznego, może być konieczne dostosowanie długości rurki kaniuli.
  9. Użyj nożyczek, aby wyciąć skos na końcu rurki kaniuli.
  10. Wykonaj płytkie nacięcie nożyczkami do tęczówki (patrz Tabela materiałów) w przewodzie limfatycznym około 5 mm od jego pojawienia się w jelicie cienkim.
  11. Przytrzymaj rurkę kaniuli za pomocą cienkich kleszczyków i delikatnie włóż końcówkę do kanału.
    UWAGA: Ważne jest, aby nie wciskać kaniuli zbyt głęboko w przewód, ponieważ może to uniemożliwić przepływ limfy, gdy cofnięte narządy zostaną przywrócone do swojej pierwotnej pozycji.
  12. Przewód limfatyczny jest zbyt delikatny na manipulacje związane z wiązaniem cewnika za pomocą szwu. Zamiast tego użyj kropli kleju cyjanoakrylowego (patrz Tabela materiałów), aby przykleić kaniulę limfatyczną do krezkowego przewodu chłonnego.
  13. Sprawdź, czy nie ma mlecznej, białej limfy (jeśli przed operacją użyto zgłębnika z oliwy z oliwek) lub czystej limfy (jeśli myszy pościły przed operacją), która zaczyna natychmiast przepływać przez kaniulę przetoki limfatycznej.
    UWAGA: Sprawdź, czy kaniula limfatyczna została pomyślnie umieszczona i czy limfa płynie; Kontynuuj zakładanie kaniuli do dwunastnicy.
  14. Za pomocą igły 18 G nakłuć otwór w okolicy odźwiernika żołądka za zwieraczem odźwiernika.
  15. Wprowadzić rurkę do infuzji dwunastnicy (patrz Tabela materiałów) przez ten otwór w żołądku do około 1-2 mm poza zwieracz odźwiernika do dwunastnicy.
  16. Zabezpiecz podwiązką ze sznurka do torebki za pomocą jedwabnego szwu 5-0 (patrz Tabela Materiałów) za pomocą igły do żołądka i uszczelnij kroplą kleju cyjanoakrylowego, aby zapobiec wyciekom.
  17. Rozpocznij infuzję dodwunastniczą 5% glukozy-0,9% soli fizjologicznej w stężeniu 0,3 ml/h,
    UWAGA: W przypadku korzystania z myszy o niewielkich różnicach masy ciała, które ważą około 25 g (~8 tygodni w wieku), odpowiedni jest wlew glukozy/soli fizjologicznej w ilości 0,3 ml / h. Jeśli myszy są znacznie większe, szybkość infuzji należy dostosować w górę, aby uwzględnić zmianę masy ciała i objętości krwi.
  18. Wymień narządy w jamie ciała i zszyj (5-0) osobno tkanki mięśniowe i skórne.
    UWAGA: Kaniula limfatyczna i rurka do karmienia dodwunastnicy są zewnętrzne przez to samo nacięcie. Nie ma precedensu w oddzielaniu rurek szwem i nie ma preferencji co do kąta eksterioryzacji rurek.
  19. Po zabiegu, ale przed odstawieniem środka znieczulającego, delikatnie umieść myszy w ograniczeniach Snuggle (patrz Tabela materiałów), aby ograniczyć ruchliwość.
    UWAGA: Ograniczniki przytuśniania uniemożliwiają myszom chwytanie lub obracanie głowy w celu żucia szwów i rurek.
  20. Następnie umieść myszy w przezroczystym pudełku z pleksiglasu na rotatorze z delikatnym kołysaniem i ogrzej je za pomocą dostępnej w handlu poduszki grzewczej dla/o kontrolowanej temperaturze, przyklejonej z boku skrzynki zabezpieczającej. Zapewnić nawilżanie również w postaci sterylnych pojemników na wodę dejonizowaną w rogach skrzynki zabezpieczającej (patrz Tabela materiałów).
  21. Po 30 minutach przed odstawieniem izofluranu należy podać myszom drugą dawkę przeciwbólową (Buprenex, 0,1 mg/kg mc., i.p.).
  22. W zależności od eksperymentu, należy zapewnić myszom ciągły wlew dodwunastniczy 5% glukozy-0,9% soli fizjologicznej w tempie 0,3 ml/h przez 1 h,
    UWAGA: 5% roztwór glukozy-0,9% soli fizjologicznej przygotowuje się przy użyciu sterylnego worka z solą fizjologiczną (do stosowania u ludzi, pH 7,4) z apteki i sterylnej butelki do stosowania u ludzi z 50% dekstrozą, zgodnie ze ścisłymi wytycznymi dotyczącymi sterylności. Roztwór musi być świeży i wyrzucony, jeśli minęła data ważności podana na woreczku z solą fizjologiczną lub na butelce z dekstrozą.
  23. Podawać myszom jeden z lipidów wymienionych w Tabeli 1 jako lipid doświadczalny przez kaniulę dodwunastniczą (patrz Tabela materiałów).
    UWAGA: Dla wszystkich danych pokazanych w Rysunek 1, SMOFlipid (20% emulsja lipidowa do wstrzykiwań, USP, patrz tabela materiałów) był podawany dodwunastnicznie. Ten wlew, zarówno przed, jak i po bolusie lipidowym dodwunastnicy, zastępuje utracony płyn drenujący przez przewód limfatyczny i jest bezwzględnym wymogiem. Myszy są teraz gotowe do podania eksperymentalnej dawki lipidów.
  24. Wykonać klasyczną infuzję lipidową z 0,3 ml bolusa emulsji lipidowej (SMOFlipid 20% lipidowa emulsja do wstrzykiwań, USP) przez rurkę do infuzji dodwunastnicy (patrz tabela materiałów).
  25. Po wstrzyknięciu w bolusie lipidów dodwunastniczych należy zmienić infuzję z powrotem na 5% glukozy-0,9% soli fizjologicznej w dawce 0,3 ml/h w sposób ciągły do końca eksperymentu.
  26. Próbki limfy należy zebrać do wstępnie zważonych probówek do mikrowirówek przez 60 minut i utrzymywać limfę na lodzie. Zważ probówki po raz drugi, aby ustalić masę limfy, która jest wydzielana co 60 minut.
    UWAGA: Spodziewaj się zebrać około 50-300 μl limfy na godzinę na mysz w ciągu ~ 6 godzin po 0,3 ml bolusa lipidowego.
  27. Limfa może płynąć do 6 godzin po wlewie lipidowym. W 6 godzinach należy poddać myszy eutanazji za pomocą izofluranu i zwichnięcia szyjki macicy.
    UWAGA: Chirurg i/lub technik laboratoryjny powinni być obecni w celu monitorowania zwierząt przez cały czas trwania eksperymentu. Podczas obserwacji zwróć uwagę na skrzepy w drenażu limfatycznym i zmiany w zachowaniu zwierząt, które wskazują na ból/niepokój. Jeśli przewód limfatyczny zostanie zatkany w dowolnym momencie eksperymentu, eksperyment zostaje zakończony, a zwierzę zostaje poddane eutanazji. Technicznie rzecz biorąc, zwierzę może być utrzymywane przy życiu do 24 godzin po operacji (zgodnie z zasadami IACUC dotyczącymi operacji przeżycia). Jednak wskaźniki przeżycia zmniejszają się z czasem, a 6 godzin to powtarzalny okres przeżycia, w którym wchłanianie lipidów nadal naśladuje fizjologię in vivo, a zwierzę nie walczy o przeżycie.
  28. Wykonać pobranie tkanek końcowych po eutanazji (krok 3.1).
    UWAGA: Różnica w profilach wchłaniania lipidów w diecie u myszy trzymanych przez 6 godzin lub 24 godziny po operacji została niedawno przetestowana44. Odkryliśmy, że 24-godzinna procedura zmniejsza wskaźniki przeżywalności zwierząt i skok lipidów z diety do limfy. Z tych powodów zdecydowanie zalecamy podejście 6-godzinne. Ta zaktualizowana konstrukcja chirurgiczna zmniejsza niepotrzebną śmierć zwierząt i potencjalne cierpienie zwierząt w okresie pooperacyjnym. Wspiera to główny cel Amerykańskiego Stowarzyszenia Akredytacji Opieki nad Zwierzętami Laboratoryjnymi, którym jest "Wymiana, Redukcja, Udoskonalenie" zwierząt [ref PMID: 21595115].

3. Zbieranie zawartości światła i tkanki śluzówkowej

  1. Pod koniec 6-godzinnego okresu infuzji lipidów należy złożyć myszy w ofierze za pomocą izofluranu i zwichnięcia szyjki macicy. Zawiąż oba końce żołądka, jelita cienkiego i jelita ślepego szwami 5-0, aby uniknąć wycieku zawartości światła.
  2. Zbierz żołądek, jelito ślepe i okrężnicę i umieść je w szklanej probówce o pojemności 15 ml. Podziel jelito cienkie na trzy lub cztery segmenty i zbierz zawartość światła, spłukując tkankę w 2-3 ml zimnego PBS po rozcięciu wzdłużnym.
  3. Usuń błonę śluzową jelit zawierającą komórki nabłonka i związaną z nimi blaszkę właściwą z warstwy mięśniowej, zeskrobując każdy fragment w 2-3 ml zimnego PBS za pomocą zakrzywionej pęsety.
  4. Umieść wszystkie tkanki, izolaty światła i błony śluzowej oraz warstwę mięśniową w szklanych probówkach i dodaj 8 ml CHCl3:MeOH 2:1 obj. / obj. do każdej probówki.
  5. Określić radioaktywność i/lub stężenia lipidów za pomocą zliczania scyntylacyjnego cieczy i/lub zestawu do oznaczania triglicerydów (patrz tabela materiałów) po ekstrakcji Folch45.

4. Chromatografia cienkowarstwowa (TLC)

  1. Ekstrakcja całkowitej ilości lipidów izolatów luminalnych i śluzówkowych za pomocą zmodyfikowanej ekstrakcji Folch45.
  2. Wysuszyć wyekstrahowane lipidy w rozpuszczalniku pod parownikiem azotu, a następnie ponownie zawiesić je w stosunku 2:1 obj./obj. CHCl3:MeOH przed załadowaniem ich na płytkę z żelu krzemionkowego TLC (patrz tabela materiałów).
  3. Oddzielić lipidy za pomocą układu rozpuszczalnikowego składającego się z eteru naftowego, eteru etylowego i lodowatego kwasu octowego (25:5:1 obj./obj.). Użyj oparów jodu do wizualizacji różnych lipidów, w tym wzorców.
  4. Zeskrobać plamki na płytce TLC odpowiadające monoglicerydom/fosfolipidom, diglicerydom, kwasom tłuszczowym, triglicerydom i estrom cholesterolu do indywidualnych fiolek scyntylacyjnych przed dodaniem 4 ml płynu scyntylacyjnego (patrz tabela materiałów) w celu zliczenia scyntylacyjnego.
  5. Wyrazić dane jako procent całkowitej dawki lipidów w bolusie lub jako ułamek całkowitej dawki lipidów wykrytych dla każdej próbki.

5. Izolacja i charakterystyka Chylomicron

  1. Przenieść połączone próbki limfy z 6-godzinnego bolusa po podaniu lipidów (krok 2.29) do probówek ultrawirówek, wymieszać z 0,9% NaCl (300-500 μL), a następnie ostrożnie nałożyć odpowiednią objętość 0,87% NaCl (300-500 μL).
    1. Ultraodwirować (patrz tabela materiałów) próbki w temperaturze 110 000 x g w temperaturze 4 °C przez 16 godzin. Zebrać górną frakcję zawierającą wyizolowane chylomikrony i przenieść je do nowej probówki do mikrowirówki.
  2. Określ stężenia triglicerydów chylomikronu, cholesterolu i apoB, wykonując poniższe czynności.
    1. Oznaczyć stężenia trójglicerydów i cholesterolu za pomocą zestawu do oznaczania triglicerydów i cholesterolu (patrz tabela materiałów).
    2. Krótko inkubować 2 μl próbek z 200 μl odczynnika enzymatycznego w temperaturze 37 °C przez 5 minut na 96-dołkowej płytce. Odczytać tabliczkę za pomocą czytnika płytek przy długości fali 500 nm dla trójglicerydów i 600 nm dla cholesterolu.
      UWAGA: Do obliczenia stężeń użyto wzorców i ślepych prób. Stężenia ApoB oznaczono za pomocą zestawu ELISA Mouse ApoB (patrz tabela materiałów).
  3. Określ wielkość cząstek chylomikronu.
    1. Do obrazowania TEM należy użyć świeżych próbek chylomikronu o stężeniu trójglicerydów około 40 mg/dl. Na krótko umieścić 5-10 μl każdej próbki na siatce TEM i wysuszyć.
    2. Zbadaj siatkę za pomocą transmisyjnego mikroskopu elektronowego i uchwyć obrazy. Zmierz rozmiary cząstek lipoprotein i przeanalizuj je za pomocą oprogramowania ImageJ (patrz tabela materiałów).

Wyniki

Rysunek 2 przedstawia wydzielanie trójglicerydów do chłonki krezkowej oraz średnie prędkości przepływu chłonki u ostatnich n = 17 myszy typu dzikiego (WT), u których przeprowadzono opisany tutaj jednodniowy zabieg przetoki chłonnej. Jak pokazano na Rysunku 2A, stężenie trójglicerydów w chłonce wzrasta w odpowiedzi na podanie do dwunastnicy bolusa 300 µL SMOFLipid. Szczytowe stężenie trójglicerydów zostaje osiągnięte około 2-3 h po podaniu bolusa i stopniowo spada w ciągu 6 h (bezpośrednio przed eutanazją). Równolegle z wydzielaniem trójglicerydów, prędkość przepływu chłonki wzrasta od momentu podania bolusa w czasie 0 aż do końca eksperymentu (Rysunek 2B).

Wyniki te wykazują, że implantacja chirurgiczna zarówno przewodu chłonnego krezkowego, jak i kaniuli dwunastniczej przebiegła pomyślnie i stanowią one pozytywną kontrolę, w odniesieniu do której można analizować inne składniki limfy (hormony, peptydy, składniki odżywcze). Brak zmiany stężenia triglicerydów w limfie w odpowiedzi na bolus lipidów podany do dwunastnicy sygnalizuje, że zabieg chirurgiczny spowodował znaczne uszkodzenie jelita cienkiego, w wyniku czego utracono zdolność do wchłaniania lipidów, lub w przypadku wcześniej niefenotypowanych modeli genetycznych, sugeruje to, że mysz posiada fizjologicznie istotny defekt wchłaniania lipidów.

Schemat osi czasu zabiegu chirurgicznego u myszy; bolus składników odżywczych, pobieranie chłonki, proces podawania glukozy/soli fizjologicznej.
Rysunek 1: Proponowany harmonogram dla modelu mysiego z przetoką chylną. T-4, T-3, T-2: Podwójna kaniulacja trwa około 2-4 h, po czym myszy są umieszczane w komorach rekonwalescencyjnych. T-1: Po przejściu myszy w okres rekonwalescencji, otrzymują one ciągłą infuzję dwunastniczą 5% glukozy i 0,9% soli fizjologicznej. T0: Ciągła infuzja wewnątrzdwunastnicza zostaje zmieniona z 5% glukozy i 0,9% soli fizjologicznej na infuzję eksperymentalnych składników odżywczych. T0-T6: Myszy otrzymują ciągłe wewnątrzdwunastnicze podawanie 5% glukozy w soli fizjologicznej lub alternatywnie ciągłe podawanie składników odżywczych. Chłonka jest pobierana co godzinę w tym okresie. Punkt końcowy: Myszy są uśmiercane, a następnie można pobrać tkanki. Rysunek został stworzony za pomocą BioRender.com. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wykresy poziomu triglicerydów i szybkości przepływu limfy krezkowej; infuzja lipidów u myszy typu dzikiego w czasie.
Rysunek 2: Stężenie triglicerydów i szybkość przepływu limfy krezkowej. Myszy typu dzikiego wyposażono w zgłębnik do żywienia wewnątrzdwunastniczego oraz kaniulę do limfy krezkowej. Myszy otrzymały bolus 300 µL lipidów. Limfę zbierano przez 6 h w godzinnych aliquotach i przechowywano w lodzie. (A) Zawartość triglicerydów w limfie określono za pomocą testu chemicznego w każdej godzinnej aliquocie limfy. (B) W ciągu 6 h po infuzji bolusa przepływ limfy przedstawiono jako gramy wydzielonej limfy na godzinę. Punkty oznaczają średnie ± SEM. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Metody dostarczania lipidówZalecenia/Instrukcje
Bolus mieszanej emulsji lipidowejDawka 0,3 ml jednego z dwóch środków (A) Liposyn III 20% emulsja tłuszczowa dożylna lub (B) Można zastosować sterylną emulsję lipidową do wstrzykiwań SMOFlipid 20%, USP, podawaną przez rurkę do infuzji wewnątrzdwunastniczej. Lipidy emulgowane są użyteczne, ponieważ nie wymagają wcześniejszego przygotowania, pozostają w formie płynnej w temperaturze pokojowej, są sterylne oraz zawierają „łatwo przyswajalną” mieszaninę wolnych kwasów tłuszczowych, triglicerydów, fosfolipidów i taurocholanu sodu. Jest to odpowiednia infuzja początkowa dla myszy, u których mogą występować niewydolności trzustki lub dróg żółciowych.
Bolus trójglicerydów0,3 ml delikatnie podgrzanej oliwy z oliwek (lub oczyszczonej trioleiny) jako neutralnego lipidu odzwierciedlającego dietę bogatą w nienasycone kwasy tłuszczowe, smalcu (odzwierciedlającego dietę o wysokiej zawartości nasyconych kwasów tłuszczowych) lub oleju kokosowego (odzwierciedlającego dietę o wysokiej zawartości średniołańcuchowych trójglicerydów) można podać za pomocą rurki do infuzji wewnątrzdwunastniczej lub poprzez zgłębnik doustny. Jeśli badany trójgliceryd jest nasycony, należy go podgrzać, aby był płynny w temperaturze pokojowej. 
Bolus mieszanego posiłku0,3 ml preparatu Ensure o składzie zawierającym 0,075 g tłuszczu (21,6%), 0,5 g węglowodanów (64,0%) i 0,1125 g białka (14,4%), który odzwierciedla niskotłuszczowy mieszany posiłek, może być podany za pomocą infuzji wewnątrzdwunastniczej.
Bolus lipidów znakowanych promieniotwórczo5.0 µCi 3trioleinian glicerolu znakowany H i/lub 1.0 µCi 14C-cholesterol w ilości 0,3 ml oliwy z oliwek można podać za pomocą infuzji wewnątrzdwunastniczej. 14C-cholesterol: Cholesterol-[4-14C] o aktywności właściwej 55 Ci/mmol i stężeniu 0,1 mCi/ml. 3H-TG Trioleina [9,10-3H(N)] (3H-TG) o aktywności właściwej 60 Ci/mmol i stężeniu 1 mCi/ml
Dawka ciągłaWlew dowolnej z powyższych eksperymentalnych formulacji składników odżywczych z prędkością 0,3 ml/h (zamiast jednorazowego bolusa o objętości 0,3 ml) spowoduje stałe wydzielanie triglicerydów do limfy. Różni się to od wlewu bolusowego, w którym stężenie triglicerydów w limfie osiąga szczyt po około 2–3 h, a następnie powraca do wartości bazowych po około 6–8 h.

Tabela 1: Tabela infuzji lipidów.

Dyskusja

Oryginalna procedura 2-dniowej przetoki limfatycznej została opisana przez Bollmana i wsp.25 i praktykowana przez laboratorium Patricka Tso przez ostatnie 45 lat26,27. Przedstawiony tutaj protokół jest potężnym dodatkiem do tej klasycznej, złotej metody identyfikacji, kwantyfikacji i zrozumienia unikalnej wydzieliny jelita cienkiego, a także dynamiki in vivo wchłaniania i metabolizmu składników odżywczych w diecie, hormonów jelitowych i odporności jelitowej.

Zalety tego modelu obejmują (1) możliwość ciągłego pobierania próbek limfy krezkowej przez cały okres karmienia i poposiłkowy, a nie statyczne pobieranie próbek w jednym punkcie czasowym podczas wchłaniania, trawienia lub wydzielania; (2) pomiar hormonów jelitowych i cytokin bezpośrednio w ich fizjologicznym kompartmencie, a nie we krwi, gdzie są one rozcieńczane i rozkładane enzymatycznie17,44; (3) zdolność do izolacji, oceny ilościowej i charakterystyki lipoprotein wydzielanych przez jelito cienkie po spożyciu posiłku lipidowego oraz brak lipaz śródbłonkowych w limfie krezkowej, która zachowuje stężenia triglicerydów chylomikronu i natywną strukturę chylomikronu 46,47; (4) Możliwość bezpośredniego pomiaru natężenia przepływu limfy, produkcji trójglicerydów i cholesterolu (lub innych związków z dwunastnicą), składu chylomikronu i stężeń hormonów jelitowych. Wreszcie, protokół ten pozwala na pobieranie stosunkowo dużych ilości >50 μl limfy co godzinę przez okres 6 godzin. Ponieważ płyn jest uzupełniany solą fizjologiczną do dwunastnicy i wlewem glukozy, model przetoki limfatycznej jest znacznie lepszy w porównaniu z innymi technikami pobierania limfy i skutkuje płynnymi, a nie statycznymi pulami limfy krezkowej. Ponieważ objętość jest główną przeszkodą dla podejść lipidomicznych, proteomicznych i metabolomicznych, jest to główna zaleta.

Opisany tutaj protokół 1-dniowej przetoki limfatycznej myszy ma kilka zalet w porównaniu z oryginalnym protokołem przetoki limfatycznej, w tym zmniejszenie całkowitej liczby zwierząt doświadczalnych w porównaniu z wcześniej opisanymi protokołami 2-dniowych przetok limfatycznych26,27 ze względu na wyższy wskaźnik przeżycia po operacji; skrócenie całkowitego czasu trwania eksperymentu z 2 dni do jednego dnia; I wreszcie, skrócenie okresu rekonwalescencji u myszy z nocy (>18 godzin), gdzie może wystąpić ból przebijający lub słabe wyniki pooperacyjne, do łatwiejszego do opanowania ~6 godzin okresu po operacji.

Cechą tego 1-dniowego protokołu jest skupienie się na względach humanitarnych i punktach końcowych. Muszą one mieć najwyższy priorytet: (1) zwierzęta muszą otrzymywać płyny dodwunastnicze lub dożylne płyny zastępcze; (2) muszą być utrzymywane w cieple i możliwie jak najmniej bolesne (pooperacyjnym lekiem Buprenex i/lub karprofenem, w zależności od projektu doświadczenia i potrzeby uniknięcia działania przeciwzapalnego); (3) Krwawienie, drżenie, biegunka lub oznaki niepokoju są istotnymi powodami dla humanitarnego punktu końcowego. Zgodnie ze ścisłymi wytycznymi IACUC, dobrym punktem końcowym jest izofluran, po którym następuje zwichnięcie szyjki macicy. Wskaźniki przeżycia chirurgicznego wynoszą ~70% w ciągu jednego dnia (w porównaniu do ~40% w przypadku oryginalnej operacji 2-dniowej), ale badacze nie powinni wahać się zakończyć eksperymentu przy oznakach niepokoju. Należy to wziąć pod uwagę przy planowaniu liczby zwierząt.

Jeśli chodzi o rozwiązywanie problemów z tą techniką, pomyślne umieszczenie kaniuli limfatycznej jest głównym wąskim gardłem w tej procedurze chirurgicznej. Podczas ćwiczenia zabiegu pomaga nabrać myszy 0,3 ml oliwy z oliwek na około 2 godziny przed zabiegiem. Spowoduje to wydzielanie chylomikronów do krezkowego przewodu chłonnego, dzięki czemu będzie on wyglądał na "mleczny" i bardziej widoczny. Można również stosować błękit metylenowy, ale często jest on mniej widoczny niż mleczny przewód limfatyczny. Jeśli po umieszczeniu kaniuli limfatycznej i umieszczeniu jej za pomocą kleju limfa krezkowa pomyślnie przepływa przez kaniulę do naczynia zbiorczego, można przystąpić do zakładania rurki do infuzji dwunastnicy. Czasami limfa może nie płynąć w sposób ciągły, ale może zacząć ponownie płynąć, gdy zwierzę zostanie umieszczone na stole obrotowym. Krytycznie należy uważać na skrzepy w rurkach limfatycznych. Należy je wymasować z rurek, aby zapobiec ciśnieniu zwrotnemu na przewód limfatyczny.

Oprócz wydzielania trójglicerydów i szybkości przepływu limfy, technikę tę można wykorzystać do określenia następującej kinetyki wchłaniania lipidów i charakterystyki chylomikronu:

Wydzielanie Chylomicron 45,48,49
Bezpośrednio po posiłku zawierającym tłuszcz następuje przejściowy wzrost krążących trójglicerydów w osoczu. Ponieważ trójglicerydy są z natury hydrofobowe, muszą najpierw zostać zemulgowane, aby były rozpuszczalne we krwi50. Enterocyty jelita cienkiego pełnią tę rolę i pakują dietetyczne trójglicerydy w cząstki emulsji chylomicron51. Chylomikrony zawierają cholesterol i trójglicerydy dietetyczne w swoim rdzeniu, otoczone fosfolipidami i apolipoproteinami, w tym apoB-48, apoA-I, apoA-IV i apoC-III 52,53,54,55. ApoB-48 jest niezbędnym białkiem strukturalnym, a inne apolipoproteiny pełnią różne funkcje wymagane do metabolizmu chylomikronu i klirensu z krwi. Aby określić kluczowe cechy chylomikronów, w tym zawartość trójglicerydów i apolipoprotein, należy zastosować przedstawioną tutaj technikę 1-dniowej przetoki limfatycznej. Szybkość wydzielania chylomikronu to procent3-triglicerydów H, które są wydzielane do limfy i mierzone przez scyntylację przez liczenie próbek limfy co godzinę. Można to połączyć ze szczegółową charakterystyką chylomikronu 48,49,56,57,58. Godzinowe próbki limfy mogą być łączone lub przechowywane oddzielnie. Limfę przenosi się do probówek ultrawirówek, miesza z 0,9% NaCl, a następnie ostrożnie nakłada 300-500 μl 0,87% NaCl. Próbki są następnie ultraodwirowywane w temperaturze 110 000 x g w temperaturze 4 °C przez 16 godzin. Górne frakcje zawierające wyizolowane chylomikrony są zbierane i badane pod kątem stężeń triglicerydów przy użyciu zestawu do oznaczania triglicerydów. Krótko mówiąc, 2 μl chylomikronu (rozcieńczenie 1:10) inkubuje się z 200 μl odczynnika enzymatycznego w temperaturze pokojowej przez 10 minut na 96-dołkowej płytce. Płytka jest odczytywana przez czytnik płytek przy długości fali 500 nm, a wzorce i ślepe próby służą do obliczania stężeń triglicerydów. Wielkość Chylomicron można następnie określić za pomocą barwienia ujemnego i transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM)14,29. Trójglicerydy i cholesterol można określić ilościowo za pomocą testu chemicznego i zawartości apolipoprotein (apoB-48, A-I, C-II, C-III) za pomocą zestawów ELISA lub Western blot.

Oznaczanie pierwotnego miejsca wchłaniania lipidów 48,59
Izolując przedziały komórek światła i nabłonka dwunastnicy, jelita czczego i jelita krętego po 6 godzinach od infuzji 3H-triglicerydów lub znakowanej radioizotopowo mieszanej mączki, zawartość jest ekstrahowana metodą Folch w celu określenia, ile 3H-triglicerydów jest wchłanianych przez błonę komórkową nabłonka (normalne) lub zatrzymywane w świetle (nieprawidłowe) na całej długości jelita cienkiego48. Badania te są szczególnie istotne, jeśli istnieją potencjalne różnice w ruchliwości przewodu pokarmowego 60,61,62, jeśli istnieje hipoteza dotycząca kwasów żółciowych (wysoce aktywnych podczas wchłaniania lipidów i ponownie wchłanianych w jelicie krętym)63,64,65,66 lub jeśli istnieje obawa, że składniki odżywcze są wchłaniane w niewłaściwym miejscu anatomicznym (jelito kręte lub nawet okrężnica)67,68,69,70.

Identyfikacja mechanizmów transportu 3H-triglicerydów do absorpcyjnych komórek nabłonka48
Odbywa się to poprzez obliczenie procentu 3-triglicerydów H-hydrolizowanych do 3wolnych kwasów tłuszczowych H w świetle jelita, wchłanianych do błony śluzowej i ponownie estryfikowanych do wewnątrzkomórkowego 3-trójglicerydu 3H przed wydzieleniem jako chylomikrony. Jest to silny marker defektów wchłaniania/wydzielania, ponieważ można go prześledzić, aby pokazać ruch dietetycznych trójglicerydów do produktów ich rozpadu, a następnie pakowanie w chylomikrony. Ekspresję mRNA maszynerii absorpcji kwasów tłuszczowych (CD36, FABP, ACSL), szlaku reestryfikacji (MGAT, DGAT, MTTP, apoB) i apolipoprotein (apoC-III, B-48, C-II, A-I, A-IV) można dalej oznaczać ilościowo za pomocą RT-PCR.

Przyszłe zastosowania tej techniki są ograniczone jedynie zainteresowaniem przesłuchami między jelitami a narządami, metabolizmem, odpornością, wchłanianiem składników odżywczych, zanieczyszczeniami środowiskowymi w diecie lub jakąkolwiek inną chorobą odgrywającą rolę w układzie pokarmowym. Jest prawdopodobne, że wiele przekonujących eksperymentów i hipotez zostało wstrzymanych z powodu trudności w dostępie do krytycznego układu limfatycznego krezki, a celem tego wizualizowanego protokołu jest ułatwienie dostępu do tej techniki. Wyizolowanie chylomikronów i limfy krezkowej, w której początkowo się znajdują, jest kluczowym elementem zrozumienia metabolizmu całego organizmu; 1-dniowy model przetoki limfatycznej myszy jest potężnym modelem fizjologicznym do badania tych zdarzeń.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Jesteśmy niezmiernie wdzięczni Fundacji Mukowiscydozy (Nagroda za Pilotaż i Wykonalność 1810, dla ABK), Fundacji Rainin (Nagroda Synergii, dla PI GJ Randolpha i Co-I ABK) oraz National Institutes of Health (R01DK118239, R03DK116011 dla ABK) za wsparcie tych badań.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,9% chlorek sodu do wstrzykiwań, USP  sterylnyHospira, Lake Forest, IL, USNDC 0409-4888-06
1,7 ml probówki EppendorfFisher Scientific, Waltham, MA, US7200184
14C-cholesterol: Cholesterol-[4-14C] (0,1mCi/ mL)American Radiolabeled Chemicals Inc., St. Louis, MO, USARC 0857
Igła18 GBecton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA305199
2 kleszcze do mikropreparacji DumontFine Science Tools, Foster City, CA, US11251-35
2 KleszczeROBOZ Surgical Instrument Co., Gaithersburg, MD, USRS-5130
3H-TAG:  Trioleina [9,10-3H(N)] (3H-TG) (1mCi/ mL)American Radiolabeled Chemicals Inc., St. Louis, MO, USART0199
3H-TG Trioleina [9,10-3H(N)] (3H-TG)American Radiolabeled Chemicals, INC. St. LouisMO 63146
50% Dextrode Injection, USP 25gram/50 mL  sterylneHospira, Lake Forest, IL, USNDC-0409-6648-16
Analtech TLC Uniplates: matryca z żelu krzemionkowego Z265500-1PAKFisher Scientific, Waltham, MA, US11-101-0007
Swasztag BD CareFusion ChloraPrepFisher Scientific, Waltham, MA, US14-910-501
Peeling chirurgiczny BetadineDynarex Corp., Orangeburg, NY, US1201
KaniulaskośnaBraintree Naukowe.,  Braintree , MA, USMRE025
Buprenorfina HCl do wstrzykiwań Carpuject PFS 0,3 mg / ml 10 / Bx (Buprenex)HenrySchein, Warrendale, PA, USA1278184
C57BL6 / J samce myszyJackson Laboratory, Bar Harbor, Maine
ChloraPrepBecton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, US260100
Zestaw do oznaczania cholesteroluFujiFilm Healthcare, Lexington, MA, Stany Zjednoczone
Cholesterol-[4-14C]American Radiolabeled Chemicals, INC. St. LouisMO 63146
Przezroczyste pudełko z pleksi dł. 43 cm x szer. 26 x wys. 21 z poduszką grzewczą o kontrolowanej temperaturze i nawilżaniemnasz własny projekt i modyfikacje
dostępne na rynku  Poduszka grzewcza dla/ShenZhen XingHongChang Electric CO., LTD. ShenZhen, ChinyXHC-F035D
Aplikatory z bawełnianą końcówkąFisher Scientific, Waltham, MA, US22363156
Rurka do infuzji dwunastnicy - canualaBraintree Scientific, Braintree , MA, USMRE037
EnsureAbbott Nutrition, Columbus, OH
Platforma chirurgiczna z pompą cyrkulacyjną ciepłej wodyPatterson Scientific, Waukesha, WI, USGaymar T/ Pompa Klasyczny
wstrzykiwanie hetaryny sodu, USP 1,000 jednostek/ml sterylnyMylan, Morgantown, WV, USNDC-67457-384-31
Image J SoftwareNational Institute of Health, Bethesda, Maryland,
Nożyczki do tęczówkiROBOZ Surgical Instrument Co., Gaithersburg, MD, USRS-5602
IsofluranePiramal Pharma Solutions, Riverview, MI, USNDC 66794-017-25
Aparat do indukcji izofluranu i aparat anestezjologicznyPatterson Scientific, Waukesha, WI, amerykańskakomora
Klej KrazyProdukty firmy Elmer's Inc., Columbus, OH, USAKG484
Liposyn III 20% lipidów do wstrzykiwańHospira Inc. Lake Forest, Illinois, USA
LS 6500 Wielofunkcyjny licznik scyntylacyjnyBeckman Coulter, Brea, CA
Nożyczki sprężynowe do mikropreparacjiROBOZ Surgical Instrument Co., Gaithersburg, MD, USRS-5602
Mysz apoB ELISA KitABCAM Inc., Waltham, MA, USab230932-1
Uchwyt igłyFine Science Tools, Foster City, CA, US12002-12
RetraktoryKent Scientific Co., Torrington, CT, USSURGI-5001
Rimadyl (Carprofen)Zoetis Inc., Kalamazoo MI, US4019449
Stół obrotowy Barnstead ThermolyneLabquake, Zü bogaty, SzwajcariaBarnstead Thermolyne
SMOFlipid 20% lipidowa emulsja do wstrzykiwań, USPFresenius Kabi, Warrendale, PA, USNDC-63323-820-01
SnuggleLomir Biomedical Inc., Notre-Dame-de-l'Î le-Perrot, QC J7V 7M4, KanadaMS 02.5PM
Nożyczki chirurgiczneROBOZ Surgical Instrument Co., Gaithersburg, MD, USRS-5912SC
Szew (jedwab 5-0 z igłą)DemeTECH, Miami Lakes, FL, USDT-719
Transmisyjny mikroskop elektronowy (JEOL 1400-FLASH 120KV)JEOL, Peabody, MA
Zestaw do oznaczania trójglicerydówRandox Laboratories, Crumlin, Wielka BrytaniaTR210
ULTIMA GOLD XR Płyn scyntylacyjnyPerkin Elmer, Hebron, KY, USA6013119
Ultrawirówka, wirnik S100AT4-497SORVALL RC M120 GX
99902601indukcyjna dla myszy

Bibliografia

  1. Natale, G., Bocci, G., Ribatti, D. Scholars and Scientists in the History of the Lymphatic System. Journal of Anatomy. 231 (3), 417-429 (2017).
  2. Loukas, M., et al. The lymphatic system: A historical perspective. Clinical Anatomy. 24 (7), 807-816 (2011).
  3. Suy, R., Thomis, S., Fourneau, I. The discovery of the lymphatic system in the seventeenth century. Part II: The discovery of Chyle vessels. Acta Chirurgica Belgica. 116 (5), 325-331 (2016).
  4. Azzali, G. Historical notes on the lymphatic vascular system. Acta Bio-medica de L'Ateneo Parmense. 61 (3-4), 113-125 (1990).
  5. Irschick, R., Siemon, C., Brenner, E. The history of anatomical research of lymphatics - From the ancient times to the end of the European Renaissance. Annals of Anatomy. 223, 49-69 (2019).
  6. Swartz, M. A. The physiology of the lymphatic system. Advanced Drug Delivery Reviews. 50 (1-2), 3-20 (2001).
  7. Deitch, E. A. Gut lymph and lymphatics: A source of factors leading to organ injury and dysfunction. Annals of the New York Academy of Sciences. 1207, 103-111 (2010).
  8. Tso, P., Gollamudi, S. R. Pluronic L-81: A potent inhibitor of the transport of intestinal chylomicrons. American Journal of Physiology. 247, 32-36 (1984).
  9. Tso, P., Karlstad, M. D., Bistrian, B. R., DeMichele, S. J. Intestinal digestion, absorption, and transport of structured triglycerides and cholesterol in rats. American Journal of Physiology. 268, 568-577 (1995).
  10. Mansbach, C. M., Dowell, R. F., Pritchett, D. Portal transport of absorbed lipids in rats. American Journal of Physiology. 261, 530-538 (1991).
  11. Bogunovic, M., et al. Origin of the lamina propria dendritic cell network. Immunity. 31 (3), 513-525 (2009).
  12. Balmer, M. L., et al. The liver may act as a firewall mediating mutualism between the host and its gut commensal microbiota. Science Translational Medicine. 6 (237), (2014).
  13. Ji, Y., Sakata, Y., Tso, P. Nutrient-induced inflammation in the intestine. Current Opinion in Clinical Nutrition & Metabolic Care. 14 (4), 315-321 (2011).
  14. Ji, Y., Sakata, Y., Yang, Q., Tso, P. Intestinal mucosal mast cells is activated by fat absorption. Gastroenterology. 140 (5), (2011).
  15. Wang, F., et al. Chronic high-fat feeding increases mixed meal-induced incretin secretion in Sprague-Dawley rats. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 309 (10), 807-815 (2015).
  16. Kindel, T. L., Yoder, S. M., D'Alessio, D. A., Tso, P. The effect of duodenal-jejunal bypass on glucose-dependent insulinotropic polypeptide secretion in Wistar rats. Obesity Surgery. 20 (6), 768-775 (2010).
  17. Kohan, A. B., Yoder, S. M., Tso, P. Using the lymphatics to study nutrient absorption and the secretion of gastrointestinal hormones. Physiology & Behavior. 105 (1), 82-88 (2011).
  18. Yoder, S. M., Yang, Q., Kindel, T. L., Tso, P. Stimulation of incretin secretion by dietary lipid: Is it dose dependent. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 297 (2), 299-305 (2009).
  19. Wang, Y., et al. Chylomicrons promote intestinal absorption and systemic dissemination of dietary antigen (ovalbumin) in mice. PLoS One. 4 (12), 8442(2009).
  20. Vors, C., et al. Postprandial endotoxemia linked with chylomicrons and lipopolysaccharides handling in obese versus lean men: A lipid dose-effect trial. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 100 (9), 3427-3435 (2015).
  21. Ghoshal, S., Witta, J., Zhong, J., de Villiers, W., Eckhardt, E. Chylomicrons promote intestinal absorption of lipopolysaccharides. Journal of Lipid Research. 50 (1), 90-97 (2009).
  22. Jandacek, R. J., Rider, T., Keller, E. R., Tso, P. The effect of olestra on the absorption, excretion and storage of 2,2',5,5' tetrachlorobiphenyl; 3,3',4,4' tetrachlorobiphenyl; and perfluorooctanoic acid. Environment International. 36 (8), 880-883 (2010).
  23. Jandacek, R. J., Tso, P. Organochlorine compounds are absorbed via lymph and portal circulation. The FASEB Journal. 22, (2008).
  24. Utermann, G., Beisiegel, U. Apolipoprotein A-IV: A protein occurring in human mesenteric lymph chylomicrons and free in plasma. Isolation and quantification. European Journal of Biochemistry. 99 (2), 333-344 (1979).
  25. Bollman, J. L., Cain, J. C., Grindlay, J. H. Techniques for the collection of lymph from the liver, small intestine, or thoracic duct of the rat. Journal of Laboratory and Clinical Medicine. 33 (10), 1349-1352 (1948).
  26. Tso, P., Balint, J. A., Rodgers, J. B. Effect of hydrophobic surfactant (pluronic L-81) on lymphatic lipid transport in the rat. American Journal of Physiology. 239 (5), 348-353 (1980).
  27. Liu, M., et al. Sexual dimorphism in intestinal absorption and lymphatic transport of dietary lipids. Journal of Physiology. 599 (22), 5015-5030 (2021).
  28. Manolas, K. J., et al. Lymph, pancreatic and gastrointestinal hormones in response to feeding in the conscious pig. European Surgical Research. 17 (5), 324-332 (1985).
  29. Lascelles, A. K., Morris, B. Surgical techniques for the collection of lymph from unanaesthetized sheep. Quarterly Journal of Experimental Physiology and Cognate Medical Sciences. 46, 199-205 (1961).
  30. Jensen, L. T., Olesen, H. P., Risteli, J., Lorenzen, I. External thoracic duct-venous shunt in conscious pigs for long term studies of connective tissue metabolites in lymph. Laboratory Animal Science. 40 (6), 620-624 (1990).
  31. Edwards, G. A., Porter, C. J., Caliph, S. M., Khoo, S. M., Charman, W. N. Animal models for the study of intestinal lymphatic drug transport. Advanced Drug Delivery Reviews. 50 (1-2), 45-60 (2001).
  32. Yasunaga, K., Saito, S., Zhang, Y. -L., Hernandez-Ono, A., Ginsberg, H. N. Effects of triacylglycerol and diacylglycerol oils on blood clearance, tissue uptake, and hepatic apolipoprotein B secretion in mice. Journal of Lipid Research. 48 (5), 1108-1121 (2007).
  33. Curtin, A., et al. Elevated triglyceride-rich lipoproteins in diabetes. A study of apolipoprotein B-48. Acta Diabetologica. 33 (3), 205-210 (1996).
  34. Gordts, P. L. S. M., et al. ApoC-III inhibits clearance of triglyceride-rich lipoproteins through LDL family receptors. Journal of Clinical Investigation. 126 (8), 2855-2866 (2016).
  35. Ginsberg, H. N., et al. Apolipoprotein B metabolism in subjects with deficiency of apolipoproteins CIII and AI. Evidence that apolipoprotein CIII inhibits catabolism of triglyceride-rich lipoproteins by lipoprotein lipase in vivo. The Journal of Clinical Investigation. 78 (5), 1287-1295 (1986).
  36. Ormai, S., Palkovits, M. Size distribution of lymphocytes in the thoracic duct lymph in rat after lymphocyte mobilization induced by polymethacrylic acid. Blut Zeitschrift für die Gesamte Blutforschung. 24 (3), 161-165 (1972).
  37. Luchoomun, J., Hussain, M. M. Assembly and secretion of chylomicrons by differentiated Caco-2 cells. Nascent triglycerides and preformed phospholipids are preferentially used for lipoprotein assembly. Journal of Biological Chemistry. 274 (28), 19565-19572 (1999).
  38. Nollevaux, G., et al. Development of a serum-free co-culture of human intestinal epithelium cell-lines (Caco-2/HT29-5M21). BMC Cell Biology. 7 (1), 20(2006).
  39. Li, D., Dong, H., Kohan, A. B. The Isolation, Culture, and Propagation of Murine Intestinal Enteroids for the Study of Dietary Lipid Metabolism. Organoids. Methods in Molecular Biology. 1576, Humana. New York, NY. 195-204 (2019).
  40. Jattan, J. J., et al. Using murine-derived primary intestinal enteroids for studies of dietary triglyceride absorption and lipoprotein synthesis, and to determine the role of intestine-specific ApoC-III in the intestine. Journal of Lipid Research. 58 (5), 853-865 (2017).
  41. Haring, E., et al. Bile acids regulate intestinal antigen presentation and reduce graft-versus-host disease without impairing the graft-versus-leukemia effect. Haematologica. 106 (8), 2131-2146 (2021).
  42. Date, S., Sato, T. Mini-gut organoids: Reconstitution of the stem cell niche. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 31 (1), 269-289 (2015).
  43. Deacon, C. F. Circulation and degradation of GIP and GLP-1. Hormone and Metabolic Research. 36 (11-12), 761-765 (2004).
  44. Dedousis, N., Teng, L., Kanshana, J. S., Kohan, A. B. A single-day mouse mesenteric lymph surgery in mice: an updated approach to study dietary lipid absorption, chylomicron secretion, and lymphocyte dynamics. J Lipid Res. 63 (11), 100284(2022).
  45. Li, D., et al. Intestinal basolateral lipid substrate transport is linked to chylomicron secretion and is regulated by ApoC-III. Journal of Lipid Research. 60 (9), 1503-1515 (2019).
  46. Glatzle, J., et al. Chylomicron components mediate intestinal lipid-induced inhibition of gastric motor function. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 282 (1), 86-91 (2002).
  47. Huang, J., Sloop, C. H., Roheim, P. S., Wong, L. Lipoprotein lipase and hepatic triacylglycerol lipase activities in peripheral and skeletal muscle lymph. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 10 (5), 720-726 (1990).
  48. Wang, F., et al. Overexpression of apolipoprotein C-III decreases secretion of dietary triglyceride into lymph. Physiological Reports. 2 (3), 00247(2014).
  49. Kohan, A. B., et al. Apolipoprotein A-IV regulates chylomicron metabolism-Mechanism and function. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 302 (6), 628-636 (2012).
  50. Hayashi, H., et al. Fat feeding increases size, but not number, of chylomicrons produced by small intestine. American Journal of Physiology. 259 (5), 709-719 (1990).
  51. Tso, P., Balint, J. A. Formation and transport of chylomicrons by enterocytes to the lymphatics. American Journal of Physiology. 250 (6), 715-726 (1986).
  52. Bhattacharya, S., Redgrave, T. G. The content of apolipoprotein B in chylomicron particles. Journal of Lipid Research. 22 (5), 820-828 (1981).
  53. Björkegren, J., Karpe, F., Milne, R. W., Hamsten, A. Differences in apolipoprotein and lipid composition between human chylomicron remnants and very low density lipoproteins isolated from fasting and postprandial plasma. Journal of Lipid Research. 39 (7), 1412-1420 (1998).
  54. Martins, I. J., Sainsbury, A. J., Mamo, J. C., Redgrave, T. G. Lipid and apolipoprotein B48 transport in mesenteric lymph and the effect of hyperphagia on the clearance of chylomicron-like emulsions in insulin-deficient rats. Diabetologia. 37 (3), 238-246 (1994).
  55. Mar, R., et al. Association of the APOLIPOPROTEIN A1/C3/A4/A5 gene cluster with triglyceride levels and LDL particle size in familial combined hyperlipidemia. Circulation Research. 94 (7), 993-999 (2004).
  56. Kassis, T., et al. Dual-channel in-situ optical imaging system for quantifying lipid uptake and lymphatic pump function. Journal of Biomedical Optics. 17 (8), 086005(2012).
  57. Nauli, A. M., et al. Chylomicrons produced by Caco-2 cells contained ApoB-48 with diameter of 80-200 nm. Physiological Reports. 2 (6), 192-196 (2014).
  58. Drover, V. A., et al. CD36 deficiency impairs intestinal lipid secretion and clearance of chylomicrons from the blood. Journal of Clinical Investigation. 115 (5), 1290-1297 (2005).
  59. Kohan, A. B., et al. Is apolipoprotein A-IV rate limiting in the intestinal transport and absorption of triglyceride. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 304 (12), 1128-1135 (2013).
  60. De Lisle, R. C. Altered transit and bacterial overgrowth in the cystic fibrosis mouse small intestine. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 293 (1), 104-111 (2007).
  61. Debas, H. T., Farooq, O., Grossman, M. I. Inhibition of gastric emptying is a physiological action of cholecystokinin. Gastroenterology. 68 (5), 1211-1217 (1975).
  62. Spiller, R. C., et al. Further characterisation of the 'ileal brake' reflex in man--Effect of ileal infusion of partial digests of fat, protein, and starch on jejunal motility and release of neurotensin, enteroglucagon, and peptide YY. Gut. 29 (8), 1042-1051 (1988).
  63. Battle, M. A., et al. GATA4 is essential for jejunal function in mice. Gastroenterology. 135 (5), 1676-1686 (2008).
  64. Morgan, R. G., Borgström, B. The mechanism of fat absorption in the bile fistula rat. Quarterly Journal of Experimental Physiology and Cognate Medical Sciences. 54 (2), 228-243 (1969).
  65. Davidson, N. O., Kollmer, M. E., Glickman, R. M. Apolipoprotein B synthesis in rat small intestine: Regulation by dietary triglyceride and biliary lipid. Journal of Lipid Research. 27 (1), 30-39 (1986).
  66. Bouchi, R., et al. FOXO1 inhibition yields functional insulin-producing cells in human gut organoid cultures. Nature Communications. 5, 4242(2014).
  67. Bijvelds, M. J. C., et al. Fat absorption in cystic fibrosis mice is impeded by defective lipolysis and post-lipolytic events. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 288 (4), 646-653 (2005).
  68. Struyvenberg, M. R., Martin, C. R., Freedman, S. D. Practical guide to exocrine pancreatic insufficiency - Breaking the myths. BMC Medicine. 15 (1), 29(2017).
  69. Tickell, K. D., Atlas, H. E., Walson, J. L. Environmental enteric dysfunction: A review of potential mechanisms, consequences and management strategies. BMC Medicine. 17 (1), 181(2019).
  70. Lo, C. M., et al. Cholecystokinin knockout mice are resistant to high-fat diet-induced obesity. Gastroenterology. 138 (5), 1997-2005 (2010).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Izolacja ch onki krezkowejprzetoka ch onnalipoproteiny jelitoweinfuzja wewn trzdwunastniczametabolizm poposi kowykaniulacja naczy ch onnychpomiar trygliceryd wkomunikacja mi dzy jelitami a organami

Powiązane artykuły