Dwuwarstwowy system lipidowy oparty na nanobarach do badania białek wykrywających krzywiznę błony in vitro

Podsumowanie

Tutaj opracowano dwuwarstwowy system lipidowy oparty na nanobarach, aby zapewnić syntetyczną membranę o określonej krzywiźnie, która umożliwia charakteryzację białek z możliwością wykrywania krzywizny in vitro.

Streszczenie

Krzywizna błony odgrywa ważną rolę w różnych istotnych procesach komórek, takich jak migracja komórek, podział komórek i transport pęcherzyków. Jest nie tylko biernie generowany przez aktywność komórkową, ale także aktywnie reguluje interakcje białkowe i bierze udział w wielu sygnalizacjach wewnątrzkomórkowych. W związku z tym bardzo cenne jest zbadanie roli krzywizny błony w regulacji dystrybucji i dynamiki białek i lipidów. Ostatnio opracowano wiele technik badania związku między zakrzywioną błoną a białkiem in vitro. W porównaniu z tradycyjnymi technikami, nowo opracowana dwuwarstwa lipidowa (SLB) oparta na nanoprętach oferuje zarówno wysoką przepustowość, jak i lepszą dokładność w generowaniu krzywizny błony poprzez tworzenie ciągłej dwuwarstwy lipidowej na wzorzystych układach nanoprętów z predefiniowaną krzywizną membrany i lokalną płaską kontrolą. Zarówno płynność lipidów, jak i wrażliwość białek na zakrzywione błony można scharakteryzować ilościowo za pomocą obrazowania za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. W tym miejscu przedstawiono szczegółową procedurę tworzenia SLB na wytworzonych powierzchniach szklanych zawierających matryce nanoprętów oraz charakterystykę białek wrażliwych na krzywiznę na takich SLB. Ponadto omówiono protokoły ponownego wykorzystania nanochipów i przetwarzania obrazu. Poza nanobar-SLB, protokół ten można łatwo zastosować do wszystkich typów nanostrukturalnych chipów szklanych do badań wykrywania krzywizny.

Wprowadzenie

Krzywizna błony to krytyczny parametr fizyczny komórki, który występuje w różnych procesach komórkowych, takich jak morfogeneza, podział komórki i migracja komórek¹. Obecnie powszechnie uznaje się, że krzywizna błony wykracza poza prosty wynik zdarzeń komórkowych; Zamiast tego okazał się skutecznym regulatorem interakcji białkowych i sygnalizacji wewnątrzkomórkowej. Na przykład stwierdzono, że kilka białek zaangażowanych w endocytozę za pośrednictwem klatryny preferencyjnie wiąże się z zakrzywioną błoną, co powoduje powstanie gorącego miejsca dla endocytozy². Istnieje wiele różnych przyczyn deformacji błony, takich jak ciągnięcie błony przez siły cytoszkieletu, obecność asymetrii lipidów z grupami głowy o różnych rozmiarach, istnienie białek transbłonowych o stożkowym kształcie, akumulacja białek kształtujących błonę, takich jak białka domeny BAR (nazwane tak od białek Bin, amfifizyny i Rvs) oraz wprowadzenie domeny helis amfipatycznych do błony¹. Co ciekawe, te białka i lipidy nie tylko deformują błonę, ale mogą również wyczuwać krzywiznę błony i wykazywać preferencyjną akumulację¹. Dlatego tak ważne jest zbadanie, czy i w jaki sposób błony o różnych krzywiznach zmieniają rozmieszczenie i dynamikę przyłączonych do nich białek i lipidów oraz potencjalny wpływ na powiązane procesy wewnątrzkomórkowe.

Opracowano wiele technik do analizy interakcji między zakrzywioną błoną a białkami zarówno w żywych komórkach, jak i w systemach in vitro. Żywy system komórkowy zapewnia rzeczywiste środowisko komórkowe z bogatą różnorodnością lipidów i dynamiczną regulacją sygnalizacji białek^2,3,4,5,6,7. Jednak tak wyrafinowany system jest trudny do zbadania ze względu na niepewność i wahania w środowisku wewnątrzkomórkowym. W związku z tym testy in vitro z wykorzystaniem sztucznej membrany złożonej ze znanych gatunków lipidów i oczyszczonych białek stały się potężnymi systemami rekonstytucji w celu scharakteryzowania relacji między białkami a zakrzywionymi błonami. Tradycyjnie, liposomy o różnych średnicach są generowane przez wytłaczanie w celu wykrycia białek wrażliwych na krzywiznę za pomocą testu kosedymentacji przy użyciu siły odśrodkowej lub testu koflotacji z gradientem gęstości, aby uniknąć agregacji białek^8,9. Jednak krzywizna wytłaczanych liposomów jest ograniczona przez dostępną wielkość porów filtra membranowego stosowanego w ekstruderze ¹⁰. Udowodniono, że test krzywizny pojedynczego liposomu (SLiC) przezwycięża to ograniczenie, w którym liposomy o różnych średnicach są znakowane fluorescencyjnie i unieruchamiane na powierzchni, dzięki czemu krzywiznę można oznaczyć za pomocą intensywności fluorescencji¹¹. Jednak w małych pęcherzykach zaobserwowano dużą zmienność składu lipidowego, co wpływa na dokładność pomiaru krzywizny¹². Eksperymenty z ciągnięciem uwięzi zapewniają dokładniejszy pomiar krzywizny przejściowej linki wyciągniętej z gigantycznych pęcherzyków jednowarstwowych (GUV) za pomocą pęsety optycznej, gdzie krzywizna może być dobrze kontrolowana przez generowane napięcie membrany^13,14. Metoda ta jest odpowiednia do badania białek o dodatniej lub ujemnej krzywiźnie, ale jest ograniczona przepustowością generacji lamp¹⁰. Test z rurkami membranowymi (SMrT) umożliwia jednoczesne generowanie wielu rurek membranowych, które są wytłaczane z tego samego zbiornika lipidów za pomocą przepływów mikroprzepływowych. Niemniej jednak krzywizna membrany zmienia się wewnętrznie wzdłuż nanorurki, co pogarsza dokładność pomiaru krzywizny na podstawie intensywności fluorescencji^15,16. Dla porównania, użycie małych pęcherzyków jednowarstwowych (SUV, średnica <100 nm¹⁷) do utworzenia podpartej dwuwarstwy lipidowej (SLB) na powierzchniach zawierających zaprojektowane topografie wygenerowało pojedynczą dwuwarstwową membranę o krzywiznach wstępnie określonych przez nanofabrykację lub nanomateriały z dużą dokładnością^18,19,20.

Tutaj prezentujemy protokół tworzenia SLB na spreparowanych powierzchniach nanochipów z układami nanobarów i jak można go użyć do badania wrażliwości białek in vitro na krzywiznę. Jak pokazano na Rysunek 1, istnieje sześć podstawowych elementów testu: A) Czyszczenie i montaż chipa z komorą mikroprzepływową; B) Przygotowanie SUV-ów o określonym składzie lipidowym; C) Tworzenie SLB na nanochipie i wiązanie się z białkami wrażliwymi na krzywiznę; D) Obrazowanie i charakterystyka białek wrażliwych na SLB i krzywiznę w mikroskopii fluorescencyjnej; E) Czyszczenie chipa do ponownego użycia; F) Przetwarzanie obrazu w celu ilościowej analizy zdolności wykrywania krzywizny białka. Szczegółowy protokół został opisany krok po kroku poniżej.

Protokół

1. Czyszczenie nanochipa

1. Umieść nanochip w zlewce o pojemności 10 ml wzorzystą stroną skierowaną do góry.
   UWAGA: Ten kwarcowy nanochip został wytworzony za pomocą litografii wiązką elektronów, jak opisano wcześniej²¹. Geometria i rozmieszczenie nanostruktury na chipie mogą być zaprojektowane na zamówienie. Rozmiary zastosowanych tutaj nanoprętów gradientowych to 2000 nm długości, 600 nm wysokości i 100 do 1000 nm szerokości (zestaw kroków 100 nm).
2. Ostrożnie dodaj 1 ml 98% kwasu siarkowego do zlewki i upewnij się, że kwas całkowicie pokrywa przednią i tylną stronę wióra.
   UWAGA: 98% kwas siarkowy jest wyjątkowo i może powodować szybkie niszczenie tkanek i poważne oparzenia chemiczne w kontakcie ze skórą lub oczami. Używaj go w dygestorium z odpowiednią ochroną.
3. Powoli obracaj zlewkę i dodawaj kropla po kropli 200 μl 30% nadtlenku wodoru, aż cała zlewka stanie się gorąca. Upewnij się, że kwas siarkowy i nadtlenek wodoru są dobrze wymieszane, tworząc roztwór piranii do usuwania cząsteczek organicznych z nanochipa¹⁷. Istnieją alternatywne techniki generowania SLB na czystych powierzchniach hydrofilowych, takie jak światło UV i ekspozycja na ozon, jak opisano wcześniej²³.
   UWAGA: Reakcja jest niezwykle egzotermiczna i może spowodować wrzenie roztworu, więc dodawaj nadtlenek wodoru do kwasu siarkowego kropla po kropli i dalej obracaj.
4. Umieść zlewkę w wtórnym szklanym pojemniku i trzymaj nanochip zanurzony w roztworze piranii przez noc, aby dokładnie oczyścić zanieczyszczenia.
   UWAGA: Umieść zlewkę w dygestorium bez żadnej osłony na wypadek, gdyby reakcja mogła wytworzyć gaz.
5. Wyjąć zlewkę i ostrożnie odpipetować roztwór piranii do pojemnika na odpady kwasowe.
6. Załaduj 5 ml wody dejonizowanej do zlewki w celu rozcieńczenia pozostałego kwasu i wyrzuć go do kwaśnych odpadów. Powtórz ten krok pięć razy i użyj 5 M NaOH do zneutralizowania kwaśnych odpadów.
7. Chwyć chip pęsetą i umyj go ciągłym strumieniem dejonizowanej wody, aby dokładnie usunąć resztki kwasu. Wysuszyć chip suszarką z 99,9% gazowym azotem do tworzenia SLB²².

2. Generowanie małych pęcherzyków jednowarstwowych (SUV)

1. Dodać 100 μl chloroformu do bursztynowej fiolki.
   UWAGA: Chloroform jest bardzo lotną, bezbarwną cieczą i może być toksyczny w przypadku wdychania lub połknięcia. Używaj go w dygestorium z założoną maską i rękawiczkami.
2. Rozpuścić 500 μg mieszaniny lipidów w chloroformie. Skład zastosowanej tutaj mieszaniny lipidów to 89,5% mol fosfatydylocholiny jaj (PC), 10 mol% fosfatydyloseryny mózgu (PS) i 0,5 mol% soli 1,2-dihexadecanoyl-sn-glicero-3-fosfoetanoloaminy Texas Red (Texas Red DHPE).
3. Wysuszyć mieszaninę lipidów w fiolce z 99,9% azotem gazowym, aż chloroform ulatnia się, a mieszanina lipidów wyschnie.
   UWAGA: Ten krok należy wykonać w dygestorium. Unikaj rozprysków płynu podczas suszenia.
4. Umieścić mieszaninę lipidów obecną w bursztynowej fiolce bez pokrywki w eksykatorze próżniowym pokrytym folią aluminiową. Następnie suszyć próżniowo próbkę za pomocą pompy przez 3 godziny, aby całkowicie ulatniać się chloroform.
5. Dodać 250 μl buforu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) do fiolki. Mieszaj roztwór, aż stanie się jednorodny.
   UWAGA: Bufor PBS składa się ze 150 mM NaCl, bez wapnia, magnezu i czerwieni fenolowej; pH jest dostosowane do 7,2 w celu wytworzenia dwuwarstwy lipidowej PC i PS.
6. Sonikować mieszaninę lipidów przez 30 minut z częstotliwością 50 kHz w sonikatorze kąpielowym. Następnie przenieś mieszaninę lipidów do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml i uszczelnij parafilmem.
7. Zamrozić mieszaninę lipidów w ciekłym azocie przez 20 s, a następnie rozmrażać w temperaturze 42 °C przez 2 minuty w łaźni wodnej. Powtórz cykle zamrażania i rozmrażania 30 razy. Następnie mieszanina lipidów wygląda jak klarowna ciecz.
   UWAGA: Ciekły azot ma temperaturę wrzenia około −195.8 °C. Może powodować odmrożenia lub oparzenia kriogeniczne. Używaj go w nieograniczonej przestrzeni z założonymi rękawicami termoizolacyjnymi.
8. Wypłucz dwie szklane, gazoszczelne strzykawki i złącze mini-ekstrudera odpowiednio etanolem, chloroformem i metanolem. Powtórz sekwencję płukania pięć razy, aby wstępnie wyczyścić urządzenie. Pozostaw je w dygestoriach do momentu całkowitego ulotnienia się rozpuszczalnika organicznego.
9. Zmontuj mini-wytłaczarkę i przepuść 500 μl buforu PBS przez złącze, aby wstępnie zwilżyć urządzenie, a następnie wyrzuć bufor z innej strzykawki. Ten etap usuwa zanieczyszczenia i ułatwia wytłaczanie.
10. Zmontuj mini-wytłaczarkę z poliwęglanową membraną filtracyjną o wielkości porów 100 nm.
    UWAGA: Wielkość porów membrany filtracyjnej określa średnicę liposomów.
11. Pobrać 500 μl buforu PBS za pomocą jednej ze strzykawek i delikatnie przepchnąć go przez filtr, aby napełnić drugą pustą strzykawkę na drugim końcu. Powtórz wytłaczanie tam i z powrotem trzy razy, aby sprawdzić szczelność aparatu i wyrzuć bufor z drugiej strzykawki.
12. Przepuść mieszaninę lipidów przez mini ekstruder, aby zastąpić bufor PBS. Następnie wytłaczaj tam iz powrotem 20 razy, aby utworzyć SUV-y. Wielopłytkowy charakter pęcherzyków może zostać zachowany przy niewystarczającej liczbie czasów ekstruzji, co wpłynie na tworzenie SLB²³.
13. Zebrać SUV-y z drugiej strzykawki, aby zmniejszyć zanieczyszczenie większymi cząstkami i przenieść je do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml.
    UWAGA: Wyjąć strzykawkę bezpośrednio ze złącza w przypadku zerwania strzykawki.
14. Owiń probówkę folią aluminiową, aby zapobiec wybielaniu lipidów znakowanych fluorescencyjnie i przechowuj je w temperaturze 4 °C. Zwykle SUV-y mogą być przechowywane do 7 dni.

3. Tworzenie SLB na nanochipie

1. Ostrożnie wyjmij oczyszczony nanochip z wody dejonizowanej pęsetą i wysusz suszarką w 99,9% gazowym azocie.
2. Czyszczenie powierzchni nanochipa za pomocą plazmy powietrznej należy wykonywać przez 1 godzinę.
3. Zmontuj nanochip w komorze polidimetylosiloksanu (PDMS), która składa się z dwóch części PDMS - środkowego PDMS i górnego PDMS (Rysunek 1A). Środkowy PDMS jest cienki (~0,5 mm) z dużym owalnym otworem pośrodku, aby zapewnić wystarczającą ekspozycję na wzór nanopasków. Górny PDMS jest gruby (~4,0 mm) z dwoma małymi otworami w dużym owalnym otworze jako wlot i wylot do obsługi cieczy.
   1. Umieść wiór na czystej powierzchni wzorem skierowanym do góry.
   2. Delikatnie przykryj środkowy PDMS chipem i upewnij się, że cały wzór jest odsłonięty w środkowej części dużego owalnego otworu w środkowym PDMS.
   3. Przykryj górny PDMS środkowym PDMS i utrzymuj jego dwa małe otwory w obszarze dużego owalnego otworu środkowego PDMS. Następnie montowana jest komora PDMS.
      UWAGA: PDMS jest najczęściej stosowanym polimerem organicznym na bazie krzemu. Jest biokompatybilny, przezroczysty, a także odkształcalny, dzięki czemu można go zaprojektować jako niestandardowy kształt do montażu chipów i obrazowania pod mikroskopem. Co ważniejsze, po obróbce plazmowej może być kowalencyjnie przyklejony do innej warstwy PDMS lub szkła, dzięki czemu nadaje się jako komora do przygotowania SLB. Ten krok zapewnia, że każda warstwa PDMS jest ściśle dopasowana, aby uniknąć szczelin i wycieków.
4. Załaduj SUV-y do komory PDMS z jednego z dwóch małych otworów w górnym PDMS za pomocą pipety i inkubuj przez 15 minut w temperaturze pokojowej, aby utworzyć SLB.
5. Delikatnie odpipetuj bufor PBS do komory PDMS z jednej strony małego otworu i usuń odpady wacikiem z drugiego otworu, aby zmyć niezwiązane SUV-y. Następnie należy pobrać SLB utworzony na nanochipie (jakość SLB jest testowana przez odzysk fluorescencji po fotowybielaniu (FRAP), jak pokazano w kroku 4.4 i omówiono w sekcji reprezentatywnych wyników).
   UWAGA: Podczas pipetowania buforu PBS do komory, końcówka pipety powinna być wypełniona buforem i stykać się z powierzchnią cieczy, aby uniknąć wstrzykiwania pęcherzyków.

4. Obrazowanie wiązania białka SLB i czujnika krzywizny na nanochipie

UWAGA: Ta sekcja będzie zależeć od systemu mikroskopu dostępnego dla eksperymentu. W tym miejscu zostaną opisane ogólne wytyczne dotyczące sposobu wykonywania obrazowania. Szczegółowe ustawienia można zmieniać między różnymi ustawieniami mikroskopu.

1. Skonfiguruj laserową skaningową mikroskopię konfokalną za pomocą obiektywu olejowego 100x (N.A.1.4). Otwórz oprogramowanie ZEN, aby wybrać moc lasera wzbudzającego, która może wzbudzić fluorescencję lipidów i białek. Wybierz tryb akwizycji > Smart Setup > Texas Red DHPE / EGFP.
2. Dostosuj ostrość za pomocą pokrętła ostrości, aby zlokalizować nanopaski na chipie, aż krawędzie nanopasków będą ostre pod kanałem lipidowym.
3. Ustaw parametry skanowania jak poniżej, aby uzyskać obraz kontrolny kanału lipidowego przed dodaniem białka: Rozmiar klatki = 512 pikseli x 512 pikseli (512 pikseli x 512 pikseli, rozmiar piksela 124 nm), Bity na piksel = 16 (głębia 16-bitowa), Szybkość skanowania = 5 i Uśrednianie = 4 (tryb uśredniania cztery razy / linię).
4. Przeprowadź test FRAP, wybielając znakowaną fluorescencyjnie dwuwarstwę lipidową na losowym obszarze z pojedynczym nanoprętem.
   1. Zaznacz pola wyboru Regiony eksperymentu i Wybielanie. Narysuj okrągły obszar o średnicy 5 μm, który może zawierać cały nanopasek w środku (rozmiar nanopręta wynosi 2 μm) i dodaj do regionów eksperymentalnych. Wprowadź parametry obrazowania poklatkowego w poniższym przykładzie: wybierz Szybkość skanowania = 9 i Uśrednianie = 1. Wybierz Szeregi czasowe > Czas trwania = 100 cykli i Interwał = 2 s. Wprowadź parametry wybielania w następujący przykład: zaznacz pole wyboru Rozpocznij po # obrazach i wybierz trzy obrazy.
   2. Zaznacz pola wyboru lasera, które wykonują FRAP i zmień moc na 100.0%. Kliknij przycisk Start Experiment (Rozpocznij eksperyment) dla eksperymentu FRAP.
      UWAGA: FRAP jest powszechną metodą charakteryzowania ruchliwości cząsteczek komórkowych. Jeśli SLB ma dobrą płynność, fluorescencja w wybielonym obszarze będzie stopniowo odzyskiwana, gdy bielone fluorofory dyfundują, a niebielone fluorofory z innych obszarów dyfundują do środka.
5. Załaduj roztwór białkowy do komory PDMS i inkubuj przez 5 minut w temperaturze pokojowej, aby umożliwić wiązanie białka z SLB.
   UWAGA: Białka używane w klasie Rysunek 2G,H w celu wykazania składu lipidowego ułatwiającego wiązanie białek na zakrzywionych nanobarach SLB to 74 μM GFP i 79 μM GFP-His. Te dwa białka są białkami zielonej fluorescencji bez lub z tagiem His. Białka używane do badania wykrywania krzywizny w Rysunek 4 i Rysunek 5 to 16 μM F-BAR, 16 μM IDR^FBP17 i 16 μM FBAR+IDR^FBP17. Te trzy białka są domenami FBP17, który jest typowym białkiem BAR, które intuicyjnie przyjmuje się zarówno jako generatory krzywizny, jak i czujniki. Każda objętość białka wynosi 20 μl.
6. Ponownie ustaw ostrość nanopasków i powtórz krok 4.3, aby wykonać obrazy kanałów lipidowych i białkowych w celu wykrywania krzywizny białek.
7. Powtórz krok 4.4, aby przeprowadzić test FRAP zarówno na kanałach lipidowych, jak i białkowych oraz wykonaj obrazowanie poklatkowe w celu scharakteryzowania ruchliwości białka wykrywającego krzywiznę.

5. Ponowne wykorzystanie nanochipa

1. Chwyć nanochip pęsetą i ostrożnie odłącz go od komory PDMS w zlewce o pojemności 50 ml wypełnionej wodą dejonizowaną.
   UWAGA: Jest to krytyczny krok. Nie dopuszczaj do tego, aby pęseta dotykała nanostruktury i nie zmuszaj chipa do oddzielania się, aby uniknąć pęknięć.
2. Dokładnie umyj nanochip bezwodnym etanolem, aby usunąć pozostałości organiczne przyczepione do powierzchni.
   UWAGA: Użyj czystej bibuły, aby usunąć wodę z powierzchni przed umyciem bezwodnym etanolem.
   UWAGA: Etanol bezwodny jest wysoce lotną i lekko niebezpieczną substancją chemiczną. Unikać kontaktu ze skórą i oczami. Używaj go w dygestorium z założoną maską i rękawiczkami.
3. Dokładnie umyj chip dużą ilością wody dejonizowanej, aby usunąć resztki etanolu. Następnie wysuszyć frytki suszarką z 99,9% azotem.
   UWAGA: Ważne jest, aby usunąć wszelkie ślady etanolu z chipa przed przejściem do następnego kroku, ponieważ kwas pirania może gwałtownie reagować z rozpuszczalnikiem organicznym i powodować eksplozje.
4. Umieść chip w czystej zlewce o pojemności 10 ml stroną ze wzorem skierowaną do góry i wyczyść chip roztworem piranii do ponownego użycia, wykonując te same czynności, co "czyszczenie nanochipa".

6. Kwantyfikacja obrazu

1. Obróć obrazy uzyskane przez mikroskop tak, aby matryca nanoprętów znalazła się w pozycji pionowej w celu późniejszej analizy w oprogramowaniu Fidżi.
2. Użyj specjalnie napisanego kodu MATLAB "c_pillarmask_averaging", aby zlokalizować pojedynczy nanopasek za pomocą kwadratowej maski (51 pikseli x 51 pikseli) zarówno w kanale lipidowym, jak i białkowym.
   UWAGA: Ten kod MATLAB jest specjalnie zaprojektowany dla nanochipa. Można go uzyskać na GitHub za pośrednictwem linku: https://github.com/wtzhaolab/GNB_SLB_MX.
3. Odejmij sygnały tła każdego obrazu z trzema ROI (5 pikseli x 5 pikseli) w rogach obrazu za pomocą funkcji meshgrid w kodzie MATLAB "BarGra_avg". Ta operacja ma na celu skorygowanie potencjalnych nierównych szumów tła spowodowanych ustawieniem mikroskopu lub poziomowaniem chipów na stoliku mikroskopu.
4. Wygeneruj średnie obrazy nanoprętów tej samej wielkości za pomocą kodu MATLAB "BarGra_avg", gdzie każdy punkt jest średnią wartości w tym punkcie we wszystkich pojedynczych nanoprętowych maskach kwadratowych. Generuj wykresy powierzchni 3D średnich obrazów w oprogramowaniu Fidżi, aby intuicyjnie pokazać średni rozkład sygnału wokół nanoprętów. Wybierz pozycję Analizuj > powierzchni > Wprowadź 100 dla mnożnika wielokąta, a następnie zaznacz pola wyboru Cień, Rysuj oś i Wygładzanie.
5. Podziel każdy nanopasek na trzy obszary, które obejmują dwa obszary końcowe nanoprętów i jeden obszar środka nanopręta, aby wyodrębnić ich intensywność fluorescencji odpowiednio za pomocą kodu MATLAB "avg_nanobar_quantification". Rozmiary nanoprętów ROI są dostosowywane zgodnie z wymiarami nanoprętów za pomocą pliku "position".
6. Podziel intensywność białka przez intensywność lipidów wyekstrahowaną z kodu MATLAB "avg_nanobar_quantification" w obszarze końca pręta, aby uzyskać gęstość końca nanopręta, która wyklucza efekt powierzchni.
7. Wykreśl gęstość końca nanopręta o różnych stężeniach w pryzmacie GraphPad, aby uzyskać krzywą wiązania. Otwórz menu Analizuj. Wybierz opcję Regresja nieliniowa (dopasowanie krzywej) > Wiązanie - Nasycenie > Specyficzne powiązanie z funkcją nachylenia wzgórza, aby dopasować krzywą do równania nachylenia, a następnie oblicz wartość współczynnika KD i wzgórza.
8. Intensywność lipidów i białek jest normalizowana do odpowiadających im intensywności w centrum nanobarów 600 nm uzyskanym na tym samym obrazie przy użyciu kodu MATLAB "avg_nanobar_quantification".
9. Użyj najjaśniejszych dziewięciu pikseli znormalizowanej intensywności białka w obszarze końca nanopręta podzielonego przez obszar środka pręta, aby określić ilościowo wykrywanie krzywizny białka za pomocą nanoprętów tej samej wielkości, wartość ta jest nazywana "stosunkiem końca do środka". Użyj stosunku znormalizowanej intensywności białka, aby znormalizować intensywność lipidów, aby określić ilościowo zakres wykrywania krzywizny białka za pomocą nanopasków o różnych rozmiarach, wartość ta jest nazywana jako "Znormalizowana gęstość końcowa nanobarów". Wartości te są obliczane przez kod MATLAB "avg_nanobar_quantification".
10. Załaduj obraz stosu FRAP w oprogramowaniu Fidżi. Wybierz obszar FRAP i wygeneruj ROI. Wybierz funkcję More > Multi measure, aby za każdym razem mierzyć intensywność obszaru FRAP. Wykreśl intensywność w GraphPad Prism, aby wygenerować krzywą odzysku FRAP.

Wyniki

Do badania białek o dodatniej krzywiźnie zalecany jest projekt nanoprętowy, który zawiera półokrąg na każdym końcu z krzywizną zdefiniowaną przez szerokość nanobara i jedną płaską/zerową kontrolę krzywizny lokalnie w środku (Rysunek 2A,B). Pomyślne wytworzenie SLB na nanoprętach skutkuje równomiernie rozłożonymi sygnałami markerów lipidowych na całej powierzchni nanoprętów, jak pokazano na Rysunek 2C. Sygnały z wielu nanoprętów można łączyć poprzez uśrednianie obra...

Dyskusja

Opisany tutaj system nanobar-SLB oferuje unikalne połączenie zalet kilku istniejących testów in vitro. Skutecznie ujawnia preferencyjne wiązanie białek z wysoce zakrzywionymi błonami, jak test flotacji liposomów lub sedymentacji, ale wymaga znacznie mniejszej liczby próbek i oferuje dokładniej zdefiniowaną krzywiznę na poszczególnych nanoprętach ^8,29. Oferuje również szeroki zakres precyzyjnie kontrolowanej krzywizny do jednoczesnego porównania z testem ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Bezwodny etanol	Sigma-Aldrich	100983
Folia aluminiowa	Diament	RN0879999FU
Bursztynowa fiolka	Sigma-Aldrich	27115-U
Mózg PS: L-&alfa;-fosfatydyloseryna (mózg, świnia) (sól sodowa)	Avanti Polar Lipids, Inc.
10 ml zlewki	Schott-Duran	SCOT211060804
50 ml zlewki	Schott-Duran	SCOT211061706
1000 ml zlewki	Schott-Duran	SCOT211065408	Drugi pojemnik
Chloroform	Sigma-Aldrich	V800117
Patyczki	kosmetyczne Watsons
18:1 DGS-NTA(Ni): 1,2-dioleoilo-sn-glicero-3-[(Kwas N-(5-amino-1-karboksypentylo)iminodiacet)sukcynyl] (sól niklowa)	Avanti Polar Lipids, Inc.
Egg PC: L-&alfa;-fosfatydylocholina (jajko, kurczak)	Avanti Polar Lipids, Inc.
Plaftorm do produkcji białek F-BAR, Szkoła Nauk Biologicznych, Uniwersytet Technologiczny Nanyang, Singapur		Produkcja białek i peptydów
F-BAR+IDR	Plaftorm, Szkoła Nauk Biologicznych, Uniwersytet Technologiczny Nanyang, Singapur		Białka i peptyd
GFP	Plaftorm do produkcji białek, Szkoła Nauk Biologicznych, Uniwersytet Technologiczny Nanyang, Singapur		Białka i peptydy
GFP-His	Plaftorm do produkcji białek, Szkoła Nauk Biologicznych, Uniwersytet Technologiczny Nanyang, Singapur		Białka i peptydy
GraphPad Prism	GraphPad	V9.0.0
Nadtlenek wodoru, 30% (certyfikowany ACS)	Thermo Scientific	H325-500
IDR od człowieka FBP17	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.
ImageJ	National Institutes of Health	1.50d
Laserowa skaningowa mikroskopia konfokalna	Zeiss	LSM 800 z obiektywem olejowym Airyscan	100x (N.A.1.4).
Metanol	Fisher	naukowy 10010240
Mini-eksfuder	Avanti Polar Lipids, Inc.	610000-1EA
1,5 ml mikroprobówki	Greiner	616201
MATLAB	Mathworks	R2018b
Hydrofilowa membrana nuklerowa, 0,1 i mu; m	Whatman	800309
Bufor fosforanowy Saline (PBS)	Life Technologies Holdings Pte Ltd.	70013
Polidimetylosiloksan (PDMS) Baza	Dow Corning Corporation	SYLGARD 184
Polidimetylosiloksan (PDMS) Środek sieciujący	Dow Corning Corporation	SYLGARD 184
Środek do czyszczenia plazmy	HARRICK PLASMA	PDC-002-HP
Nanochip kwarcowy	Donghai County Alfa Quartz Products CO., LTD
Wodorotlenek sodu	Sigma-Aldrich	795429
Kwas siarkowy	Sigma-Aldrich	258105
Texas Red DHPE: Texas Red 1,2-dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, sól trietyloamonowa Life	Technologies Holdings Pte Ltd.
Pęseta	Gooi	PDC-002-HP
Myjki ultradźwiękowe	Elma	D-78224
Voterx	Scientific Industries	G560E
Eksykator próżniowy	NUCERITE	5312
Kąpiel wodna	Julabo	TW8

840032790404840051T1395MP